Biología Molecular y Filogenia en Micología

Transcripción

1 Biología Molecular y Filogenia en Micología Biól. Nicolás Pastor Micología 2014

2 Por qué usar herramientas moleculares? Sistemática - Delimitación de especies Concepto filogenético de especie Diagnosis inequívoca(?) de especies - Resolución de conflictos taxonómicos

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5 Por qué usar herramientas moleculares? Sistemática - Delimitación de especies Concepto filogenético de especie Diagnosis inequívoca(?) de especies - Resolución de conflictos taxonómicos Evolución - Estudios de co-evolución - Evolución de caracteres morfológicos

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8 Por qué usar herramientas moleculares? Sistemática - Delimitación de especies Concepto filogenético de especie Diagnosis inequívoca(?) de especies - Resolución de conflictos taxonómicos Evolución - Estudios de co-evolución - Evolución de caracteres morfológicos Ecología - Independencia de basidiomas y ascomas - Cambios en la composición espacial y temporal de las comunidades

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10 PREGUNTA Flujo de trabajo EXTRACTO DE ADN AMPLICON MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN ANÁLISIS FILOGENÉTICO ARBOL FILOGENÉTICO

11 Flujo de trabajo PREGUNTA EXTRACTO DE ADN MATERIAL BIOLÓGICO LAB. HUMEDO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS BIOINFORMATICA ANÁLISIS FILOGENÉTICO AMPLICON SECUENCIA DE ADN ARBOL FILOGENÉTICO

12 Pregunta y selección del material biológico - Morfología muestra algunos caracteres afines a algún género conocido, pero... No se lo puede identificar mediante las claves existentes, ni es similar a nada publicado (al menos de lo que se conoce!!)

13 Pregunta y selección del material biológico Encontré una nueva especie? Si así es, cómo está relacionada con el resto de las especies más cercanas del género? Cuál es su posición filogenética en el género?

14 Flujo de trabajo PREGUNTA EXTRACTO DE ADN AMPLICON MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN ANÁLISIS FILOGENÉTICO ARBOL FILOGENÉTICO

15 Extracción de ADN Kit Comercial Protocolo tradicional - Disgregación mecánica del tejido - Lísis celular (mecánica y química) - Secuestro de ADN y precipitación de otros contenidos celulares (proteínas, lípidos, etc) - Precipitación de ADN - Lavado y resuspensión de ADN ADN genómico

16 Flujo de trabajo PREGUNTA EXTRACTO DE ADN AMPLICON MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN ANÁLISIS FILOGENÉTICO ARBOL FILOGENÉTICO

17 Amplificación y secuenciación de ADN

18 Amplificación y secuenciación de ADN - Con cuántos marcadores voy a trabajar? loci independientes (no ligados) - Que nivel taxonómico quiero resolver? tasas de evolución de ADN - Qué hay disponible en las bases de datos? meramente pragmático!!!

19 Amplificación y secuenciación de ADN Marcadores más utilizados No-codificantes (intrones, DNAr) - ITS = espaciador interno de la transcripción - LSU/25S = subunidad ribosomal mayor - SSU/18S = subunidad ribosomal menor Codificantes (expresan proteínas) - rpb1/rpb2 = RNA polimerasa subunidad I ó II - atp6 = subunidad 6 ATPasa mitocondrial - tef1 = factor de enlongación 1-α - β-tubulina = subunidad beta de Tubulina

20 Amplificación y secuenciación de ADN Cebadores: específicos y no específicos Bellemain et al.(2010). BMC Microbiology.10:

21 Amplificación y secuenciación de ADN

22 Flujo de trabajo PREGUNTA EXTRACTO DE ADN AMPLICON MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN ANÁLISIS FILOGENÉTICO ARBOL FILOGENÉTICO

23 Minería de datos - Búsqueda de secuencias por similitud B asic L ocal A lignment S earch T ool Busca en una BD determinada, las secuencias similares a la que uno provee. Altschul etl al J Mol Biol. 215(3): Por qué buscamos secuencias similares? Similitud Homología

24 Minería de datos - Bases de datos más utilizadas en Micología GenBank BD general (todo tipo de secuencias, todo tipo de organismos). : M AA R J A M :. maarjam.botany.ut.ee/ BD específica de secuencias de ITS de hongos BD específica para Glomeromycota. Varios marcadores

25 Flujo de trabajo PREGUNTA EXTRACTO DE ADN AMPLICON MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN ANÁLISIS FILOGENÉTICO ARBOL FILOGENÉTICO

26 Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA) s1:en LA RAMA NOS CANTA LA RANA [22 letras] s2:la RANA NO CANTA EN LA CAMA [21 letras] ENLARAMANOSCANTALARANA LARANANOCANTAENLACAMA* * * 3/22 = 0, % similitud ENLARAMANOSCANTA--LARANA 16/22 = 0, LARANANO-CANTAENLACAMA 73% similitud **** *** ***** ** * * insercion/deleción mutación puntual

27 Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA) - Existen programas para realizar MSA de manera automática, basados en diferentes algoritmos: Clustal (W, IX, Ω) MUSCLE T-Coffee MAFFT

28 Flujo de trabajo PREGUNTA EXTRACTO DE ADN AMPLICON MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN ANÁLISIS FILOGENÉTICO ARBOL FILOGENÉTICO

29 Análisis filogenético - Puedo hacer filogenía sin biología molecular? C A Esporas B D

30 Hábito Hipógeo [0] / Epígeo [1] Esporas Negra [a] / Blanca [b] / Rosa [c] Ornamentaciónes Verrugas [a] / Sin [b] / Espinas [c] Color basidioma Azul [0] / Rojo [1] A verrugas negra hipogeo azul B sin Habito Esp Orna Color A 0 a a 0 B 0 a b 0 C 1 b c 1 D 1 c c 1 C blanca D rosa espinas epigeo rojo

31 Análisis filogenético Entonces... Por qué utilizar caracteres moleculares?

32 Análisis filogenético - Enorme disponibilidad de caracteres Cada sitio de las secuencia es un carácter distinto Elección objetiva del carácter y sus estados - Tasas de evolución conocidas Modelos de evolución de ADN Relojes moleculares

33 Análisis filogenético - Métodos basados en matriz de distancias Neighbor-joining Mínimos cuadrados NO ES UPGMA FILOGENIA!!! - Método de Máxima Parsimonia - Métodos Probabilísiticos Máxima Verosimilitud Inferencia Bayesiana DISCUTIDO MODELOS DE SUBSTITUCION DE ADN

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