EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES EN DISTINTAS FORMAS DE CONSUMO DE YERBA MATE PRODUCIDAS EN ARGENTINA

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1 EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES EN DISTINTAS FORMAS DE CONSUMO DE YERBA MATE PRODUCIDAS EN ARGENTINA INTRODUCCIÓN La Yerba Mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) es una planta que crece en la región central del Mercosur, del cual se consumen los productos elaborados a partir del procesamiento de sus hojas y ramas jóvenes. El consumo se lleva a cabo en tres formas diferentes: el tradicional mate que es la forma principal de consumo, tereré que es la segunda forma de consumo de uso extendido durante meses de verano y su tercer forma, es una infusión preparada en forma similar al té en saquitos. Se conocen algunos trabajos sobre el aporte nutricional de este producto (azúcares, vitaminas minerales, etc.) en sus diferentes formas de consumo pudiendo citarse los trabajos realizados por Ramallo y col., (1998) y Schmalko y col., (1995). En los últimos años se realizaron trabajos sobre el contenido de polifenoles totales, de los que pueden citarse los realizados por Bravo, y col., (2005), y el de Heck, y col., (2008). Estos investigadores trabajaron sobre el sólido seco e infusiones, sin embargo no se ha encontrado a la fecha trabajos relacionados al aporte de polifenoles totales en sus diferentes formas de consumo. OBJETIVOS Determinar el contenido de polifenoles totales en yerba mate elaborada producida en la República Argentina en sus diferentes formas de consumo. Realizar un relevamiento de los análisis realizados en los últimos años del contenido de nutrientes en el extracto acuoso de la yerba mate obtenido en una mateada simulada. Citar algunos datos reportados acerca del contenido de polifenoles totales en otros alimentos de consumo habitual. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Se utilizaron 10 muestras por duplicado de diferentes marcas de yerba mate elaborada con palo (Ilex paraguariensis St. Hil.) y 5 muestras comerciales por 1

2 duplicado de saquitos de yerba mate elaborada obtenidos en distintos comercios de la provincia de Misiones, Argentina. El contenido de cada paquete de yerba mate fue mezclado y la muestra obtenida por cuarteos sucesivos. Reactivos Agua destilada, ácido gálico, ácido clorogénico, reactivo de Folin-ciocalteau, carbonato de sódio, todos de grado analítico o grado HPLC. 1- Preparación del material de vidrio: Debido a que este ensayo es sensible a trazas de impurezas orgánicas, el material a utilizar debe ser sometido previamente a un lavado extra con una solución de ácido nítrico de aproximadamente 15 % v/v. 2- Preparación del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido (10 % v/v): Usando una pipeta, trasferir 10 ml del reactivo Folin-Ciocalteau a un matraz aforado de 100 ml, enrazar con agua y mezclar. 3- Preparación de solución de carbonato de sodio (7,5 % p/v): pesar 37,50 ± 0,01 g de carbonato de sodio anhidro y enrazar en matraz aforado a 500 ml. Esta solución es estable a temperatura ambiente por un mes. Preparación de los extractos extracción 1: Mateada simulada La extracción de las sustancias solubles en agua de las muestras de yerba mate elaborada se realizó con un dispositivo que simula el proceso real de beber mate. El mismo consta de un recipiente cilíndrico de vidrio de 50 mm de diámetro y 110 mm de altura con una bombilla conectada por medio de una manguera flexible a un kitasato en el que se hace vacío mediante una trompa de vacío. La bombilla es de plástico de calidad alimenticia, con orificios no mayores a los 0,8 mm. En el recipiente de vidrio se colocan 50 g de yerba mate elaborada, se vierten aproximadamente 20 ml de agua destilada a 70 ºC, se espera unos 20 segundos y se realiza vacío durante 20 segundos. Se detiene el vacío y se realiza otro vertido. El proceso se repite hasta que el líquido en el kitasato alcance un volumen de 500 ml. extracción 2: Tereré simulado La extracción se realizó en las mismas condiciones que para el mateo simulado pero usando agua a 5 ºC. 2

3 Extracción 3: Mate cocido (Infusión preparada a partir de saquitos) La infusión se preparó vertiendo 200 ml de agua destilada en ebullición sobre un saquito (aproximadamente 3 g), agitando a continuación por 5 minutos. Al cabo de este tiempo, se retiró el saquito y se enrazó con agua destilada hasta completar los 200 ml. Extracción 4: Según norma ISO/FDIS :2004 (E) Determination of total polyphenols in tea-colorimetric method using Folin- Ciocalteau reagent. Part 1 Descripción resumida el método: 1. Se pesaron 0,2 g +/- 0,001 g de yerba mate elaborada molida que pasa por un tamiz de 500 µm y se colocó en un tubo de ensayo. 2. Se agregaron 5 ml mezcla metanol/agua (70/30 v/v) a 70 C y se tapa. 3. Se dejó 10 minutos en baño termostatizado con agitación, agitando en vortex cada 5 minutos. 4. Se sacó el tubo del baño, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se centrifugó, luego se recogió el sobrenadante. 5. Se agregaron 5 ml mezcla metanol/agua (70/30 v/v) a 70 C y se tapó. 6. Se repitieron los pasos 3, 4 y 5, luego se juntaron los sobrenadantes. Determinación de humedad Para determinar el contenido de agua se utilizó el método gravimétrico por secado durante 6 horas en estufa de aire de convención natural a 103 ºC ± 2 ºC. Se utilizaron de 2 a 3 g de yerba mate elaborada o del polvo extraído del saquito de yerba mate, de acuerdo a lo establecido por la norma IRAM Determinación del extracto acuoso Se realizó una extracción con agua en ebullición bajo reflujo para extracción de las sustancias solubles de una muestra de ensayo a partir del producto filtrado, y lavado. El residuo insoluble en agua caliente se secó y se pesó. El extracto acuoso se define como las sustancias solubles extraíbles de una muestra de ensayo por agua hirviendo en las condiciones especificadas en la norma IRAM y expresadas por porcentaje en masa respecto de la muestra seca. 3

4 Determinación de los sólidos solubles De cada extracto de la mateada simulada, tereré simulado o infusión preparada, se tomó una alícuota de 50 ml, se filtró en papel de filtro rápido y se vertió en un crisol limpio, seco y previamente tarado. A continuación se evaporó el líquido a baño María hasta casi sequedad y entonces se dejó en estufa a 103 C +/- 2 ºC por 16 horas. Se sacó de la estufa y se dejó enfriar en desecador. Se pesó el crisol con el residuo y por diferencia se calcularon los sólidos solubles. Determinación del porcentaje de palos y hojas El porcentaje de las fracciones (% de hojas, % palos y % de impurezas) se realizó según lo exigido por el Código Alimentario Argentino en el Capítulo XV Productos estimulantes o fruitivos Artículos 1194 y Las distintas fracciones de las muestras se separaron por tamizado durante 20 minutos utilizando un tamizador electrónico Marca Zonytest, Industria Argentina, provisto de los respectivos tamices para determinar las correspondientes fracciones. Determinación del contenido de polifenoles totales La concentración de polifenoles totales se determinó utilizando el método de Folin-Ciocalteau descripto en la norma ISO/FDIS :2004 (E). Descripción resumida el método: Se mezcló 1 ml del extracto diluido con 5 ml del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido (10 en 100), se agitó y se dejó transcurrir 3 a 8 minutos, se agregó 4 ml de la solución de carbonato de sodio. Cada tubo se agitó, se tapó y se dejó en reposo a temperatura ambiente. Luego de 60 minutos se determinó la absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro marca Spectronic modelo Genesys de origen estadounidense. Las curvas de calibración se prepararon con ácido clorogénico y ácido gálico (0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 ug/ml). Las ecuaciones del ajuste fueron y = 0,0066 * x - 0,00093, donde x = concentración del patrón ácido clorogénico (R 2 = 0,9973) e y = 0,0122* x - 0,00898; siendo x = concentración del patrón ácido gálico (R 2 = 0,9986). Los resultados provenientes de los métodos de extracción 1 y 2 se expresan como gramos de polifenoles equivalentes a ácido clorogénico por 100 g de yerba mate seca, y como gramos de polifenoles equivalentes a ácido gálico por 100 g de yerba mate seca. 4

5 RESULTADOS Los datos correspondientes al porcentaje de las distintas fracciones, extractos acuosos y sólidos solubles se presentan en la Tabla 1. Para determinar el % de palos de la yerba mate elaborada se realizó una determinación por marca. Tabla 1 - Extracto acuoso, sólidos solubles y porcentajes de las distintas fracciones en las muestras analizadas Extracto acuoso (g % bs) Sólidos solubles (g % bs) % de Fracciones Yerba Marca Mate elaborada Polvo de saquitos Extracción 1 Extracción 2 Extracción 3 Palos Impur. Hojas 1 34,7±3, ,2 0,5 77,3 2 35,2±2, ,0 1,4 75,6 3 26,8±3,11 40,7 ± 0,16 21,8 ± 0,91 11 ± 0,29 37,9 ± 0,92 24,1 0,1 75,8 4 30,4±2, ,8 0,4 74,8 5 41,8±1, ,6 0,7 77,7 6 28,7±2,10 42,4 ± 0,44 23,1 ± 0,51 7,7 ± 0,33 37,3 ± 0,44 22,0 0,5 77,5 7 39,0±1,87 41,5 ± 0,33 27,3 ± 0,34 15,3 ± 0,49 38 ± 0,44 16,6 1,1 82,3 8 35,4±2,32 39,1 ± 0,22 23,8 ± 0,48) 13,8 ± 0,27 37,2 ± 0,6 23,3 0,8 75,9 9 32,6±2,51 40,6 ± 0,43 23 ± 0,42 18,4 ± 0,32 38,1 ± 0,43 24,3 0,6 75, ,3±1, ,7 0,1 75,2 Los datos se expresan como media ± error estándar de 2 o 3 determinaciones. Tabla 2 Contenido de cafeína y humedad de todas las muestras analizadas Muestras Humedad Cafeína Muestras Humedad (YME) (g % bh) (g % bs) (saquitos) (g % bh) 1 6,1 ± 0,03 1,43 ± 0, ,0 ± 0,07 1,25 ± 0, Cafeína (g % bs) 3 5,6 ± 0,09 1,16 ± 0,03 3 7,9 ± 0,4 1,24 ± 0,03 4 6,3 ± 0,02 1,17 ± 0, ,4 ± 0,12 1,17 ± 0, ,4 ± 0,03 1,15 ± 0,02 6 8,5 ± 0,28 1,48 ± 0,03 7 6,9 ± 0,10 1,16 ± 0,01 7 8,2 ± 0,11 1,06 ± 0,03 8 4,9 ± 0,05 1,17 ± 0,01 8 8,3 ± 0,13 1,57 ± 0,01 9 6,2 ± 0,10 1,25 ± 0,02 9 7,7 ± 0,13 1,23 ± 0, ,9 ± 0,06 1,20 ± 0, Los datos se expresan como media ± error estándar de 2 determinaciones. 5

6 En la Tabla 2 se presentan los resultados del contenido de humedad y de cafeína de todas las muestras. Los datos correspondientes al contenido de polifenoles totales obtenidos a partir de dos lecturas por muestra empleando dos muestras por marca según los cuatro métodos de extracción fueron determinados y se presentan en la Tabla 3 y en las Figuras 1 y 2. Los datos se expresan como gramos de polifenoles equivalentes al ácido correspondiente por 100 g de producto comercial seco. Tabla 3 - Cuadro comparativo del contenido de polifenoles totales por marca de yerba mate elaborada y por método de extracción extracción 1 Mateada simulada extracción 2 Tereré simulado extracción 3 Infusión de saquitos extracción 4 Metodología ISO Marca AC AG AC AG AC AG AC AG ,49 ± 0,71 10,70 ± 0, ,97 ± 0,45 8,77 ± 0,25 3 9,6 ± 0,08 5,25 ± 0,05 3,59 ± 0,10 1,97 ± 0,06 20,2 6 ± 0,34 11,12 ± 0,19 16,63 ± 0,22 9,13 ± 0, ,24 ± 1,10 9,46 ± 0, ,60 ± 0,11 9,66 ± 0,06 6 8,35 ± 2,39 5,94 ± 0,07 2,67 ± 0,07 1,46 ± 0,04 18, 27 ± 0,19 10,03 ± 0,11 17,00 ± 0,63 9,34 ± 0, ,81 ± 0,04 6,46 ± 0,02 5,54 ± 0,05 3,04 ± 0,03 18,75 ± 0,26 10,29 ± 0,14 17,45 ± 0,02 9,58 ± 0, ,88 ± 0,01 5,95 ± 0,01 5,23 ± 0,12 2,87 ± 0,07 19,92 ± 0,39 10,94 ± 0,22 18,40 ± 0,15 10,10 ± 0,08 9 9,18 ± 0,09 5,02 ± 0,05 7,10 ± 0,06 3,90 ± 0,04 19, 82 ± 0,50 10,88 ± 0,28 17,59 ± 0,03 9,66 ± 0, ,06 ± 0,11 9,92 ± 0,06 AC: Ácido Clorogénico AG: Ácido Gálico Los datos se expresan como media +/- error estándar Se encontró que el contenido de polifenoles totales (CPT) expresado en equivalentes a ácido clorogénico es mayor al expresado en equivalentes de ácido gálico, lo cual coincide con lo reportado por González de Mejía y col (2005). Esto se debe probablemente a que al ácido gálico se halla en menor proporción que el ácido clorogénico, con lo cual se estaría subestimando el CPT real. 6

7 Gráfico comparativo del contenido de polifenoles totales g equiv a AC/100 g producto seco Marca Mateo simulado Tereré Simulado Mate Cocido (infusión) Metodología ISO Figura 1 - Contenido de polifenoles totales según marca y método de extracción expresado como equivalentes de ácido clorogénico. Gráfico comparativo del contenido de polifenoles totales g equiv a AG/100 g producto seco Marca Mateo simulado Tereré simulado Mate Cocido (infusión) Metodología ISO Figura 2 - Contenido de polifenoles totales según marca y método de extracción expresado como equivalentes de ácido gálico 7

8 De los datos obtenido se puede observar que el CPT extraído mediante el procedimiento de mate cocido (infusión de saquitos) fue ligeramente mayor al CPT extraído con la metodología ISO citada y a su vez bastante mayor al CPT extraído por mateo simulado. Estas diferencias podrían atribuirse a numerosos factores relacionados al método de extracción como ser la polaridad de la fase extractiva, tamaño de las partículas de las muestras, relación peso de muestra/volumen de solvente, tiempo y temperatura de extracción, etc.), y factores relacionados al tiempo y condiciones de almacenamiento de las muestras. En la Tabla 4 se presentan los contenidos promedios generales de polifenoles totales de todas las muestras de yerba mate expresados como ácido gálico y ácido clorogénico para los 4 métodos de extracción estudiados. Tabla 4 - Cuadro de medias generales del contenido de polifenoles totales Ácido de Nro. de Contenido de extracción referencia muestras polifenoles totales* 1 Clorogénico 5 9,96 ± 0,62 1 Gálico 5 5,72 ± 0,26 2 Clorogénico 5 4,82 ± 0,77 2 Gálico 5 2,64 ± 0,43 3 Clorogénico 5 19,40 ± 0,38 3 Gálico 5 10,65 ± 0,21 4 Clorogénico 10 17,54 ± 0,31 4 Gálico 10 9,63 ± 0,17 *Datos expresados en g de polifenoles equivalentes al ácido de referencia/100 g de producto seco Los datos se expresan como media ± error estándar Estimación de las cantidades ingeridas según forma de consumo Considerando un valor promedio de humedades a partir de 10 marcas comerciales igual al 6 % en base húmeda: Mateada: cebando 500 ml de agua a 70 C en un recipiente co n 50 g de yerba mate comercial, se ingieren entre 4,2 g y 5,4 g de polifenoles equivalentes a ácido clorogénico y entre 2,4 y 3,0 g de polifenoles equivalentes a ácido gálico. Tereré: cebando 500 ml de agua a 5 C en un recipiente con 50 g de yerba mate comercial, se ingieren entre 1,2 g y 3,3 g de polifenoles equivalentes a ácido clorogénico y entre 0,7 y 1,8 g de polifenoles equivalentes a ácido gálico. 8

9 Mate cocido (saquitos): considerando un valor promedio humedades del contenido de saquitos de 7 %, y un peso neto por saquito de 3 g, en una infusión preparada con 200 ml de agua a ebullición, se ingieren entre 0,5 g y 0,6 g de polifenoles equivalentes a ácido clorogénico y de 0,3 g de polifenoles equivalentes a ácido gálico. En las Tablas 5 y 6 se presentan valores de polifenoles reportados por diferentes investigadores para otros productos. Tabla 5 Contenido de polifenoles totales reportados en la bibliografía de algunas bebidas Bebida PT (mg eq. AG/100 ml) Fuente bibliográfica Jugo de naranja 62,56 ± 0,49 Bravo y col., (2007) ( Folin- Ciocalteau) Vino tinto 170 ± 80 German, y col., (2000) ( Vino tinto 195,68 ± 1,78 Bravo, y col., (2007) ( Vino rosé 46 ± 13 German, y col., (2000) ( Vino rosé 41,36 ± 0,67 Bravo, y col., (2007) ( Vino blanco 19 ± 29 German, y col., (2000) ( Vino blanco 18,98 ± 0,59 Bravo, y col., (2007) ( Infusión de té negro en saquitos 93,63 ± 2,02 Bravo, y col., (2007) ( Folin-Ciocalteau Infusión de té verde en saquitos 116,22 ± 1,07 Bravo, y col., (2007) ( Infusión de yerba mate en saquitos 148,2 ± 4,3 Brumovsky, y col., (2008) ( Mateada simulada 572,4 ± 54,0 Brumovsky, y col., (2008) ( Tereré simulado 249,0 ± 89,3 Brumovsky, y col., (2008) ( PT: Polifenoles Totales - AG: Ácido Gálico Datos se expresan como media ± desvío estándar 9

10 Tabla 6 Contenido de polifenoles totales reportados en la bibliografía de algunas frutas y verduras PT (mg eq. AC/100 g Fuente bibliográfica producto fresco) Morrón rojo 296 ± 13 Kevers, y col., (2007) ( Uva verde 407 ± 15 Kevers, y col., (2007) ( Manzana 272 ± 13 Kevers, y col., (2007) ( Limón 324 ± 16 Kevers, y col., (2007) ( Frutilla 313 ± 4 Kevers, y col., (2007) ( Tomate 35 ± 2 Kevers, y col., (2007) ( Lechuga 32 ± 1 Kevers, y col., (2007) ( Brócoli 127 ± 32 Kevers, y col., (2007) ( PT: Polifenoles Totales - AC: Ácido Clorogénico Datos se expresan como media ± desvío estándar Relevamiento del contenido de nutrientes en muestras de yerba mate elaborada con palo Los datos presentados en la Tabla 7 corresponden a los nutrientes contenidos en el extracto acuoso obtenidos por el método de extracción 1 (mateada simulada) a partir de 27 marcas comerciales diferentes de yerba mate elaborada con palo. Los datos fueron suministrados por el Programa de Yerba Mate de la Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones (años 2005 al 2008). 10

11 Tabla 7 - Contenido de nutrientes de la yerba mate elaborada obtenido del extracto acuoso a partir de la mateada simulada Nutriente Media DS Valor energético (kcal) 44,3 5,54 Carbohidratos (g) 9,82 1,42 Azúcares (g) 2,97 0,76 Proteínas (g) 1,03 0,18 Grasas totales (g) 0,00 0,00 Grasas saturadas (g) 0,00 0,00 Grasas trans (g) 0,00 0,00 Fibra alimentaria (g) 0,56 0,21 Sodio (mg) 15,66 8,39 Hierro (mg) 1,56 0,51 Calcio (mg) 33,61 10,76 Magnesio(mg) 66,97 32,13 Fósforo (mg) 18,29 5,57 Vitamina B6 (mg) 0,51 0,17 Vitamina C (mg) 2,53 0,67 Tiamina (mg) 0,85 0,30 Niacina (mg) 1,31 0,58 Cafeína (g) 0,38 0,06 Cenizas totales (g) 1,45 0,17 El contenido de grasas totales aparece informado como cero debido a que en el extracto acuoso de la yerba mate estos nutrientes son despreciables. CONCLUSIONES Este trabajo contribuye a afirmar que las infusiones de yerba mate en sus formas habituales de consumo constituyen una fuente importante de polifenoles totales, sobre todo en su forma de consumo tradicional (la mateada) que sería la manera en que aporta la mayor cantidad de estos compuestos. 11

12 BIBLIOGRAFÍA CITADA Bravo, L.; Goya, L., and Lecumberri, E. LC/MS Characterization of phenolic constituyents of mate (Illex paraguarienses, St. Hil.) and its antioxidant activity compared to commonly consumed beverages, Food Researh Internacional 2007, 40, Código Alimentario Argentino Actualizado. Capítulo XV. Productos estimulantes o fruitivos. German, J. B., and Walzem, R. L. The health benefits of wine. Annual Review of Nutrition, 2000, 20, González De Mejia, E.; Soo Song, Y.; Ramírez-Mares, M. V.; and Kobayashi, H. Effect of Yerba Mate (Ilex paraguariensis) Tea on Topoisomerase Inhibition and Oral Carcinoma Cell Proliferation. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, IRAM Nro , 1995 Instituto Argentino de Racionalización de Materiales Norma 20503: Yerba mate: Determinación de la pérdida de masa a 103 ºC. IRAM Nro , 1995 Instituto Argentino de Racionalización de Materiales Norma 20503: Yerba mate: Determinación del extracto acuoso. Kevers, C; Falkowski, M; Tabart J; Defraigne J; Dommes J y Pincelmail J. Evolution of Antioxidant Capacity during Storage of Selected Fruits and Vegetables. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, ) ISO/FDIS :2004 (E) Determination of total polyphenols in tea- Colorimetric method using Folin-Ciocalteau reagent. Part 1. Heck, C.; Schmalko, M.; and Gonzalez de Mejia, E. Effect of Growing and drying Conditions on the Phenolic Composition of Mate Teas (Ilex paraguariensis). J. Agric. Food Chem. (2008), 56,

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