Caracteres moleculares

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1 PEDECIBA BIOLOGÍA Sistemática Biológica: Métodos y Principios Ivanna Tomasco Caracteres moleculares Clase elaborada por Guillermo D Elía y modificada por Ivanna Tomasco evolucion.fcien.edu.uy/sistematica/sistematica.htm Esquema para este tema Precisiones y generalidades Algunos ejemplos de caracteres moleculares Particularidades del análisis de caracteres moleculares (en referencia al análisis de secuencias) Caracteres moleculares y morfológicos Consideraciones finales Mensaje: Precisiones y generalidades Conceptualmente un carácter molecular es lo mismo que un carácter morfológico (son atributos heredables de los organismos) Sistemática es la disciplina cuyo objetivo es la detección, descripción, y entendimiento del origen y mantenimiento de la diversidad biológica. Estos estudios comprenden el análisis comparado de patrones y procesos tanto microevolutivos como filogenéticos. Por lo tanto: los caracteres morfológicos y los moleculares pueden analizarse de la misma forma SM - rama de la sistemática que usa caracteres moleculares como evidencia 1

2 Popularidad Estudios sistemáticos basados en caracteres moleculares son muy comunes mayoría de museos y universidades tienen laboratorios de SM y colecciones de tejidos mayoría de programas de sistemática ofrecen cursos de SM revistas y libros especializados en SM algunas razones popularidad Avances en el análisis de caracteres moleculares son publicados constantemente - estrecha relación con la Evolución Molecular - ha rejuvenecido a la sistemática ha permitido documentar diversidad que de otra forma pasaba desapercibida propiciado avances conceptuales y refinamientos metodológicos propiciado debates 2

3 Tipos de caracteres moleculares Proteínas - distancias inmunológicas - electroforesis - secuencias Ácidos Nucleicos (ADN o ARN) - hibridización de ADN-ADN - polimorfismos en el largo de fragmentos de ADN (RFLP, microsatélites) - orden de genes en el genoma mitocondrial - SINEs y LINEs secuencias Electroforesis de proteínas Hibridización de ADN/ADN - Caracteriza a las proteínas por tamaño y/o carga eléctrica - Provee caracteres discretos: presencia/ausencia de una banda que se pueden transformar a frecuencias - Casi no se usa en estudios filogenéticos - Gran aplicación en estudios poblacionales idea: combinación de hebras de ADN simple de diferentes especies comparar la temperatura a la que esta cadena doble se desnaturaliza análisis: Mayor similitud = duplex más estables = temperatura más alta Provee una matriz de distancia entre pares de especies 3

4 Polimorfismos en el Largo de Fragmentos de Restricción (RFLPs) Pero Combina la amplificación de ADN y el corte del mismo usando enzimas de restricción 1)...A A A T C A T T C G A A T T A A G G G G T T... 2)...A G G T C A T T G G A A T T A G A G A G T T... 3)...A G G T C A T T C G A A T T A G A G A G T T... - no revela toda la variación existente a nivel de las secuencias 1)...A A A T C A T T C G A A T T A A G G G G T T... 2)...A G G T C A T T G G A A T T A G A G A G T T... 3)...A G G T C A T T C G A A T T A G A G A G T T... - uso de una batería de enzimas igual no revela toda la variación existente ej: Enzima de restricción X: - reconoce secuencia T T C G A - y corta después de la 2da T provee caracteres discretos: bandas presentes o no - hoy casi no se usa para reconstruir relaciones filogenéticas - fue bastante usado en estudios poblacionales Secuencias de ADN Análisis de secuencias Secuencias: fragmentos de ADN o genomas completos - ADN mitocondrial - ADN de cloroplastos - ADN nuclear -ARN (amplificados por PCR) 1 er paso AACCAATTGG ACATG alinear las secuencias y esto no es trivial información más directa para inferir relaciones filogenéticas secuencias nucleotídicas = tipo de caracteres moleculares más usados 2 do paso reconstrucción filogenética 4

5 Un alineamiento es una hipótesis sobre las homologías posiciónales entre bases (caracteres) de distintos individuos Un alineamiento es una hipótesis sobre las homologías posiciónales entre bases (caracteres) de distintos individuos 1)...G C C T A C C... 2)...G C C T A C C... 3)...G C A T A C C... 4)...G C C T A C C... 5)...G C C T A C C... 6)...G A C T A C C... 7)...G A T A C C... Es decir: el establecimiento de la correspondencia de bases entre las secuencias de los distintos especimenes A) ) G C C T A C C 2) G C C T A C C 3) G C A T A C C 4) G C C T A C C 5) G C C T A C C 6) G A C T A C C 7) G A T A C C B) ) G C C T A C C 2) G C C T A C C 3) G C A T A C C 4) G C C T A C C 5) G C C T A C C 6) G A C T A C C 7) G A - T A C C Un alineamiento es una hipótesis sobre las homologías posiciónales entre bases (caracteres) de distintos individuos Un alineamiento es una hipótesis sobre las homologías posiciónales entre bases (caracteres) de distintos individuos A) ) G C C T A C C 2) G C C T A C C 3) G C A T A C C 4) G C C T A C C 5) G C C T A C C 6) G A C T A C C 7) G A T A C C B) ) G C C T A C C 2) G C C T A C C 3) G C A T A C C 4) G C C T A C C 5) G C C T A C C 6) G A C T A C C 7) G A - T A C C A) carácter 3 B) carácter 2 C C A C C C A C C C C C A A A) ) G C C T A C C 2) G C C T A C C 3) G C A T A C C 4) G C C T A C C 5) G C C T A C C 6) G A C T A C C 7) G A T A C C B) ) G C C T A C C 2) G C C T A C C 3) G C A T A C C 4) G C C T A C C 5) G C C T A C C 6) G A C T A C C 7) G A - T A C C A) carácter 3 B) carácter 2 C C A C C C A C C C C C A A Supongamos que las relaciones entre los 7 taxa están dadas por la siguiente filogenia Al mapear los estados de los caracteres 3 y 2 en los alineamientos A) y B) respectivamente tenemos: A en 3 y A en 7 son: estados de carácter análogos (el ancestro común de 3 y 7 no tenía A) A en 6 y A en 7 son: estados de carácter homólogos (el ancestro común de 6 y 7 tenía A) 5

6 Establecimiento de homologías posicionales Pero. Con caracteres morfológicos (casi) no hay problema 1) 4 mamas, raíz labial del M1 presente, fosa parapterigoidea plana, procíngulo del M2 ausente, vesícula biliar ausente Con caracteres moleculares es un tema clave y puede llegar a ser un problema inmenso 2) procíngulo del M2 presente, 8 mamas, vesícula biliar presente, raíz labial del M1 ausente raíz labial procíngulo vesícula fosa del M1 del M2 mamas biliar parapterigoidea 1) presente ausente 4 ausente plana 2) ausente presente 8 presente? AACCAATTGG ACATG Alinear secuencias que codifican proteínas es más fácil (codones, codigo genético degenerado) Alinear secuencias no codificantes es en general más difícil 1) ) ? Alineamiento de estas dos secuencias: Dos alineamientos (de los muchos posibles): 2 ACATG 2 AC--AT-G- 4 gaps + 0 cambio ** ** * 2 ACATG gap + 4 cambios * Gaps: representan eventos de inserción o deleción de bases ( indel ) Cambios: son sustituciones de bases purinas = A(denina) G(uanina) pirimidinas = T(imina) C(itosina) transiciones (Ts): cambios de purinas a purina o de pirimidina a otra pirimidina. 4 posibilidades transversiones (Tv): cambios de purinas a pirimidinas o viceversa. 8 posibilidades A T G C Sin embargo, las Ts son más comunes que las Tv 6

7 Como elegir entre los distintos alineamientos? Que criterio usar? 2 AC--AT-G- ** ** * 2 ACATG----- * Recordar: los datos determinan los resultados el alineamiento determina la topología que se obtendrá Respuesta: Balance entre costos de gaps (indels) y de sustituciones gap: sustituciones: apertura / extensión transiciones / transversiones Asumiendo los siguientes costos: Sin embargo. Gap de apertura = 1 Gap de extensión = 0 Cualquier cambio = 1 elegimos el 1er alineamiento gap cambio 2 AC--AT-G = 4 ** ** * 2 ACATG = 5 * 7

8 si cambiamos los costos (gap de apertura ahora cuesta 2) Además.. gap cambio gap cambio costo AC--AT-G = = 8 ** ** * 2 ACATG = = 6 * El alineamiento final puede variar según los costos asumidos al menos se debería explorar el efecto de distintas combinaciones de costos y evaluar la variación en el alineamiento final Para un juego de costos puede haber más de un alineamiento igualmente óptimo Gap de apertura = 1 Gap de extension = 0 Cualquier cambio = 1 gap cambio gap cambio TTAAGAAC = 2 TTAAGAAC = 2 TAA--AAC T-AA-AAC * * *** * ** *** Sin embargo: la mayoría de los programas de alineamiento (e.g., Clustal) dan un único alineamiento Recordar: el alineamiento determina la topología que se obtendrá Notar: - hemos alineado dos secuencias muy cortas - método usado: ojo - imposible de realizar con una base de datos real - operativamente es muy complejo necesidad de explorar un espacio n-dimensional distintos modos para explorar este espacio 8

9 Resumen alineamiento: Avance conceptual En última instancia lo que se quiere encontrar es: Para un juego de secuencias tenemos que: el alineamiento que produce el árbol más corto - el alineamiento final depende de los costos asumidos - para un juego de costos puede haber más de un alineamiento igualmente óptimo Entonces: el alineamiento de las secuencias y la búsqueda del árbol son parte del mismo problema optimización del alineamiento La topología que se obtendrá depende directamente del alineamiento empleado Optimización del alineamiento - hay programas (MALIGN y POY) que hacen esto en un contexto de máxima parsimonia la optimización del alineamiento también se podría implementar en un marco de máxima verosimilitud - proceso sumamente complejo por la cantidad de cálculos que se deben de hacer. imaginarse esto cuando se tienen pb para individuos 9

10 Presentación de CM en trabajos sistemáticos Proteínas: - tabla con alelos y sus frecuencias Secuencias: - antes se presentaba el alineamiento - hoy no listado de números de acceso de GENBANK disponibilidad a pedido disponibilidad en la red material suplementario en las ediciones en línea de las revistas los árboles moleculares no vienen solos... Qué caracteres son mejores: los morfológicos o los moleculares? Visión pre-molecular MA R humanos orangután chimpancé gorila Visión de Sarich y Wilson R 4-6 MA orangután gorila humano chimpancé 10

11 Históricamente los datos moleculares han sido propagandeados por algunos sistemáticos moleculares como superiores Algunas propuestas de aquellos que sostienen que los caracteres moleculares son mejores: Taxonomía basada en ADN Holotipos de ADN Importante notar lo siguiente: La inmensa mayoría de los estudios filogenéticos (filogeográficos y poblacionales) implican una identificación basada en morfología de los especimenes estudiados Mapeo de caracteres morfológicos sobre topologías obtenidas exclusivamente en base a caracteres moleculares 11

12 más precisiones: morfología vs. moléculas nuestro método provee la conclusión final acerca de la filogenia Okada, 2000 El desarrollo de la SM no ha implicado una refutación total de las hipótesis filogenéticas basadas en morfología. Hay desacuerdos que no son moléculas / morfología: morfología / morfología ej.: hipótesis del primate volador moléculas / moléculas ej.: parafilia de los roedores Los mensajes son: Caracteres morfológicos - conceptualmente un carácter molecular es lo mismo que un carácter morfológico - cada clase de carácter tiene sus ventajas y desventajas - el tema no pasa por la clase de carácter - el tema pasa por como se eligen y se registra la variación de los caracteres Ventajas: - estudio de especimenes depositados en colecciones (previo a colecciones de tejidos) - estudio de especimenes fósiles (ADN antiguo) - uso de información ontogenética - costo (?) el problema está en nosotros, en los sistemáticos 12

13 Caracteres morfológicos Caracteres moleculares Ventajas: Desventajas: - taxones divergentes pueden tener pocos caracteres en común - efecto ambiental difícil de disecar - convergencia adaptativa (??) reflejo de nuestro mayor conocimiento de morfología funcional? 1) mamíferos marinos han independientemente adquirido un exceso de argininas 2) endotermos independientemente han enriquecido su genoma en GC - no hay efecto ambiental; estrictamente material hereditario - descripción de los estados de carácter no es ambigua (es A o G no fino y menos fino ) - ciertos genes homólogos existen en todos los taxa, universal - regiones diferentes del genoma evolucionan con distinta tasa permitiendo estudiar problemas filogenéticos a distintos niveles - es relativamente fácil generar una matriz de miles de caracteres 1) y 2) quizás no sea adaptativo, sino sesgos sustitucionales otra ventaja: Caracteres moleculares Desventajas: Comunes a cualquier tipo de carácter: - Dificultad en el establecimiento de homologías (e.g., RFLPs) - Niveles de variación inadecuados para el problema a tratar lo que lleva a muchos autores a asumir hipótesis ad hoc (e.g., pesar caracteres, incorporar modelos de evolución) Otros tratamientos de datos 13

14 Caracteres moleculares Ejemplo de árbol de gen distinto del árbol de las especies Desventajas (más): Topología mejor corroborada Topología reconstruida Propios de los caracteres moleculares: Akodon cursor Akodon azarae Akodon cursor Akodon azarae Árbol de gen / árbol de las especies Necromys lasiurus Necromys lasiurus retención de polimorfismos ancestrales paralogía en familias multigénicas transferencia horizontal genes duplicados en poliploides seudogenes recombinación en genes nucleares tiempo y $$$$ Qué es lo que puede estar pasando? Fijación alternativa de polimorfismos ancestrales Fijación alternativa de polimorfismos ancestrales Akodon cursor Akodon azarae Akodon cursor Akodon azarae Necromys lasiurus Necromys lasiurus Problema mayor cuando se tratan de reconstruir divergencias recientes Problema mayor cuando se tratan de reconstruir divergencias recientes i.e., cuando los internodos son cortos i.e., cuando los internodos son cortos 14

15 Otro ejemplo; otra causa Topología mejor corroborada Topología reconstruida Árbol de las especies Árbol de los genes Duplicación génica anterior a la divergencia de los tres taxa en estudio Las copias 1, 2, y 3 del gen son homólogos ortólogas (idem respecto a las 3 copias de ) y son homólogos parálogos; hay dos copias del gen en el genoma (no estamos hablando de los dos alelos del gen que existen en un genoma diploide, estamos hablando de que el gen se ha duplicado) Pensar en las familias multigénicas Las copias 1, 2, y 3 del gen son homólogos ortólogas (idem respecto a las 3 copias de ) y son homólogos parálogos; hay dos copias del gen en el genoma (no estamos hablando de los dos alelos del gen que existen en un genoma diploide, estamos hablando de que el gen se ha duplicado) Pensar en las familias multigénicas 15

16 Consideraciones finales La sistemática molecular es cada vez más popular recordar: son pocos los estudios que son 100% moleculares Los caracteres moleculares: no tienen nada de especial no son intrínsicamente mejores ni peores que los caracteres morfológicos Estos fueron los alelos estudiados (o 2 y 3 y 1 ) MENSAJE: estudio filogenético debe de basarse en genes homólogos ortólogos respecto a estos tienen ciertas ventajas y desventajas algunos problemas son comunes a cualquier clase carácter otros son propios Considerando que: Mensaje para llevarse a casa: - la topología con mayor apoyo será aquella que pasa la mayor cantidad de pruebas (tests), y - que cada carácter constituye una prueba de hipótesis (la topología) independiente: La sistemática tica es una sola Hay buena sistemática y mala sistemática esto no se corresponde con un tipo de evidencia en particular Lo mejor es combinar en un mismo análisis caracteres de distintas fuentes 16