Participación de la anandamida en la interacción espermatozoide oviducto en mamíferos.

Transcripción

1 Participación de la anandamida en la interacción espermatozoide oviducto en mamíferos. Silvina Perez Martinez- Laboratorio de Fisiología de las Gametas CEFYBO (CONICET_UBA( CONICET_UBA) Octubre 2007

2 Que necesita un espermatozoide (ESP) para fertilizar a un ovocito? MADURACIÓN CAPACITACIÓN Epidídimo Tracto reproductor de la hembra

3 Proceso de Fertilización

4 Fertilización

5 Tránsito de los ESP a través del tracto de la hembra

6 Tránsito de los ESP a través del tracto de la hembra Los ESP están sujetos a stress físico durante la eyaculación y contracciones del tracto reproductor de la hembra y pueden sufrir daños oxidativos. Existen distintas estrategias para eludir al sistema inmune en las diferentes especies de mamíferos Millones de ESP son inseminados durante la cópula en mamíferos, solamente unos pocos alcanzan las Trompas de Fallopio u oviducto y UNO solo es el que fertiliza a un ovocito

7 Transporte de los ESP a través del oviducto-fertilización

8 Interacción espermatozoides-oviducto oviducto Para que el espermatozoide (ESP) pueda fertilizar al ovocito es e necesario que haya atravesado una serie de eventos dentro del tracto reproductor de la hembra que le otorguen la capacidad fertilizante. te. En la mayoría de las especies de mamíferos, los ovocitos son fertilizados en las horas cercanas a la ovulación En algunas especies, los espermatozoides (ESP) inseminados esperan eran días (equinos, ganado y cerdo) o meses (murciélagos) la llegada del ovocito. En humanos, hay evidencias de que puede haber fertilización aún cuando la cópula ocurrió 5 días antes de la ovulación (Wilcox( 1995). La adhesión de los espermatozoides a las Trompas de Fallopio u oviducto es beneficiosa para aumentar su vida media y seleccionar aquellos con alta calidad. El oviducto es un sitio crítico para seleccionar a los espermatozoides no capacitados con acrosoma intacto, morfología superior y estructura normal de la cromatina

9 Interacción espermatozoides-oviducto

10 Oviducto: Reservorio de espermatozoides Se produce por la unión de los ESP al epitelio oviductal. Los ESP mótiles se unen a la superficie apical de las células oviductales El oviducto como sitio de almacenamiento de ESP tiene 3 funciones: 1. Previene la polispermia 2. Garantiza la fertilidad del ESP entre el comienzo del estro y la ovulación. 3. Regula los procesos de capacitación (cambios en membrana plasmática) e hiperactivación (cambios en la motilidad) del ESP.

11 Unión de los espermatozoides al epitelio oviductal La unión ESP-oviducto involucra reconocimiento de carbohidratos: Fetuin/ác ác. siálico: : el ESP posee moléculas tipo lectina que unen residuos de ácido siálico Fucoidan/fucosa fucosa: pretratamiento de oviducto con fucoidasa inhibe el pegado de los ESP al oviducto Bovinos: PDC-109 del ESP une fucosa oviducto y participa en pegado de ESP al Moléculas tipo selectinas también participan temporalmente en la unión ESP-oviducto (similar adhesión leucocitos al endotelio) La unión de los ESP al oviducto mantiene bajos niveles citoplasmáticos de Ca2+ comparado con los ESP que nadan libremente. Evita capacitación ión temprana.

12 Liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal No estaría afectada: Disminución del nº de sitios de unión entre células Destrucción enzimática Si estaría afectada: Cambios involucrados en la membrana plasmática del ESP; modificación ción o eliminación de moléculas (proteínas y colesterol) unidas a la cabeza del ESP que preparan al mismo para sufrir la reacción acrosomal y fertilización del ovocito. Cambios en la motilidad del ESP que proporciona una fuerza tal que q permite vencer la atracción entre células.

13 Liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal El epitelio oviductal podría liberar factores que alteran al ESP (ej: glicosaminoglicanos sulfatados Señales hormonales inducida por la ovulación Señales moleculares del folículo preovulatorio Señales moleculares provenientes del plasma seminal

14 Antecedentes Anandamida (AEA) AEA es un endocanabinoide lipídico y es el primer agonista endógeno para receptores cannabinoides que se descubrió La AEA se sintetiza en la mayoría de las células a demanda, por la hidrólisis del NAPE (precursor fosfolipídico de membrana). Una vez generada dentro de la célula, la AEA se libera al espacio intersticial, difunde o actúa en forma paracrina y/o autocrina. La liberación de AEA es rápidamente eliminada por la acción de la enzima FAAH ( hidrolasa de ácidos grasos) Este endocannabinoide ejerce sus efectos a través de la activación de receptores para cannabinoides específicos localizados en la superficie de las células.

15 Receptores que unen cannabinoides/endocannabinoides CB1 Ampliamente distribuido en SNC y órganos periféricos Agonistas:: AEA, MAEA, WIN55212 Antagonistas: SR141716, AM251 CB2 Ampliamente distribuido en sistema inmune y órganos periféricos Agonistas:: AEA, MAEA, 2-AG2 Antagonistas: SR144528, AM630 TRPV1 Pertenece a familia de receptores TRP: transient receptor channels Distribuido: SNC y periférico. Se activa por: capsaicina,, RTX, AEA, calor y ácido. antagonista: capsazepina

16 Regulación de AEA El efecto de la AEA depende : 1) la concentración en el espacio extracelular, 2) la incorporación a la célula a través de un transportador específico 3) la degradación intracelular por enzima FAAH La actividad de FAAH está regulada por: Esteroides sexuales Citoquinas y prostaglandinas

17 AEA en Reproducción Ovulación Secreción hormonas gonadotróficas AEA Desarrollo embrionario Fertilización Capacitación Reacción acrosomal Motilidad ESP

18 AEA en Reproducción Schuel 1987; Berdyshev 1999: los cannabinoides inhiben la fertilización en Erizo de Mar. Shuel 2002: los fluidos reproductivos humanos, tales como plasma seminal, fluido oviductal y fluido folicular, poseen AEA. Agonistas del receptor de AEA, tales como AM-365 y THC, inhiben tanto la motilidad del espermatozoide, la reacción acrosomal y la unión a hemizonas humanas. Rossato 2005 y Maccarrone 2005: los espermatozoides de mamíferos poseen receptores funcionales para cannabinoides. Wang 2006 y col.: demostraron que existe un balance crítico entre la síntesis de AEA mediado por la enzima NAPE-PLD PLD (fosfolipasa( D selectiva para N-acylN acyl- fostatidil-etanolamina (NAPE)) y su degradación por la FAAH, tanto en embrión como en oviducto de ratón, creando un tono apropiado de AEA para el normal desarrollo embrionario, transporte oviductal, implantación y preñez.

19 Regulación del tono de AEA en el oviducto- Schuel H 2006

20 Resultados- Caracterización del sistema endocannabinoide ESPERMATOZOIDES OVIDUCTO

21 Resultados-Caracterización del sistema endocannabinoide

22 Resultados-Caracterización del sistema endocannabinoide 4 nmol AEA/h*mg Prot Ampolla Istmo

23 Co-cultivo de BOEC y ESP Oviductos Cultivo de días Co-cultivo de 1h con los ESP + agonistas o antagonistas de receptores para ECB Lavados y fijación Observación (nº de /área ó % ESP unidos respecto al control)

24 Co-cultivo de BOEC con ESP

25 Resultados- Curva de MAEA % ESP unidos respecto al control ** * * % ESP unidos respecto al control ** ** 0 Control MAEA (M) 0 C MAEA (1,4x10-9 ) AEA (10-9 ) (M)

26 (1 um) Resultados- Curva de Antagonistas de CB1 y CB2 AM251 AM ** # ** * %ESP unidos respecto al control % ESP unidos respecto al control Control MAEA MAEA+AM 251(0,1um) MAEA+AM 251(1um) MAEA+AM 251 (10 um) AM 251 (1um) Control MAEA MAEA+AM 630 (0,1um) MAEA+AM 630(1um) MAEA+AM 630 (10 um) AM 630 (1um) MAEA+251(1um)+630(1um)

27 Resultados- Curva de Antagonistas de CB1 y CB2 SR SR # # * * SR SR nº ESp unidos/0,11 mm2 nº ESP unidos/0,11 mm2 0 Control MAEA SR MAEA SR MAEA SR110-7+MAEA SR SR SR Control MAEA MAEA+SR MAEA+SR MAEA+SR SR

28 Resultados- Curva de capsaicina (CPS), agonista específico de TRPV % ESP unidos respecto al control * * # # * 20 0 Control MAEA CPS(10-9) CPS(10-8) CPS(10-7) CPS(10-6) Tratamientos (M)

29 Ensayo de Preincubación Drogas a testear A + PBS 15 min Pre incubación de ESP 3 Lavados Drogas a testear 1 hora de co-incubación de ESP-CEO 3 lavados Fijar y Montar B + 15 min Pre incubación de CEO 3 Lavados

30 Resultados-Preincubaciones de BOEC % ESP unidos respecto al control Control MAEA (10-10) MAEA (10-9) (M)

31 Resultados-Preincubaciones de BOEC 140 % ESP unidos respecto al control Control MAEA MAEA SR1+MAEA (10-10 ) (10-9 ) (10-9 ) Tratamientos (M) **

32 Ensayo liberación de ESP Drogas a testear PBS Fijar P3 3 lavados 1 Hora de co-incubación ESP-CEO 15 min de Co-incubacion con drogas 3 lavados Fijar y montar P2

33 ab a SR1+CZP Resultados- Efecto MAEA en la liberación de ESP nº espermatozoides unidos/0,11 mm 2 Control Met-AEA (10-9 M) Capsaicina (10-8 M) Met-AEA+CZP (10-7M) Met-AEA+SR1 (10-10 M) Met-AEA+CZP+SR1

34 Posible mecanismo molecular

35 Ensayos de funcionalidad espermática de los ESP liberados con MEAE Acrosoma intacto: 80% ESP capacitados: 35% Ensayos de Reacción acrosomal con inductores fisiológicos Estudiar su capacidad fertilizante mediante ensayos de unión ( a zonas pellucidas ) y de fusión al oolema.

36 Posible mecanismo celular Hormonas Esteroideas FAAH NAPE- PLD EtNH2 + AA TRPV1 AEA AEA (nm) AMT C CB1 N Capacitación Hiperactivación LIBERACIÓN

37 MUCHAS GRACIAS!!!!!