CARACTERIZACIÓN DE FIBRAS DE CELULOSA MEDIANTE MICROSCOPÍA LÁSER CONFOCAL y ANÁLISIS DE IMÁGENES

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1 CARACTERIZACIÓN DE FIBRAS DE CELULOSA MEDIANTE MICROSCOPÍA LÁSER CONFOCAL y ANÁLISIS DE IMÁGENES M. ALONSO GUERVÓS*, F. GONZÁLEZ-RÍo**, MARTÍNEZ- NISTALA.*, R. ASTORGA** & A. SAMPEDRO*. * SERVICIO DE PROCESO DE IMÁGENES DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO. cl JULIAN CLAVERÍA SiN (FAC. DE QUÍMICA) OVIEDO. ** CELULOSAS DE ASTURIAS S. A. (CEASA) NA VIA (ASTURIAS). RESUMEN Se ha utilizado la microscopía láser confocal para el estudio de fibras de celulosa. Esta técnica simplifica la preparación de las muestras y permite obtener rápidamente secciones transversales de la imagen de un modo no destructivo. Se han obtenido, mediante análisis de imágenes, varios parámetros morfométricos y se ha calculado el grado de colapso de las fibras. Se han estudiado las variaciones en la morfología de la fibra utilizando nueve o una sección transversal por fibra sin encontrarse diferencias significativas entre ambos métodos. Igualmente se han estudiado las posibles correlaciones entre la longitud de las fibras, el espesor de la pared y el grado de colapso. P.e.: Microscopía láser confocal, Análisis de imágenes, Fibras de celulosa, Eucalipto. SUMMARY Confocallaser scanning microscopy has been used to study cellulose fibres. This technique simplifies specimen preparation and allows to obtain rapidly non destructive cross-section images. Several cross-sectional morphological parameters and shape parameters were quantified using an image processing procedure. Variations in fibre morphology were studied using either nine, or one, value by fibre. No significant differences have been found in most of the measured parameters using either method. No correlation among fibre length, wall parameters and shape parameters was found for these fibres. K.W.: Confocallaser microscopy, Image analysis, Cellulose fibres, Eucalypt. INTRODUCCIÓN El control de calidad en la industria de la pasta y el papel se lleva a cabo convencionalmente mediante medidas del producto final con el fin de satisfacer los requerimientos de los clientes. Sin embargo, la caracterización de las propiedades individuales de las fibras es necesaria para controlar su variación a lo largo del proceso y su contribución al comportamiento del producto final (PAULAPURO y RITY, 1976; HEIKKURINEN el al., 1991). 101

2 La definición de parámetros y el desarrollo de métodos fiables de cuantificación mediante la aplicación de nuevas tecnologías como el análisis de imágenes y la microscopía láser confocal, pueden contribuir al conocimiento sobre la estructura y composición de las fibras. La anchura de la fibra y su longitud puede ser observada fácilmente con microscopía óptica de luz transmitida, pero la obtención de secciones transversales para el estudio del espesor de la pared y su grado de colapso requiere de una metodología más compleja (KIBBLEWHITE & BAILEY 1988). El uso de la microscopía láser confocal simplifica la preparación de las muestras y permite obtener rápidamente secciones transversales de un modo no destructivo (lang et al. 1992). En este trabajo se presenta la utilización de microscopía láser confocal y análisis de imágenes para la obtención y cuantificación de secciones transversales de las fibras. Se realiza un estudio de las posibles variaciones en los parámetros en función del número de secciones transversales obtenidas por cada fibra y se analizan las posibles correlaciones entre la longitud de la fibra y el espesor de pared y el grado de colapso. MATERIAL Y MÉTODOS Para la realización del presente trabajo se ha utilizado un sistema de microscopía láser confocal Bio-Rad MRC-600 CLSM (Bio-Rad Laboratories S.A.). Las fibras de celulosa analizadas procedían de pasta Kraft blanqueada, a partir de madera de Eucalyptus globulus (Labill.). Para la preparación, se disuelve la pasta de celulosa en agua destilada hasta obtener una disolución de fibras, tiñéndose las fibras con el fluorocromo Texas Red. Para la realización de secciones transversales (x-z) se orienta la fibra perpendicularmente a la dirección de barrido del láser y se toma una serie de líneas mientras se desplaza la muestra verticalmente a lo largo del eje z. La cuantificación de los parámetros morfométricos de las secciones transversales se realizó mediante el empleo de un equipo de análisis de imágenes IMCO 1000 (Kontron Instruments Gmbh). Además de la longitud de la fibra se han cuantificado los siguientes parámetros (figura 1): área de pared (AP), área de lumen (AL), longitud de pared (LP), perímetro total (PT), perímetro del lumen (PL), diámetro máximo (Dmax) y diámetro mínimo (Dmin). El valor medio del espesor de la fibra (Esp) es igual a AP dividido por LP (KIBBLEWHITE & BAILEY, 1988). Durante el proceso de elaboración de la pasta de celulosa la fibra es expuesta a procesos fisico-químicos que cambian su forma original produciendo el aplastamiento o el colapso. Estos cambios pueden ser estimados a partir de la forma de las secciones transversales de las fibras. La elongación (E), definida como la relación entre Dmin y Dmax, ha sido propuesta por KIBBLEWHITE y BAILEY, (1988). como un parámetro para estimar el grado de colapso de las fibras. Un valor pequeño de E indicaría un mayor grado de aplastamiento de la fibra. JANG et al (1995) definen un nuevo parámetro denominado índice de colapso (lc) que se basa en calcular la disminución sufrida por la fibra en el tamaño dellumen: IC=AL/ALa siendo AL el área del lumen y ALa el área que tendría la fibra si no hubiese. sufrido aplastamiento. El valor de ALa es calculado por JANG et al. asumiendo que la forma original dellumen es rectangular. En nuestro caso y dado que se ha trabajado con fibras de diferentes procedencias y que es extremadamente difícil y arriesgado predecir una forma original de área de lumen para todas ellas, hemos considerado el círculo como forma teórica dellumen en una fibra sin colapsar. IC es igual a 1 si ellumen es completamente circular y vale O si la fibra está totalmente colapsada. 102

3 La figura 2 muestra nueve secciones transversales de diferentes fibras y sus correspondientes valores de : área de pared (AP), área de lumen (AL), espesor de pared (EP), elongación (E) e indice de colapso (lc). Se presenta además un nuevo índice de deformación (ID), que hemos definido para corregir los problemas que aparecen, en algunos tipos de fibras, al utilizar los valores de E o IC para medir el grado de colapso.el valor de ID se ha definido como el promedio de E e le. Su ventaja es que tiene en cuenta tanto la forma externa de la pared como el área dellumen, con lo que fibras con una forma externa aplastada pero con un lumen redondeado presentan un valor de ID menor que si sólo se considerase el le. Otra ventaja de este índice es que permite diferenciar grados de aplastamiento, cuando el lumen está completamente cerrado (IC=O), en función de la forma externa de la fibra. RESULTADOS Se realizó un análisis de 210 fibras correspondientes a un mismo tipo de pasta para estudiar como las variaciones en la morfología de la fibra pueden afectar a los parámetros cuantificados a partir de las secciones transversales. De cada fibra se realizaron nueve secciones transversales en su zona media, con una distancia entre secciones de 9 ~m. A continuación se calcularon los valores medios y la desviación standard de cada parámetro utilizando nueve valores por fibra (los correspondientes a las nueve secciones de cada fibra) o usando un único valor por fibra. En este segundo caso el valor único de cada fibra fue obtenido de cuatro formas distintas: a partir de las medias de las nueve secciones, utilizando el valor de la sección que tenía mayor espesor de la pared, utilizando el valor de la sección central y utilizando el valor de la sección más extrema de las nueve. Para el AP los valores medios son muy similares en todos los casos. Para el valor de AL el análisis ANOV A ha mostrado diferencias significativas entre los diferentes métodos, obteniéndose el valor más bajo de AL si utilizamos la sección de mayor espesor y el valor más alto si utilizamos la sección central. Como era de esperar los valores medios más altos de EP se obtuvieron en el caso de utilizar las fibras con mayor espesor de pared, mientras que no se apreciaron diferencias significativos en los valores obtenidos por los otros cuatro métodos. La figura 3 presenta los valores obtenidos para los diferentes índices de colapso utilizados. En este caso, no se han encontrado diferencias significativas entre los distintos métodos. Según estos resultados no es necesario tomar más de una sección transversal por fibra para el estudio de la mayoría de los parámetros definidos. Únicamente en el caso de del área del lumen se ha visto que presenta variaciones significativas según se utilice uno u otro método. La longitud de las fibras se comparó con el área de pared (AP) en una sección transversal tomada en su zona media y con el espesor de pared en esa misma sección. Igualmente se realizó una comparación entre el índice de deformación (ID) y el espesor de pared (figura 4) y entre ID y la longitud total de la fibra. El valor de correlación obtenido entre longitud y AP fue de p = (p<o.ol), y entre longitud y espesor fue de p = (p<o.ol). Para el caso del índice de deformación (ld) los valores de correlación obtenidos fueron: p = (p<o.ol) en relación con el espesor y p = (p<o.ol) en relación con la longitud de la fibra. CONCLUSIONES Con la microscopía láser confocal es posible obtener secciones transversales de fibras de pasta sin necesidad de una preparación de la muestra compleja y tediosa. Usando métodos de 103

4 análisis de imágenes es posible cuantificar varios parámetros morfométricos que nos permitan conocer la estructura de la fibra y su grado de colapso. Se ha estudiado el efecto de las variaciones en la morfología de la fibra utilizando nueve secciones o una única sección en el cálculo de los parámetros, encontrándose que no existen diferencias significativas entre ambos métodos. El análisis de las correlaciones bivariadas entre longitud, espesor y grado de colapso muestra bajos coeficientes de correllación siendo el más significativo el observado entre el ID y el espesor (p = 0.440). AGRADECIMIENTOS El presente trabajo ha sido, financiado dentro del 11 Plan Regional de Investigación del Principado de Asturias gestionado por la FICYT. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS HEIKKURINEN A, LEVLIN JE, PAULAPURO H (1991) PrincipIes and Methods y in Pulp Characterization -Basic Fiber Properties. Paperi la Puu- Paper and Timber. Vol 73, Iss 5, pp 41 l. JANG, H.F, ROBERTSON, A.G., SETH R.S. (1992) Transverse dimensions of Wood Pulp Fibers by Confocal Laser Scanning Microscopy and Image-Analysis. lournal qf Materials Science. 27, JANG, H.F., HOWARD, Re., SETH, RS. (1995) Fiber characterization using confocal microscopy - the effects of recycling. Tappi lournal. 78, KIBBLEWHITE, RP., BAILEY D.G. (1988). Measurement of Fibre Cross-Section Dimensions U sing Image Processing. Appita. 41, PAULAPURO, H, RITY, N (1976) Pulp characterization for process control purposses. Pulp & Paper Canada.vol 77: n 6: l. 104

5 Area de pared Perímetro convexo (pe) erímetro total (PT) erímetro dellumen (PL) Longitud de pared (LP) del lumen (AL) Diámetro máximo (Dm iámetro mínimo (Dmin) Fig. 1. Sección transversal de una fibra de celulosa donde se representan los diferentes parámetros medidos. AP = m 2 AL =5.92..m 2 EP= m E = 0.81 le= =0.88 AP = m 2 AL = f.tm 2 EP=3.44..m E=0.78 le= 0.87 ID= 0.82 AP = m 2 AL == m 2 EP=2.64..m E= 0.75 IC = 0.61 ld= 0.72 r " ) 4 AP = m 2 AL = m 2 EP=2J9 f.tm E= 0.56 le == 0.71 ld=0.81 AP == m) AL = m 2 EP= m E= 0.65 le = 0.64 ld=o.64 AP = m 2 AL"" m 2 EP= m E= 0.42 le= 0.64 ld= 0.53 AP = m 2 AL = o f.tm 2 EP=4.78..m E==0.74 le=o ld "" AP = f.tm 2 AL=0f.tm2 EP=3.62 f.tm E= 0.45 Ie=o ID= 0.22 AP = m 2 AL=Of.tm 2 EP=2.53..m E=0.32 IC=O ID "" 0.16 Fig 2. Conjunto de nueve secciones transversales, correspondientes a nueve fibras distintas con sus correspondientes valores de: área de pared (AP), área de lumen (AL), Espesor de pared (EP), elongación (E), indice de colapso (IC) e indice de deformación (ID). 105

6 0,800 0,700 0,600 o 0,500 : E.. 0,400.2 ~ O,SOO 0,200 0,100 0,000 9sec. Med.9 Max. Esp. Seco Central SeCo Extrem. Fig 3. Valores medios de los parámetros de elongación (E), índice de colapso (Ie) e índice de deformación (ID); obtenidos usando nueve o una sección por fibra. p= (p<0.01) º 0, ,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1.#..... #.... :... It.._..... ~~ t:....# -~# \... \....:.,.. -.,... # :..;-~ ~~t~; O 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 Espesor de pared (... m) 6,000 7,000 8,000 Fig. 4. Gráficas del índice de deformación (ID) frente al espesor de pared 106