Revista de Investigación Universidad La Salle ISSN (Versión impresa): COLOMBIA

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1 Revista de Investigación Universidad La Salle ISSN (Versión impresa): COLOMBIA 2007 Ángela Cristina Zapata Lesmes / Víctor Manuel Acero Plazas / Andrés Ramírez Sanjuan / Felio Jesús Bello García SUSCEPTIBILIDAD DE UNA LÍNEA CELULAR DERIVADA DE AEDES AEGYPTI (DIPTERA: CULICIDAE) A LA INFECCIÓN CON LEISHMANIA PANAMENSIS, EN PRESENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Y FISICOQUÍMICOS Revista de Investigación, julio-diciembre, año/vol. 7, número 002 Universidad La Salle Bogotá, Colombia pp Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal Universidad Autónoma del Estado de México

2 Revista de Investigación, ISSN Vol. 7 (2): Julio - diciembre Susceptibilidad de una línea celular derivada de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) a la infección con Leishmania panamensis, en presencia de factores ambientales y fisicoquímicos 1 ÁNGELA CRISTINA ZAPATA LESMES*, VÍCTOR MANUEL ACERO PLAZAS*, ANDRÉS RAMÍREZ SANJUAN*, FELIO JESÚS BELLO GARCÍA** *Laboratorio de Entomología, Biología Celular y Genética, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad de La Salle, Bogotá DC, Colombia. **Laboratorio de Entomología Médica y Forense, Instituto de Ciencias Básicas, Universidad del Rosario, Bogotá DC, Colombia. El presente trabajo describe la infección in vitro de Leishmania (V) panamensis en cultivos celulares derivados de Aedes aegypti, teniendo en cuenta factores ambientales y fisicoquímicos. Los cultivos celulares fueron mantenidos en medio Grace/L-15, con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB). La cepa de L. panamensis (MHOM/CO/87CL412) se empleó en la infección de las células, combinando los siguientes factores ambientales y fisicoquímicos: ausencia y presencia de CO 2, ph del medio de cultivo (5,0; 5,5; 6,0; 6,8 y 7,2) y temperatura (26, 32 y 37 C). Las células fueron infectadas en cajas de cultivos de 24 pozos, con laminillas de 12mm de diámetro en su interior, las cuales se retiraron 1, 2 y 3 horas y 3, 6 y 9 días postinfección. El mayor porcentaje de infección se obtuvo con 5% de CO 2, 26 o C y a ph de 6,8; durante el día 6 postinfección, con un valor de 53% y un índice de infección de 111,3. El establecimiento de estas condiciones óptimas para el proceso infectivo permitió alcanzar niveles altos de infección, los cuales serán útiles en estudios básicos y aplicados, en la perspectiva de contribuir al control de la leishmaniosis tegumentaria ocasionada por estos parásitos. Palabras clave: Aedes aegypti, Leishmania panamensis, factores ambientales y fisicoquímicos, porcentaje e índice de infección. Susceptibility of a cell line derived from Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) to infection with Leishmania panamensis, in presence of physiochemical and environmental factors The present work describes the in vitro infection by Leishmania (V.) panamensis in cell cultures from Aedes aegyti, keeping in mind physicochemical and environmental factors. The medium used to maintain the cell cultures was Gracel/L-15, containing 10% Foetal Bovine Serum (FBS). The infection process was performed using Leishmania panamensis MHOM/CO/87CL412 strain. The physicochemical and environmental factors evaluated for the experimental tests of the cell infection were: presence and absence of CO 2, ph of the culture medium (5.0, 5.5, 6.0, 6.8 and 7.2) and temperature (26 o C, 32 o C and 37 o C). As substrate for the infected cells, glass coverslips of 12 mm diameter in 24 well plates were used. The coverslips with attached infected cells were removed after 1, 2, and 3 hours and 3, 6 and 9 days post-infection. The highest level of infection was 53% with an index of infection of These results were produced in the presence of the following factors: 5% of CO 2, 26 o C of temperature and to a ph of 6,8, during the day 6 post-infection. The establishment of the physicochemical and environmental optimum conditions in the process infective of the parasite for to interact with the cells of A. aegypti, permitted to reach relatively high levels of infection, which will be useful in basic studies and applied, in the perspective of to contribute in the control of the leishmaniosis tegumentaria that cause these parasites. Key words: Aedes aegypti, Leishmania panamensis, physicochemical and environmental factors, percentage and index of infection. 1 Investigación financiada por la Universidad de La Salle y la Universidad del Rosario Bogotá D.C. Colombia Correspondencia: czapata@lasalle.edu.co, fbello@urosario.edu.co Recibido: 26 de enero de Aceptado: 21 de agosto de

3 Células de Aedes aegypti infectadas con Leishmania panamensis. Zapata A, C. et al. INTRODUCCIÓN Una de las principales enfermedades endémicas en Colombia es la leishmaniosis, cuyos agentes etiológicos son parásitos del género Leishmania, los cuales presentan un ciclo de vida digenético, con dos estadios morfológica y antigénicamente diferentes: la flagelada, extracelular móvil (promastigote) que se desarrolla en el tracto digestivo del insecto vector y la otra inmóvil (amastigote), intracelular obligada, que se desarrolla y multiplica en los macrófagos de un hospedero vertebrado (Abdulrahman et al. 1998). En Colombia, la infección por Leishmania tiene una distribución endémica en casi todo el territorio nacional con excepción de San Andrés, Atlántico y Bogotá (Corredor et al. 1990). Los registros de casos de leishmaniosis durante los últimos años, muestran una tendencia ascendente en el número de pacientes notificados así, por ejemplo, para el año 2005 se reportaron casos de la enfermedad, de los cuales el 99,4% correspondieron a la forma cutánea, el 0,3% a la mucosa y el 0,3% restante a la visceral; estos datos incluyen a las fuerzas militares y representan un incremento de casos con respecto a los notificados en el 2004 (Saravia y Nicholls 2006). Los primeros estudios in vitro sobre el desarrollo del ciclo biológico de Leishmania se realizaron con promastigotes en medios axénicos, posteriormente se indujo diferenciación de promastigotes en amastigotes mediante variaciones de ph y temperatura en medios libres de células (Bates y Tetley 1993, Bates 1994). También, se ha logrado diferenciación, maduración y replicación in vitro de estos parásitos en cultivos celulares de macrófagos, principal célula hospedera durante el proceso de infección (Chang 1978, Pearson et al. 1981, Aikawa et al. 1982). De la misma manera, se ha demostrado la infección de otros tipos de células como fibroblastos, epiteliales, neutrófilos y dendríticas con parásitos del género Leishmania (Mattock y Petters 1975, Dedet et al. 1983, Schwartzman y Pearson 1985, Corte-Real et al. 1995, Hervás Rodriguez 1996, Pessotti et al. 2004). A pesar de los estudios realizados sobre el desarrollo del ciclo biológico de Leishmania en diferentes líneas celulares y cultivos axénicos, son excepcionales los reportes acerca de la interacción, maduración y multiplicación de estos patógenos en cultivos celulares de mosquitos. Recientemente, se ha podido demostrar que los cultivos celulares de Lutzomyia longipalpis y L. spinicrassa son susceptibles a la infección con Leishmania infantum (Moraes-Silva et al. 2006) y L. braziliensis respectivamente (Bello et al. 2005, Zapata et al. 2005, Miranda et al. 2005, Acero et al. 2006), al lograrse el desarrollo del ciclo biológico de los patógenos en estos sustratos celulares. Aunque los parásitos en los flebótomos vectores son extracelulares, en los estudios desarrollados alcanzaron la transformación de la forma promastigota a la amastigota en líneas celulares derivadas de estos insectos, permitiendo generar valiosos conocimientos que pueden ser útiles para develar importantes procesos de la interacción parásito-célula hospedera. El primer trabajo reportado en la literatura internacional especializada sobre la infección de Leishmania en cultivos celulares de mosquitos data de mucho años, en el cual Dedet y Odete (1977) desarrollaron el proceso infectivo en cultivos celulares derivados de A. albopictus con una especie de parásitos del Viejo Mundo, L. donovanni, obteniendo la transformación del ciclo biológico; sin embargo, este fue un trabajo preliminar que se publicó como una corta comunicación. Más recientemente, se estableció el proceso infectivo de L. infantum y L. braziliensis en cultivos celulares derivados de tejidos embrionarios de A. aegypti, insecto no vector en su ambiente natural de dichos parásitos, lográndose la conversión de las formas promastigotas a amastigotas en las células evaluadas (Muñoz et al. 2005). El objetivo principal del presente trabajo fue analizar la susceptibilidad de los cultivos celulares derivados de A. aegypti a la infección con el parásito L. panamenisis, en presencia de algunos factores ambientales y fisicoquímicos. MATERIALES Y MÉTODOS Mantenimiento de los cultivos celulares de A. aegypti, previo a la infección con L. panamensis. Los cultivos celulares de A. aegypti, en pases de 154

4 Revista de Investigación, Vol. 7 (2). Julio - diciembre a 80, se mantuvieron en frascos para cultivo celular de 25 cm 2, en presencia de una mezcla de medio Grace/L15 (Sigma ), suplementado con SFB al 10%, ajustado a un ph de 6,8 e incubados a una temperatura de 26 o C, los subcultivos se repicaron cada 10 días. El proceso de preparación, remoción y cambio del medio de mantenimiento, al igual que la infección de los cultivos celulares de A. aegypti con el parásito L. panamensis, se llevaron a cabo en condiciones de esterilidad en una cabina de flujo laminar vertical tipo II, marca HOLTEN, LaminAir HBB2436. Mantenimiento de la línea celular J774. La línea J774 (Ralph et al. 1975) derivada de ratón Balb/c hembra, con propiedad fagocítica, se mantuvo en el medio RPMI, suplementado con SFB inactivado al 7% y se incubó a una temperatura de 37 C. Las células J774 se emplearon como control de cada una de las infecciones. Tal como se hizo con las células de A. aegypti, se realizaron pases en frascos estériles mediante remoción mecánica, previa observación de una monocapa confluente del cultivo. También se llevó a cabo un control diario de los cultivos celulares. Finalmente, para la utilización de la línea celular J774 en los ensayos de infección, se seleccionaron aquellos cultivos que presentaron una monocapa semiconfluente. Parásitos. Se empleó la cepa MHOM/CO/87CL412 de L. panamensis suministrada por el laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud de Colombia, esta cepa se mantuvo en el medio NNN bifásico modificado con Schneider s, enriquecido con SFB inactivado al 10% e incubados a una temperatura de 26 C. La inoculación de los parásitos a las células se efectuó cuando la mayoría de éstos estuvieron en su estado metacíclico infectivo. Infección de L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti. Los experimentos de infección de las células de A. aegypti con el parásito L. panamensis, se efectuaron en el laboratorio de Biología Celular de la Universidad de La Salle, Departamento de Ciencias Básicas. En este proceso infectivo se tuvieron en cuenta los siguientes factores ambientales y fisicoquímicos: diferentes temperaturas de incubación (26, 32 y 37 C), presencia y ausencia de una atmósfera de CO 2 y diversos ph de los medios de cultivos (5,0; 5,5; 6,0 y 6,8). Las células de A. aegypti en una concentración de 2 X 10 5 células, se sembraron en cajas de 24 pozos de fondo plano para cultivos celular de 35 X 10mm a las cuales se les colocaron laminillas estériles de 12 mm de diámetro, marca Fisher Scientific, en el fondo de cada pozo. Después de 24 horas de adaptación, adherencia y crecimiento celular se realizó la infección con promastigotes metacíclicos de L. panamensis en una proporción de 10 parásitos por célula. Luego, se incubaron los cultivos de A. aegypti a las temperaturas señaladas anteriormente, con y sin atmósfera de CO 2, y con medios de cultivos ajustados a los ph antes descritos. Réplicas exactas sin parásitos fueron incubadas al mismo tiempo como controles. Las células J774 se incubaron a 37 C. Al cabo de 1, 2 y 3 horas y a los 3, 6 y 9 días postinfección se retiraron las laminillas correspondientes, se lavaron con solución salina, se fijaron con metanol absoluto (Merck ), se colorearon con Giemsa (Merck ) al 10% y, por último, se realizó un montaje permanente con entellán (Merck ) en láminas portaobjetos. Posterior al montaje se hicieron observaciones en el microscopio de luz y se registraron los datos de la infección para determinar porcentaje e índice de infección, este último parámetro se calculó multiplicando el porcentaje de infección celular por el promedio de amastigotes/célula (Lonardoni et al. 2000). Análisis estadístico. Para establecer el efecto de la concentración de CO 2, la temperatura, el ph y el tiempo sobre el porcentaje de infección de células de A. aegypti con parásitos de L. panamensis se implementó un diseño de cuatro factores: atmósfera de CO 2, temperatura, ph y tiempo. El primer factor tuvo dos niveles: CO 2 0% y CO 2 5%; el segundo factor con 3 niveles: 26, 32 y 37 o C; el tercer factor con cinco niveles: ph 5,0; 5,5; 6,0; 6,8 y 7,2 y el cuarto factor con 6 niveles: 1, 2 y 3 horas, 3, 6 y 9 días. El efecto de los factores sobre el número de amastigotes por célula, el por- 155

5 Células de Aedes aegypti infectadas con Leishmania panamensis. Zapata A, C. et al. centaje de infección y el índice de infección se determinaron con un análisis de varianza. En el caso en que se encontraron diferencias por efecto de alguno de los factores o por interacción entre los factores se corrió una prueba de comparación múltiple de promedios de Tukey entre las interacciones, la cual permitió conformar los grupos homogéneos de promedios para cada una de las variables. RESULTADOS Figura 1. Células derivadas de A. aegypti infectadas con el parásito L. panamensis, se observan amastigotes (señalados con flechas) al interior de vacuolas parasitóforas. 1000X. El desarrollo del ciclo biológico del parásito se obtuvo a 26 o C, CO 2 al 5% y a ph de 6,8. En todos los experimentos, independientemente de los factores ambientales y fisicoquímicos que fueron evaluados, se observó infección del parásito L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti, lo cual se evidenció mediante la presencia de amastigotes en las vacuolas parasitóforas (Figura 1). Esta situación permitió inferir que previamente hubo internalización de los promastigotes, transformación a la forma amastigota y multiplicación intravacuolar. Sin embargo, los registros mayores de la infección del parásito en las células analizadas, representados en porcentaje de infección, índice de infección y número de amastigotes por célula; estuvieron en función de los factores evaluados. La Tabla 1, muestra los datos más representativos del porcentaje, índice de infección y número de amastigotes por célula, obtenidos en los cultivos de A. aegypti infectados con el parásito L. pana- mensis, en función de factores ambientales (presencia o ausencia de CO 2 y diferentes temperatura) y fisicoquímicos del medio de cultivo (ph). El más alto nivel de infección correspondió a 53% y a un índice de infección de 111,3. Estos resultados se produjeron en presencia de los siguientes factores: 5% de CO 2, 26 o C de temperatura y ph de 6,8, durante el día 6 postinfección (Figura 2a). Sin embargo, también hubo otros registros de infección relativamente altos, comparados con los anteriores, aunque con valores menores, los cuales se indican a continuación: porcentajes de infección de 45 y 44% con índices de infección de 72 y 57,2 respectivamente, obtenidos ambos en presencia de 5% de CO 2 y temperatura de 26 o C, pero, en su orden, con ph de 7,2 y 5. Los tiempos postinfección donde se dieron estos resultados fueron de 3 y 9 días, respectivamente. La infección de L. panamensis en las células J774, 156

6 Revista de Investigación, Vol. 7 (2). Julio - diciembre Tabla 1. Promedios representativos de los porcentajes de infección, índice de infección y razones amastigote/célula, obtenidos durante el proceso de infección del parásito L. panamensis en las líneas celulares de A. aegypti y J774 en presencia de variables ambientales y fisicoquímicas. Atmósfera Temperatura ph Tiempo CO 2 0% CO 2 5% 26 o C 32 o C 37 o C 26 o C 32 o C 37 o C Amastigotes /Célula Porcentaje de infección Índice de infección Media Media Media 5,0 3d 1,4± 0,2 23,0± 7,1 32,2± 4,2 5,5 3d 1,2± 0,1 32,0± 9,9 38,4± 9,2 6,0 3d 1,3± 0,3 33,0± 1,4 42,9± 12,7 6,8 3d 1,4± 0,3 38,0± 8,5 53,2± 24,0 7,2 3d 1,2± 0,2 31,0± 21,2 37,2± 29,7 5,0 3h 1,2± 0,1 34,5± 0,7 41,4± 2,8 5,5 3h 3,4± 1,9 41,0± 0,0 139,4± 0,0 6,0 3d 3,5± 2,3 2,6± 1,4 9,1± 0,0 6,8 6d 6,7± 2,3 13,0± 0,0 87,1± 0,0 7,2 3d 1,5± 0,3 40,0± 8,5 c 75,2± 27,6 5,0 1h 1,0± 0,0 23,0± 0,0 23,0± 0,0 5,5 3h 0,4± 0,7 4,0± 1,1 1,6± 0,0 6,0 1h 1,1± 0,1 10,0± 11,3 11,0± 12,7 6,8 1h 1,4± 0,4 14,0± 0,0 19,6± 7,8 7,2 2h 1,7± 0,3 8,0± 1,4 13,5± 5,0 5,0 9d 1,3± 0,1 44,0± 7,1 57,2± 12,7 5,5 3d 1,2± 0,1 32,0± 9,9 38,4± 13,4 6,0 6d 1,4± 0,3 38,0± 7,1 53,2± 20,5 6,8 6d 2,1± 0,1 53,0± 2,1 a 111,3± 2,8 7,2 3d 1,6± 0,1 45,0± 1,4 b 72,0± 7,8 5,0 9d 1,4± 0,0 25,5± 9,2 35,7± 13,4 5,5 6d 1,2± 0,1 14,5± 6,4 17,4± 9,2 6,0 6d 1,2± 0,0 28,5± 7,8 34,2± 9,9 6,8 6d 1,8± 0,1 40,0± 1,4 72,0± 2,1 7,2 6d 1,5± 0,1 39,5± 14,1 59,3± 19,1 5,0 3h 1,2± 0,2 7,5± 2,1 9,0± 1,4 5,5 3h 1,5± 0,5 6,0± 1,7 9,0± 0,0 6,0 3h 1,1± 0,1 15,5± 19,1 17,1± 22,6 6,8 3h 1,6± 0,8 12,0± 3,8 19,2± 0,0 Control J774 CO 2 0% 37 C 7,2 3h 2,7± 0,5 45,0± 11,3 121,5± 54,5 Control J774 CO 2 5% 37 C 7,2 2h 1,6± 0,5 26,0± 12,0 41,6± 33,9 tomadas como control positivo a la temperatura de 37 o C, en presencia y ausencia de CO 2 y a ph de 7,2, arrojó los resultados indicados en la parte inferior de la Tabla 1. El mayor porcentaje de infección (45%) se obtuvo sin atmósfera de CO 2 a las 3 horas postinfección. También, teniendo en cuenta las condiciones antes señaladas, se obtuvo el mayor índice de infección que fue de 121,5 y el más alto número de amastigotes por célula que correspondió a 2,7. La Figura 2b muestra la infección de L. panamensis en las células de A. aegypti, a una temperatura de 26 o C, en ausencia de una atmósfera de CO 2 a diferentes ph y tiempos postinfección. Se puede observar que el más alto porcentaje de infección (46,5%) se obtuvo el día 9 a un ph de 7,2. En general, la gráfica muestra una tendencia mayor de porcentajes de infección en los días 3 y 6 postinfección a ph 6,0 y 6,8. 157

7 Células de Aedes aegypti infectadas con Leishmania panamensis. Zapata A, C. et al Porcentaje de infección h 2h 3h Tiempo 3d 6d 9d ph 5.5 a Número de celulas infectadas h 2h 3h Tiempo 3d 6d 9d ph 5,5 5.0 b Figura 2. a. Porcentajes de infección de L. panamensis, en los sustratos celulares de A. aegypti, teniendo en cuenta los siguientes factores ambientales y físicoquímicos: 26 o C, 5% de CO 2, 4 diferentes niveles de ph y 6 diversos días de evaluación post-infección. b. Porcentajes de infección de L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti, obtenidos a 26 o C, 0% de CO 2, a diferentes ph y días post-infección. Los porcentajes de infección a 32 o C, en ausencia de una atmósfera de CO 2, a diferentes tiempos postinfección y expuestos a 5 distintos valores de ph, se muestran en la Figura 3a. Los niveles más altos en porcentajes de infección se obtuvieron a ph de 6,8, durante los tiempos de exposición a los parásitos de 3 horas (42%) y 3 días (44%). Se puede observar que en el día 9 postinfección sólo se registraron datos del proceso infectivo a un ph de 6,8, aunque la cantidad de las células evaluadas fue extremadamente reducida. En la Figura 3b se muestran los resultados del porcentaje de infección a 32 o C, 5% de CO 2 y a diferentes ph. Los mayores valores se registran a los 3 y 6 días postinfección a ph de 6,8 y 7,2. A 37 o C sólo hubo infección a las 3 horas postinfección (Tabla 1), debido a que las células se desprendieron de la monocapa Porcentaje de infección Porcentaje de infección h 2h 3h Tiempo 3d 6d 9d ph a h 2h 3h Tiempo 3d 6d 9d ph b Figura 3. a. Porcentajes de infección de L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti, obtenidos a 32 o C, 0% de CO 2, a diferentes ph y días post-infección. b. Porcentajes de infección de L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti, obtenidos a 32 o C, 5% de CO 2, a diferentes ph y días post-infección. 158

8 Revista de Investigación, Vol. 7 (2). Julio - diciembre El nivel más alto en el número promedio de amastigotes por célula, obtenido a partir de la infección del parásito L. panamenis en los cultivos celulares derivados de A. aegypti, correspondió a un valor de 6,7 (Tabla 1). El proceso infectivo se dio a 32 C, 0% de CO 2, a ph de 6,8 y en el día 6 postinfección. DISCUSIÓN Como característica común, registrada en los resultados de la infectividad del parásito L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti, se observó la transformación del ciclo biológico del patógeno, al diferenciarse la forma promastigota en amastigota al interior de la vacuola parasitófora en el citoplasma de los sustratos celulares analizados. Esta situación demuestra que algunas células receptoras tuvieron un relevante comportamiento fagocítico, de manera similar a lo ocurrido en esta misma línea celular al interactuar con las especies L. infantum y L. braziliensis (Muñoz et al. 2005). No obstante, el mecanismo molecular de los sistemas ligando-receptor a nivel de los procesos infectivos de los parásitos del género Leishmania con células derivadas del mosquito A. aegypti es desconocido. Una vez se haya dilucidado el proceso anterior, resultará interesante comparar este fenómeno in vitro de interacción molecular de los parásitos con el proceso de infección que tiene lugar en células derivadas de flebótomos vectores, pero mediando, al mismo tiempo, una previa definición de los aspectos inmunológicos y bioquímicos en la especificidad de la interacción parásito-célula hospedera, en concordancia con los resultados preliminares obtenidos por Fampa et al. 2003, Bello et al. 2005, Zapata et al. 2005, Miranda et al y Acero et al Un análisis de los registros cuantitativos de los porcentajes de infección, índice de infección y número de amastigotes por célula, en el proceso de susceptibilidad de L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti, teniendo en cuenta factores de temperatura, atmósfera de CO 2 y ph de los medios de cultivo; indica que en todas las combinaciones experimentales hubo infección, la cual se expresó con una mayor o menor intensidad en los datos evaluados. Una tendencia similar en la combinación de factores se obtuvo en el proceso de infección de L. infantum en la línea celular de L. longipalpis (Lulo), al determinar los autores (Miranda et al. 2005) que el mayor porcentaje de infección (33,3%) se alcanzó al 5% de SFB, a ph de 6,8, osmolalidad de 320 mosm/kg y a una temperatura de incubación de 26 C, sin atmósfera de CO 2. Aunque en el presente trabajo no se evaluaron los factores de osmolalidad y concentración de SFB, se puede notar que en la relación de algunos factores ambientales y fisicoquímicos óptimos hubo coincidencia, pero también se presentaron diferencias notables con el anterior trabajo, en razón a que los valores alcanzados en los porcentajes de infección de L. panamensis en los cultivos celulares de A. aegypti fueron relativamente más altos. En el trabajo previo de infección (Muñoz et al. 2005) de L. braziliensis y L. infantum en los cultivos celulares derivados de A. aegypti, se demostró la interacción, internalización y maduración in vitro de las dos especies del parásito en las células de este insecto no vector de Leishmania. Los resultados con valores mayores de porcentajes de infección correspondieron a 29,8% para L. braziliensis y de 12,5% para L. infantum, a temperatura de 26 C y sin atmósfera de CO 2. Una comparación de estos valores con los máximos obtenidos en la presente investigación, sobre porcentaje de infección, demostró que L. panamensis en las mismas células alcanzó promedios mayores. Esta situación podría explicarse en razón a varios factores: a) las características propias de cada una de las especies de Leishmania, en cuanto a las moléculas de adhesión con las células, particularmente sobre el polimorfismo de LPG, probablemente produjo ventajas adaptativas a L. panamensis al interactuar con los sustratos celulares seleccionados; b) los niveles de infectividad, concretamente en la fase metacíclica del parásito, serían mayores en intensidad y en número en esta última especie que en L. braziliensis y L. infantum, propiciando los resultados ya conocidos; c) las condiciones ambientales y fisicoquímicas de 5% de CO 2, 26 o C de tempera- 159

9 Células de Aedes aegypti infectadas con Leishmania panamensis. Zapata A, C. et al. tura y ph de 6,8, durante el día 6 postinfección, resultaron ser las más óptimas para L. panamensis en alcanzar la máxima expresión de su infectividad, situación que probablemente no tuvieron las otras especies de Leishmania en el proceso de interacción con las células derivadas de A. aegypti y d) una combinación de todos los factores analizados anteriormente o una combinación parcial de ellos, no se descarta como posible causa de dichos resultados. A temperatura de 37 C y en presencia de los demás factores, durante el proceso infectivo de L. panamenis en los cultivos de A. aegypti, sólo se registraron valores de infección en las 3 primeras horas de exposición de las células al parásito, debido a que en los otros tiempos postinfección las células no fueron viables y se desprendieron de la monocapa. Lo anterior demuestra que estos cultivos celulares no se adaptaron a temperaturas extremas al interactuar con los parásitos. Contrariamente, en un trabajo de interacción de L. infantum con la línea celular Lulo (Acero et al. 2006), se registraron significativos porcentajes de infección a esta temperatura, lo cual indica que las células derivadas de L. longipalpis son menos termolábiles que las del presenté trabajo, obtenidas de tejidos embrionarios de mosquitos. La infección de la línea celular J774 confirmó que los parásitos de la especie L. panamensis utilizados en el estudio se encontraban en la etapa metaciclíca infectiva. Sin embargo, se notó en dichos resultados que el mayor porcentaje de infectividad en estos cultivos ocurrió en las 3 primeras horas de exposición a los parásitos, contrario a la tendencia observada en la línea celular derivada de A. aegypti donde los valores máximos de porcentajes e índices de infección se registraron a los días 3 y 6 postinfección. Es importante señalar, también, que los valores mayores de infectividad se obtuvieron en los cultivos celulares de A. aegypti, comparados con los datos registrados en las células J774, el control positivo, rompiendo de esta manera con la tendencia observada en anteriores trabajos de infección de los parásitos del género Leishmania en cultivos celulares de insectos, donde los datos obtenidos mostraron valores menores (Bello et al. 2005, Zapata et al. 2005, Miranda et al. 2005, Muñoz et al. 2005, Acero et al. 2006). Los altos niveles de infección registrados en el presente trabajo, teniendo en cuenta los factores ambientales y fisicoquímicos seleccionados, serán útiles para desarrollar estudios aplicados del ciclo biológico de L. panamensis en cultivos celulares derivados de A. aegypti, en la perspectiva de contribuir al control de la enfermedad que ocasionan. En conclusión, se analizaron el porcentaje e índice de infección y el número de amastigotes por célula del parásito L. panamensis en cultivos celulares derivados de A. aegypti, teniendo en cuenta algunos factores ambientales y fisicoquímicos, en donde la interacción in vitro, evidenció la presencia de amastigotes en las vacuolas parasitóforas. A diferencia de trabajos previos de infección de Leishmania en cultivos celulares de insectos, el control positivo (células J774) registró valores menores de infección comparado con los obtenidos en el presente trabajo, donde se obtuvo el más alto porcentaje con 5% de CO 2, 26 o C de temperatura y a ph de 6,8, durante el día 6 postinfección, constituyéndose estas combinaciones de factores ambientales y fisicoquímicos en las más eficientes durante el proceso de infección. A 37 C de temperatura y en presencia de los otros factores ambientales y fisicoquímicos, sólo hubo registros de infección en las primeras horas, en razón a que las células de A. aegypti se desprendieron de la monocapa. Finalmente, se validó un nuevo modelo celular in vitro, derivado de tejido embrionarios de A. aegypti, como alternativo para el estudio del ciclo biológico de L. panamensis, bajo los factores señalados, en la perspectiva de ser utilizado en actividades de diagnóstico e investigación biomédica. AGRADECIMIENTOS A la Universidad de La Salle y a la Universidad del Rosario por la financiación de esta investigación. A la doctora Martha Stella Ayala Sotelo, investigadora del Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud, por la colaboración brindada en el suministro de la cepa MHOM/ CO/87CL412 de L. panamensis. Al profesor Alberto Díaz, por su colaboración en la asesoría como estadístico. 160

10 Revista de Investigación, Vol. 7 (2). Julio - diciembre BIBLIOGRAFÍA Abdulrahman YI, Garmson JC, Molyneux DH and Bates PA Transformation, development, and transmission of axenically cultured amastigotes of Leishmania mexicana in vitro and in Lutzomyia longipalpis. Am J Trop Med Hyg 59: Acero V, Galeano E, Ayala MS, Castellanos J, Bello FJ Interacción de Leishmania (l.) chagasi con la línea celular Lulo en diferentes condiciones ambientales. Rev Col Entomol 32: Aikawa M, Hendricks LD, Ito Y, Jagusiak M Interaction between macrophage like cells and Leishmania braziliensis in vitro. Am J Pathol 108: Bates PA, Tetley L Leishmania mexicana: induction of metacyclogenesis by cultivation of promastigotes at acidic ph. Exp Parasitol 76: Bates PA Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitology 108: 1-9. Bello FJ, Mejía AJ, Corena M, Ayala MS, Sarmiento L, Zuñiga C, Palau M Experimental infection of Leishmania (L) chagasi in a cell line derived from Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). Mem Inst Oswaldo Cruz (100): Chang KP Leishmania infection of human fibroblasts in vitro: absence of phagolysosomal fusion after induced phagocytosis of promastigotes, and their intracellular transformation. Am J Trop Med Hyg 27: Corredor A, Kreutzer RD, Tesh RB, Boshell J, Palau MT, Caceres E, Duque S, Pelaez D, Rodriguez G, Nicholls S, Hernández CA, Morales A, Young DG, Ferro C Distribution and etiology of leishmaniasis in Colombia. Am J Trop Med Hyg 42: Corte-Real S, Santos CB, Meirellses MNL Differential expression of the plasma membrane Mg 2+ ATPase and Ca 2+ ATPase activity during adhesion and interiorization of Leishmania amazonensis in fibroblasts in vitro. J Submicros Cytol Parasitol Pathol 27: Dedet JP, Odette GG Leishmania donovani multiplication in a Cell Line of Aedes albopictus. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 70 (5-6): Dedet JP, Ryter A, Vogt E, Hosu P, Pereira Da Silva L Uptake and killing of Leishmania mexicana amazonensis amastigotes by human skin fibroblasts. Ann Trop Med Parasitol 77: Fampa P, Correa Da Silva MS, Lima DC, Oliveira SM, Motta MC, Saraiva E Interaction of insect trypanosomatids with mosquitoes, sand fly and the respective insect cell lines. Int J Parasitol 33: Hérvas-Rodriguez J, Mozos E, Méndez A, Pérez J, Gómez-Villamandos JC The Leishmania infection of canine skin fibroblasts in vitro. Vet Pathol 33: Lonardoni MVC, Russo M, Jancar S Essential role of platelet-activating factor in control of Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect Immun 68: Mattock NM, Peters W The experimental chemotherapy of leishmaniasis. I: Techniques for the study of drug action in tissue culture. Ann Trop Med Parasitol 69: Miranda A, Serrano W, Ayala MS, Bello FJ Evaluación del proceso infectivo de Leishmania chagasi en la línea celular Lulo, con base en variables ambientales y físicoquímicas. Revista de Medicina Veterinaria 10: Moraes-Silva E, Antunes FR, Rodrigues MS, da Silva Julião F, Dias-Lima AG, Lemos-de-Sousa V, de Alcantara AC, Reis EA, Nakatani M, Badaro R, Reis MG, Pontes-de-Carvalho L, Franke CR Domestic swine in a visceral leishmaniasis endemic area produce antibodies against multiple Leishmania infantum antigens but apparently resist to L. infantum infection. Acta Trop 98:

11 Células de Aedes aegypti infectadas con Leishmania panamensis. Zapata A, C. et al. Muñoz-Camargo C, Barreto A, Bello FJ Análisis de la susceptibilidad de una línea celular de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) a la infección con Leishmania (L) chagasi y Leishmania (V) braziliensis. Revista Ciencias de la Salud 3 (2): Pearson RD, Romito R, Symes PH, Harcus JL Interaction of Leishmania donovani promastigotes with human monocite-derived macrophages: parasite entry, intracellular survival, and multiplication. Infect Immun 32: Pessotti JH, Zaverucha Do Valle T, Corte-Real S, Goncalves Da Costa SC Interaction of Leishmania (L) chagasi with the Vero cell line. Parasite 11: Ralph P, Richard J, Cohn M Reticulum cell sarcoma: an effector cell in antibody-dependent cell-mediated immunity. J Immunol 114: Saravia N, Nicholls R Leishmaniasis: un reto para la salud pública que exige concertación de voluntades y esfuerzos. Biomédica 26: 7-9. Schwartzman JD, Pearson RD The interactions of Leishmania donovani promastigotes and human fibroblasts in vitro. Am J Trop Med Hyg 34: Zapata AC, Cárdenas E, Bello FJ Characterization of cell cultures derived from Lutzomyia spinicrassa (Diptera: Psychodidae) and their susceptibility to infection with Leishmania (Viannia) braziliensis. Med Sci Monit 11: