UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

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1 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA COMPARACIÓN DE DOS PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION UTILIZANDO DIFERENTES DOSIS DE GONADOTROPINA CORIÓNICA EQUINA (ecg) EN LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES OVINOS Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: María Belén Morales Gordón TUTOR: Dr. Richard Roberto Salazar Silva Quito, Marzo 2017

2 DEDICATORIA El mar es peligroso y sus tormentas terribles. Pero estos obstáculos nunca han sido razón suficiente para quedarse en tierra Fernando de Magallanes. A mis padres Patricio y Juanita, que con su ejemplo me enseñaron a esforzarme por todo aquello que uno desea en la vida, este fue un sueño que lo construimos juntos y gracias a su apoyo incondicional ahora es realidad, gracias por guiarme a lo largo de mi vida, todo lo que soy ahora es fruto de sus innumerables esfuerzos. A mis familiares y amigos que me brindaron siempre su apoyo y aliento en los momentos más difíciles. Con cariño Mabe. ii

3 AGRADECIMIENTOS A mis padres que siempre confiaron en mí y me impulsaron a cumplir mis metas y objetivos, gracias por su apoyo incondicional sin ustedes nada de esto hubiese sido posible. A la Hacienda Zuleta y Anexas Cía. Ltda. por poner a disposición el uso de sus instalaciones y animales en la realización de este proyecto, a la Empresa IMPVET Cía. Ltda. por su aporte con productos usados en este proyecto. A Bernard y Telio Nicolalde, por abrirme no solo las puertas de su hogar, sino las de su corazón, y por su apoyo incondicional para que este proyecto sea posible. A mi tutor Dr. Richard Salazar, por brindarme su apoyo incondicional en la realización de este proyecto, por su guía, sus consejos y su amistad. A mis maestros y amigos: Dr. Juan Vargas, Dr. Richard Mancheno, Dr. Fabián Mancheno, Dra. Pamela Martínez, MVZ. Pamela Martínez Estévez, MVZ. Gabriela Ortega, Ing. Daysi Páez, MVZ. Orominavi Tisalema, MVZ Xavier Villacís, quienes colaboraron en este proyecto. iii

4 AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL iv

5 INFORME DEL TUTOR v

6 CALIFICACIÓN DEL TRABAJO ESCRITO FINAL vi

7 vii

8 viii

9 ÍNDICE GENERAL CONTENIDO pág. DEDICATORIA... ii AGRADECIMIENTOS... iii AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL... iv INFORME DEL TUTOR... v CALIFICACIÓN DEL TRABAJO ESCRITO FINAL... vi ÍNDICE GENERAL... ix ÍNDICE DE TABLAS O CUADROS... xiii ÍNDICE DE FIGURAS... xiv INDICE DE ANEXOS... xv RESUMEN... xvi ABSTRACT... xvii CAPITULO I...1 INTRODUCCIÓN...1 ix

10 OBJETIVOS...3 OBJETIVO GENERAL...3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:...3 HIPÓTESIS...3 CAPITULO II...4 MARCO TEORICO...4 CICLO ESTRAL DE LA OVEJA...4 FASE FOLICULAR...4 Proestro...4 Estro...5 FASE LUTEAL...6 Metaestro:...6 Diestro...6 DESARROLLO DE ONDAS FOLICULARES...7 FACTORES QUE REGULAN EL CICLO ESTRAL...8 Fotoperiodo...8 Nutrición...8 Efecto macho...8 MÉTODOS DE SINCRONIZACIÓN DEL ESTRO...9 x

11 Sincronización utilizando progestágenos...9 Sincronización utilizando PGF-2α...9 MÉTODOS DE SUPEROVULACIÓN...9 Tratamiento con gonadotropina coriónica equina (ecg)...10 Tratamiento con FSH...10 TIPOS DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL...11 IA Vaginal...11 IA cervical...11 IA intrauterina...11 COLECTA DE EMBRIONES...12 CALIFICACIÓN EMBRIONARIA...12 CAPITULO III...14 MATERIALES Y MÉTODOS...14 CARACTERÍSTICAS DE LA ZONA DE ESTUDIO MATERIALES...14 Materiales químicos y biológicos...14 Equipos...15 Insumos médicos...15 Unidades Experimentales...16 xi

12 Tipo de investigación...16 METODOLOGÍA...17 TRATAMIENTOS...17 PROTOCOLO TRATAMIENTO PROTOCOLO TRATAMIENTO Procedimiento para colocación de esponja intravaginal...19 Técnica de inseminación artificial cervical...20 Técnica de lavado y recuperación de embriones...20 Búsqueda y clasificación de embriones...21 ANÁLISIS ESTADÍSTICO...21 Tamaño de la muestra...21 CAPÍTULO IV...23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN...23 CAPÍTULO V...30 CONCLUSIONES...30 BIBLIOGRAFÍA...31 ANEXOS...35 xii

13 ÍNDICE DE TABLAS O CUADROS TABLA pág. Tabla 1. Valoración del estadio de desarrollo embrionario...12 Tabla 2. Valoración de la calidad embrionaria...13 Tabla 3. Numero de cuerpos lúteos observados mediante laparotomía...23 Tabla 4. Embriones obtenidos mediante lavado uterino, y clasificación a través del esteromicroscopio Tabla 5. Costos parciales de producción de embriones ovinos por tratamiento y por donadora...28 xiii

14 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA pág. Figura 1. Evolución de los niveles plasmáticos de esteroides ováricos y de gonadotropinas hipofisarias durante el ciclo estral de la oveja...7 Figura 2. Ubicación geográfica Hacienda Zuleta y Anexas S.A Figura 3. Esquema del Protocolo de superovulación y transferencia de embriones xiv

15 INDICE DE ANEXOS ANEXO pág. ANEXO 1. REGISTRO DE PROTOCOLO DONADORAS...36 ANEXO 2. REGISTRO DE COLECTA DE EMBRIONES...38 ANEXO 3. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO ANEXO 4. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO ANEXO 5. RESULTADOS ANALISIS DE LABORATORIO...43 ANEXO 6. FOTOGRAFÍAS...47 xv

16 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA COMPARACIÓN DE DOS PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION UTILIZANDO DIFERENTES DOSIS DE GONADOTROPINA CORIONICA EQUINA (ecg) EN LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES OVINOS Autor: María Belén Morales Gordón Tutor: Richard Salazar Silva Fecha: 15 de Marzo, 2017 RESUMEN El efecto de un tratamiento de superovulación y transferencia de embriones realizado en ovejas Poll Dorset (n= 16) estimuladas en los meses de septiembre-octubre, en la Hacienda Zuleta y Anexas S.A. a una altitud de 2885msnm, el día 0 se colocó una esponja intravaginal Chronogest CR durante 9 días, en el día 7 se administró Tratamiento I (1000 UI ecg Folligon ) Tratamiento II (1500 UI de ecg Folligon ), día 9 se administró un análogo de la prostaglandina F2α (Lutalyse 10mg) conjuntamente con el retiro de la esponja, y al momento del celo se aplicó un análogo de GnRH (Conceptal 8µg), se realizó la inseminación artificial cervical 48 horas post retiro de esponja intravaginal. La recuperación embrionaria se realizó 6 días posteriores por laparotomía. El número de cuerpos lúteos obtenidos en el tratamiento I (5,40±3,02) tratamiento II (9,8±5,20) demostró (P <0,05) y que existe una diferencia significativa en la respuesta superovulatoria entre tratamientos. El número de embriones obtenidos tratamiento I (0,63±1,41) tratamiento II (2,13±2,30) donde (P>0,05) sin mostrar una diferencia significativa entre los tratamientos. Se concluyó que el Tratamiento II (1500 UI de ecg Folligon ) mostro una mejor respuesta a la superovulación y a la producción de embriones frente al Tratamiento I (1000 UI ecg Folligon ). Palabras clave: sincronización, ovulación múltiple, inseminación artificial, cuerpo lúteo, calidad embrionaria. xvi

17 "COMPARISON OF TWO SUPEROVULATION PROTOCOLS USING DIFFERENT DOSES OF EQUINE CHORIONIC GONADOTROPHIN (ecg) IN THE PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS" Author: María Belén Morales Gordón Tutor: Richard Salazar Silva Date: March 15 th, 2017 ABSTRACT The effect of a superovulation and embryo transfer treatment on Dorset Poll sheep (n = 16) stimulated in the months of September-October, at Hacienda Zuleta and Anexas S.A. At an altitude of 2885 meters above sea level, on day 0 an intravaginal sponge Chronogest CR was placed for 9 days, on day 7 Treatment I (1000 IU egg Folligon ) Treatment II (1500 IU ecg Folligon ) was administered, day 9 Administered a prostaglandin F2α analogue (Lutalyse 10mg) in conjunction with the removal of the sponge, and at the time of estrus a GnRH analogue (Conceptal 8μg) was applied, cervical artificial insemination was performed 48 hours post intravaginal sponge removal. Embryonic recovery was performed 6 days later by laparotomy. The number of luteal bodies obtained in treatment I (5.40 ± 3.02) treatment II (9.8 ± 5.20) showed (P <0.05) and that there was a significant difference in the superovulatory response between treatments. The number of embryos obtained treatment I (0.63 ± 1.41) treatment II (2.13 ± 2.30) where (P> 0.05) did not show a significant difference between the treatments. In conclusion the Treatment II (1500 IU of Folligon ecg) showed a better response to superovulation and to the production of embryos compared to Treatment I (1000 IU Folligon ecg). Keywords: synchronization, multiple ovulation, artificial insemination, corpora lutea, embryo quality. xvii

18 CAPITULO I INTRODUCCIÓN La población ovina en el Ecuador es de animales, representa el 3,64% de la población pecuaria total (Instituto Nacional Estadísticas y Censos, 2015), comparando con datos de años anteriores se observa una notable disminución, por lo que establecer biotecnologías reproductivas tendría un efecto a mediano y largo plazo para revertir este proceso e incrementar la producción ovina con calidad genética en el país. La capacidad de reproducción bajo sistemas tradicionales en las diferentes especies y razas es un factor limitante para acelerar el progreso genético. En condiciones normales la crianza de ovinos, se obtiene durante toda la vida productiva de una oveja entre 6 a 8 crías; la transferencia de embriones permite incrementar el potencial reproductivo de las hembras de alto valor genético mediante un mayor aprovechamiento de la reserva de ovocitos que se encuentran en el ovario que mediante estimulación hormonal desencadena una ovulación múltiple (OM) pudiéndose obtener un número considerable de embriones en un corto período de tiempo (Gibbons & Cueto, 2013). La implementación de la transferencia de embriones (TE) permite disminuir el intervalo entre generaciones y aumenta la tasa reproductiva de las hembras en forma similar al rol de la inseminación artificial en los machos (Palma, 2001), tomando en cuenta que la importación de un animal con alto valor genético puede ser un proceso largo y costoso; la transferencia de embriones es más sencilla, con la ventaja de obtener animales de excelente 1

19 calidad genética, con un adecuado manejo sanitario, logrando evitar la transmisión de enfermedades, y permitiendo transportar el material genético a través de grandes distancias (Abecia & Forcada, 2010) La inmunidad que transmiten las receptoras a las crias es importante pues reciben anticuerpos especificos para los patógenos de la región, resultando una ventaja frente a los animales introducidos a mayor edad (Palma, 2001). La ovulación múltiple y transferencia de embriones (MOET) traducido del inglés multiple ovulation and embryo transfer permitirá crear programas de producción más eficientes y con alta rentabilidad, utilizando una menor inversión inicial, y en los programas de producción existentes permitirá mejorar la genética a un menor costo (Gibbons & Cueto, 2013). Dentro de los protocolos MOET el uso ecg presenta ventajas al ser un tratamiento económico, se administra en una sola dosis lo que evita el manejo excesivo que resulta ser un factor estresante para los animales criados en condiciones extensas como los del presente estudio, y dicho estrés resulta ser perjudicial para el rendimiento reproductivo (Simonetti et al., 2008). El objetivo de esta investigación es generar protocolos prácticos probados aplicables a nuestra realidad nacional, y sentar datos de base para futuras investigaciones que permitan generar biotecnologías eficientes. 2

20 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Comparar dos protocolos de superovulación utilizando diferentes dosis de gonadotropina coriónica equina (ecg) en la producción de embriones ovinos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Evaluar el efecto de la dosis de 1000 UI y 1500 UI de ecg mediante el conteo de cuerpos lúteos por laparotomía. Determinar el número de embriones obtenidos mediante conteo directo por observación a través del estereomicroscopio. Analizar los costos parciales de producción de los embriones. HIPÓTESIS Hipótesis nula (H0). Los animales tratado con la dosis de 1000 UI de ecg tienen la misma respuesta ovulatoria que los animales tratados con una dosis de 1500 UI de ecg. Hipótesis alternativa (H1). Los animales tratados con una dosis de 1000 UI de ecg tienen diferente respuesta ovulatoria que los animales tratados con una dosis de 1500 UI de ecg. 3

21 CAPITULO II MARCO TEORICO CICLO ESTRAL DE LA OVEJA Según varios autores tiene una duración promedio de 17 días, y posee dos fases una fase folicular considerada desde el día 14 al día 1 y una luteal más extensa que va del día 2 al día 13, considerando el inicio del estro el día 0 de este ciclo (Pugh & Baird, 2012). Este ciclo está controlado totalmente por las hormonas, lo que ha generado una constante investigación, creando un mejor entendimiento de los mecanismos de acción fisiológicos en busca de estrategias que puedan mejorar los resultados y eficiencia de los tratamientos con hormonas exógenas, incluyendo tratamientos como: sincronización de celos, inseminación artificial (IA), MOET, aumentando el número de embriones recuperados y reduciendo la mortalidad embrionaria (Phillips & Jahnke, 2016). FASE FOLICULAR Esta fase se extiende desde la luteólisis hasta la ovulación consta de dos etapas, proestro y estro. Proestro Al caer los niveles de progesterona (P4) por debajo de 1ng/ml da lugar a la lisis del cuerpo lúteo (CL) inducida por la secreción de oxitocina por parte 4

22 del CL provocando en el endometrio la descarga de PGF2α la cual actúa reduciendo el flujo sanguíneo al CL y uniéndose a receptores para reducir la síntesis de P4 inhibiendo el transporte intracelular y dando lugar a una apoptosis (Aisen, 2004; Gibbons & Cueto, 2013). Una vez completada la luteólisis la inhibición de la GnRH cesa permitiendo su síntesis en el hipotálamo basal medio y con los bajos niveles de estradiol circulante incapaces de inhibir la secreción pulsátil de GnRH hacia el sistema porta-hipofisario actuando en células de la hipófisis anterior para una posterior liberación de LH (hormona luteínizante) y FSH (folículo estimulante) (Galina, 2008; Hafez, E. & Hafez, 2002). Dichas hormonas son sintetizadas y almacenadas como gránulos secretorios en las células basófilas de la hipófisis anterior (gonadotropos) para luego ser secretadas a través de exocitósis, y tienen como tejidos diana las células ováricas (Gordon, 2004; Universidad Nacional Autónoma De México, 2008) El aumento de la FSH y LH facilita la maduración de los folículos ováricos (foliculogénesis), dando lugar al aumento de estradiol circulante cesando la producción de gonadotrofinas hipofisarias facilitando la presentación del estro y una consiguiente ovulación (A. Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004). Estro Este debe ser entendido como el momento en que la hembra se muestra receptiva al macho teniendo una duración de horas, siendo más duradero en hembras prolíficas y adultas. El pico preovulatorio de LH se da 2-6 horas después de iniciado el celo y la ovulación de horas del inicio del mismo (Abecia & Forcada, 2010). La ovulación se da tras un incremento del estradiol plasmático que produce un exagerado aumento de la concentración de LH hasta la ovulación donde el folículo maduro elabora la hormona inhibina cuya función es inhibir la 5

23 liberación de FSH impidiendo el crecimiento folicular adicional (Aisen, 2004). FASE LUTEAL Se extiende desde la ovulación hasta la luteólisis presenta dos etapas el metaestro y el diestro. Metaestro: Empieza luego de la ovulación cuando el folículo de Graff se convierte en cuerpo hemorrágico, a consecuencia de la secreción preovulatoria de LH, las células de la granulosa se transforman en células luteínicas y secretan P4 (Aisen, 2004). Diestro Durante esta fase los niveles plasmáticos de P4 aumentan progresivamente alcanzando valores entre 1-5 ng/ml, durante esta fase se observan ondas de desarrollo folicular, las 2 primeras terminaran en atresia folicular y la tercera dará un folículo ovulatorio. Durante esta etapa la progesterona ejerce una retroalimentación negativa, limitando la liberación de GnRH y LH la secreción constante de P4 actúa en el endometrio incrementando el almacenamiento de fosfolípidos y actividad enzimática para la posterior conversión del ácido araquidónico a PGF2α, para que se dé a cabo la luteólisis si no hay implantación (A. Abecia & Forcada, 2010; Pugh & Baird, 2012). Al inicio de la gestación la P4 es muy importante, pero la suplementación de P4, puede generar altos niveles exógenos inhibiendo la producción endógena por retroalimentación negativa (Gordon, 2004). Una hormona que posiblemente tenga una acción antiluteolítica indirecta es la GnRH que actúa suprimiendo la secreción de estradiol 17β y PGF2α foliculares, mejorando en yeguas las tasas de gestación, administrada de 6

24 8-11 días luego de la ovulación y la IA. y en ovinos estudios indican que puede mejorar la supervivencia embrionaria al día 12 de la gestación (Gordon, 2004). Figura 1. Evolución de los niveles plasmáticos de esteroides ováricos y de gonadotropinas hipofisarias durante el ciclo estral de la oveja (Tomado de Abecia & Forcada 2010) DESARROLLO DE ONDAS FOLICULARES El número de ondas foliculares en un ciclo puede variar en caprinos entre 2-5 ondas, pero en los ovinos acontecen 3 o 4 pero con mayor frecuencia se desarrollan 3 ondas (Aisen, 2004; Seekallu et al., 2010). La regulación de la dinámica folicular está dada por las gonadotrofinas, en interacción con la P4, niveles superiores a los normales durante la fase lútea favorecen el recambio folicular afectando, evitando la dominancia folicular (Alfonso Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004). En la fase folicular la tasa ovulatoria está determinada por los niveles de FSH que controla el número de folículos que maduraran otros factores que también intervienes son: genéticos, nutricionales, relación endócrinas entre folículos. La secreción de FSH es regulada por retroalimentación de hormonas foliculares que son los estrógenos y la inhibina, existe correlación 7

25 negativa entre concentraciones de estradiol y FSH. (Aisen, 2004; Seekallu et al., 2010) FACTORES QUE REGULAN EL CICLO ESTRAL Fotoperiodo Los ovinos son animales poliéstricos estacionales, su actividad reproductiva va a desarrollarse en función de la cantidad de horas luz (fotoperiodo), en el hemisferio norte, en zonas cercanas a la línea ecuatorial los cambios del fotoperiodo son menos marcados, siendo la época de reproducción influenciada por otros factores como temperatura, precipitación y disponibilidad de alimento (Aisen, 2004; Galina, 2008). Nutrición La administración de una alimentación suplementaria con altos niveles energéticos generalmente con granos con raciones que van de g. denominado flushing, entre 2 a 3 semanas previas al empadre, induciendo a un aumento en la condición corporal con el fin de aumentar la tasa de ovulación y sobrevivencia embrionaria (Pugh & Baird, 2012; Universidad Nacional Autónoma De México, 2008). Efecto macho Es un factor social que juega un papel importante en la fisiología reproductiva, en ovejas previamente aisladas del macho en un lapso de 3 a 4 semanas, el mecanismo de acción es mediante la presencia del macho induce un estímulo capaz de alterar la secreción pulsátil de LH a tal punto de ser capaz de estimular la ovulación dentro de los 6 días siguientes, dicho evento se favorecido con el inicio del celo en varias ovejas, induciendo al celo a otras ovejas del grupo (A. Abecia & Forcada, 2010; Pugh & Baird, 2012). 8

26 MÉTODOS DE SINCRONIZACIÓN DEL ESTRO Tiene como objetivo agrupar los estros, para realizar inseminación artificial, transferencia de embriones o sincronizar partos mediante la aplicación de tratamientos hormonales. Sincronización utilizando progestágenos El mecanismo de acción de los progestágenos sintéticos utilizados para sincronizar el estro, es inhibir la secreción de LH de la Hipófisis, evitando la foliculogénesis (Hafez, E. & Hafez, 2002). Consiste en la aplicación de un dispositivo que puede ser una esponja o un implante denominado CIDR impregnado con una fuente de progesterona, y es aplicada por vía vaginal, imitando la fase luteal del ciclo estral y al final del proceso se aplica una gonadotropina capaz de favorecer la respuesta ovulatoria (A Abecia, Forcada, & González-Bulnes, 2012). Sincronización utilizando PGF-2α Se realiza mediante la aplicación de un análogo de la PGF-2α induciendo una regresión temprana del CL, interrumpiendo la fase luteal y desencadenando una nueva fase folicular, este método no es efectivo si no existe la presencia de un CL funcional (Universidad Nacional Autónoma De México, 2008). Consiste en una primera aplicación de la hormona que provocara luteólisis solo en las hembras que presenten un CL, 9 a 11 días posteriores se aplica una segunda dosis donde las hembras que no respondieron a la primera aplicación tendrá ya un CL funcional, y las que respondieron tendrán un CL a mitad del ciclo y también tendrán respuesta (A Abecia et al., 2012). MÉTODOS DE SUPEROVULACIÓN Pese a los intensivos trabajos de investigación realizados por años la respuesta ovulatoria es variable y poco predecible, lo que sigue 9

27 representando el factor limitante en este tipo de biotecnología reproductiva (Busch & Waberski, 2007). Esta idea coincide con otros autores que mencionan que existen otros factores que pueden afectar la respuesta ovulatoria, tales como: hormonales, ambientales, intrínsecos de cada animal. Tratamiento con gonadotropina coriónica equina (ecg) Una de las primeras hormonas usadas comercialmente para la superovulación, es una glucoproteína con subunidades alfa y beta, similares a la FSH Y LH, es secretada por las copas endometriales en el útero equino como una gonadotropina placentaria, entre los días 41 al 85 de gestación (Hafez, E. & Hafez, 2002) tiene acciones bilógicas similares a la actividad FSH (80%) y LH (20%) y tiene una larga vida media de 63 horas debido a su alto contenido de ácido siálico (Barrett, Bartlewski, Batista- Arteaga, Symington, & Rawlings, 2004; Hafez, E. & Hafez, 2002). El tratamiento de ovulación múltiple utilizando ecg presenta ventajas al ser un tratamiento económico, puede administrase en una sola dosis lo que evita el manejo excesivo que resulta ser un factor estresante para los animales criados en condiciones extensas como los del presente estudio, y dicho estrés resulta ser perjudicial para el rendimiento reproductivo (Simonetti et al., 2008). Tratamiento con FSH Es una alternativa para la ovulación múltiple la presentación comercial es a partir de extractos de hipófisis de especie ovina o porcina, por tanto su relación FSH:LH puede variar (A. Abecia & Forcada, 2010). La FSH tiene una vida media corta, por lo que necesita una administración frecuente para poder mantener concentraciones séricas capaces de generar una respuesta superovulatoria, es necesario administrar la hormona entre 4 a 8 veces en un lapso de 12, y coincidiendo la última 10

28 aplicación 12 horas después de retirada la esponja. Se obtiene mejores resultados de aplicando la hormona en dosis decreciente, que a dosis constantes, este tratamiento también puede ir acompañado de una sola dosis de ecg (A. Abecia & Forcada, 2010; Gibbons & Cueto, 2013). TIPOS DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL El objetivo de la inseminación artificial es depositar el material seminal en el aparato genital de la hembra en el sitio y momento adecuado de tal modo que este alcance el oviducto y fecunde el óvulo (Aisen, 2004; Evans & Maxwell, n.d.) IA Vaginal Es el tipo de IA más sencilla requiere poco entrenamiento, es necesario emplear semen fresco con una alta concentración espermática, mayor a 300 millones para que esta técnica sea exitosa, se deposita el semen únicamente en la vagina sin localizar el cuello uterino (Aisen, 2004) IA cervical Esta técnica necesita menor concentración de espermatozoides 100 millones con la ayuda de un vaginoscopio y una fuente de luz se ubica la entrada al cérvix y es depositado el materia seminal en la entrada del cérvix ya que es poco probable poder atravesar los anillos cervicales (Abecia & Forcada, 2010; Sanchez, Mejia, & Manzur, 2014). IA intrauterina Es un método invasivo de IA, pero permite la utilización de semen fresco o congelado consiste en que mediante laparoscopia el tracto reproductivo es localizado y el semen es inyectado en el lumen del útero (Bearden, Fuquay, & Willard, 2004). 11

29 COLECTA DE EMBRIONES Existen dos técnicas: La quirúrgica que consiste en realizar una laparotomía media y determinar la respuesta ovulatoria (conteo de cuerpos lúteos), exponer el útero y mediante una sonda Foley generar una corriente de arrastre con un medio adecuado y se colecta en un filtro para embriones. En la no quirúrgica, son procedimientos poco experimentados, requiere de un profesional que maneje bien esta técnica (Alfonso Abecia & Forcada, 2010; Gibbons & Cueto, 2013). Para el manejo del embrión es necesario utilizar medios e insumos no tóxicos y estériles (Phillips & Jahnke, 2016). CALIFICACIÓN EMBRIONARIA Tabla 1. Valoración del estadio de desarrollo embrionario Estadio Desarrollo Característica Edad Embrionaria post celo 0 Sin Fertilizar células horas 2 8 células Día 3 (72 horas) 3 16 células: Mórula temprana Día 4 (96 horas) 4 Mórula Día 5 5 Blastocisto temprano Día Blastocisto Día 6 7 Blastocisto expandido Día 7 8 Blastocisto eclosionado Día 8 Adaptado de (Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004) 12

30 Tabla 2. Valoración de la calidad embrionaria Calidad Característica Descripción 1 Excelente Embrión ideal, esférico, simétrico con células de tamaño, color y textura uniforme. Desarrollo embrionario correspondiente al día de recolección. No existen defectos visibles los blastómeros son visibles y la zona pelúcida está intacta. 2 Bueno Posee imperfecciones triviales, el embrión tiene pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o posee una pequeña cantidad de vesículas. Su forma puede ser ligeramente irregular. 3 Regular El embrión posee defectos definidos: detritus celulares, forma irregular, color muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelúcida. Pocas células degeneradas, vesículas y presencia de blastómeros desprendidos. 4 Malo El embrión posee severos defectos: los correspondientes a la calidad 3 más desarrollo retardado, seria ruptura de la zona pelúcida (el embrión puede estar parcialmente fuera de la misma), forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración con granulación y vacuolización de los blastómeros. Incluye a los estados hasta 8 células y la degeneración. Esta categoría de embriones no es transferible. Clasificación convenida por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) Adaptado de (Gibbons & Cueto, 2013) 13

31 CAPITULO III MATERIALES Y MÉTODOS CARACTERÍSTICAS DE LA ZONA DE ESTUDIO. La investigación se desarrolló en la Hacienda Zuleta y Anexas S.A, ubicada en la provincia de Imbabura, Cantón Ibarra, Parroquia Angochagua. El relieve de la parroquia es irregular, su altitud va desde los 2589 msnm hasta los 3899 msnm de altitud. La precipitación oscila entre los 700 mm y mm, con frecuencia se presenta neblina y lluvia en la zona, aunque en los últimos años han sido recurrente las sequías. La temperatura en la zona varía entre los 10 C y 16 C (GAD, 2015). Figura 2. Ubicación geográfica Hacienda Zuleta y Anexas S.A. MATERIALES Materiales químicos y biológicos - Unidades experimentales. 14

32 - Esponjas intravaginales (Chronogest CR) - Hormona ecg (Folligon ) - Análogo de la prostaglandina F2α dinoprost (Lutalyse ) - Análogo de la GnRH, acetato de buserelina (Conceptal ) - Selenio ( Seleben E) - Bio-Life Advantage Embryo collection medium - Vigro holding plus - Clorhexidina - Alcohol yodado - Agua destilada - Cloruro de sodio - Xilacina - Ketamina - Antibiótico (Shotapen LA) - Alcohol - Lidocaína sin epinefrina 1% Equipos - Camilla de IA para ovinos - Vaginoscopio - Equipo quirúrgico básico - Lámpara de cabeza - Termo - Termómetro - Maquina rasuradora - Estereomicroscopio - Ecógrafo - Pipeta Automática Insumos médicos - Catéter Foley # 10 3cc - Pipeta para IA 15

33 - Jeringuilla 50ml - Caja Petri cuadriculada - Punta para pipetas - Filtro Emcon - Sutura Vicryl 0 - Campos estériles - Gasas estériles - Guantes quirúrgicos estériles - Toallas papel - Caja jeringuillas 3ml - Caja jeringuillas 5ml - Caja agujas - Guantes manejo Unidades Experimentales Las ovejas de 2-4 años con condición corporal entre 3-3,5 y con pesos entre kg que se encontraban dentro del calendario reproductivo (época reproductiva), y cumplían las características fenotípicas de la raza. Los animales en el tratamiento 1 y 2 se encontraron bajo las mismas condiciones de manejo, nutricionales, condición corporal, tipo de instalaciones, además se utilizaron hormonales de los mismos lotes de fabricación. Tipo de investigación El tipo de investigación que se realizó fue experimental, de campo y laboratorio. Y se utilizó un muestreo estratificado para la selección de las unidades experimentales. 16

34 METODOLOGÍA TRATAMIENTOS PROTOCOLO TRATAMIENTO 1. Día 0: A las 9am se colocó la esponja intravaginal (EIV) Chronogest CR, y se aplicó 1ml de Selenio (Seleben E ) vía intramuscular (IM). Día 1, 2, 3, 4: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV. Día 5: Se retiró la primera EIV Chronogest CR, y se reemplazó por una nueva. Día 6: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV. Día 7: Se administró 1000 UI de ecg (Folligon ) vía IM. Día 8: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV. Día 9: A las 12pm se retiró la segunda EIV Chronogest CR, y se administró un análogo de la prostaglandina F2α (Lutalyse 10mg). Día 10: Se detectó celo a las a las 24 horas post retiro de EIV. Se aplicó un análogo de GnRH (Conceptal 8µg) al momento del celo. Día 11: Se realizó la inseminación artificial (IA) a las 48 horas post retiro de EIV. Día 16: A las 7 am se inició el ayuno de agua y alimento de los animales, 24 horas previas a la laparotomía. Día 17: A partir de las 7am realizó el lavado y recuperación de embriones. 17

35 Adaptado de (Alfonso Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004; Azawi & Al- Mola, 2011; Blanco, Simonetti, & Rivera, 2003; Durán, 2013; Gibbons & Cueto, 2013) PROTOCOLO TRATAMIENTO 2. Día 0: A las 9am se colocó la esponja intravaginal (EIV) Chronogest CR, y se aplicó 1ml de Selenio (Seleben E ) vía intramuscular (IM). Día 1, 2, 3, 4: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV. Día 5: Se retiró la primera EIV Chronogest CR, y se reemplazó por una nueva. Día 6: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV. Día 7: Se administró 1500 UI de ecg (Folligon ) vía IM. Día 8: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV. Día 9: A las 12pm se retiró la segunda EIV Chronogest CR, y se administró un análogo de la prostaglandina F2α (Lutalyse 10mg). Día 10: Se detectó celo a las a las 24 horas post retiro de EIV. Se aplicó un análogo de GnRH (Conceptal 8µg) al momento del celo. Día 11: Se realizó la inseminación artificial (IA) a las 48 horas post retiro de EIV. Día 16: A las 7 am se inició el ayuno de agua y alimento de los animales, 24 horas previas a la laparotomía. Día 17: A partir de las 7am realizó el lavado y recuperación de embriones. 18

36 Adaptado de: (Alfonso Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004; Azawi & Al- Mola, 2011; Blanco et al., 2003; Durán, 2013; Gibbons & Cueto, 2013) Figura 3. Esquema del Protocolo de superovulación y transferencia de embriones. CEIV: Colocación de EIV. Se: Seleben E. CEIV*: Retiro de 1era EIV y colocación de una nueva. ecg: Administración IM de ecg. REIV+PF2α: Retiro de EIV + aplicación IM de análogo de prostaglandina F2α. DC + GnRH: Detección de celo + aplicación IM de análogo de GnRH. IA: inseminación artificial. LRE: Lavado y recuperación de embriones. Procedimiento para colocación de esponja intravaginal - Se desinfectó el aplicador de esponjas (Chronogest CR) con amonio cuaternario al 0,1%. - Se colocó la EIV Chronogest CR en la extremidad posterior del aplicador de esponjas Chronogest CR. - Se abrió la vulva e introdujo el aplicador lubricado, se lo desliza suavemente hasta el fondo de la vagina, se retiró ligeramente el aplicador, se empujó la esponja con ayuda del embolo hasta que salga del tubo aplicador. - Se retiró de la vagina el tubo aplicador y el émbolo del aplicador suavemente (Daza, 1997). 19

37 Técnica de inseminación artificial cervical La IA se realizó a las 48 horas post retiro de EIV. - Registrada la oveja se la colocó en la camilla con los miembros posteriores levantados. - Se realizó una limpieza de la vulva con una toalla de papel. - Se introdujo el vaginoscopio, empleando una lámpara de cabeza, dirigiendo la luz hacia la vagina, a través del vaginoscopio, hasta ubicar el orifico de entrada del cérvix. - Se introdujo la pipeta en el cérvix lo más profundo posible, hasta sentir resistencia, se empujó el embolo hasta depositar 0,20 ml de semen con una concentración de aproximadamente 100 millones de espermatozoides, se retiró la pipeta y luego el vaginoscopio - Una vez terminada la IA, se bajó a la oveja y se la dejo de pie (Sanchez et al., 2014) Técnica de lavado y recuperación de embriones La recuperación de embriones debido a las características anatómicas de la hembra ovina se realizó mediante laparotomía. - El preanestésico utilizado fue xilazina 2% IM a una dosis de 0,2mg/kg y como anestésico ketamina 5% IV a una dosis de 0,2mg/kg, y un anestésico local lidocaína al 2% (Gibbons & Cueto, 2013; Pugh & Baird, 2012) - Se colocó a la oveja en la camilla con la cabeza hacia abajo, se sujetó a la oveja, se realizó antisepsia y desinfección del campo operatorio, se realizó la incisión de 8 a 10cm, a 3 cm por delante de la ubre, en la línea alba, hasta entrar a cavidad abdominal, exteriorizar los ovarios y útero (Morrow et al., 1994; Pugh & Baird, 2012). - Se realizó el conteo y registro de los cuerpos lúteos (CL), se perfora el cuerno uterino con una aguja no traumática, se inserta la sonda Foley en la luz uterina, creando una corriente de arrastre con

38 ml de medio Bio-Life TM Advantage Embryo collection medium (Morrow et al., 1994), mediante técnica de la jeringa, el medio se inyectó con jeringa a través de la sonda Folley en cada cuerno y se recuperó el medio a través de la jeringuilla y el medio se colocó en un filtro Emcon (Phillips & Jahnke, 2016). - Una vez terminado el lavado de los cuernos uterinos, se suturó los planos quirúrgicos, el plano muscular-aponeurótico con una sutura reabsorbible, y el cutáneo con una sutura no absorbible. Se administró un antibiótico de amplio espectro y larga acción, analgésico y un análogo de la prostaglandina F2α (Aisen, 2004; Gibbons & Cueto, 2013). Búsqueda y clasificación de embriones Se vertió el medio recuperado sobre una caja Petri de búsqueda (cuadriculada) de embriones con un aumento de 10X con el estereomicroscopio. Conforme fueron encontrados los embriones se aspiraron y se colocaron en una caja Petri con medio de mantenimiento Holding, para su clasificación convenida por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) (Tabla 2) con un aumento de 40X (Aisen, 2004; Phillips & Jahnke, 2016). ANÁLISIS ESTADÍSTICO Tamaño de la muestra Debido a que los animales utilizados en este estudio debían cumplir con criterios de inclusión para su selección, dejó una población pequeña. Para calcular la muestra se utilizó la siguiente ecuación (Jaramillo & Martínez, 2010). n= ( z^2 pq ) / d^2 n= [( 1.96 ) ^ 2 ( 0.5 ) ( 1-0.5)] /[(0.05)]^2 n=384 n= tamaño de la muestra 21

39 z= nivel de confianza 95%=1,96 p=probabilidad de que ocurra el evento q= 1-p, probabilidad que no ocurra el evento d= error estimado Debido a que el tamaño de la muestra es mayor a la población fue necesario realizar un ajuste de la muestra, utilizando la siguiente ecuación (Jaramillo & Martínez, 2010). na= n/(1+(n-1)/n) na=384/(1+(384-1)/16) na=15,42 na= tamaño de la muestra ajustado n= tamaño de la muestra N= total de individuos en la población Los resultados fueron registrados en los formularios respectivos, y digitalizados en hoja de cálculo Excel Los resultados del número de cuerpos lúteos observados mediante laparotomía, fueron evaluados estadísticamente mediante análisis de varianza simple. Debido a que los datos no presentaban distribución normal se realiza la transformación logarítmica de su logaritmo natural con el programa, PROGRAMA STATGRAPHICS Centurion XVI versión (32bits) considerando la variable dependiente, el número de cuerpos lúteos producido y variable independiente el tratamiento. Los resultados del número de embriones obtenidos mediante lavado uterino fueron evaluados estadísticamente mediante análisis de varianza simple con el programa, PROGRAMA STATGRAPHICS Centurion XVI versión (32bits) considerando la variable dependiente, el número de embriones viables y variable independiente el tratamiento. 22

40 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN El número de cuerpos lúteos obtenidos (Tabla 3) en el tratamiento 1 fue de 5,40 ±3,02 mientras que para el tratamiento 2 fue de 9,8±5,20 encontrándose una diferencia estadísticamente significativa (p 0,05) entre el promedio de cuerpos lúteos del T1 y el T2. Estos resultados confirman la hipótesis alternativa demostrando que los animales del T1 tienen diferente respuesta ovulatoria que los animales del T2. Tabla 3. Numero de cuerpos lúteos observados mediante laparotomía. Tratamiento n cuerpos lúteos Desviación estándar Análisis estadístico* Razón-F Valor-P T1 (1000 UI ecg) T2 (1500 UI ecg) 8 5,40 ±3,02 4,95 0, ,8 ±5,20 * Análisis de Varianza del logaritmo natural. : Promedio. 23

41 Los resultados obtenidos son similares a los reportados por Blanco et al., (2003) quienes obtuvieron 6,2±0,8 con una dosis de 1200 UI de ecg y 11±3,0 cuerpos lúteos con una dosis de 1600 UI de ecg, encontrando una diferencia significativa entre los tratamientos. También estos resultados coinciden con los obtenidos por Azawi et al., (2011) los mismos que obtuvieron 7,33±0,54 cuerpos lúteos utilizando una dosis de 1200 UI de ecg. Según Donaldson (1982) citado por Liu et al. (2007) un factor determinante en la respuesta al tratamiento superovulatorio además de la dosis administrada de ecg son las características intrínsecas de cada individuo sus estudios muestran que solamente el 68% de las hembras respondieron al tratamiento y el 32% restante no tuvo respuesta a la estimulación, por consiguiente siempre se debe tener presente que un porcentaje de hembras no responderá al tratamiento hormonal de ovulación múltiple. En el presente estudio en el T1 solamente 1 de las 8 ovejas tratadas no tuvo respuesta, representando un 12,5% de las ovejas que no respondieron al tratamiento a diferencia del T2 donde 8/8 ovejas respondieron a la estimulación, consiguiendo una respuesta del 100%. Los resultados obtenidos confirman lo mencionado por Bartlewski et al., (2016), donde indica que a pesar del extenso conocimiento de la fisiología ovárica, particularmente de dinámica folicular y su supuesta relación con el resultado superovulatorio, ha proporcionado valiosas pautas e indicios para predecir la respuesta superovulatoria anticipada de las ovejas donantes. Sin embargo, al existir una continua falta de consistencia en los rendimientos superovulatorios entre diversos estudios, sugiere que es necesario cambiar y ampliar la orientación de los estudios, más allá de modificaciones en protocolos de estimulación ovárica, sino enfocarse ahora en la evaluación de aspectos relacionados con la condición gonadal, tales como: la medición de las concentraciones séricas de hormonas ováricas (inhibina A, estrógeno, FSH y LH endógena), evaluar la presencia y número 24

42 de estructuras ováricas (folículos y CL), además el flujo sanguíneo en el tracto reproductivo. La caracterización de perfiles hormonales podría enfocarse a establecer dichos perfiles en base a características específicas como: razas (prolíficas y no prolíficas), edad, historia reproductiva (nulíparas, multíparas), regiones geográficas y temporadas, incluso para diferentes tipos de progestágenos usados en la sincronización del estro. Factores hemodinámicos podrían tener una interacción en la salud folicular y la calidad del ovocito que a través de ecografía Doppler permitiría establecer una relación individual en la respuesta ovulatoria (Bartlewski et al., 2015, 2016). Otro de los factores que puede dar una variación en la respuesta individual a la estimulación hormonal según Bruno-Galarraga et al. (2015) está el estado fisiológico del ovario y por el número de folículos al iniciar el tratamiento hormonal. Lo cual es corroborado por González-Bulnes et. al., (2000, 2002) citado por (Mossa, Duffy, Naitana, Lonergan, & Evans, 2007); demostrando que en su estudio los animales con el mayor número de folículos ( 8) con un diámetro 2 mm denominado grupo alto al iniciar la superovulación produjeron más cuerpos lúteos (P <0,05) con relación a los que presentaban menos folículos (<7) denominado grupo bajo al inicio de la superovulación. Además el número de embriones totales, y de buena calidad fue mayor en el grupo alto pero sin existir una diferencia estadísticamente significativa en cuanto a dicha calidad, y tampoco se vio afectada la tasa de recuperación embrionaria. La variabilidad en el número de folículos es aún desconocida, pero podría estar influenciada por factores intrínsecos como el número de folículos primordiales al nacer (Erickson, 1966), mecanismos genéticos (Spearow & Bradfoed, 1983), niveles hormonales o por factores externos como nutrición (Lucy et al., 1991) condiciones ambientales (Kafi & McGowan, 1997) citado por (Mossa et al., 2007) 25

43 En cuanto al número de folículos al inicio del tratamiento superovulatorio Bartlewski et al. (2016) establece que no se relaciona con la respuesta ovulatorias, pero establece una relación entre el número de folículos de tamaño mediano es decir 4 mm de diámetro detectados 12 horas después de la primera inyección de pfsh con el número CL y embriones viables después de la superovulación. Puesto que a pesar de la existencia de los receptores de gonadotropina sólo una parte de folículos podría utilizar FSH exógena para el crecimiento que culminara en la ovulación y posterior formación del CL. Según varios autores mencionan que la dominancia folicular tiene un efecto perjudicial sobre el resultado superovulatorio en ovejas, disminuyendo el número de ovulaciones, viabilidad y recuperación embrionaria, asociando la presencia de un folículo dominante con disminución en la tasa de ovulación y recuperación embrionaria (Bartlewski et al., 2016). Tabla 4. Embriones obtenidos mediante lavado uterino, y clasificación a través del esteromicroscopio. Análisis Tratamiento n embriones obtenidos por oveja EV (%) ENV (%) estadístico*. Razón- Valor-P F T1 (1000 UI ecg) T2 (1500 UI ecg) 8 0,63±1,41 5/5 (100) 0 (0) 17/19 2/19 8 2,13±2,30 (89,47) (10,53) : Promedio. *Análisis de varianza. EV: Embriones viables. ENV: Embriones no viables 26

44 El promedio de embriones viables obtenidos (Tabla 4) en el tratamiento 1 fue 0,63±1,41 embriones por donadora. En el tratamiento 2 el número de embriones viables fue 2,13±2,3. Lo que indica que no hay diferencia estadísticamente significativa (p 0,05) entre los embriones viables del T1 y el T2. Para el T1 con un promedio de 0,63±1,41 embriones obtenidos por oveja es inferior frente al promedio reportado por Blanco et. al (2003) donde obtuvo un promedio de 1,0±0,5 embriones por oveja. y para el T2 el resultado 2,13±2,3 embriones obtenidos por oveja es superior frente a 1,2±0,6 embriones por oveja reportado por Blanco et. al (2003) a pesar de tener una dosis menor para la estimulación. Los 0,63±1,41 embriones recuperados por donadora son diferentes a los reportados por Azawi et al., (2011) en cuyo estudio se recuperaron 4,32±0,56 embriones a una dosis de 1200UI de ecg Los estudios anteriores (Jabbour y Evans, 1991, Mahmood et al., 1991, Chagas e Silva et al., 2003) demostraron que una dosis alta de ecg puede causar el desarrollo de folículos anovulatorios probablemente debido a la larga vida media de esta hormona. Dichos folículos con una alta producción hormonal podrían producir elevadas concentraciones de estradiol (Jabbour y Evans, 1991), afectando el medio uterino interfiriendo con el transporte de óvulos al momento de la captura de óvulos por las fimbrias (Murray et al., 1994) y espermatozoides a través del tracto genital femenino (Evans y Armstrong, 1984) afectando la recuperación de embriones citado por (Blanco et al., 2003; Simonetti et al., 2008). En estudios que comparan tratamiento superovulatorios utilizando pfsh y ecg, coinciden que la pfsh produjo mayor numero de embriones viables y mejor desarrollados, en comparación con la ecg. Posiblemente porque la pfsh, al ser una glucoproteina natural, con menor vida media que es captada y metabolizada más fácil y eficientemente (Blanco et al., 2003; Garzón, Urrego, & Giraldo, 2007). 27

45 Bartlewski et al. (2016) reporto que folículos 4 mm de diámetro el día de la remoción de la EIV se asoció con una aparición temprana de estro y aumento de la LH circulante y una mayor tasa de ovulación. Sin embargo, la tasa de recuperación de embriones disminuyó significativamente en ovejas con picos de LH preovulatorios tempranos, por consiguiente bajas en la recuperación de embriones que pueden anular el número de ovulaciones en ovejas con un alto número de pequeños folículos presentes al inicio de la estimulación hormonal, a pesar de ello no es clara la relación que existe por lo que sugiere más estudios para aclarar dichas relaciones en ovejas. Existen factores antes mencionados los que en conjunto van a inferir y modificar la respuesta ovulatoria y la recuperación embrionaria, para lo cual sería necesario evaluar más aspectos como perfiles hormonales que deben ser evaluados durante todo el tratamiento hasta la recuperación embrionaria, además características y cambios en los ovarios antes, durante y después de la estimulación hormonal, que podrían tomarse en cuenta para futuros estudios. En cuanto al análisis de los costos parciales de producción de los embriones en este estudio (Tabla 5) se determinó que en el T1 que incluye 8 donadoras es de 739,68 dólares y de 795,28 dólares en el T2, dividido para el número de embriones viables obtenidos por tratamiento en T1: 5 embriones viables, da un costo parcial de 147,94 dólares por embrión viable y en el T2: se obtuvo 17 embriones, dando un costo parcial de 46,78 dólares por embrión viable. 28

46 Tabla 5. Costos parciales de producción de embriones ovinos por tratamiento y por donadora. T1 T2 Ovejas Tratadas 8 8 Costo de sincronización y 36,11 43,06 superovulación $ (por donadora) Costo de Inseminación Artificial 2 2 $ (por donadora) Costo de lavado y recolección de 54,66 54,66 embriones $ (por donadora) Costo total $ (por donadora) 92,77 99,57 Costo por tratamiento 742,15 796,55 Embriones Viables 5 17 Costo parcial por embrión 148,43 46,86 El costo parcial de la superovulación (Tabla 5) en el T1 que incluye 8 donadoras es de 739,68 dólares y de 795,28 dólares en el T2, dividido para el número de embriones viables obtenidos por tratamiento en T1: 5 embriones viables, da un costo parcial de 147,94 dólares por embrión viable y en el T2: se obtuvo 17 embriones, dando un costo parcial de 46,78 dólares por embrión viable. Estos valores nos indican que con la aplicación del T2 es posible obtener mayor número de embriones por lo tanto disminuyendo los costos parciales de producción, permitiéndonos obtener mayor rentabilidad en una producción comercial. 29

47 CAPÍTULO V CONCLUSIONES - El número de cuerpos lúteos obtenidos 9,8±5,20 en el tratamiento 2 con 1500 UI de ecg mostro una mejor respuesta ovulatoria que el tratamiento 1 con 1000 UI ecg donde se obtuvo 5,40±3,02 cuerpos lúteos. - El número de embriones obtenidos en el tratamiento 1 (0,63±1,41) con 1000 UI de ecg fue menor que el número de embriones obtenidos en el tratamiento 2 (2,13±2,30) con 1500UI de ecg. Sin embargo no hay diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos. - El costo parcial de producción por embrión viable con el tratamiento 1 de 1000 UI de ecg fue 148,43 dólares, y el costo parcial por embrión viable y en el tratamiento 2 con 1500 UI de ecg fue 46,86 dólares, demostrando que el tratamiento 2 produce embriones con menor costo parcial. 30

48 BIBLIOGRAFÍA Abecia, A., & Forcada, F. (2010). Manejo reproductivo en ganado ovino (Primera). Zaragosa: Servet. Abecia, A., Forcada, F., & González-Bulnes, A. (2012). Hormonal control of reproduction in small ruminants. Animal Reproduction Science, 130(3 4), Aisen, E. (2004). Reproducción ovina y caprina (Primera). Buenos Aires. Azawi, O., & Al-Mola, M. (2011). A study on the effect of GnRH administration on the ovarian response and laparoscopic intrauterine insemination of Awassi ewes treated with ecg to induce superovulation. Tropical Animal Health and Production, 43(7), Barrett, D., Bartlewski, P., Batista-Arteaga, M., Symington, A., & Rawlings, N. (2004). Ultrasound and endocrine evaluation of the ovarian response to a single dose of 500 IU of ecg following a 12-day treatment with progestogen-releasing intravaginal sponges in the breeding and nonbreeding seasons in ewes. Theriogenology, 61(2 3), Bartlewski, P., Seaton, P., Emilia, M., Oliveira, F., Kridli, R., Murawski, M., & Schwarz, T. (2016). Intrinsic determinants and predictors of superovulatory yields in sheep: Circulating concentrations of reproductive hormones, ovarian status, and antral follicular blood flow. Theriogenology, Bartlewski, P., Seaton, P., Szpila, P., Oliveira, M., Murawski, M., Schwarz, T., Zieba, D. (2015). Comparison of the effects of pretreatment 31

49 with Veramix sponge ( medroxyprogesterone acetate ) or CIDR ( natural progesterone ) in combination with an injection of estradiol- 17β on ovarian activity, endocrine profiles, and embryo yields in cyclic ewes s. Theriogenology, 84(7), Bearden, J., Fuquay, J., & Willard, S. (2004). Applied Animal Reproduction (Sixth Edit). Upper Saddle River. Blanco, M. R., Simonetti, L., & Rivera, O. E. (2003). Embryo production and progesterone profiles in ewes superovulated with different hormonal treatments. Small Ruminant Research, 47(3), Busch, W., & Waberski, D. (2007). Manual de inseminación artificial de los animales domésticos y de explotación zootécnica. Zaragoza. Daza, A. (1997). Reproducción y sistemas de explotación del ganado ovino. Madrid. Durán, F. (2013). Inseminación y transferencia de Embriones en animales de granja. (Grupo Latino Editores, Ed.) (Primera). Evans, G., & Maxwell, W. (n.d.). Inseminación atificial de ovejas y cabras. Zaragoza. GAD. (2015). Plan de Desarrollo y Ordenamiento Territorial. Retrieved from _PDyOTGAD Parroquial Angochagua 2015_ _ pdf Galina, C. (2008). Reproducción de animales domésticos (Tercera). Mexico D.F: Editorial Limusa S.A. DE C.V. 32

50 Garzón, N., Urrego, R., & Giraldo, C. A. (2007). Algunos Factores Que Afectan Los Tratamientos De Superovulación En La Transferencia De Embriones Bovinos. Revista CES, 2(2), Retrieved from Gibbons, A., & Cueto, M. (2013). Transferencia de Embriones en Ovinos (Segunda). Retrieved from s/01-transferencia_embriones.pdf Gordon, I. (2004). Reproductive Technologies in Farm Animal. Zaragoza. Hafez, E. & Hafez, B. (2002). Reproducción e Inseminación Artificial en animales. Séptima Edición.McGraw-Hill (Séptima Ed). México DF. Instituto Nacional Estadísticas y Censos. (2015). Compendio estadístico 2014 (Vol. 1). Retrieved from inec/bibliotecas/compendio/compendio- 2014/COMPENDIO_ESTADISTICO_2014.pdf Jaramillo, C., & Martínez, J. (2010). Epidemiología veterinaria. México DF. Morrow, C., Asher, G., Berg, D., Tervit, H., Pugh, P., McMillan, W., Bell, A. (1994). Embryo transfer in fallow Deer (Dama dama): Superovulation, embryo recovery and laparoscopic transfer of fresh and cryopreserved embryos. Theriogenology, 42, Mossa, F., Duffy, P., Naitana, S., Lonergan, P., & Evans, A. C. O. (2007). Association between numbers of ovarian follicles in the first follicle wave and superovulatory response in ewes, 100, Palma, G. (2001). Biotecnología de la reproducción (Primera). Argentina. 33

51 Phillips, P., & Jahnke, M. (2016). Embryo Transfer (Techniques, Donors, and Recipients). Veterinary Clinics of North America - Food Animal Practice, 32(2), Pugh, D., & Baird, A. (2012). Sheep and Goat Medicine (Second). Maryland Heights. Sanchez, J., Mejia, O., & Manzur, A. (2014). Programa de transferencia de tecnología en aplicación de técnicas asistidas para ovinos en el trópico. Idia XXI. Chiapas. Retrieved from s/01-transferencia_embriones.pdf Seekallu, S. V., Toosi, B. M., Duggavathi, R., Barrett, D. M. W., Davies, K. L., Waldner, C., & Rawlings, N. C. (2010). Ovarian antral follicular dynamics in sheep revisited: Comparison among estrous cycles with three or four follicular waves. Theriogenology, 73(5), Simonetti, L., Forcada, F., Rivera, O. E., Carou, N., Alberio, R. H., Abecia, J. A., & Palacin, I. (2008). Simplified superovulatory treatments in Corriedale ewes. Animal Reproduction Science, 104(2 4), Universidad Nacional Autónoma De México. (2008). Reproducción de ovejas y cabras (Primera). México D.F. 34

52 ANEXOS 35

53 ANEXO 1. REGISTRO DE PROTOCOLO DONADORAS N ID Donadora DIA 0 COLOCACION EIV DIA 5 CAMBIO EIV DIA 7 DIA 9 RETIRO EIV DETECCION CELO SERVICIO FECHA LAVADO Fecha Se ecg + PF2α Fecha GnRH Fecha Id macho

54 Elaboración: El autor 37

55 ANEXO 2. REGISTRO DE COLECTA DE EMBRIONES ID hembra:. ID macho:.. Izquierdo: Número de cuerpos lúteos por ovario Derecho: Embriones colectados Estadio de desarrollo Sin Fertilizar 2-4 células 8 células 16 células: Mórula temprana Mórula Blastocisto temprano Blastocisto Blastocisto expandido Blastocisto eclosionado TOTAL EMBRIONES: TOTAL OVOCITOS SIN FERTILIZAR Elaboración: El autor Calidad

56 ANEXO 3. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO 1 COSTO PARCIAL DE PRODUCCION TRATAMIENTO 1 COSTO DE SINCRONIZACION Y SUPEROVULACIÓN valor presentación dosis Valor unitario ITEM frasco ($) (ml/uni) (ml/uni) ($) Seleben E 14,50 100,00 2,00 0,29 Chronogest CR 1era 150,00 25,00 1,00 6,00 Chronogest CR 2da 150,00 25,00 1,00 6,00 Gel Lubricante 5,00 30,00 3,00 0,50 Guantes Manejo 8,00 100,00 6,00 0,48 Folligon 13,90 5,00 5,00 13,90 Lutalyse 31,50 30,00 2,00 2,10 Conceptal 27,70 10,00 2,00 5,54 Jeringuillas 0,13 1,00 10,00 1,30 SUBTOTAL 36,11 COSTO DE INSEMINACION ARTIFICIAL Frasco colector de semen 0,50 1,00 1,00 0,50 Catéter de Inseminación 1,50 1,00 1,00 1,50 SUBTOTAL 2,00 COSTO DE LAVADO Y RECOLECCION DE EMBRIONES Xilacina 20,00 30,00 1,00 0,67 Ketamina 25,00 30,00 0,30 0,25 Jeringuillas 0,13 1,00 5,00 0,65 Hoja de Bisturí 12,00 100,00 1,00 0,12 Lidocaína 3,50 50,00 6,00 0,42 Campo operatorio 1,20 1,00 1,00 1,20 Gasas estériles 8,00 100,00 3,00 0,24 Guantes Quirúrgicos 0,50 1,00 2,00 1,00 39

57 Sutura Reabsorbible 36,00 12,00 1,00 3,00 Sonda Foley 4,50 1,00 1,00 4,50 Filtro Emcon 21,66 1,00 1,00 21,66 Jeringuillas baja citotoxicidad 30,00 100,00 1,00 0,30 Medio de lavado 55, ,00 50,00 2,75 Puntas para pipeta 28,50 96,00 2,00 0,59 placa petri para búsqueda 22,00 10,00 1,00 2,20 Placa petri lavado 12,00 10,00 1,00 1,20 Holding 62,70 50,00 0,30 0,38 Pajillas 48,00 50,00 6,00 5,76 Etilenglicol 54,72 50,00 1,50 1,64 Antibiótico 25,00 100,00 5,00 1,25 Estrumate 48,80 20,00 2,00 4,88 SUBTOTAL 54,66 COSTO PARCIAL POR DONADORA 92,77 COSTO PARCIAL POR TRATAMIENTO 742,15 40

58 ANEXO 4. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO 2 COSTO PARCIAL DE PRODUCCION TRATAMIENTO 2 COSTO DE SINCRONIZACION Y SUPEROVULACIÓN valor presentación dosis Valor ITEM frasco ($) (ml/uni) (ml/uni) unitario ($) Seleben E 14,50 100,00 2,00 0,29 esponja 1 150,00 25,00 1,00 6,00 esponja 2 150,00 25,00 1,00 6,00 Gel Lubricante 5,00 30,00 3,00 0,50 Guantes Manejo 8,00 100,00 6,00 0,48 Folligon 13,90 5,00 7,50 20,85 Lutalyse 31,50 30,00 2,00 2,10 Conceptal 27,70 10,00 2,00 5,54 Jeringuillas 0,13 1,00 10,00 1,30 SUBTOTAL 43,06 COSTO DE INSEMINACION ARTIFICIAL Frasco colector de semen 0,50 1,00 1,00 0,50 Catéter de Inseminación 1,50 1,00 1,00 1,50 SUBTOTAL 2,00 COSTO DE LAVADO Y RECOLECCION DE EMBRIONES Xilacina 20,00 30,00 1,00 0,67 Ketamina 25,00 30,00 0,30 0,25 Jeringuillas 0,13 1,00 5,00 0,65 Hoja de Bisturí 12,00 100,00 1,00 0,12 Lidocaína 3,50 50,00 6,00 0,42 Campo operatorio 1,20 1,00 1,00 1,20 Gasas estériles 8,00 100,00 3,00 0,24 Guantes Quirúrgicos 0,50 1,00 2,00 1,00 Sutura Reabsorbible 36,00 12,00 1,00 3,00 41

59 Sonda Foley 4,50 1,00 1,00 4,50 Filtro Emcon 21,66 1,00 1,00 21,66 Jeringuillas baja citotoxicidad 30,00 100,00 1,00 0,30 Medio de lavado 55, ,00 50,00 2,75 Puntas para pipeta 28,50 96,00 2,00 0,59 placa petri para búsqueda 22,00 10,00 1,00 2,20 Placa petri lavado 12,00 10,00 1,00 1,20 Holding 62,70 50,00 0,30 0,38 Pajillas 48,00 50,00 6,00 5,76 Etilenglicol 54,72 50,00 1,50 1,64 Antibiótico 25,00 100,00 5,00 1,25 Estrumate 48,80 20,00 2,00 4,88 SUBTOTAL 54,66 COSTO PARCIAL POR DONADORA 99,72 COSTO PARCIAL POR TRATAMIENTO 797,75 42

60 ANEXO 5. RESULTADOS ANALISIS DE LABORATORIO 43

61 44

62 45

63 46

64 ANEXO 6. FOTOGRAFÍAS Ovejas donadoras Aplicación de esponja intravaginal Hormona ecg Aplicación IM de hormona Ubicación del cérvix Inseminación Artificial 47

65 Colocación y sujeción de oveja Respuesta superovulatoria Respuesta superovulatoria Materiales para manejo de embriones Búsqueda de embriones Embriones recuperados 48