ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y MOLECULAR DE PARÁSITOS INTESTINALES EN NIÑOS MARROQUÍES

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1 Indice ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y MOLECULAR DE PARÁSITOS INTESTINALES EN NIÑOS MARROQUÍES TESIS DOCTORAL CHADIA EL FATNI Granada, 2014

2 Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Chadia El Fatni D.L.: GR ISBN:

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4 Indice ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y MOLECULAR DE PARÁSITOS INTESTINALES EN NIÑOS MARROQUÍES TESIS DOCTORAL Universidad de Granada (España) Instituto de Biotecnología Departamento de Parasitología Chadia El Fatni

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6 Indice El trabajo de investigación que se expone en la presente memoria, titulado: "ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y MOLECULAR DE PARÁSITOS INTESTINALES EN NIÑOS MARROQUÍES ", ha sido realizado en el Departamento de Parasitología Molecular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Granada, bajo la supervisión de la profesora Dra. Dña. Mª José Rosales Lombardo. Granada, octubre de 2014 Tesis Doctoral presentada por Dña. Chadia El Fatni, para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Granada. La Directora del Trabajo Fdo. Dra. Dña. Mª José Rosales Lombardo El licenciada Fdo.Dña. Chadia El Fatni Este trabajo ha sido financiado por la Agencia Española de Cooperación al Desarrollo (A/028401/09), (A/033147/10). Beca MAEC-AECID programa II-A de Becas del Ministerio de Asuntos Exteriores y Cooperación de estudio en España para ciudadanos extranjeros en el curso 2011/2012

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8 Indice OBJETIVOS INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES Parasitosis intestinales: un problema de salud pública Factores asociados a la parasitosis intestinales Los niños y los enteroparásitos Programas de control frente a los enteroparásitos Parasitosis intestinales en Marruecos Giardia, un enteropatógeno muy frecuente Algunos datos epidemiológicos Taxonomía y epidemiología molecular MATERIAL Y METODOS Introducción Ubicación del estudio: lugar y población Descripción de la provincia de Tetuán Población estudiada Fases del estudio Visitas a los colegios Fichas identificativas Estudio del peso y talla Diagnóstico coprológico Recogida de las muestras fecales Procesamiento y análisis coprológico de las muestras fecales Estudio nutricional. Indicadores antropométricos Método empleado y análisis de resultados Entrega de resultados y tratamiento de los niños parasitados Comparación cuantitativa de las técnicas de Faust y Ritchie Análisis molecular de las muestras con Giardia Aislamiento y purificación de quistes Ruptura /digestión de los quistes Extracción de ADN Purificación de ADN Cuantificación de ADN Técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Electroforesis Purificación de los productos obtenidos por PCR Secuenciación Comparación con secuencias publicadas Blast

9 Indice 2.4. Análisis estadístico de resultados RESULTADOS Sobre las características de la población estudiada Nivel de participación de la población en el estudio Prevalencia de enteroparásitos Estudios de índice se parasitación simple (IPS) y corregido (IPC) Estudio comparativo de parasitismo según la zona Estudio del IPS e IPC por edades Estudio comparativo del parasitismo según la edad Estudio comparativo del parasitismo según la edad en cada zona Estudio del IPS y del IPC por sexos Estudio comparativo del parasitismo según el sexo Estudio comparativo del parasitismo según el sexo y por zonas Estudio del IPS y del IPC según la estación de año Estudio comparativo del parasitismo según la estación del año Estudio cualitativo Estudio de la prevalencia de enteroparásitos según la zona Estudio de la prevalencia de enteroparásitos según la estación del año en cada zona Estudio de la prevalencia de enteroparásitos en cada zona según la edad Estudio de la prevalencia de enteroparásitos en cada distrito según la edad Estudio de la prevalencia de enteroparásitos asociados a diarrea Estudio de enteropatógenos Estudios del IPS e IPC por zona Estudio del IPS e IPC por edades Estudio comparativo de IPS e IPC según edad Estudio comparativo del parasitismo por enteropatógenos Según la edad y la zona Estudio del IPS y del IPC por sexos Estudio comparativo del parasitismo por enteropatógenos según el sexo Estudio comparativo del parasitismo según el sexo y la zona Estudio del IPS y del IPC según la estación del año Estudio comparativo del parasitismo por enteropatógenos según la estación del año Estudio de poliparasitismo Estudio del estado nutricional Comparación cuantitativa de las técnicas de Faust y Ritchie

10 Indice 3.8. Caracterización molecular de Giardia PCR SECUENCIACIÓN Estudio comparativo de proporciones de parásitos intestinales en niños de Tetuán Estudio comparativo de proporciones por zonas Estudio comparativo de proporciones por sexos Estudio comparativo de proporciones por estaciones del año Estudio comparativo de proporciones según la edad DISCUSIÓN ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Giardia CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

11 Objetivos OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Concienciar de la importancia actual de los parásitos intestinales en Tetuán mediante un estudio epidemiológico conducente al tratamiento de los niños afectados por enteroparásitos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Estudio epidemiológico de parásitos intestinales en escolares de la provincia de Tetuán (Marruecos). 2. Estudio del estado nutricional de los niños y su posible asociación a enteroparasitosis. 3. Tratamiento de los niños afectados por parásitos intestinales. 4. Caracterización molecular de Giardia, el principal enteropatógeno de los niños estudiados. 1

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13 Introducción y Antecedentes 1. Introducción y Antecedentes 1.1. Parasitosis intestinales: un problema de salud pública Las parasitosis intestinales constituyen un serio problema de salud pública que afecta a la población mundial, no solamente a la de países en vías de desarrollo, produciendo morbilidad y mortalidad considerable. Los enteroparásitos repercuten negativamente en el progreso socioeconómico de un país y afectan al estado nutricional e intelectual de su población. Entre los enteroparásitos humanos existen diversidad de protozoos y helmintos. Sus fases de transmisión o los individuos adultos pueden aparecer en las heces, al igual que también pueden estar presentes formas de desarrollo de otros parásitos pulmonares o hépaticos. En la Tabla 1. Se indican los parásitos más frecuentes, intestinales o no, cuyas fases de transmisión pueden identificarse en las heces humanas. Ultimamente debido al rápido incremento de los viajes intercontinentales, la inmigración y la proliferación de casos de inmunodepresión, se han convertido es afecciones más difundidas y más difíciles de controlar. La frecuencia y el tipo de parásito pueden variar de una región a otra, pero los enteroparásitos no discriminan por raza, sexo, estado económico, o situación geográfica, aunque presenta mayor impacto en los países subdesarrollados, donde sus habitantes no cuentan con infraestructura ni educación sanitaria (Hernandez y cols. 2000). En las áreas rurales de esos países es donde el problema se acentua. La población infantil es la principalmente afectada debido a su inmadurez inmunológica y al poco desarrollo de hábitos higiénicos (Ytalia y cols. 2007). Las parasitosis intestinales pueden afectar el estado general del individuo favoreciendo no solo la anemia y la malnutrición sino también representando una puerta de entrada para otros agentes infecciosos. 3

14 Introducción y Antecedentes TABLA 1 HELMINTOS Nematodes Trematodes Cestodes Ascaris lumbricoides Fasciola hepatica Taenia solium Trichuris trichiura Fasciolopsis buski Taenia saginata Ancylostoma duodenale Fasciola gigantica Diphyllobothrium latum Necator americanus Clonorchis sinensis Opisthorchis spp. Diphyllobothrium pacificum Strongyloides spp. Paragonimus spp. Hymenolepis nana Trichostrongylus spp. Schistosoma mansoni Hymenolepis diminuta Capillaria spp. Schistosoma japonicum Dipylidium caninum Enterobius vermicularis Trichinella spp. Heterophyes heterophyes Metagonimus yokogawai Echinostoma ilocanum Echinochasmus perfoliatus Gastrodiscoides hominis Dicrocoelium dendriticum Acantocéfalos Macracanthorhynchus hyrudinaceus Moniliformis moniliformis PROTOZOOS Amebas Flagelados Coccidios Entamoeba histolytica Giardia duodenalis Isospora belli Entamoeba dispar Chilomastix mesnili Cryptosporidium spp. Entamoeba coli Cyclospora cayetanensis Trichomanos tenax Trichomonas hominis Sarcocystis spp. Entamoeba hartmanni Enteromonas hominis Entameba polecki Retortamonas intestinalis Entamoeba gingivalis Endolimax nana Iodamoeba bütschlii Ciliados Balantidium coli Otros Blastocystis hominis Microsporidium spp. 4

15 Introducción y Antecedentes Entre los síntomas ocasionados, como es lógico, los más generalizados son los de carácter entérico como malestar general, dolor abdominal, nauseas, vómitos, diarrea, flatulencia y en ocasiones fiebre. Pero estos síntomas van más allá, ya que más allá del tracto gastrointestinal van también algunos de los enteroparásitos tales como Entamoeba histolytica, Cryptosporidium,Cyclospora,Ascaris,Strongyloides,Ancylostoma/Necator Por poner algunos ejemplos. Por ello pueden aparecer patologías pulmonares, hepáticas, cerebrales, etc más o menos graves asociadas a parásitos intestinales. En realidad, la patogenicidad o virulencia de los parásitos refleja la interacción dinámica entre estos y el hospedador en una lucha entre el sistema defensivo del huésped y la capacidad evasiva del parásito (Lujan, 2006). Por ello en pacientes inmunodeprimidos como los oncológicos, desnutridos, esplenectomizados, VIH y niños con desnutrición severa los síntomas se exarceban, pudiendo ocasionar la muerte de la persona afectada por enteroparásitos. En los niños, principal población de riesgo, los enteroparásitos se ha visto que también afectan a su desarrollo fisico (talla/peso) y cognitivo, son causantes de gran ausentismo escolar y se asociacian con anemia y desnutrición (Schaible y Kaufmann, 2007; Borrego 2009; Gamboa y cols. 2011). El mecanismo fisiopatogénico del daño es distinto según la naturaleza del parásito; los protozoos normalmente producen diarreas agudas o crónicas por lesiones o reducción del número de vellosidades intestinales, lo cual disminuye la superficie de reabsorción del intestino delgado, o forman úlceras en el intestino grueso que se manifiestan como diarreas disentéricas con mucus, pus y sangre. 5

16 Introducción y Antecedentes Los helmintos suelen producir daños menores en las mucosas pero compiten con el alimento preformado del intestino delgado sustrayendo del huésped, aminoácidos, proteínas, vitaminas, oligoelementos y hierro; esta expoliación de los nutrientes más ricos durante varios años, conduce a la desnutrición crónica, la disminución de peso y talla, y una disminución irreversible de la capacidad cognitiva (Al Rumbein y cols. 2005). Si bien la mortalidad es baja, se estimó hace algunos años que sobre mil millones de personas en el mundo se encontraban infectadas con al menos una especie enteroparásita (WHO, 2012). Pero realmente estos datos se quedarán cortos por la falta de obligatoriedad en su declaración oficial en la mayoría de los países. Según informes de la Organización Mundial de la Salud, una sexta parte de la población mundial se encuentra afectada por helmintos intestinales, llegando a causar alrededor de seis millones de muertes anuales. Entre ellos, los datos más recientes resaltan 1.4 billones de personas afectadas por Áscaris lumbricoides, con uncinarias 1.2 billones y con Trichuris trichuria 1 billón (WHO, 2012). En el caso de los protozoos, Entamoeba histolytica afecta a 50 millones de personas y produce muertes anuales y Giardia lamblia afecta a 200 millones de personas en todo el mundo. Todos ellos pueden generar estados patológicos como infecciones crónicas, afecciones del estado nutricional y por ende el crecimiento y alteraciones de la actividad física así como en el rendimiento académico de esta población (Berrocal y cols. 2006; Neves Santos y cols. 2012). También cabe añadir la relevancia adquirida en los últimos años por parásitos intestinales patógenos humanos como son los coccidios, cuya incidencia ha aumentado espectacularmente debido a su carácter oportunista en pacientes inmunodeprimidos (infectados por VIH, transplantados, etc.) y en población infantil. Entre ellos destacan, por méritos propios, 6

17 Introducción y Antecedentes Cryptosporidium y Cyclospora que son responsable de multitud de epidemias por vía hídrica y alimentaria en todo el planeta (Chalmers, 2014 a,b; Fariza y Bahi, 2013; Slapeta, 2013; Chacín-Bonilla, 2010). No podemos olvidar tampoco, aunque no se considere un protozoo, que el enteroparásitos más frecuentes a nivel mundial es Blastocystis hominis, cuya patogenicidad es objeto de controversia, aunque algunos estudios lo asocian a cuadros abdominales agudos y retraso en el crecimiento y desarrollo infantil (Clark y cols. 2013). Todos estos patógenos no solo ocasionan problemas de salud pública, también ocasionan otros de tipo económico, habiéndose estimado en billones de dólares los gastos ocasionados en atención sanitaria a enfermos afectados por enteroparásitos (Chacón y Leal, 2006). Se evaluaría mejor la importancia que revisten las parasitosis intestinales para la salud pública si se pudiera evaluar cuantitativamente la morbilidad que ocasionan. La disposición que muestran las sociedades a pagar los gastos para controlar o eliminar las enfermedades se podrían aprovechar con facilidad si a quienes formulan las normas de acción del gobierno y a los planificadores de los sevicios de salud se les brindar la oportunidad de comparar análisis de costo-benificio o de eficacia en función de los costos de los diversos caminos a seguir con estimaciones de las pérdidas económicas pronosticadas por causas de morbilidad. Con respecto a las parasitosis intestinales, se podría buscar información cuantitativa acerca de los años de vida potencial perdidos, del número de días saludables perdidos, de las tasas de incidencia, prevalencia y letalidad de la enfermedad, utilizándose a este propósito métodos cuantitativos como los empleados actualmente en otras enfermedades como el cáncer o las enfermedades cardiovasculares. Pero, debe procederse cuidadosamente al seleccionar los parámetros que permitan dilucidar la importancia en salud pública de las 7

18 Introducción y Antecedentes enteroparasitosis debido a las variaciones regionales del alcance del problema. Además la letalidad no es un parámetro útil en el caso de estas afecciones, ya que es escasa, pero los costos para el sistema, los servicios sanitarios y las personas si se pueden medir en términos de pérdida de nutrientes y productividad. Realmente la OMS empezó a ser consciente del efecto económico y social de las parasitosis intestinales en una reunión celebrada en Beers, Países Bajos, en 1983 sobre los aspectos económicos de las enfermedades parasitarias (OMS, 1987), donde se resaltó que enteroparásitos como Ascaris y las uncinarias constituían un serio problema en la economía y calidad de vida de algunas comunidades. Esto se refleja claramente en: a) nutrición, desarrollo y crecimiento, b) trabajo y productividad, c) costos de atención médica. Por todo lo dicho, la OMS desde el año 2001, considera a las parasitosis intestinales como un problema de salud pública mundial y fijó como meta para el 2010, proporcionar tratamiento masivo a un 75% de la población escolar en riesgo; incluyendo además educación sanitaria, interrelación con los programas de salud y saneamiento ambiental apropiado. Aunque esta finalidad se hubiera cumplido, cosa que es cuestionable, los parásitos intestinales siguen y seguirán difundiéndose y afectando a millones de personas en todo el mundo debido a la gran variedad de factores que habría que controlar para su erradicación. Es evidente por todo, que determinar los daños a la salud causados por enteroparásitos, mediante el estudio de causas de morbilidad y determinantes ambientales de la salud, permite obtener una visión panorámica e integral de los avances en salud de la población y sirve para. 8

19 Introducción y Antecedentes establecer con objetividad los programas que es necesario mantener o eliminar para mejorar el estado de salud de la población frente al riesgo de enfermar o morir Factores asociados a la parasitosis intestinales La prevención y control de las enteroparasitosis requiere de la identificación de factores de riesgo locales, sobre todo entre los grupos de alto riesgo. Está claro que los parásitos intestinales, como todos los parásitos, necesitan de unas condiciones medioambientales que aseguren su desarrollo y propagación, ya se trate de parásitos monoxenos o heteroxenos. Así, necesitan de un biotopo, con unas características medioambientales que permitan su superviviencia. Así los suelos aireados y húmedos, con vegetación que los proteja de la desecación y de la radiación solar directa, son los biotopos idóneos, dentro de unos límites de termperatura, para que maduren los huevos de Ascaris o Trichuris, o las larvas las uncinarias. Igualmente, también necesitan de una biocenosis formada por la flora y fauna necesarios para su superviviencia y propagación, ya que deben incluir a los hospedadores intermediarios y definitivos de los parásitos. Entre los factores ambientales implicados en la supervivencia de los parásitos intestinales se encuentra la temperatura que ha de ser preferentemente cálida y la humedad relativa y pluviometría propia de zonas tropicales es también beneficiosa. De otra parte, está claro que la prevalencia de las parasitosis varía según el riesgo de exposición a ambientes insalubres, y están asociados a prácticas higiénicas inadecuadas, tales como hábitos y costumbres en la preparación de los alimentos o problemas en la dotación de agua potable y alcantarillado en poblaciones que viven en condiciones de pobreza, 9

20 Introducción y Antecedentes lo que se traduce en que la prevalencia de parasitosis sea mayor cuando los ingresos económicos de la familia sean menores (Ávila y cols. 2007; Östan y cols. 2007). En un estudio realizado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) refiere que más del 40% de la morbilidad mundial se origina por factores ambientales. Las amenazas ambientales más frecuentes se relacionan con agua, insegura, saneamiento inadecuado de excretas, contaminación del aire, exposición a productos químicos peligrosos y lesiones no intencionales. Muchos de estos factores ambientales son modificables. Tomando en cuenta el contexto global, existen factores que condicionan la infestación por parásitos, estos tienen que ver fundamentalmente con el estado de saneamiento ambiental en que viven las personas, así como con el estilo de vida. Así podemos destacar el inadecuado o ausente tratamiento del agua de consumo, la ausencia de letrinas y redes de distribución y tratamiento de excretas, el empleo de viviendas con piso de tierra, el contacto con animales domésticos y el poco uso de calzado. Mucho habría que hablar sobre la importancia del agua en la transmisión de los enteroparásitos y como desencadenante de procesos diarreicos ya que muchos parásitos intestinales se transmiten a través de agua de bebida, residual o recreacional, y algunos de ellos han desencadenado múltiples epidemias, tal es el caso de Giardia y Cryptoporidium (Karanis, 2011). Estas epidemias por vía hídrica no solo han afectado a países en vías de desarrollo sino a países desarrollados, y a un alto número de individuos por lo que han creado situaciones de alarma que han llevado al establecimiento de costosas técnicas de control protozoológico del agua. Asociados a estos factores medioambientales están los socioculturales. Muy importante es la escasa cultura de la población por lo que la formación sanitaria es prácticamente nula. Esto implica no tener unas 10

21 Introducción y Antecedentes nociones básicas sobre higiene, como el lavado de manos previo a la comida o después de defecar, la inadecuada manipulación de alimentos, y las dietas poco balanceadas que inducen a la desnutrición en el caso de los niños. De otro lado, la precaria capacidad adquisitiva de muchas familias también llevaría a esta estado de deficiente nutrición. Este problema además se ve agravado al no tener, en muchos casos, acceso a los servicios sanitarios. Si bien se ha demostrado que algunos enteroparásitos son causantes de desnutrición infantil (Stephenson y cols. 1993; Gendrel y cols. 2003; Hesham Al Mekhlafi y cols. 2005; Casapia y cols. 2006; Botero y cols. 2009; Inabo y cols. 2011) también sucede lo contrario y los problemas nutricionales podrían, a su vez, influir sobre el estado de infección parasitaria a través de la modulación de la respuesta inmune involucrada en los mecanismos de defensa contra estos parásitos. Es decir, que también existen factores propios del hospedador, como el estado inmunológico, que condicionan el enteroparasitismo o la gravedad de la afección por enteroparásitos. Por eso los niños, con sistema inmunológico inmaduro y más si están malnutridos, son uno de los principales grupos de riesgo para los parásitos intestinales. Por poner algún ejemplo; las Ig E están implicadas en la respuesta inmunológica frente a los helmintos (King y cols. 1993). Se ha demostrado que factores sociales relacionados con el riesgo nutricional son fuertes estimuladores de la producción policlonal de IgE (Hagel y cols. 1993), así como también que en niños parasitados malnutridos los niveles de IgE total son muy elevados, mientras que la respuesta IgE específica al parásito es deficiente (Hagel y cols. 2001). Y además, que al contrario de los niños bien nutridos, después de la aplicación de tratamiento antihelmíntico sostenido y prolongado no se observan cambios en la relación IgE total/ IgE específica en niños malnutridos, lo cual indica que la malnutrición podría favorecer respuestas policlonales de IgE y reducir la capacidad de establecer una 11

22 Introducción y Antecedentes respuesta específica protectora (Hagel y cols. 2001). Esto contribuiría a las reinfecciones continuas que son frecuentes sobre todo en niños. Igualmente pacientes de SIDA, transplantados, tratados con corticoides o mujeres embarazadas, constituyen importantes grupos de riesgo también. En ellos, en base a las deficiencias en su sistema inmunológico, los enteroparásitos se pueden multiplicar más activamente y mejor, e incluso coloniza localizaciones extraintestinales como es el caso de Cryptosporidium spp., Cyclospora cayetanensis, Strongyloides spp, etc.. Otros factores asociados a la actividad humana como son el hacinamiento, o las migraciones, muchas veces forzadas, hacen que se relajen los hábitos higiénicos o se introduzcan enteroparásitos en países donde no existían. Además, el fenómeno de la migración de la población potencia las enteroparasitosis, ya que generalmente se ubica en áreas marginadas con servicios de saneamiento ambiental insuficientes. (Berrocal y cols., 2006) Los niños y los enteroparásitos La OMS consideró a la salud ambiental infantil como uno de los principales retos sanitarios del siglo XXI, luego de celebrar en diciembre de 2002 la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sostenible en Johannesburgo, Sudáfrica. Desde entonces, estimula el desarrollo de estrategias para abordar, divulgar y resolver los problemas ambientales a partir de centros especializados. Esta difusión ha dado origen a un nuevo movimiento en la pediatría, conocido como Pediatría Ambientalista, destinada a diagnosticar, tratar y prevenir las patologías relacionadas con la contaminación del medio ambiente (Gil, 2008). En mayo de 2002, la Asamblea General de las Naciones Unidas sobre la Infancia emitió el documento titulado Un mundo apropiado para los niños, en el que los líderes mundiales acordaron reducir la prevalencia de 12

23 Introducción y Antecedentes las parasitosis intestinales y reconocieron la estrategia de desparasitación masiva como una herramienta útil a este propósito. Las infecciones parasitarias predominan en la población infantil y constituyen una causa importante de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, la pobreza y las condiciones higiénicas limitadas se asocian a una alta frecuencia e intensidad de estas infecciones. Entre las causas de morbilidad infantil a nivel mundial, la producida por parásitos intestinales se sitúa en el tercer lugar, precedida por las infecciones respiratorias agudas y las diarreas de otras etiologías, además son unas de las enfermedades transmisibles más difíciles de controlar, no solo por su gran difusión, sino por los diversos factores que intervienen en su cadena de propagación (Espinosa- Morales y cols. 2011). El conocimiento actual sobre las enfermedades diarreicas, su prevención y control, ha permitido en los últimos años salvar millones de vidas en todo el mundo y contribuir a la supervivencia infantil. A pesar de estos avances, millones de niños y niñas siguen padeciendo estas enfermedades. El tratamiento de los niños en edad escolar constituye la base de la prevención de las enteroparasitosis de la población de un área geográfica (Balcioglu y cols. 2007). Aproximadamente 1.5 millones de niños mueren al año de diarrea, muchos de ellos por parásitos intestinales, y el 90% de estos casos se debe a agua contaminada o falta de higiene (OMS, 2012). Los datos epidemiológicos más recientes sobre enteroparasitosis en niños reflejan más del 80% de prevalencia en países en vías de desarrollo, frecuencia de multiparasitismo del 20% y una de las más importantes causas de mortalidad (Paz Soldán y cols. 2006; Peréz Cordón y cols. 2008; Gamboa y cols. 2011; Garbosa, 2013; El-Sherbini y cols. 2013; Bailey y cols. 2013). 13

24 Introducción y Antecedentes De importancia son las infecciones parasitarias en los niños en edad preescolar y escolares hasta 7 años, quienes son más susceptibles que otros grupos de edad a ellas y las cuales puede tener una profunda repercusión sobre el crecimiento y el desarrollo en los niños. La mayor suceptibilidad de este grupo etario se debe a la inmadurez del sistema inmunológico y a la esposición a lo parásitos por sus juegos y poca práctica de hábitos higiénicos (Londoño, 2009; Alarcón, 2010; Nguyen y cols. 2012). Muchos niños con parásitos intestinales son asintomáticos pero aquellos que presentan síntomas los manifiestan básicamente de dos formas: síntomas gastrointestinales y carenciales. Dentro de los gastrointestinales sobre todo diarrea acuosa o hemorrágica, dolor abdominal, nauseas, vómitos, flatulencia o tenesmo. Los síntomas carenciales se manifiestan con debilidad, palidez e hiporexia entre otros (Gonzalez de la Rosa y cols. 1999). Además, cuando los menores sufren episodios repetidos de diarrea quedan en estado de mayor vulnerabilidad ante la desnutrición y otras enfermedades (Unicef, 2005). La mayoría de los niños en países en vías de desarrollo están infectados de gusanos intestinales (Paz Soldán y cols. 2006; Peréz Cordón y cols. 2008; Gamboa y cols. 2011; OMS 2012) y no es extraño ya que millones de personas en todo el mundo están afectadas por helmintos intestinales. Más de 270 millones de niños en edad preescolar y más de 600 millones en edad escolar viven en zonas con intensa transmisión de geohelmintos y necesitan tratamiento e intervenciones preventivas (OMS, 2013). Estos al igual que los demás enteroparásitos pueden causar malnutrición en los niños y disminuir las posibilidades de crecer, desarrollarse y aprender. Asimismo, la OMS (2013) ha señalado que los niños infectados que reciben tratamiento muestran un aumento espectacular 14

25 Introducción y Antecedentes de la memoria a corto y largo plazo, así como de su capacidad de razonamiento y de comprensión de lectura. Según la OMS (2013) los niños en edad preescolar y escolar constituyen, junto con las mujeres embarazadas, los principales grupo de riesgo de las geohelmintiosis. Y el programa de control frente a helmitos transmitidos por el suelo, iniciado en 2001, tiene como principal meta mundial eliminar la morbilidad causada por las helmintiasis transmitidas por el suelo en los niños de aquí a Ello se logrará mediante el tratamiento periódico de al menos el 75% de los niños en las zonas endémicas (según los cálculos, unos 873 millones) Programas de control frente a los enteroparásitos Los objetivos de los programas de control de las enteroparasitosis están dirigidos fundamentalmente a reducir la morbilidad a corto plazo mediante la atención médica individual, quimioterapia y educación sanitaria. A largo plazo pretenden reducir la prevalencia a través de la mejora del saneamiento, abastecimiento de agua potable y promoción de la higiene personal y alimentaria. En muchos países las infecciones parasitarias intestinales endémicas guardan una relación estrecha con los procesos de desarrollo económico y social y, por consiguiente, el control de aquéllas puede ser una cuestión delicada, tanto social como políticamente. En otros, el control de dichas infecciones ha resultado ser un punto útil de entrada para el despliegue de otras actividades de atención primaria de salud, por ejemplo, en la planificación de la familia, la atención infantil, la educación en materia de salud y la nutrición. En el diseño de programas de prevención y control frente a parasitosis intestinales son esenciales los estudios epidemiológicos más allá 15

26 Introducción y Antecedentes de la mera identificación y del recuento de casos. La elaboración de encuestas exactas de la distribución y del alcance de las enfermedades parasitarias siempre será esencial en la selección de problemas que han de atacarse a través de los programas de prevención y control para observar el progreso y la eficacia de la estrategia elegida. Los descubrimientos recientes en la investigación epidemiológica han contribuido, sin embargo, a que comprendamos mejor cómo se transmiten los parásitos, cómo se regula su número dentro de los huéspedes (tanto personas como comunidades) y cómo puede perturbarse la dinámica de la población afectada por una infección parasitaria dada a los efectos del control. Se han elaborado modelos matemáticos de varias infecciones que permiten predecir los efectos de la interferencia con un aspecto particular de la historia de la vida de un parásito, con una intervención dada, en la prevalencia y la intensidad de la infección en la comunidad. Los modelos matemáticos para formular estrategias de control, planificar la secuencia cronológica y la forma de las intervenciones y pronosticar los resultados serán de poco provecho, a menos que se hayan elaborado sobre la base de datos exactos acerca de la prevalencia e intensidad de las infecciones de helmintos en relación con la edad, y sobre la tasa de incidencia de infecciones protozoarias en relación con la edad. La recopilación de datos debe fundamentarse en diagnósticos fiables y en el muestreo correcto de la comunidad, y al efectuarla habrá que tener en cuenta las variaciones estacionales. El primer paso consiste en estudiar la epidemiología de las infecciones parasitarias intestinales y en recopilar la información existente acerca de la índole y del alcance de aquellas infecciones y otras enfermedades existentes en la zona sometida a estudio. Esa información puede ser suficiente para la evaluación del grado de 16

27 Introducción y Antecedentes prioridad que debe asignarse a la prevención y al control de las infecciones parasitarias intestinales. En la mayoría de los casos, sin embargo, tendrán que obtenerse datos suplementarios mediante encuestas especiales con objeto de definir y cuantificar los problemas de salud, de identificar los sectores de la población particularmente afectados y de evaluar la viabilidad de las medidas de control. Los datos de las encuestas tienen que suplementarse mediante estudios sobre el terreno acerca del comportamiento humano, de las prácticas locales en cuanto a higiene alimentaria, de los métodos de evacuación de heces y de la calidad y accesibilidad del abastecimiento de agua. El comportamiento humano reviste importancia considerable en la transmisión de las infecciones parasitarias intestinales y el éxito de los programas de control quizá depende en última instancia de la modificación de las normas de comportamiento. El comportamiento humano puede ser deliberado o involuntario y puede promover la salud o contribuir a su deterioro. Por ejemplo, la defecación indiscriminada, el uso impropio de las letrinas y el empleo de las heces humanas sin tratar como estiércol son actos deliberados que propician la transmisión de la infección. La buena higiene personal, el uso habitual de calzado y la abstención del consumo de ciertos tipos de alimentos asociados con algunas enfermedades (por ejemplo, la carne de cerdo mal cocinada) reducen la transmisión y el riesgo de infección. En las encuestas que se emprendan como parte de un programa planificado de control debe incluirse la recopilación de información acerca de los valores y normas de la comunidad, su actitud hacia esas infecciones y la reacción general a la intervención proyectada. Es importante, en particular, identificar qué tipos de comportamientos determinados por la cultura y las prácticas locales son desfavorables para la salud y sería 17

28 Introducción y Antecedentes necesario modificar con objeto de reducir el riesgo de infección, cuáles son beneficiosos y necesitarían reforzarse para realzar el cumplimiento del programa de control. Una vez que se han sentado los cimientos epidemiológicos, puede adoptarse una decisión de principios normativos en cuanto a si ha de iniciarse o no un programa en gran escala. Si la decisión es afirmativa, es esencial una formulación clara de los objetivos específicos que se pretenden alcanzar para la planificación apropiada del programa, la selección de estrategias y los métodos para ponerlas en práctica, la fijación de metas, el seguimiento y la evaluación. El objetivo global a largo plazo es reducir la prevalencia, intensidad y gravedad de las infecciones parasitarias intestinales a niveles a los que éstas cesen de ser importantes para la salud pública. En este contexto, la expresión a corto plazo abarca la cobertura de unos pocos años, en tanto que la expresión a largo plazo se refiere a un decenio o más. El enfoque básico consiste en interrumpir la transmisión mediante: a) la introducción, el uso y el mantenimiento de medidas de saneamiento eficaces; b) la promoción de métodos de evacuación inocua; c) el abastecimiento de agua potable; y d) la promoción de la higiene personal y alimentaria. Usualmente esas medidas surten efecto con lentitud, exigen una inversión considerable y necesitan ir acompañadas de actividades de desarrollo social, económico y educacional. Con los objetivos a corto plazo se aspira a controlar la enfermedad con rapidez, lo cual es crucial si se desea obtener el apoyo y la cooperación de la comunidad. Dichas medidas, por lo tanto, deben dirigirse hacia aquellos sectores de la población que se encuentran en mayor riesgo. Por ejemplo, en el caso de enfermedades helmínticas esto quiere decir la aplicación de quimioterapia en masa o 18

29 Introducción y Antecedentes selectiva con antihelmínticos y, en el caso de la infección por uncinarias, la utilización de antihelmínticos suplementados con hierro. Cuando las infecciones y enfermedades parasitarias intestinales constituyen un problema de salud importante, el programa de prevención y control debe incorporar componentes a plazos cortos y largos. Las medidas a corto plazo se precisan para lograr un efecto temprano y las medidas amplias a largo plazo se necesitan para reducir la transmisión por debajo del nivel que se requiere para mantener la infección. Desde 1987 hasta la actualidad algunos de los objetivos de la OMS en el control de las parasitosis intestinales son los siguientes: A) En el caso de la ascariosis el objetivo a corto plazo es atenuar la intensidad de la infección a niveles a los que los efectos perniciosos en el estado nutricional y las manifestaciones de obstrucción intestinal en los niños sean poco comunes. Esto se puede lograr por medio de la quimioterapia, enfocada hacia los sectores de la población más acentuadamente infectados (los niños de corta edad) o los más vulnerables (los niños desnutridos). El control de la ascariasis pulmonar, biliar y de otros estados relacionados con la migración de vermes adultos en el cuerpo y la alergia por Ascaris requiere el logro de una reducción sustancial de la prevalencia general de A. lumbricoides, lo que representa un objetivo a largo plazo que se puede alcanzar con una mejora del saneamiento, suplementada por la quimioterapia en gran escala. B) En la infección por uncinarias el objetivo a corto plazo debe consistir en reducir la morbilidad y la mortalidad debidas a la anemia producida por las uncinarias y, en el logro de este objetivo, los centros periféricos de salud tienen una función crucial que desempeñar. El objetivo a largo plazo, la disminución de la prevalencia total, demanda 19

30 Introducción y Antecedentes que se mejoren en general el saneamiento y la higiene, y su logro se puede acelerar mediante la aplicación de medidas específicas sanitarias y quimioterapéuticas. C) En lo que se refiere a la estrongiloidiosis el objetivo a corto plazo es prevenir la infección intensiva o diseminada. Esto se puede llevar a cabo mediante el examen. El tratamiento si es necesario, de los que se encuentran en riesgo especial (es decir, las personas con alguna malignidad o alteración de la inmunidad o los pacientes que están a punto de recibir medicamentos inmunosupresores para operaciones de transplante de órganos). En el caso de la infección por «S. fuelleborni» (por ejemplo, en Papua Nueva Guinea), la quimioterapia profiláctica y el tratamiento bien organizado de casos corrientes deben contribuir a salvar las vidas de lactantes a menos que alguna encuesta indique que se necesitan mejores medidas de control. El mejoramiento del nivel de vida en general reducirá la prevalencia de la estrongiloidiasis pero no la erradicará debido a que la infección se transmite con facilidad de una persona a otra y es de duración sumamente prolongada. D) En lo atinente a la teniosis por T. solium el objetivo a corto plazo es reducir la mortalidad y la morbilidad debidas a la neurocistercercosis, lo cual es probable que se pueda lograr por medio de la quimioterapia en gran escala en zonas hiperendémicas. El objetivo a largo plazo debería consistir en la reducción global de la prevalencia de la teniasis mediante la supervisión apropiada de casos, la detección y el tratamiento tempranos de la infección, la inspección regular de la carne y la mejora del saneamiento y la higiene veterinaria. La educación en materia de salud y la participación de la comunidad revisten importancia particular en los programas de control de T. solium. 20

31 Introducción y Antecedentes E) En la himenolepiosis debe ponerse interés particular en la prevención y el control de epidemias de H. nana en instituciones infantiles y hospitales. La reducción a largo plazo de la prevalencia de- manda el mejoramiento de la higiene personal más que medidas sanitarias generales. F) En lo que se refiere a la amibiosis el objetivo a corto plazo consiste en reducir la mortalidad y la morbilidad debidas a la disentería amibiana y a amibiosis extraintestinal. Esto se puede lograr mejorando el saneamiento, la higiene personal y alimentaria y la calidad del agua y su abastecimiento, así como mediante el diagnóstico y el tratamiento de casos individuales. La reducción de las tasas de prevalencia se puede alcanzar aplicando las medidas higiénicas no específicas mencionadas antes, que en general son esenciales para la prevención y el control de la mayoría de las infecciones intestinales y diarrea de origen vírico, bacteriano o parasitario. G) En el caso de la giardiosis el objetivo a corto plazo es prevenir y controlar las epidemias en poblaciones que comparten las fuentes de agua o en instituciones (como centros de atención diurna, orfanatos y hospitales para tratamiento de enfermedades mentales). En todos aquellos casos en que la tasa de prevalencia global exceda del 10 % deberá intentarse reducir el número de casos mediante la aplicación de medidas higiénicas no específicas. A continuación hay que establecer las prioridades, costos y beneficios y la decisión de establecer un programa de control de enfermedades parasitarias intestinales puede que dependa de la evaluación de las ventajas del control. En otras palabras, urge decidir si los beneficios previstos del control pueden justificar plenamente los costos de las medidas necesarias, en particular cuando hay limitaciones de recursos y otros problemas de salud. 21

32 Introducción y Antecedentes Las razones que justifican el control de las parasitosis intestinales son claras: a) Cada vez se tienen más pruebas de que dichas infecciones revisten gran importancia para la salud pública debido al efecto directo que ejercen en la salud y a que contribuyen a que se produzcan otras condiciones patológicas. b) La experiencia adquirida en el uso correcto de los medicamentos modernos ha hecho que el control de esas infecciones sea a la vez viable y eficaz. c) La aplicación de medidas para combatir los parásitos intestinales promueve el desarrollo de programas integrados de salud a nivel de la comunidad. Esas medidas son acogidas con beneplácito por las comunidades y tienen un efecto psicológico beneficioso que propicia el mejor cumplimiento de las otras partes de un programa integrado de salud y desarrollo. El proceso de planificación debe incluir enfoques analíticos para estimar los costos y beneficios comparativos de los diferentes programas de salud. Además, deberán hacerse evaluaciones del efecto potencial de diferentes estrategias y políticas no sólo en el estado de salud de la población que se va a cubrir, sino también de los cambios experimentados en los conocimientos, la actitud y el comportamiento de la gente. Se deben evaluar, por tanto, los beneficios directos e indirectos. El costo de la prevención y del control de las parasitosis intestinales es mínimo cuando el programa está estructurado de tal manera que sus varios componentes sean parte de la rutina establecida del trabajo de salud de la comunidad, como la atención de salud maternoinfantil, la atención de los niños de edad escolar, la educación en materia de salud y el saneamiento ambiental. Los costos adicionales corresponden en gran parte a los laboratorios de diagnóstico y a los antihelmínticos, en tanto que el coste de personal y de transporte es relativamente menor. 22

33 Introducción y Antecedentes Por último hay que aplicar las estrategias adecuadas mediante el control de las epidemias, el tratamiento de los casos y los proyectos de orientación comunitaria. La mira de los proyectos de orientación comunitaria debe de ser doble: a) controlar las propias infecciones parasitarias intestinales prevalecientes localmente y b) promover la cooperación de la comunidad en cuestiones de salud utilizando un programa de control de esa índole como medio de lograr un desarrollo general. Además, las actividades relacionadas con la prevención y el control de infecciones parasitarias intestinales tendrán que llevarse a cabo en general a través de otros programas importantes de salud, a saber: abastecimiento de agua y saneamiento, control de las enfermedades diarreicas, atención de salud maternoinfantil, programas de alimentación, inocuidad de los alimentos, educación en materia de salud y salud ocupacional. La quimioterapia se ha convertido en un instrumento potente para controlar helmintiasis intestinales graves, aunque su eficacia para controlar las infecciones protozoarias intestinales es menos evidente. Aun cuando la quimioterapia orientada hacia la comunidad proporciona resultados inmediatos el efecto puede ser pasajero si el tratamiento no se repite a intervalos apropiados por espacio de algún tiempo o si no es apoyado por medidas sanitarias y programas de educación en materia de salud. La quimioterapia se utiliza tanto en la atención médica de particulares como en proyectos basados en la población. Toda decisión en cuanto a utilizar la quimioterapia en gran escala debe fundamentarse en los resultados de una encuesta de la distribución y transmisión de parásitos intestinales en una zona dada y en objetivos claramente definidos. La tecnología aplicada al saneamiento también es fundamental Las 23

34 Introducción y Antecedentes infecciones parasitarias intestinales mantendrán su prevalencia en tanto que la gente no tenga acceso fácil y cómodo al abaste- cimiento de agua potable y a las instalaciones higiénicas para la eva- cuación de las excretas humanas. El abastecimiento de agua potable y la provisión de mejores servicios de saneamiento y su utilización contribuirían en escala importante a la prevención y al control de enteroparasitosis. Por último es necesario valorar la eficacia del programa aplicado. En la práctica, la prevención y el control de infecciones parasitarias intestinales dependen de encuestas iniciales exactas y fiables y de la observación apropiada de la evolución de los programas de intervención. Debe prestarse atención particular a los instrumentos de diagnóstico, a la entrega y al uso de los medicamentos, a la elección de la tecnología sanitaria y a la educación en materia de salud para particulares y la comunidad. El trabajo epidemiológico, efectuado a través de la vigilancia de la población, constituye un componente esencial de todo programa de prevención y control. La vigilancia permite a los funcionarios de salud observar la evolución de los programas de control y modificarlos, según sea necesario. Por último, la vigilancia epidemiológica actúa como un sistema para el seguimiento a largo plazo de la prevalencia de las infecciones en relación con las medidas de control establecidas. En el trabajo de vigilancia deben verificarse con todo detenimiento los factores que determinan la incidencia y distribución de una infección parasitaria intestinal. Es importante recopilar y analizar datos sobre la prevalencia e intensidad de la infección por edad, sexo, situación socioeconómica de la población, ubicación geográfica de la zona cubierta y variaciones estacionales en la zona. Los principales elementos de una estrategia de vigilancia pueden ser: a) las encuestas epidemiológicas de la población para determinar la prevalencia distribución e intensidad de la infección, 24

35 Introducción y Antecedentes donde fuere el caso: b) el registro de la mortalidad y c) la notificación de la morbilidad. Los datos demográficos son necesarios toda vez que contribuyen a la interpretación de los resultados de las encuestas epidemiológicas y permiten hacer estimaciones de los suministros que se precisan para llevar a cabo los programas de prevención y control. La OMS (2001) hace incapie entre las parasitosis intestinales a las helmintiosis transmitidas por el suelo y la esquitosomiosis, incluidas dentro de las llamadas enfermedades desatendidas. Las enfermedades desatendidas son un grupo de enfermedades parasitarias y otras enfermedades infecciosas que se caracterizan por la inversión destacablemente baja del sector farmacéutico en ellas y porque principalmente afectan a los grupos más desfavorecidos de la sociedad. Entre estas enfermedades se incluyen las parasitosis intestinales, principalmente las geohelmintiosis por Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale y Necator americanus y la esquistomiosis. En mayo de 2001, los miembros de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se reunieron para implementar e integrar una estrategia de prevención y control para la esquistosomiasis y las helmintiasis a través de la resolución 19 de la 54th World Health Assembly (WHA54.19). La Asamblea reconoció el abastecimiento sanitario y de agua segura (agua potable) como elementos esenciales. Se subrayó que la medida más adecuada para lograr disminuir la morbilidad y mortalidad, para mejorar la salud y el desarrollo de las comunidades infectadas es el tratamiento de los grupos de alto riesgo, especialmente niños en edad escolar, y el acceso a fármacos desde los servicios de atención primaria. En el documento final del período extraordinario de sesiones de la Asamblea General de las Naciones Unidas sobre la infancia (mayo de 2002), titulado «Un mundo apropiado para los niños», los líderes mundiales 25

36 Introducción y Antecedentes acordaron «reducir la incidencia de los parásitos intestinales» y «reducir en un tercio la prevalencia de la anemia, incluida la anemia ferropénica, para el año 2010». La declaración conjunta OMS-UNICEF (2004) que lleva por título Prevención y control de la esquistosomiosis y las helimintiosis transmitidas por el suelo ya indicaba que Las estrategias globales e integradas de prevención y control de las infecciones por helmintos, incluido el tratamiento vermífugo regular de las personas en riesgo, puede tener importantes repercusiones en la salud, el crecimiento y el desarrollo cognitivo de los niños. A fin de promover y proteger los derechos de los niños, entre ellos el «el derecho del niño al disfrute del más alto nivel posible de salud y a servicios para el tratamiento de las enfermedades y la rehabilitación de la salud» (Convención sobre los Derechos del Niño), hay que hacer frente de forma eficaz a las enfermedades que suponen una carga excesiva para su salud y desarrollo. Además, la creación de un entorno educativo seguro, saludable, inclusivo y con una distribución equitativa de los recursos que fomente la excelencia del aprendizaje, es una condición importante para que se cumpla el derecho de todos los estudiantes a tener una educación de buena calidad. En esta misma declaración se indica el ejemplo de Sudáfrica: tratamiento vermífugo de los escolares para mejorar el aprendizaje en que en un poblado rural de Ciudad del Cabo, Sudáfrica, los profesores y los padres observaron que los niños que se quedaban dormidos en la escuela eliminaban gran número de gusanos en las heces o los vómitos. Una amplia encuesta realizada en las 12 escuelas primarias de la zona reveló que más del 95% de los niños estaban infectados por gusanos. Estos resultados alarmantes llevaron a la formación de un grupo de trabajo cuyo objetivo fue obtener de las empresas privadas recursos para administrar tratamiento vermífugo a los niños. Cada 6 meses, los profesores y las enfermeras escolares administraron 26

37 Introducción y Antecedentes tratamiento vermífugo a más de niños, con lo que la proporción de niños infectados se redujo a menos del 20%. Aprovechando el éxito de este programa de tratamiento vermífugo, el grupo de trabajo prosiguió su labor con las comunidades escolares. El resultado ha sido que todas las escuelas han establecido planes de acción para mejorar el entorno escolar y han integrado en sus programas la educación sobre la higiene; a la hora de asignar recursos para el saneamiento, el gobierno local ha comenzado a darle prioridad a las escuelas. Igualmente incentivadas por la OMS se han desarrollado muchos Proyectos de Escuelas Saludables en Latinoamérica en base a la definición Un espacio para la transformación social, con el compromiso de formar ciudadanas y ciudadanos plenos de derechos, fundamentado en los principios de igualdad, equidad, libertad, solidaridad y justicia social, donde niños, niñas y adolescentes logran un armonioso desarrollo biológico, emocional y social, con estilos de vida saludables, en un ambiente de bienestar, compartido con sus familias, docentes, personal de la escuela y comunidad, bajo un enfoque integral, integrador y participativo. Todos trabajando por un fin común, formar generaciones futuras con cultura de salud integral y desarrollo humano Es importante también recordar (OMS-UNICEF, 2004) que para poner en práctica cualquier programa de control de las helmintiosis y conseguir que llegue a las mujeres y a los niños será necesario vincularlo con los programas esenciales de los países que ya estén en marcha y colaborar con las actividades regionales, nacionales y locales ya existentes. Esto podría incluir: la estrategia de AIEPI (Atención Integrada de las Enfermedades Prevalentes de la Infancia), incluida la AIEPI comunitaria; los programas basados en las escuelas, como Saneamiento e Higiene y FRESH (Concentración de Recursos en la Sanidad Escolar); programas de suplementación de vitamina A; salud maternoinfantil; salud reproductiva, 27

38 Introducción y Antecedentes incluida la iniciativa Reducir los Riesgos del Embarazo; hacer Retroceder el Paludismo; programa Ampliado de Inmunización; agua y saneamiento ambiental. Se concluye que El tratamiento vermífugo mejora la salud, la nutrición y el desarrollo físico, hace que el embarazo sea más seguro y mejora su desenlace. Además, es barato; un programa escolar de tratamiento vermífugo suele costar entre US$ 0,25 y US$ 0,50 por niño y año. El tratamiento es seguro, incluso cuando se administra durante el embarazo o a niños no infectados. Por último, el tratamiento vermífugo puede añadirse fácilmente a actividades y programas ya existentes en los servicios de salud, a los programas de salud escolar y a campañas sanitarias especiales. Cuando se acompaña de actividades de saneamiento e higiénicas apropiadas, destinadas a prevenir la reinfección, el tratamiento vermífugo regular puede tener impacto a largo plazo. La administración coordinada y masiva de medicamentos para tratar varios tipos de parásitos intestinales se convirtió en una norma internacional a partir de este punto. Poco después, el secretariado de la Organización Mundial de la Salud empezó a fortalecer las alianzas a fin de hacer que los parásitos intestinales tuvieran una mayor prioridad entre los defensores y practicantes de la salud pública. Estas alianzas convergieron para determinar los métodos más efectivos para aunar los compromisos políticos mostrados por los Estados Miembros y los enfoques técnicos respaldados por la Asamblea Mundial de la Salud. La publicación de la Organización Mundial de la Salud del año 2006 titulada Quimioterapia Preventiva para las Helmintiasis Humanas: Uso Coordinado de Medicamentos Antihelmínticos en las Intervenciones de Control, fue el primer manual para los profesionales de la salud sobre la manera de tratar los parásitos intestinales, y les ha ofrecido a los médicos y planificadores de la salud una orientación en 28

39 Introducción y Antecedentes riesgo y reducir el reservorio de la infección. También resalta que son esenciales alianzas entre las instituciones gubernamentales (incluyendo las escuelas), la sociedad civil y el sector privado para las campañas exitosas de desparasitación (OPS, 2011). El control integral de las helmintiasis intestinales necesita de la participación activa de la comunidad y de esfuerzos coordinados multidisciplinarios e interinstitucionales para el desarrollo de estrategias apropiadas. Se indica también que las geohelmintiosis, en particular, requieren de la integración de acciones para el saneamiento y otras intervenciones ambientales necesarias, la provisión de agua potable, la mejora de la vivienda y de las condiciones de vida, la promoción de hábitos apropiados de higiene personal y colectiva y la introducción de normas para la producción, manejo y consumo de alimentos en el ámbito familiar y comunitario. El médico y el equipo de salud directamente vinculado a la comunidad, juegan un rol fundamental como efectores de acciones específicas, en la educación, la consejería permanente y el estímulo para la incorporación de hábitos adecuados por parte de la comunidad, que sirvan de base para la prevención y el control efectivo de estas y otras enfermedades transmisibles (OPS, 2003). Recientemente, en 2012 la OMS publicó Eliminación de helmintiosis transmitidas por el suelo como un problema de salud pública en niños. Progresos desde y plan estratégico y volvió a analizar las estrategias de control de las helmintiosis transmitidas por el suelo consistente en controlar la morbilidad tratando periódicamente a las personas en situación de riesgo que viven en zonas endémicas. Las personas en riesgo son las siguientes: niños en edad preescolar, niños en edad escolar, mujeres en edad fecunda (en particular las embarazadas durante el segundo y tercer trimestres de la gestación y las 29

40 Introducción y Antecedentes mujeres lactantes), y adultos con algunas ocupaciones de alto riesgo, como recolectores de té o mineros. La OMS recomienda el tratamiento farmacológico (vermífugo) periódico sin diagnóstico individual previo para todas las personas en situación de riesgo que vivan en zonas endémicas. El tratamiento debe administrarse una vez al año si la prevalencia de helmintiasis transmitidas por el suelo en la comunidad supera el 20%, y dos veces al año si la prevalencia supera el 50%. Esta intervención reduce la morbilidad porque hace disminuir la carga de gusanos. Además, la educación sobre salud e higiene reduce los casos de transmisión y reinfección porque fomenta la adopción de conductas saludables; también es importante que haya unos sistemas adecuados de saneamiento, pero ello no siempre es posible en los entornos con pocos recursos. Las actividades de control se centran en la morbilidad. El tratamiento periódico de las poblaciones en riesgo reducirá la intensidad de la infección y la morbilidad de las personas infectadas. El tratamiento vermífugo periódico se puede integrar fácilmente en los días de salud infantil o los programas de suplementación entre los niños en edad preescolar, o bien en los programas de salud escolar. En 2011, más de 300 millones de preescolares y escolares recibieron tratamiento con antihelmínticos en los países donde estas parasitosis son endémicas, cifra que corresponde a un 30% de los niños en riesgo. Las escuelas constituyen un punto de entrada especialmente idóneo para las actividades de desparasitación, ya que permiten aplicar fácilmente el componente de educación en salud e higiene, insistiendo por ejemplo en el lavado de las manos y la mejora del saneamiento. 30

41 Introducción y Antecedentes La OMS actualmente indica que el 24% de la población mundial están afectados por enteroparásitos. Las ascariosis afecta a cerca de 1 billón de personas, la trichuriosis 795 millones y las uncinariosis 740 millones; de ellos 270 millones son niños en edad preescolar y 600 en edad escolar. Por ello estas enfermedades siguen preocupando. La meta mundial (OMS 2012, OMS 2013), de este programa de control, iniciado en 2001, consiste en eliminar la morbilidad causada por las helmintiosis transmitidas por el suelo en los niños de aquí a Ello se logrará mediante el tratamiento periódico de al menos el 75% de los niños en las zonas endémicas (según los cálculos, unos 873 millones). Los estados miembros de la Organización Panamerica de la Salud, en Latinoamérica apoyando esta iniciativa se han comprometido a reducir antes del 2015 la prevalencia de geohelmintiosis a menos del 20% en niños en edad escolar viviendo en áreas de alto riesgo de infección. En Africa se estiman en 400 millones las personas afectadas por geohelmintiosis y 200 millones por esquistosomiosis por lo que OMS/AFRO está llevando a cabo los correspondientes programas de control también en África y que en el caso de la esquistosomiosis, al igual que en el resto de los países, se basan en: tratamiento preventivo, control de caracoles, saneamiento y educación sanitaria. Podemos decir que el 90% de las personas que están recibiendo tratamiento frente a la esquistosomiosis viven en África. La Fundación Bill and Melinda Gates está financiando programas de control nacionales para la esquistomiosis y las infecciones por helmintos en varios países de África (Uganda, Tanzania y Zambia). Esta fundación mediante la Iniciativa para el Control de la Esquistosomiosis puso en marcha en 2003 programas de control en Burkina Faso, Mali y Níger que priorizaban el uso de los propios recursos, e identificaban zonas endémicas de alto riesgo donde existía un acuerdo político para el control de la esquistosomiosis. 31

42 Introducción y Antecedentes Se seleccionó para cada país la estrategia de control más adecuada y se aportó evidencia sobre el impacto positivo de los programas de control sobre la prevalencia e intensidad de la infección y de la morbilidad. En América 4 países son endémicos de esquistosomiosis: Brasil, Venezuela, Suriname y Santa Lucía, y la OPS en Resolución su resolución CD49.R19 de 2009 se propuso como meta para el 2015 reducir la prevalencia en aquellos países donde la transmisión fuera de al menos el 10%. Posterior a esta fue la Resolución WHA de la Asamblea de Salud Mundial en la que se hace un llamamiento a los países endémicos para que se reduzca la transmisión y se acelere la eliminación de la enfermedad antes del OPS/OMS colaboran unidas en países endémicos de esquitosomiosis para obtener la donación de medicamentos, monitorizar y luchar para interrumpir la transmisión y eliminar la esquisomiosis. En la Región del Pacífico Occidental 4 países son endémicos de esquistomiosis: Camboya, China, Laos y Filipinas. Desde 2010 se han tratado a más de personas. La experiencia de China y Egipto demuestra que la quimioterapia preventiva y el tratamiento masivo con praziquantel pueden dar significativos resultados en los índices de infección y que el tratamiento durante la niñez es probable que evite la enfermedad en la edad adulta.n 1.5 Parasitosis intestinales en Marruecos Históricamente, los parasitismos intestinales ya eran conocidos en Marruecos por los antiguos médicos árabes. La disentería amebiana aparece en libros como Kitab arrahma y Talhil al manafi descrita por Averrhoes y en Cannon de la Medicine por Avicenna, donde le da diferentes denominaciones como Zahir y Sahj (Bouceta, 1952). 32

43 Introducción y Antecedentes La palabra Sahj deriva de una raíz de la lengua árabe clásica significando la erosion. Su uso ha desaparecido, siendo sustituido por los términos Zehma en Fes, Tekdia en Marrakech y Ujaa el Kalb en las tribus del norte de Marruecos. El médico del XII Avenzohair describe la disentería en su libro Taysir como enfermedad de origen hídrico (Faraj, 1952). Realmente los datos sobre enteroparasitosis son confusos, pero haciendo una breve reseña histórica, podemos observar que estos parásitos persisten casi con prevalencia similar a la reflejada en la escasa bibliografía existente al respecto. Así podemos encontrar referencias de estudios llevados a cabo en Marruecos sobre enteroparásitos durante los años del protectorado. M. Grall y Hornus (1908) en un estudio realizado en el Hospital Militar de Casablanca, con un total de 379 enfermos diagnosticaron Entamoeba histolytica en 104 de ellos, lo que supone un índice de parasitación simple (IPS) de 0,27. En 1911, un médico de una misión militar francesa diagnosticó diez casos de abscesos amebianos que fueron intervenidos quirúrgicamente en 1911 y En Fez en el Hospital Auvert, en 1913 Hornus realizó exámenes de muestras fecales de 200 individuos, entre el 20 de agosto y el 20 de noviembre de 1913, encontrando 11 positivos a amebiasis, es decir un índice de parasitación simple de 0,05. En 1921 Jausion y Dekster, en Fes examinaron muestras fecales, siendo 392 positivas a E.histolytica, IPS=0,14. También en Fez, y un año después, Jausion y Dekester sobre enfermos hospitalizados por enteropatías encuentran en 714 de ellos parasitosis intestinales, IPS 0,44. 33

44 Introducción y Antecedentes En 1922 M. Jausion en Fez llevo a cabo exámenes coprológicos encontrando una tasa de infestación por Giardia intestinalis de un 46%. En 1923 Jausion y Dekester detectan un 10% de portadores de Giardia, entre enfermos hospitalizados por perturbaciones digestivas, y tan solo cuatro entre 100 sujetos sanos. En 1925 en Fez, Deschiens, durante el mes de octubre, sobre 959 enfermos afectados de perturbaciones digestivas, detecta un IPS de 0,07 relativo a flagelados intestinales, un 0,18 para amebas y un 0, 037para ambos grupos de protozoos. En 1932 Eduardo Ortiz de Landazuri, en el hospital militar de Tetuán detecta un índice de parasitación simple de 0,61. Sobre 75 exámenes coprológicos de los individuos sanos, habitantes de la Kabila de Ben Bousra, detecta 35 positivos, es decir un índice de parasitación de 0,466. Deschien y Melnotte (1933) en Fez, practican exámenes coprológicos (de octubre de 1923 a marzo de 1924), en el laboratorio de los hospitales Cocard y Auvert. Sobre un total de 665 muestras, detectan 90 individuos con parasitación intestinal, IPS=0,13. En 1936 Flye Ste Maria en Fez encuentra en pacientes que padecían de enteropatías agudas o crónicas. 61casos fueron positivos de amebiasis disentérica entre 346 muestras fecales examinadas. En otros exámenes en el mismo hospital de 236 de materias fecales, detectaron formas vegetativas o quistes en un 0,28% de los casos. En 1936 el mismo autor lleva a cabo una encuesta en Fez sobre 236 adultos, encontrando un 0, 22% positivos a Chilomastix mesnili y un 0,45% a Pentatrichomonas y a Enteromonas. 34

45 Introducción y Antecedentes En los años 1938 al 1942, Benlinger y Bailly hallaron 112 casos positivos a protozoos y helmintos en un total de 501 exámenes coprológicos efectuados en Tánger. El índice de parasitación simple 0,223. Flye Ste Marie en 1943 en 348 muestras de niños detecta un IPS de 0,052 para Chilomastix mesnili y de 0,115 para Pentatrichomonas y Enteromonas. Jourencel (1945) en Casablanca halla una tasa de infestación del 20% para Giardia intestinalis en enfermos que presentaban perturbaciones digestivas. Estos exámenes se efectuaron en el Instituto Pasteur. En 1951 Gand y Chedecal en Berguent sobre 457 exámenes coprológicos encontraron un 18% positivos para Chilomastix mesnili, un 19% para Pentatrichomonas y un 23% para Enteromonas. En 1952 Al Fasi examino 402 muestras coprológicos de niños escolarizados. El índice de la parasitación simple IPS fue 0,41. Los mismos autores publican en 1955 para la zona Noroeste que la tasa de infestación por Giardia intestinales en 1943 era 10% para 399 niños escolarizados en Fez y del 20% para 300 niños escolarizados en Immouzer du Kander.En 1951 era 33% en 457 niños escolarizados en Berguem y 17% en 1955 en 280 niños escolarizados en Tahla. Entre 1949 y 1956 el número de casos de amebiasis en Marruecos ascendió anualmente en unos Este número podría extrapolarse a unos para la totalidad del país, lo que supondría un 5% de la población. En 1962 Deschiens ofreció los datos estadísticos del laboratorio provincial de Fez, hospital Ibn Khatib. Fruto del examen de muestras coprológicos, había encontrado una frecuencia de infestación por Entamoeba histolytica de 0, casos de los 88 estudiados manifestaron un síndrome disentérico. Por otra parte, Deschiens llevo a cabo análisis coprologicos durante el mes de febrero de 1963 en Fez detectando que un 20%de los casos 35

46 Introducción y Antecedentes presentaban síndromes cólicos agudos o subagudos, en los cuales aparecían las formas vegetativas de tipo histolytica o minuta de la amebiasis disentérica. En 1967 Tinta Renau detectan formas atípicas de los quistes de Giardia intestinalis aproximadamente en un 16% de los portadores de los parásitos, constatando que los periodos negativos superan a veces 25 días y en un 10%de los exámenes la densidad de los quistes es muy débil. En una investigación sobre la forma parasitaria de medio rural entre 1188 individuos examinados encontraron un 0,11(IPS) portadores de los quistes de Giardia intestinalis y 0,037IPS eran portadores de quistes que ellos denominaban azules. Entre Belkhayat en Tánger señala una tasa global de infestación por protozoos de 0,0075(IPS), y para helmintos de 0, 1709 (IPS) sobre un total de 1737 exámenes coprológicos. En 1970 Cadi Soussil en Rabat en enfermos de afecciones digestivas encuentra 0,22 (IPS) portadores de protozoos y 0,024(IPS) portadores de helmintos. En 1974 Sequat Mohamed realizo un trabajo sobre el parasitismo intestinal y examino muestras coprológicos de las cuales procedían de los hospitales Ibn Sina y Sidi Talha, ambos en Rabat. Por otra parte, el mismo autor examino muestras coprológicas en un hospital de Fez (Mohamed V) y en el Hospital El Ghasani detectando un índice de parasitación simple IPS para la ciudad de Rabat y su región de 0,32 y para Fez de 0,46. En 1976 Hajfani Noradine realizó un examen coprológico de muestras entre los años 1973 al 1975 en el hospital de CHU de Rabat encontrando 0,271 (IPS) de protozoos y 0,017 (IPS) de helmintos, con un índice de parasitación total de 0,

47 Introducción y Antecedentes En 1983 Hajhouj Ahmend realizó una encuesta sobre el parasitismo intestinal en Alhocima. Examinó 830 muestras fecales de niños escolarizados, encontró un índice de parasitación simple (IPS) 0,6036 para protozoos, (Entamoeba coli y Entamoeba histolytica-0,2951; Giardia- 0,1831), y un 0,0602 IPS para helmintos (Enterobius e Hymenolepis nana) y un 0,365 para poliparasitismo. En 1980 Lahlou Nor El Yakin realizó una encuesta epidemiológica de parasitosis intestinales en 768 individuos de edades comprendidas entre 1 mes y 14 años, en el centro de Sanidad del Yousofia, Rabat. EL índice de parasitación simple fue de 0,6484, siendo los parásitos más frecuentes Enterobius (0,3512), Entamoeba histolytica (0,226), Giardia intestinales (0,2018) y Entamoeba coli (0,1132). En 1984 Guessous Idrissi N y cols. Realizaron exámenes coprológicos en 240 personas del hospital CHU de Casablanca, encontrando que un 0,417 IPS de ellas estaban parasitados, la mitad de ellos por especie reconocidas como patógenas. El poliparasitismo afectaba asi a un 0, 213%de los examinados. En 1984 Garcia-Fernandez y cols. Estudiaron muestras de 187 alumnos de Ceuta de los colegios nacionales de zona socioeconómicas deprimidas en las que frecuente los alumnos musulmanes, encontrando índices de parasitación intestinal por protozoos y helmintos. En los 86 alumnos parasitados identificaron las siguientes especies: Trichuris trichiura 0,261, Entamoeba coli 0,118, Giardia 0,081, Iodamoeba buschilii 0, 048, Endolimax nana 0,043, Hymenolepis nana 0,011, Ascaris lumbricodes 0,011. Jimenez-Albarran y cols. (1986), realizando un estudio epidemiológico de trichiurosis en muestras procedentes del norte de Marruecos, hallaron casualmente huevos de T.vulpis en las heces de dos 37

48 Introducción y Antecedentes personas, constatando las diferencias en razón longitud-anchura, y forma y aspecto de mamelones polares. En 1988 Mahmoudi A realizo exámenes coprológicos en un Hospital infantil de Rabat durante un periodo 3 años. En el examen de 4909 muestras encontraron casos positivos (índice de parasitación simple 25,87) los protozoos más frecuentes fueron Entamoeba histolytica (0,1057), Giardia intestinalis (01047) y Entamoeba coli, 0,0613. Los helmintos estaban presentes en una muestra de cada diez, siendo H.nana el más hallado (0.0107), y el poliparasitismo de También en 1988 Ghilan M examinó muestras en el Instituto Pasteur de Tanger constatando un IPS de de niños con poliparasitismo. Los protozoos eran más frecuentes que los helmintos en los recién nacidos (0,4723) frente a un 0,1456 en niños mayores), y para helmintos en mayores frente a un en niños recién nacidos. Massoudi M efectuo 5947 examino coprológicos entre el premiro de marzo1985 al 29 de febrero 1988 en el laboratorio provincial de Fez (Hospital Ghasani), el índice de la parasitación simple fue 0,0938, las tasas de infestación por protozoos y helmintos fueron respectivamente 0,455y 0,059. Más tarde Jimenez-Albarran y Odda (1994), en un trabajo efectuado en este Departamento de Parasitologia de la Universidad de Granada, estudiaron un total de 4643 muestras fecales, encontrando parásitos en 2,637 de ellas, con un IPS de 56.79% y un índice comparativo de parasitismo (ICP) de Entre los protozoos prevalecían E.coli, E.nana G.lamblia y Iodamoeba. Entre los helmintos T.trichiura, seguido de A.lumbricoides, E.vermicularis e H.nana. La prevalencia global de parasitismos intestinales fue mayor en Tetuán y Larache que en Tánger. 38

49 Introducción y Antecedentes En 1993 El Abdeloui D efectuó un examen coprológico de 710 muestras en el laboratorio Provincial del Jadida durante un periodo de 2 años. La tasa de parasitación fue 0,1940 para protozoos y de 0,1518 para helmintos. El índice de parasitación simple IPS fue 0,3412. Bouhoum y Schwartzbrod en 1998 compararon los datos obtenidos en 253 niños control no expuestos. El primer grupo de niños estaba más parasitado por nematodes, con un índice de poliparasitismo (IPP) del 13% frente a un 2% del control. En 1999, Laamrani el Idrissi A y cols, llevaron a cabo un estudio en las provincias de Taounate, Beni Mellal y Tizinit, en un total de 1682 individuos escogidos tanto en población urbana como rural. Los dos tercios de los habitantes en zona rural estaban parasitados y un 50% de los que vivian en zona urbana. Las amebas eran los parásitos más frecuentes, seguidos por flagelados y helmintos. Habbari K y cols (2000) en la provincia de Beni-Mellal estudiaron a 1343 niños, 740 de ellos de zonas donde se riega con residuales, el resto controles no expuestos. La prevalencia global de parasitosis intestinales fue del 50,8% en el primer grupo, frente a un 8,2% en el control. Los parásitos hallados en orden de mayor a menor prevalencia fueron: E.histolytica, G.intestinalis, A.lumbricoides, T.trichiura, E.vermicularis, H.nana y T.saginata. Se encontró una prevalencia de ascariosis aproximadamente cinco veces mayor entre los niños de las regiones de aguas residuales afectadas en comparación con las regiones control. Las tasas de trichiurosis no mostraron una diferencia estadísticamente significativa entre las aguas impactadas y las regiones de control. En 2001 El Fatni Hoummad realizó un estudio de 1003 muestras coprológicas procedentes de tres provincias: Tetuan, Rabat y Marrakech. El índice de parasitación simple en las tres provincias fue 56 en Tetúan, 40 en 39

50 Introducción y Antecedentes Rabat y 47 en Marrakech, expresado en tanto por ciento. Se estudiaron las tasas de parasitación comparativas entre áreas rurales y urbanas, por edades, sexo, estación del año, etc. La parasitación intestinal globalmente resultó más elevada en zonas rurales que en las urbanas, las personas de edad comprendida entre 6 y 15 años fueron las más parasitadas. La parasitación resultó más elevada en la población masculina y el verano fue la estación del año con más parasitismos. Tetuan fue la provincia con tasa de infección por helmintos más elevada, destacando un 21% de Trichuris que normalmente apareció asociado a Ascaris. Es importante resaltar también la presencia de Ancylostoma duodenale en 6 muestras en la provincia de Rabat. En 2002 Amahmid O y cols analizaron muestras de una planta piloto de estabilización de agua en Marrakech para detectar la presencia de quistes de Giardia y los huevos de Ascaris. Se aislaron 2,8 x 10 3 quistes de Giardia/l, a continuación 1,7 huevos de Ascaris/l. Los datos también indican que las diferencias estacionales en las concentraciones de quistes de Giardia y los huevos de Ascaris en las aguas negras, siendo más elevadas en los meses de primavera y verano. En las aguas tratadas para consumo público no se encontraron ni quistes de Giardia ni huevos de Ascaris. Al estudiar lo lechos sedimentados y secos se encontraron a razón 1,3 x 10 3 quistes/g y 29,6 huevos /g. En 2006 Tligui y Agoumi presentaron los resultados de un estudio realizado de octubre a diciembre de Un total de 170 niños fueron seleccionados al azar de una escuela primaria. Las muestras de heces de cada niño fueron examinados para detectar la presencia de parásitos. Las edades de los niños estaban entre 7 y 15 años, con una edad media de 10,3 ± 5, la proporción de sexos fue de 0, 7. De las 170 muestras examinadas, encontramos 97 positivo para la presencia de parásitos (prevalencia de 57,1%). Prevalencia de protozoos no patógenos fue de 46% mientras que la 40

51 Introducción y Antecedentes de protozoos patógenos de 25,8%. Blastocystis hominis estuvo presente en 38 niños. Enterobius vermicularis e Hymenolepis nana se detectaron en el 4,1% de las muestras examinadas. 14% asociaciones protozoo-protozoo se encontraron y 2.9% asociaciones gusano-helminto. La edad de 10 a 12 años fue la más afectada, (84,1%). 20 niños tenían síntomas clínicos. También en el mismo año El Kettani S y cols. (2006) estudiaron el riesgo de regar con aguas residuales no tratadas en Marruecos asociado a la prevalencia de Giardia intestinalis. El trabajo se realizó sobre 214 personas de edades comprendidas entre años que vivían en zonas que riegan con residuales los cultivos y 119 de edades entre años de zonas no expuestas a estos riegos. En la población expuesta la prevalencia de G. intestinalis fue 11.7% comparado con el 2.5% en la población control. El riesgo relativo fue de 4,6. Esta diferencia es estadísticamente significativa. Los más afectados eran principalmente los niños de entre 3 y 14 años. El contacto entre los miembros afectados fue evidente ya que el 50% eran familias. Ascaris lumbricoides fue el helminto más frecuentemente observado, con una prevalencia del 4,2%. En 2009 El Guamri y cols. hicieron un estudio epidemiológico restrospectivo de enteroparásitos en el Hospital Provincial Central El Idrissi de Kenitra (Marruecos). Se analizaron muestras de heces recogidas entre mediante examen coprológico. De las personas encuestadas, 606 de ellos fueron parasitados por una o más especies, un índice de infección, de 14,15%. La amebas fueron las más frecuentes (47,04%), con una prevalencia de E. histolytica fue de (23,74%). Siguieron flagelados (28,79%), representados por Giardia intestinalis (22,71%), Trichomonas intestinalis (5,49%) y Chilomastix mesnili (0,60%). Los helmintos se encontraron menos. Ascaris lumbricoides fue común entre los helmintos (11,87%), seguido de Trichuris trichiura (5,64%), Hymenolepis nana 41

52 Introducción y Antecedentes (2,68%), Enterobius vermicularis (2,08%), Taenia saginata (0,75%) y Stronyloides stercoralis (0,45%). En 2009 Elqaj M y cols. analizaron la prevalencia de parásitos intestinales en una población infantil de zonas rurales pobres y escasa higiene. El estudio transversal se llevó a cabo en una escuela primaria situada en Douar Ouled Berjal, entre abril y junio 96 de Participaron 163 escolares (proporción de sexos hombre / mujer = 1,29 y edad media de 9,7 años). Cada niño se sometió a un examen de heces, incluyendo una revisión El examen de heces fue macroscópico y microscópico en fresco y después otro tras concentración. Los resultados mostraron una prevalencia global de parásitos intestinales de 68,1%, con 36,94% de poliparasitismo. Se identificaron los parásitos: Blastocystis hominis (56,44%), Giardia lamblia (19%), Entamoeba coli (9,2%), Enterobius vermicularis (5,52%), Trichuris trichiura (3,07%), Hymenolepis nana (2,45%), Entamoeba histolytica / dispar (1,84%), Iodamoeba butschlii (1,84%), Ascaris lumbricoides (1,23%) e Hymenolepis diminuta (0,61). En 2010 Rahmouni H estudió enteroparásitos en 123 de escolares de Rabat. El estudio se realizó durante un periodo de 4 meses. La tasa de parasitación fue del 61,7% y el grupo más afectado el de edad comprendida entre No se observó diferencia estadística entre sexos. Los protozoos aparecienron en el 57, 7% (n = 71) de los niños examinados. Los helmintos estaban presentes en el 26% (n = 32) de los escolares. 36,4% de los niños estaban multiparasitados. En 2011 El Kouraibi S estudio los enteroparásitos de 70 mujeres embarazadas en colaboración con el laboratorio de Parasitología y ginecología del Hospital Mohammed V de Rabat. 46 mujeres estaban parasitadas, por tanto una tasa de parasitación de 65,7% en comparación con 48,7% en mujeres no embarazadas. No se encontraron helmintos. 42

53 Introducción y Antecedentes Las mujeres embarazadas afectadas de parásitos patógenos fueron 4.3%. 23 de las mujeres estaban multiparasitadas, 32.8% del total. En 2012 Tagajdid R y cols. realizaron un estudio de incidencia y prevalencia de parásitos intestinales durante un período de cinco meses en escolares de la ciudad de Salé (Marruecos). La recolección de las muestras fecales se realizó durante tres días. Durante el período de estudio, se incluyeron 123 escolares. Setenta y seis niños (61,7%) estaban infectados con parásitos intestinales. El grupo de edad años fue el más afectado. Los protozoos se encontraron en 57,7% (N = 71) de los niños examinados. Las amebas fueron predominantes. Los helmintos estaban presentes en el 26% (N = 32) de los escolares. Cuarenta y cinco (36,6%) de los niños estaban multiparasitados. Este trabajo indica la importancia de los enteroparásitos en la salud de los niños y su asociación a desnutrición, por lo que se hace imprescindible su prevención y control Giardia, un enteropatógeno muy frecuente Algunos datos epidemiológicos Giardia es uno de los parásitos intestinales más comunes en humanos. Aproximadamente 200 millones de personas en Asia, África y Latino América manifiestan afección sintomática, pero la giardiosis asintomática es mucho más frecuente, especialmente en países en vías de desarrollo (Feng y Xiao, 2011). Giardia es también un enteroparásito común en animales domésticos (perros, gastos, ovejas, vacas, cerdos, caballos, cabras) y en multitud de animales salvajes, incluidos pájaros y mamíferos marinos (Plutzer y cols. 2010). La giardiosis constituye un problema de salud pública mundial, por ser Giardia uno de los parásitos intestinales más prevalentes, por su capacidad para desencadenar brotes epidémicos y por los graves trastornos 43

54 Introducción y Antecedentes físicos y cognitivos que ocasiona en niños. Tampoco podemos olvidar su importancia en veterinaria. En Europa los datos más recientes de prevalencia de giadiosis en seres humanos oscilan entre el 1% y el 17% (De Wit y cols. 2001; Almeida y cols. 2006; Karanis y Ey, 1998; Horman y cols. 2004; Bajer, 2008; Davies y cols. 2009; Berrilli y cols. 2006; Spinelli, 2006, y Geurden y cols. 2009). En Estados Unidos y Canadá está considerado como el parásito entérico más prevalente (Mandell G, 2002; Church y cols. 2010) y alrededor del 15% de la población rural de América Latina presenta dicha afección (Atías y Neghme, 1996; Acuña y cols. 1999). En Australia y Nueva Zelanda se estima en 7.6% la prevalencia en los últimos estudios epidemiológicos realizados (Learmonth y cols. 2003; Read y cols. 2002). Giardia no se considera un parásitos oportunista, así en pacientes inmunodeprimidos como los afectados por HIV se han publicado prevalencias similares a las de personas normales, por ejemplo de 3.5%-6.2% en Italia (Giangaspero y cols. 2007), 3.1% en Irán (Daryani y cols. 2009), 6.6% en Arabia Saudí (Al-Megrin, 2010) y 13.9% en Francia (Oksenhendler, 2008). Solo de forma ocasional en zonas pobres de países en vías de desarrollo o de países desarrollados. Así se han indicado alta prevalencia (42.9%) en Italia en la pequeña comunidad pobre de Rom (Marangi y cols. 2010). Es evidente que la giardiosis es más frecuente en países en vías de desarrollo, donde las condiciones higienico sanitarias son más deficientes. En países asiáticos (Banglades, Camboya, China, Laos, Indonesia, India, Nepal, Malasia, Filipinas, Tailandia, Vietnan), norte de América (Cuba, México y Nicaragua), Sudamérica (Argentina, Brasil, Colombia o Perú), y África la prevalencia de Giardia oscila entre 4-73% (Feng y Xiao, 2011; Madhumita y cols. 2014; Puebla JL, 2014). Lo normal en estos países es que esté por 44

55 Introducción y Antecedentes encima del 30%. Los datos más elevado, 73.4%, se han reportado en Nepal (Easow y cols. 2005). La mayoría de estos datos corresponden a estudios realizados en niños, siendo la población infantil la más afectada por Giardia, especialmente los niños de guarderías y escuelas en los primeros años. No solo son más suceptibles a la infección por sus actividades y juegos sino también por la inmadurez de su sistema inmunológico, por lo que se reifectan continuamente. Un cierto grado de inmunodepresión también afecta a las mujeres embarazadas y en este caso hay un estudio específico sobre el tema realizado en México en que se estiman 25.1% de mujeres infectadas por Giardia spp. (Rodriguez-García y cols. 2002). Los quistes de Giardia se transmiten por vía fecal-oral, tanto directa como indirectamente. La giardiosis puede transmitirse como antroponosis o como zoonosis. El agua de bebida, residual o recreacional puede consituir una vía de infección al igual que los alimientos contaminados con quistes; productos normalmente de consumo en crudo como vegetales, fruta, moluscos bivalvos u otros alimentos que se han contaminado a través de agua, artrópodos o manipuladores de alimentos (Plutzer y cols. 2010). Aunque la mayoría de los casos de giardiosis ocurren de forma esporádica, también se han producido múltiples brotes epidémicos por este parásito. Al menos se han producido 132 brotes por Giardia a través del agua desde 1954 en todo el mundo (Karanis y cols. 2011). De ellos 104 se han relacionado con agua de bebida, 18 con aguas recreacionales y 10 con viajeros al extranjero. El número de casos en cada brote varió hasta un número máximo de personas. La mayoría de los brotes publicados se han producido en Norteamérica y Europa posiblemente porque disponen de mejores sistemas de vigilancia y presentación de informes que en otros lugares. También se producido algunos brotes por alimentos contaminados asociados con hielo, vegetales o alimentos contaminados por manipuladores 45

56 Introducción y Antecedentes (Yoder y cols. 2010). Brotes persona a persona se han producido también en niños en guarderías (Ang L, 2000). Pocos brotes se han identificado de animales a personas, solo dos. Uno de ellos por consumo de punding contaminado con heces de roedores y otro por consumo de sopa hecha con tripas de oveja afectada de giardiosis (Smith y cols. 2006) Taxonomía y epidemiología molecular Giardia es un protozoo perteneciente al Phylum Sarcomastigophora, Subphylum Mastigophora, Clase Zoomastigophorea, Orden Diplomonadida y Familia Hexamitidae (Morrison y cols. 2007). 46

57 Introducción y Antecedentes Especies Hospedadores G. agilis (Kunstler, 1882) Anfibios G. ardeae (Noller, 1920) Aves G. microti (Benson, 1908) Roedores G. muris (Benson, 1908) Ratas y topos G. psittaci (Erlandsen y Bemrick, Aves 1987) G. varani (Lavier, 1923) Reptiles G. duodenalis (Davaine, 1875): Ensamblajes A-H Ensamblage A (=G. duodenalis sensu stricto a ) - Subensamblajes AI-AIV Ensamblage B (=G. entérica a ) - Subensamblages BI-BIV Ensamblaje C (=G. canis a ) Ensamblaje D (=G. canis a ) Ensamblaje E (= G. bovis a ) Ensamblaje F (=G. cati a ) Ensamblaje G (=G. simondi a ) Ensamblaje H Humanos, primates no humanos, rumiantes domésticos y salvajes, alpacas, cerdos, caballos, cánidos domésticos y salvajes, gatos, roedores, marsupiales, hurones y otros mamíferos (incluso marinos) Humanos, primates no humanos, vacas, perros, caballos, conejos, ratas, castores y mamíferos marinos Cánidos domésticos y salvajes Cánidos domésticos y salvajes Rumiantes domésticos y cerdos Gatos Ratones y ratas Animales marinos Tabla 2. Especies y ensamblajes de Giardia a Nombres de especies recientemente propuestas (Thompson y Monis, 2004; Thompson y cols. 2008; Monis y cols. 2009) 47

58 Introducción y Antecedentes Actualmente se aceptan 6 especies de Giardia: G. agilis, G. ardeae, G. microti, G. muris, G. psittaci y G. duodenalis (G. intestinalis, G. lamblia). La Tabla 2 muestra las especies y ensamblajes de Giardia. De todas las especies de Giardia solamente G. duodenalis (G. intestinalis o G. lamblia) parasita a seres humanos. Aunque a nivel médico se ha empleado durante mucho tiempo el término G. lamblia para designar a la especie que afecta al hombre, numerosos estudios genéticos han demostrado que la misma especie está presente en el hombre y un amplio rango de mamíferos y que no existen bases taxonómicas para el uso del término G. lamblia en humanos. De igual forma el Código Internacional de Nomenclatura Zoológica no indica esto tampoco, por lo que pueden emplearse indistintamente los términos G. lamblia, G. duodenalis y G. intestinalis (Feng and Xiao, 2011). G. duodenalis es la única especie que parasita al hombre pero también se ha encontrado en muchos animales, tanto domésticos como salvajes, que actúan como reservorios. Actualmente, y gracias a una considerable cantidad de datos, G. duodenalis se considera como una especie compleja dividida en 8 grupos genéticos o ensamblajes, A-H, (Tabla 2). Esta subdivisión tiene bases genéticas esencialmente. Gracias a una variedad de técnicas moleculares tales como la PCR-RFLP, PCR múltiple o PCR a tiempo real se ha realizado el análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de diferentes genes tales como la glutamato deshidrogenasa (gdh), triosafosfato isomerasa (tpi), β giardina (bg), SSUrRNA, 18SrDNA y factor de elongación 1 α (ef 1 α), (Elegio y cols. 2008; Babaei y cols. 2008; Almeida y cols. 2010). Los ensamblajes A y B se han encontrado en humanos, animales domésticos (ovejas, cabras, cerdos, caballos, vacas, perros y gatos) y ciertas especies de animales salvajes, incluyendo mamíferos marinos (Plutzer y cols. 2010). Los ensamblajes A y B se dividen a su vez en subensamblajes en bases a los mismos análisis filogenéticos. De tal forma que el ensamblaje A se divide en 48

59 Introducción y Antecedentes AI, AII, AIII y AIV y el ensamblaje B en BI, BII, BIII y BIV (Ryan y Caccio, 2013). El resto de los ensamblajes C-H se han aislado de animales, (Tabla 2). Un análisis por PCR de aislados Giardia duodenalis de heces humanas, de diferentes localizaciones geográficas, demostró que casi de forma exclusiva los ensamblajes A y B son los que está asociados con giardiosis humana (Feng y Xiao, 2011). La distribución de estos dos ensamblages varía incluso dentro del mismo país, pero el ensamblaje B parece ser más común que el A tanto en países desarrollados como en los que están en vías de desarrollo (Ryan y Caccio. 2013). También parece ser que los subensamblajes AI y AII así como los BIII y BIV son habituales en personas mientras que los demás se encuentran fundamentalmente en animales (Monis y cols. 2009; Ryan y Caccio. 2013). De todos ello el AI parece ser que es el que tiene mayor carácter zoonótico (Thompson, 2004). En cualquier caso, hay también algunas publicaciones que indican la existencia de los ensamblajes considerados de animales en personas. Así los ensamblajes específicos de cánidos (C y D) se han encontrado en humanos en Tailandia (Traub y cols. 2009), ensamblaje F en Etiopía (Giangaspero y cols. 2007), ensamblaje E en Egipto (Foronda y cols. 2008) y ensamblajes C, D y F en Europa (Sprong y cols. 2009). De todas formas, estos trabajos son puntuales y se ponen en duda las técnicas empleadas en algunos de ellos (Feng y Xiao, 2011). También es interesante considerar que las infecciones mixtas con varios ensamblajes son habituales, sobre todo en los países en vías de desarrollo (Ryan y Caccio. 2013). Aunque actualmente se sigue esta nomenclatura taxonómica existe una gran controversia al respecto, con la idea de modificarla. Esto se debe a la gran distancia genética que existe entre unos ensamblajes y otros, y a que esta coincide con la especificidad de hospedador. Por eso se está proponiendo 49

60 Introducción y Antecedentes adoptar los nombres de G. duodenalis para el ensamblage A, G. enterica para el ensamblaje B, G. canis para los ensamblajes C y D, G. bovis para el ensamblaje E, G. cati para el ensamblaje F y G. simondi para el ensamblaje G. No se ha propuesto ningún nombre para el ensamblaje H (Feng and Xiao, 2011; Ryan y Caccio, 2013). En cualquier caso estas especies necesitarían ser redescritas y sus nombres validados de acuerdo a datos biológicos y moleculares de acuerdo al Código de Nomenclatura Zoológica antes de poder ser aceptadas como especies. 50

61 Material y Métodos 2. MATERIAL Y MÉTODOS Introducción Hemos realizado un estudio epidemiológico en escolares de la provincia de Tetuán (Marruecos) tanto en zonas rurales como urbanas. La mayoría de las muestras corresponden a los barrios situados dentro de la ciudad y los pueblos de los alrededores. El objetivo de este estudio es conocer la prevalencia de los enteroparásitos, especialmente los patógenos, de esta población para que a los niños enfermos se les prescriba el tratamiento adecuado en vías a adoptar medidas de prevención y control. Al diagnosticar a Giardia como el patógeno más frecuente en los niños analizados, hemos querido contribuir al conocimiento de la epidemiología molecular de la giardiosis, llevando a cabo el primer estudio de caracterización molecular de Giardia realizado en Marruecos 2.2. Ubicación del estudio: lugar y población Este estudio se ha llevado muestreando niños de Tetuán (Marruecos) por lo que vamos a describir brevemente esta provincia Descripción de la provincia de Tetuán Tetuán es una ciudad del norte de Marruecos, ubicada en las proximidades del mar Mediterráneo, limita al sur por la provincia de Larache, al este por la provincia de Chefchauen y al oeste por la Wilaya de Tanger. Esta provincia se extiende sobre un área geográfica caracterizada por paisajes montañosos, el lado oeste de la cadena rifeña tiene topografía muy accidentada, a excepción de ciertas zonas que tienen un relieve poco elevado y algunas llanuras mediterráneas: Martil, Anjra, Ouedlou, Mallallin, Smir y Negro. 51

62 Material y Métodos Se superficie es de km, o sea el 31.25% de la superficie total de la Wilaya de Tetuán, su clima se caracteriza por la existencia de dos estaciones diferentes una estación lluviosa y húmeda del mes de octubre hasta el mes de abril, y otra seca del mes de mayo al mes de septiembre. Las precipitaciones son variables y la temperatura está influenciada por la acción del mar Mediterráneo y el Océano Atlántico. Es una zona de clima mediterráneo y las temperaturas dan un clima bastante dulce con períodos muy cálidos durante los meses de julio y agosto (28.3ºC a 32.9ºC) y también periodos muy fríos durante los meses de enero y febrero (5.3ºC a 8.6 ºC). La provincia de Tetuán está atravesada por muchos ríos, entre los principales el de Martil y Ouedlaou cuyo caudal varia de 15 a 70 l /s. Existen tres embalses de agua de grandes dimensiones y más de fuentes de agua, 70 importantes, que permiten la irrigación de una superficie del orden de ha. La provincia o Wilaya de Tetuán tiene habitantes (2006), el 75% de las aguas residuales urbanas se recogen en el río de Martil llegando al mar a unos 8 km al este de la ciudad. El resto se descarga en pozos u otros sistemas autónomos. El río es el depositario principal de las aguas residuales domésticas de Tetuán. Estas aguas no son tratadas. Sin embargo, en el contexto del derecho al saneamiento en la ciudad de Tetuán, ha entrado una empresa francesa llamada Amendis que está construyendo una planta de tratamiento de aguas residuales cerca del largo río. En el centro de la ciudad de Tetuán la población presenta un nivel socioeconómico medio, con buenas condiciones higiénicas, agua potable y todo el material necesario para vivir, además el sistema sanitario es adecuado 52

63 Material y Métodos con la presencia de hospitales privados y un hospital civil grande que se llama Hospital Saniate Armal. En las infraestructuras de la ciudad, encontramos canales de alcantarillado, contenedores de basura, máquinas de limpieza de calles y están reguladas carreteras y aceras. Todas estas mejoras se están realizando por la empresa francesa de agua y luz Amendis, asociada con el gobierno de Marruecos, aunque se ha producido un gran aumento en las tasas de luz y agua. Los barrios urbanos donde hemos muestreado son Boujarah, El Barrios, Ajbal Darsa, Jamaa El Mazouak y Kuelma. En ellos se han muestreado los colegios 18 Novembre, Ahmed al Bakal, Ahmed Zaouak, Mouhamed Ben Abdelkarim El Khattabi, Maghrrib El Arrabi y El Fakih Tanji. Estos colegios están situados en las zonas más o menos altas, montañosas, menos la zona de Kuelma. En estos colegios no tienen comedores pero hay algunas ayudas para los niños que las necesitan. La mayoría de los padres son más o menos analfabetos. El nivel de la vida es medio-bajo, con falta de condiciones higiénicas, en algunas zonas faltan los servicios en las casas y el agua potable. Las aguas residuales contaminan los acuíferos o las fuentes de agua de consumo. En estos barrios el sistema sanitario es escaso. Están alejados del centro de Tetuán y en algunos existen centros de salud pero están alejados de los hospitales. Existen mayormente bloques de edificios y las mascotas conviven con las familias dentro o fuera de las casas, ya que poseen perros, gatos, ovejas, vacas, cerdos, cabras, burros etc En los barrios rurales (Ben Karrich, El Mellalyène, Azla, Souk el Kadim) los colegios muestreados son Ben Karrich, El Mellalyène, Azla y 53

64 Material y Métodos Bounazal. La mayoría son zonas montañosas menos la zona de Azla que está situada en el mar. Estos barrios, están formados por casas que han sido construidas por sus propietarios con cemento, adobe o ladrillo, y están más o menos dispersas unas respecto de las otras. En algunos de estos colegios hay comedores que preparan la comida para repartirla a los niños. Estos comedores hacen una gran labor social para los niños más pobres y para los que viven lejos de sus casas. La mayoría de los padres son analfabetos o tienen escasísima cultura. El nivel de vida es bajo, con ausencia de condiciones higiénicas, agua no potable, beben agua del pozo no tratada o agua del grifo pero está contaminado con los acuíferos, y el hacinamiento en las viviendas es frecuente. La mayoría de la población rural no tiene sanitarios y defecan en áreas próximas a sus viviendas. Al no existir cultura higiénica la contaminación de los alimentos es elevada por moscas, manipulación inadecuada, riego de verduras con aguas negras y consumo de aguas no tratadas, etc.. En definitiva, la sanidad no está a la altura deseada. Los hospitales en la zona son escasos solo hay algún centro de salud bastante deficiente. Las personas que viven en la zona rural no tienen un acceso fácil al agua potable y algunas personas lavan sus platos y ropa, en canales o ríos que se contaminan fácilmente. El contacto con animales domésticos es frecuente y las condiciones de vida de los niños en estas zonas son higiénicamente muy deficientes. 54

65 Material y Métodos Fig. 1. Mapa de Marruecos Población estudiada En zonas urbanas de Tetuán se realizó el estudio de parásitos intestinales en los escolares de los colegios ya mencionados que cuentan con el siguiente número de alumnos: 55

66 Material y Métodos Barrio Boujarah - Colegio 18 de Novembre: 1205 alumnos El Barrios - Ahmed Al Zaouk: 560 alumnos Barrio Ajbal Darsa - Ahmad Al Bakal: 1382 alumnos Barrio Jamaa El Mazouak - Maghrrib El Arrabi: 1000 alumnos - Mouhamed Ben Abdelkarim El Khattabi: 1293 alumnos Barrio Kuelma - El Fakih Tanji: 964 alumnos En la zonas rurales los colegios estudiados han sido: Barrio Mellalyéne - Mellalyéne: 212 alumnos Barrio Ben Karrich - Ben Karrich: 463 alumnos Barrio Azla - Azla: 247 alumnos Barrio Souk el Kadim - Bounzal: 168 alumnos 56

67 Material y Métodos Fig. 2. Mapa de Tetúan con sus barrios 57

68 Material y Métodos 2.3. Fases del estudio Visitas a los colegios Previo al muestreo se concertaron citas con los responsables de los colegios, profesores y director de cada colegio con el objetivo fundamental de conocer las zonas de estudio y a las personas que colaborarían en el mismo. Gracias a esta primera toma de contacto se pudieron conocer las características de la población de cada barrio y la realidad de cada colegio. Así se obtuvo información lo más detallada posible sobre la población: actividades profesionales, nivel socioeconómico, sanitario y cultural, así como de las principales enfermedades que afectan habitualmente a niños y adultos. También fue interesante conocer detalles imprescindibles como la fuente de obtención de agua potable, la existencia o inexistencia de redes de distribución de agua y alcantarillado, el tipo de alimentación, los hábitos higiénicos, el contacto con animales, el tipo y condiciones de las viviendas y de los colegios etc.. Como es lógico, uno de los puntos más importantes fue adquirir información sobre las enfermedades más frecuentes en la población de estos distritos tanto a nivel general como en los niños. Consultamos todos los aspectos relacionados con el sistema sanitario y el grado de familiarización de la población con los parásitos intestinales y el control de los mismos Fichas identificativas. Se diseñaron unas fichas identificativas que a la vez contenían una pequeña encuesta socioeconómica para ser cumplimentadas por los niños o sus padres (Fig. 1) con los siguientes datos: nombre, edad, sexo, peso, talla, enfermedades padecidas, forma de abastecimiento de agua y eliminación de desechos humanos y presencia de animales en casa. El peso y la talla se rellenaron en el colegio, ya que cada niño al entregar la muestra fecal fue 58

69 Material y Métodos pesado y medido. Al final la ficha quedaba cumplimentada con el diagnóstico parasitológico y el tratamiento recomendado, (con indicación del principio activo). Las fichas de los niños parasitados se remitieron directamente del colegio al centro de salud para que los médicos les proporcionaran el tratamiento o les dijeran cual era para comprarlo. Ficha identificativa del alumno/a Nombre: Edad : Sexo: Peso: Talla: Enfermedades (en curso/padecidas): Tipo de vivienda Indique de donde toma el agua para beber: Indique si tiene servicios sanitarios: Tiene animales en casa? Diagnóstico parasitológico: Tratamiento (principio activo): Fig. 3. Ficha identificativa personal Estudio del peso y talla. Todos los niños fueron pesados y medidos mediante báscula portátil (± 100 g), con tallímetro adaptado (± 0.1 cm). Las medidas se llevaron a cabo con el niño en posición erecta de manera que su espalda, nalgas y talones, 59

70 Material y Métodos permanecieran en contacto con el tallímetro y que la cabeza estuviera siguiendo el plano horizontal, con el objeto de lograr una correcta posición cefálica durante las mediciones Diagnóstico coprológico Recogida de las muestras fecales A cada niño se le hizo entrega de un contenedor estéril de plástico de 50 ml de capacidad etiquetado para indicar nombre, edad y curso escolar. Simultáneamente se le dieron las fichas identificativas para que rellenaran los datos correspondientes. La entrega de los contenedores se centralizó en los colegios. Se indicó la necesidad de la entrega de la muestra fecal a la mayor brevedad posible y se fijó una fecha máxima de entrega. A la entrega de la muestra fecal se solicitó la ficha identificativa para que pudiera terminar de rellenarse. A la recogida de las muestras se les fue adicionando a cada una de ellas dicromato potásico al 2.5% y se conservaron a 4ºC hasta su traslado al Departamento de Parasitología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Granada, donde fueron analizadas. El muestreo de heces se llevó a cabo desde octubre de 2009 a julio de Se realizó un muestreo estacional para poder analizar las posibles variaciones que podían manifestar algunos parásitos Procesamiento y análisis coprológico de las muestras fecales A) Examen macroscópico de las muestras Se realizó a simple vista, observando y registrando los caracteres organolépticos que pudieran dar pistas de posibles patologías: consistencia, color, presencia de mucus, grasa, sangre, restos alimenticios mal digeridos e incluso la eventual presencia de helmintos (enteros o partes de ellos). 60

71 Material y Métodos B) Examen microscópico de las muestras Tras la observación macroscópica todas las muestras se observaron al microscopio óptico a la mayor brevedad posible. En primer lugar mediante un examen directo y posteriormente tras concentración. B.1. Examen directo El fundamento del examen directo microscópico, es buscar la presencia de formas evolutivas de parásitos de tamaño microscópico: trofozoítos y quistes de protozoos, así como larvas o huevos de helmintos. Para ello se colocamos en una lámina portaobjetos una porción de heces de 2 a 3 mm. de diámetro de la muestra fecal, que se diluyó con solución yodo-yodurada de lugol, con lo que simultáneamente se efectuó una tinción con yodo que ayudó a diferenciar caracteres. Se cubrió con una laminilla cubreobjetos y se observó al microscopio óptico a 10, 40 y 100x. Otra porción de la muestra, conservada en dicromato potásico al 2.5%, fue observada directamente con el mismo microscopio con idénticos aumentos. B.2. Examen tras concentración Pasamos a exponer las técnicas de concentración más frecuentes empleadas. Para realizar cualquiera de estas técnicas previamente se la lavaron las muestras fecales varias veces con agua mediante centrifugación a r.p.m durante 10 minutos al objeto de eliminar el dicromato potásico, y por último se filtraron por una gasa doble. 61

72 Material y Métodos B.2.1. Métodos de concentración por sedimentación Método de sedimentación rápida. Esta técnica se base en la gravidez de los huevos. Por su tamaño y peso sedimentan rápidamente cuando se suspenden en agua. Se realiza en base al siguiente procedimiento: homogeneizar bien 10 a 20 ml de muestra fecal. Colocar un colador y dos capas de gasa en la abertura del vaso y a través de ella, filtrar la muestra. Se retira el colador y se llena la copa con agua filtrada hasta 1 cm debajo del borde y se deja sedimentar la muestra durante 30 minutos. Decantar las 2/3 partes del contenido de la copa o vaso y agregar nuevamente agua. Repetir los pasos anteriores cada 5 a 10 minutos por 3 ó 4 veces, hasta que el sobrenadante quede limpio. Transferir el sedimento a una placa Petri y observar al microscopio. B.2.2. Métodos de concentración por flotación. Método de Fülleborn Esta técnica se base en la flotación de quistes, ooquistes y huevos de parásitos en una solución saturada de NaCl que posee mayor densidad que ellos. Para ello hay que: mezclar la muestra a analizar con 50 ml de solución de Fülleborn. Filtrar por doble capa de gasa en colador y a través de embudo recoger el filtrado en el tubo de ensayo llenando hasta formar un menisco. Se deja reposar 30 minutos y con la ayuda del asa de platino, tomar una muestra de la superficie del menisco y colocarla en una lámina portaobjeto, agregar lugol, cubrir con laminilla y observar al microscopio a 10, 40 y 100x. El inconveniente que tiene esta técnica es que si las heces tienen gran cantidad de grasa, esta flota en la superficie y cubre la capa acuosa donde 62

73 Material y Métodos pueden estar los huevos o quistes. Tampoco se obtienen buenos resultados con los huevos operculados o los huevos infértiles de Ascaris lumbricoides que pueden deformarse e impedir su identificación. Método de flotación de Willis Se basa en la flotación de quistes, ooquistes y huevos de parásitos en una solución saturada de NaCl que posee mayor densidad que ellos, pero en este caso para la toma de muestra tras la concentración no se usa asa de platino, en su lugar, se aplica una laminilla cubreobjetos. El procedimiento es similar al método de Fülleborn explicado anteriormente, salvo que en lugar de usar asa de platino para tomar una muestra de la superficie del menisco; se coloca sobre éste, una lámina cubreobjetos dejándolo reposar de 10 a 15 minutos. Pasado este tiempo, se levanta con cuidado el cubreobjetos y se coloca sobre un portaobjetos. Observar al microscopio inmediatamente a 10, 40 y 100x, ya que la preparación se seca rápidamente. B.2.3. Método mixto o de centrifugación-flotación Método de Faust Consiste en concentrar huevos y quistes mediante el empleo de sulfato de zinc. Para ello la técnica consiste en preparar una solución de sulfato de zinc al 33% en agua. Después se centrifuga la muestra en agua solo una vez a r.m.p durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y tomar el sedimento. A continuación hay que coger 1,5 ml de muestra y añadir 5 ml de sulfato de zinc y agitar hasta resuspender, luego centrifugar la muestra a r.m.p durante 5 minutos. Recoger la parte superior del sobrenadante donde están los parásitos, montarla entre porta y cubre y llevarla a observación al microscopio. 63

74 Material y Métodos Método de Ritchie (centrifugación con formol-éter) El fundamento de esta técnica se base en la concentración de quistes y huevos por sedimentación mediante centrifugación y flotación con la ayuda de formol y éter para separar y visualizar los parásitos. Para realizar esta técnica el filtrado obtenido de la muestra fecal pasada por la gasa se centrifuga 2 minutos a r.m.p, luego se decanta el sobrenadante y si el líquido obtenido es muy turbio hay que volver a lavar el sedimento con agua destilada. Una vez hecho esto al sedimento obtenido se le añaden dos partes de formol al 10% y una parte de éter, luego tapamos el tubo y mesclamos vigorosamente hasta obtener un solución homogénea que dejamos reposar en poco. A continuación se centrifuga a 2000 r.m.p durante 3 minutos. Se observan cuatro capas en el tubo, una del éter, la segunda de restos, la tercera del formol y la última es un sedimento donde se encuentran los parásitos. Hay que desechar el sobrenadante procurando no arrastrar el sedimento del fondo que contendrá el concentrado de párasitos. Añadimos una gota del lugol y mezclamos, colocamos un cubreobjetos y observamos en el microscopio 10x y 40x. Método de Telemann El fundamento de esta técnica se base en la concentración de quistes y huevos por sedimentación mediante centrifugación y flotación con la ayuda de xilol y éter. Para realizarlas se toma 2-3 ml de la dilución fecal realizada previamente y se colocan en un tubo de centrífuga. A cada tubo se añade un volumen de éter igual a la suspensión fecal colocada. Se cierra con tapón de caucho y se agita vigorosamente para poner en contacto la fase acuosa y la fase etérea. En esta agitación se forman gases, por lo que a intervalos de 64

75 Material y Métodos tiempo se ha de destapar el tubo con cuidado para liberarlos. Después se centrifugar a 1.500/ rpm durante unos 3 minutos. Despegamos el coágulo de las paredes del tubo mediante la varilla de vídrio y decantar rápidamente todo el sobrenadante, procurando no arrastrar el sedimento. Añadir al sedimento una gota de solución 0.1 N de NaOH y mezclar bien para tomar con la pipeta una muestra del sedimento y colocarla entre porta y cubre para ser observada al microscopio. B.2.4. Método Kato o método de concentración por tamizado Consiste en el aclaramiento de las heces con el uso de glicerina, que permite preparar una capa transparente y observar las formas parasitarias. Se realiza tamizando 1g de la muestra de heces a través de gasa, nylon o malla metálica. Se extiende el tamizado sobre el portaobjetos y se cubre con la laminilla impregnada en glicerina. Comprimimos la muestra durante 30 min. y secamos el exceso de glicerina. Así ya queda lista para su observación al microscopio B.2.5. Método de Baermann (Método de concentración por migración) Se trata de un método de enriquecimiento específico para las larvas de primér estadio de nematodes broncopulmonares, larvas de tercer estadio de nematodes gastrointestinales y nematodes del suelo (no patógenos). Se basa en el hidrotropismo de las larvas vivas, que abandonan las materias fecales si existe agua alrededor, y se concentran por sedimentación. La técnica consiste en llenar el embudo con agua previamente calentada a 40ºC de tal manera que la malla y la gasa se mojen. Colocar la materia fecal sobre la malla y la gasa, dejar reposar durante 2 horas para que 65

76 Material y Métodos las larvas pasen al agua del embudo. Pasadas las 2 horas se abre la pinza, se deja salir el agua y se recibe en 2 tubos de ensayo y se centrifuga el líquido durante 1 min a 2000 r.p.m. Tomar una muestra del sedimento y colocarla entre porta y cubreobjetos. Examinar al microscopio con 10x y posteriormente con 40 x. B. 3. Examen microscópico tras tinción permanente En muchas ocasiones sin la ayuda de tinciones, se vuelve muy complicado hacer un diagnóstico acertado de los parásitos presentes en la muestra y, más aun, diferenciar algunas estructuras de los mismos que nos permitan identificarlos. Para tal fin, se hace uso de colorantes a través de distintos métodos de coloración que según el parásito y la forma evolutiva del mismo, será de un tipo u otro. En nuestro estudio, los métodos de coloración aplicados han sido tres: Método de Ziehl-Neelsen modificado o Kinyoun, hematoxilina férrica y tinción con Giemsa. Preparación del frotis fecal Previamente a la aplicación de los colorantes, se hace necesario realizar un frotis fecal. Para ello, las heces se lavan varias veces con agua, y sin contener dicromato potásico se diluyen en un poco de solución salina fisiológica. Sobre una lámina portaobjetos desengrasado, con ayuda de una pipeta Pasteur se coloca una gota de la suspensión de heces y se hace una extensión. Para la fijación del frotis, éste se deja secar a temperatura ambiente y se aplica fijador. En nuestro caso el fijador aplicado fue metanol absoluto, cuyo tiempo de aplicación varió según el método de coloración aplicado. 66

77 Material y Métodos Métodos de Ziehl-Neelsen modificado o Kinyoun Se basa en el comportamiento ácido-alcohol-resistente de la cubierta de algunos parásitos como Isospora y Cryptosporidium, los cuales se tiñen de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul, dependiendo del colorante de contraste usado. Para realizar esta tinción se prepara el frotis fecal y se fija con metanol durante 5 minutos, tras lo cual se deja secar. Una vez seca se cubre la preparación con fucsina fenicada durante 15 minutos, mejor en estufa a 37ºC. Se lava con agua y se cubre con azul de metileno por 5 minutos, se vuelve a lavar con agua y dejar secar, se procede a observar al microscopio con objetivo de inmersión. Tinción con hematoxilina férrica de Heidenhain Método clásico para colorear e identificar estadios de protozoos principalmente amebas y flagelados comunes en heces del humano, sobre todo cuando sólo hay trofozoítos y las infecciones son mixtas. Se prepara un set de placas Petri con los reactivos correspondientes. Una vez realizado el frotis con la muestra fecal y secado, éste se pasa por solución de Schaudinn durante 3 a 5 minutos. Seguidamente se pasa por alcohol al 70% más 1 a 2 gotas de tintura de yodo durante 5 minutos; posteriormente por alcohol al 50% por 5 minutos y pasar por agua corriente de 5 a 10 minutos. Se somete a la solución mordiente al 2% de 5 a 10 minutos y se enjuaga con agua corriente. Tras someter el frotis al mordiente se aplica el colorante durante 5 a 10 minutos. Lavar con agua corriente y pasar por una segunda solución mordiente para decolorar. Se lava con agua corriente durante 10 minutos y posteriormente se deshidrata pasando por alcohol al 70%, 85%, 95% y absoluto, de 10 a 15 minutos cada uno. Aclarar con xilol, montar con bálsamo de Canadá y observar la microscopio a 100x. El 67

78 Material y Métodos citoplasma de los parásitos se observan de color azul oscuro y los núcleos de color morado intenso a negruzco. Debido a la laboriosidad del método y a la cantidad de reactivos empleados, sólo se aplicó dicho método cuando la identificación de determinada amebas fue dudosa mediante el examen directo con lugol. Tinción con Giemsa Se basa en la capacidad del colorante Giemsa para teñir de color fucsia los componentes ácidos de los parásitos y de color azul los que tienen carácter básico. Esto se debe a que este colorante está formado por eosina (tiñe los componentes ácidos) y azul de metileno (tiñe los componentes básicos). La técnica se realiza tiñendo un frotis fecal previamente fijado con metanol y seco. El colorante Giemsa se diluye al 10 o 20% con agua destilada y se aplica cubriendo el frotis fijado. Tras esperar 20 minutos se retira el colorante y se lava suavemente la preparación. Se deja secar y se observa al microscopio óptico. B.4. Recuento de parásitos Cámara de Neubauer Es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de células en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. En nuestro caso, es igualmente en el recuento de formas parasitarias. 68

79 Material y Métodos Esta cámara de recuento está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial (en especial una vez que se haya añadido la muestra líquida). Luego se introduce, por capilaridad entre la cámara y el cubre, la muestra fecal con las parásitos a contar, generalmente ya procesada previamente a través de alguna de las técnicas de concentración descritas o diluida si se trata de la muestra inicial. Se observa la retícula al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan los parásitos. A partir del número de parásitos contados, conociendo el volumen de líquido que admite el campo de la retícula, se calcula la concentración de células en la muestra líquida aplicada. El cálculo de la concentración de parásitos se puede expresar así: Parásitos / μl = (parásitos contados) / [ (superficie contada (mm²) profundidad de la cámara(mm) ] dilución 69

80 Material y Métodos En la retícula central, la cámara de Neubauer tiene un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados terciarios. El cuadrado secundario central contiene no 16, sino 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. Esta técnica es útil para el recuento de cualquier forma parasitaria microscópica, ya sean trofozoitos, quistes, larvas, huevos, etc Cámara de McMaster Permite determinar el número de huevos y larvas de helmintos, así como de ooquistes de coccidios por gramo de heces. La lámina Mc Master tiene 4 cámaras de 0,3 ml cada una. Cada cámara está subdividida en dos áreas de recuento de 0.15 ml, cada una de las cuales tiene líneas guía para ayudar al recuento. 70

81 Material y Métodos Cálculo de recuento: Huevo por gramo= Recuento total x 100/Nº de cámaras contadas Multiplicando por 100, obtendremos el número de huevos por gramo de heces (los retículos de la cámara tienen 1 cm por lado y la altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos es de 1,5 mm. El volumen de cada cámara será, por tanto, de 0.15 ml) Estudio nutricional. Indicadores antropométricos. La malnutrición es uno de los problemas que más afecta a la población infantil de los países en vías de desarrollo. Como ya hemos indicado previamente la antropometría es la técnica más usada en la evaluación nutricional, siendo las mediciones más utilizadas el peso y la talla. La Organización Mundial de la Salud recomienda el uso de las curvas de crecimiento elaboradas por el National Center for Health Statistics (NCHS), ya que los pesos y tallas de niños provenientes de grupos socioeconómicos de nivel alto y medio de países subdesarrollados son similares a los de niños de países desarrollados con antecedentes comparables. 71

82 Material y Métodos El peso como parámetro aislado no tiene validez y debe expresarse en función de la edad o de la talla Método empleado y análisis de resultados. En nuestro estudio se han utilizado las tablas para cada sexo en percentiles del Indice de Masa Corporal (IMC), por edades elaboradas por el National Center for Health Statistics (NCHS) del CDC (Figs. 4-7). Se calculó el IMC de cada niño y dentro de cada grupo de edad, los límites de los percentiles 5 y 95; se calculó la media de dichos valores entre las edades límites de los grupos de edad. Según los resultados, se clasificaron a todos los niños en tres categorías según su estado nutricional: desnutrición, normal o sobrepeso. 72

83 Material y Métodos Fig. 4 73

84 Material y Métodos Fig 5 74

85 Material y Métodos Fig. 6 75

86 Material y Métodos Fig. 7 76

87 Material y Métodos Entrega de resultados y tratamiento de los niños parasitados. Una vez obtenidos los resultados se transmitieron a los colegios. De forma inmediata, en el momento del diagnóstico, se notificaron los niños que padecían algún enteropatógeno para que estos niños fueran tratados a la mayor brevedad posible Comparación cuantitativa de las técnicas de Faust y Ritchie Dado que las técnicas de concentración que mejores resultados ofrecieron en la recuperación de formas parasitarias fueron las técnicas de Faust (1939) y Ritchie (1948), decidimos realizar un estudio cuantitativo para ver cuál de las dos técnicas es más efectiva. Para ello tomamos 100 muestras fecales al azar de los niños objetos de este estudio. Las muestras fecales se lavaron varias veces mediante centrifugación a r.p.m durante 15 minutos descartando el sobrenadante tras cada centrifugación. De esta forma se eliminó el dicromato potásico en que estaban preservadas. Una fracción de la muestra se destinó a la realización de la técnica de Faust y otra fracción a la de la técnica de Ritchie, tal como se ha expuesto en apartados anteriores. La muestra de parásitos obtenida tras la realización de cada una de las técnicas fue recogida y se procedió a la cuantificación de formas parasitarias empleando las cámaras de Neubauer y McMaster. De esta forma se determinaron los parásitos/ml en el primer caso y por gramo en el segundo, para ambas técnicas. 77

88 Material y Métodos Análisis molecular de las muestras con Giardia Giardia duodenalis fue el enteroparásito patógeno más frecuente. Dada nuestra experiencia previa sobre caracterización molecular de Giardia (Peréz Cordón y cols. 2008) decidimos realizar un breve estudio molecular para identificar los principales ensamblajes que estaban presentes en las muestras fecales de los niños estudiados. Este ha sido el primer estudio de caracterización molecular de Giardia realizado en Marruecos hasta la fecha. La dificultad y laboriosidad de este trabajo estriba en varios puntos que pasamos a exponer: - La pequeña cantidad de quistes que presentaban la mayoría de las muestras - La pérdida de quistes en los procesos de concentración empleados - La dificultad para conseguir romper los quistes de Giardia - La pequeña cantidad de ADN obtenida que en la mayoría de los casos era insuficiente para continuar con el proceso de PCR A continuación pasamos a explicar la metodología ensayada para mejorar el rendimiento en la cantidad de ADN obtenido de los quistes de Giardia Aislamiento y purificación de quistes Los quistes de Giardia lamblia se purificaron a partir de las muestras de heces de los niños estudiados mediante de la técnica de Faust previamente ya que otras técnicas pueden impedir el posterior procesado para realizar PCR. 78

89 Material y Métodos Ruptura/digestión de los quistes Se ensayaron varias técnicas para intentar incrementar el número de quistes abiertos para la posterior extracción de ADN. A) Choque térmico: Los quistes se sometieron a 10 ciclos de congelación-descongelación. La congelación se realizó a (-80ºC durante 30 minutos) y descongelación brusca en baño a 100ºC B) Acción enzimática y choque térmico: B.1. De acuerdo a las técnicas descritas previamente (Coggins y Schaefer, 1986; Polverino y cols. 2004). La técnica es la siguiente: A 0.5 ml de las heces, con los quistes, previamente lavadas se les incorpora 5 ml de una solución ácida de pepsina (0.1 M NaHCO 3, 12 mm KCl, 40 mm NaCl, 0.5% de pepsina. Ajustar el ph final de la solución a 2.0), y se incuban a 37ºC durante 1h con agitación. Centrifugar a r.p.m durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante. Lavar por centrifugación 2 veces con PBS caliente (37ºC) Resuspender el potón con los quistes en 10 ml de solución tripsina-tyrode (0.5% p/v, ph 8) e incubar a 37ºC durante 30 minutos. Observar si los quistes se han abierto y si no lo han hecho someter a 6 ciclos de congelación (-80ºC, 30 minutos) y descongelación (80ºC, 30 minutos) y posterior ebullición. 79

90 Material y Métodos B.2. De acuerdo a la metodología descrita por Renton y cols. 1986). La muestra fecal o los quistes purificados se someten a 6 ciclos de congelación (-80ºC, 30 minutos) y descongelación (80ºC, 30 minutos) y posterior ebullición a 100ºC durante 15 minutos. Centrifugar a r.p.m durante 10 minutos Resuspender el botón en solución Hank con 1% de tripsina (ph 2.7) e incubar durante 1h a 37ºC. Centrifugar y lavar 2 veces con PBS Resuspender el botón en solución Hank (ph 7) con 1% de bilis bovina y 0.06% de bicarbonato sódico durante minutos a 37ºC. Mirar si se han desenquistado. Si no se han digerido aún centrifugar y lavar 4 veces. El botón final ponerlo en tampón de lisis 24h a 37ºC. C) Sonicación en tampón de lisis: - Partir de muestras fecales previamente lavadas varias veces por centrifugación a r.p.m y concentradas mediante la técnica de Faust. - Añadir al botón final 1.5 ml de tampón de lisis con inhibidores de proteasas - Homogenizar bien la muestra - Introducir la muestra en hielo - Realizar 6 ciclos de sonicación con 1.5 minutos cada vez. 80

91 Material y Métodos Extracción de ADN La extracción del ADN genómico de Giardia, se efectuó mediante mini kit QIAamp (QIAGEN, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El kit comercial, corresponde a un método de extracción por columna de intercambio iónico que permite la purificación de ADN de muestras frescas o congeladas que presentan gran concentración de inhibidores de PCR. EL ADN liga específicamente a la membrana de sílica gel del QIAamp y los contaminantes la atraviesan. Los inhibidores de PCR son removidos por la acción combinada de una resina de adsorción (InhibitEX) y un tampón. La lisis con proteinasa K asegura un alto rendimiento de todos los tipos de ADN en las muestras, incluso de patógenos gastrointestinales. Las impurezas son eficientemente removidas por dos lavados con diferentes tampones (AW1 y AW2), obteniéndose un ADN puro el que debe ser eluído en tampón salino para su uso directo en reacciones de amplificación. El proceso de extracción de ADN fue el siguiente (Fig. 8) - Las muestras estaban previamente sonicadas en 1.5 ml de tampón de lisis (Buffer ASL) proporcionado por el kit QIAamp. - Las muestras se agitaron durante 1 min para su total homogenización. - Para la lisis se calentaron las muestras a 95 C por 5 min, se agitaron por 15 seg. y centrifugaron a máxima velocidad por 1 min hasta obtener un botón de la muestra. - Del sobrenadante, 1,2 ml se trasladaron a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml y se desechó el pellet. - Se adicionó una tableta de Inhibitex a cada muestra y se agitó inmediata durante 1 min. 81

92 Material y Métodos - A continuación se incubó la suspensión por 1 minuto a temperatura ambiente para permitir que los inhibidores se adsorbieran a la matriz InhibitEX. - Se centrifugó la muestra a máxima velocidad por 3 min para que el botón de inhibidores se unieran al InhibitEX. - Todo el sobrenadante se depositó en un nuevo tubo de centrífuga y se eliminó el botón, centrífugándose la muestra a máxima velocidad por 3 min. - Se colocaron 15 l de proteinasa K dentro de un nuevo tubo de microcentrifuga de 1,5 ml y 200 l de sobrenadante, se adicionó 200 l de tampón AL y se aplicó vortex por 15 seg. - Se incubó a 70 C durante 10 min. Se adicionaron 200 l de etanol (100%) al lisado y se mezcló mediante vortex. - En una nueva columna QIAamp situada en un tubo de colección de 2 ml, se aplicó el lisado y se centrifugó a máxima velocidad por 1 min. - La columna QIAamp se situó en un nuevo tubo de colección y se desechó el tubo que contenía el filtrado, se adicionaron 500 l de tampón AW1, se centrifugó a máxima velocidad por 1 min. - La columna QIAamp fue situada en un nuevo tubo de colección de 2 ml y se desechó el tubo de colección que contenía el filtrado. - Se adicionaron 500 l de tampón AW2, se centrifugó a máxima velocidad por 3 min y se desechó el tubo de colección que contenía el filtrado. - La columna QIAamp se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se adicionó 200 l de tampón AE directamente dentro de la membrana QIAamp. - Se incubó por 1 min. a temperatura ambiente y se centrifugó a máxima velocidad por 1 min para obtener el ADN eluido. 82

93 Material y Métodos - Las muestras de ADN extraído se conservaron a -20ºC hasta su uso. Fig 8. Esquema de extracción de ADN mediante QIAamp 83

94 Material y Métodos Purificación de ADN Dado que aún seleccionando las muestras con mayor cantidad de quistes, la concentración obtenida de ADN era pequeña procedimos a purificar el ADN mediante un kit de purificación de ADN (Wizard Genomic, Promega), de acuerdo a la siguiente técnica - Añadir 200 µl de isopropanol a los 200 µl de ADN extraído mediante el kit - Agitar por volteo suavemente - Centrifugar a r.p.m durante 4 minutos - Descartar el sobrenadante - Añadir 400 µl de etanol de 70º - Centrifugar a r.p.m durante 4 minutos - Eliminar el sobrenadante y mantener en la estufa hasta secar (15 minutos) - Añadir 70 µl de solución de rehidratación de ADN (10mM Tris, 1mM EDTA). Mantener 1 h a 65ºC Cuantificación de ADN Tras la obtención del ADN purificado por el kit, se procede a su cuantificación y medida del grado de pureza, para esto último se mide la absorbancia a 260 y 280 nm. El cociente λ260/λ280 nos da una medida de pureza del ADN, donde: < 1,5 exceso de proteínas > 2 exceso de ácidos nucleicos (RNA) Mientras que para medir la concentración del ADN tenemos en cuenta la absorbancia medida a 260 nm, la dilución empleada y un factor de corrección para la cuantificación utilizando cubetas de cuarzo. 84

95 Material y Métodos La dilución empleada es la 1/50 (490 µl de tampón TE + 10 µl muestra = 500 µl total). [ADN] (µg/µl) = A , Técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Este técnica permite identificar los genotipos de Giardia duodenalis en las muestras fecales de los niños estudiados Hemos seleccionado dos técnicas para confirmar los resultados. Ensayo de PCR 1 Realizamos una PCR semi-anidada, (nested-pcr), con los cebadores y las condiciones publicados por Read y cols. (2004) para amplificar un fragmento de 432 pb del gen de la glutamato deshidrogenasa (gdh) de Giardia. El gen gdh ha sido previamente utilizado, mostrando un alto grado de polimorfismo en G. duodenalis, lo que permite la diferenciación tanto en el genotipo (ensamblajes) como a nivel intragenotípico (subensamblajes). Los cebadores empleados (Thermo Fisher Scientific) fueron: GDHeF: 5'-TCA ACG TYA AYC GYG GYT TCC GT-3 ', GDHiF: 5'-CAG TAC AAC TCY GCT CTC GG-3', GDHiR: 5'-GTT RTC CTT GCA CAT CTC C- 3. La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 50 µl, con 200 nmol de cada cebador, Biomex formado por 200 µm de dntp, 1,5 mm de MgCl 2, 2,5 U de taq ADN polimerasa (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), 2 µl DMSO (Dimetilsulfóxido 10 mg /ml) (Promega, (Promega, Biotech Ibérica S.L ) y 20 µl de ADN. Las condiciones de amplificación consistieron en, un paso previo, un ciclo de 94 C durante 2 min, 56 C durante 1 min, 72 C durante 2 min y 55 85

96 Material y Métodos ciclos de amplificación (94 C durante 30 s, 56 C durante 20 s, 72 C durante 45 s), seguido de un ciclo de 7 min a 72ºC. Ensayo de PCR 2 Realizamos una PCR anidada (nested PCR) empleando la técnica previamente descrita por (Appelbee y cols. 2003), para amplificar un fragmento de 292 pb del gen 18S rrna de Giardia (Appelbee et al., 2003). Los cebadores empleados son los siguientes: GiaF: 5'-AAG TGT GGT ACG GAC GGA CTC-3 ', GiaR: 5'-CTG CTG CCG TCC TTG GAT GT-3', RH11: 5 - CAT CCG GTC GAT CCT GCC-3 ' y RH4: 5'-AGT CGA ACC CTG TCA CTC CGC CAG G-3. La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 50 µl, con 200 nmol de cada cebador, Biomex compuesto de 200 µm de dntp, 1,5 mm de MgCl 2, 2,5 U de taq ADN polimerasa (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), 2 µl DMSO (Dimetilsulfoxido 10 mg /ml) (Promega, Biotech Ibérica S.L) y 20 µl de ADN. Las condiciones de amplificación consistieron a 35 ciclos (96ºC durante 45 s, 55 C durante 30 s, 72 C durante 45 s) seguido por un ciclo de 4 min a 72 C a la PCR primaria. A continuación, 35 ciclos de amplificación (96 C durante 45 s, 59 C durante 30 s, 72 C durante 30 s) seguido por un ciclo de 4 min a 72. Como control positivo se usó Giardia duodenalis (ATCC 30888) Electroforesis Los productos obtenidos de las PCR1 y PCR2 se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se usaron alícuotas de 5 l mezcladas con 1 l del buffer de corrida constituido por glicerol 30%, azul de bromofenol 0,25%, xileno-cianol 0,25% y H 2 O destilada autoclavada en csp 86

97 Material y Métodos 100 ml. La electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 2% en buffer TBE 1x a 100 Volts por 1:45 hrs, usando además un marcador de peso molecular, 1000 pb Ladder (Promega, (Promega, Biotech Ibérica S.L). Para revelar las bandas, el gel de corrida se tiñó con bromuro de etidio (10mg/ml) durante 15 min, se lavó en H 2 O bidestilada durante 15 minutos, se observó en transiluminador de LUV (UVP, Cambridge UK) y se procedió a fotografiar con cámara (OLYMPUS C-4000 Zoom, New York USA) Purificacion de los productos obtenidos por PCR Para ello se empleó el kit Wizard SV gel y purificación de productos de PCR (Promega, USA) siguiendo el siguiente protocolo: - Partiendo del gel de agarosa recortar las bandas de 432 y 292 bp obtenidas en la PCR1 y PCR2 con un escarpelo. - Introducir las bandas recortadas en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. - Añadir 10 µl de solución de unión a membrana (Membrane Binding Solution) por 10 mg del gel de agarosa. - Mezclar agitando e incubar a 50ºC- 65ºC hasta que el gel de agarosa se disuelva - Insertar una columna (SV) en un tubo de colección - Transferir el gel disuelto a la columna e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto - Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. Descartar el sobrenadante y reinsertar la columna dentro de otro tubo de colección. - Añadir 700 µl de solución de lavado de membrana (etanol absoluto) y centrifugar a máxima velocidad durante 5 minutos. Descartar el 87

98 Material y Métodos sobrenadante y reinsertar la columna dentro de un nuevo tubo de colección. - Añadir 500 µl de solución de lavado de membrana. Centrifugar a máxima velocidad durante 5 minutos. - Vaciar el tubo de colección y centrifugar la columna durante 1 minuto, abrir la tapa de microcentrífuga para permitir la evaporación del etanol residual. - Transferir cuidadosamente la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. - Añadir 50 µl de agua libre de nucleasas en la columna. Incubar en una temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrigugar a máxima velocidad durante 1 minuto. - Descartar la columna y conservar el ADN a 4ºC o -20ºC Secuenciación La cantidad de ADN para una reacción de secuencia de los productos de PCR, fue calculada de acuerdo a la siguiente fórmula: Tamaño del fragmento x 0,1 = ng DNA para una reacción de secuencia Debido a que el volumen máximo de reacción de secuencia es de 10 µl, la mínima concentración del producto debe ser de 5 ng/µl. Para realizar la secuenciación se empleó un ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). 88

99 Material y Métodos Comparación con secuencias publicadas Blast La secuencia obtenida se comparó efectuando un alineamiento local mediante la introducción de la secuencia parcial en el programa bioinformático del Centro Nacional de Información para Biotecnología (NCBI) empleando Blast para nucleótidos. A través del programa Blast se puede conocer la homología existente entre la secuencia problema y las recogidas en GenBank Análisis estadístico de resultados Se llevó a cabo un estudio cuantitativo de los resultados obtenidos mediante el cálculo de los Índices de Parasitación Simple e Índice de Parasitación Corregido, según la edad, sexo y distrito de procedencia de los alumnos. El Índice de Parasitación Simple (IPS) se define como la relación de personas parasitadas (NPP) y el tamaño muestral (TM). IPS = NPP/TM El Índice de Parasitación Corregido (IPC) se define como la relación entre el número total de parásitos (NTP) y el tamaño muestral (TM). IPC = NTP/TM 89

100 Material y Métodos Por otra parte, se aplicó el test de comparación de proporciones. Supongamos que una cierta característica, expresada porcentualmente, quiere compararse entre dos poblaciones, y que para ello, se toman sendas muestras de tamaños N 1 y N 2 respectivamente, obteniéndose a partir de ellas unos porcentajes muestrales de P 1 y P 2. El test de significación consiste en evaluar el estadístico: Que se distribuye según una ley normal N (0,1). Como para un nivel α = 0.05 es Z α / 2 = 1.96 la diferencia porcentual entre ambas poblaciones será significativa. En nuestro trabajo llevamos a cabo los estudios siguientes: - Estudio comparativo de proporciones de parásitos en los colegios de la zonas urbanas y rurales por grupo de edades, por sexo y por estaciones. - Estudio comparativo de proporciones de parásitos entre los distintos sexos: por zonas, por grupo de edades y zona, por estación más grupos de edades y zonas. - Estudio comparativo de proporciones de parásitos según la estación del año. 90

101 Material y Métodos - Estudio comparativo de proporciones de enteropatógenos en zonas rurales y urbanas y por grupos de edades, sexo y por estaciones. - Estudio comparativo de proporicones de multiparasitismo - Estudio comparativo de desnutrición asociada a enteroparásitos También se ha calculado la prevalencia de los parásitos encontrados en función de los parámetros analizados. Número de sujetos parasitados Prevalencia = x 100 Número de sujetos del grupo estudiado 91

102 92

103 Resultados 3. RESULTADOS 3.1. Sobre las características de la población estudiada Nivel de participación de la población en el estudio Tabla 1. Nivel de participación en cada zona Zona N/N total % N Rural 470/ % Urbana 935/ % Total 1.405/ % Nº alumnos participantes en el muestreo/nº total de alumnos de los colegios de las diferentes zonas Tabla 2. Distribución de la población según zona Zona N % N Rural ,5% Urbana ,5% Total ,0% 93

104 Resultados Tabla 3. Distribución de la población según la estación del año Rural Urbana N % N N % N Primavera ,3% ,2% Verano 125 8,9% ,2% Otoño 74 5,3% 118 8,4% Invierno 0 0% ,7% Total ,5% ,5% Tabla 4. Distribución de la población según el sexo Niñas Niños N % N N % N Rural ,9% ,5% Urbana ,5% ,1% Total ,4% ,6% 94

105 Resultados Tabla 5. Distribución de la población por estaciones del año según sexo y zona Rural Urbana Niñas Niños Niñas Niños N % N N % N N % N N % N Primavera 127 9,0% ,2% ,5% 136 9,7% Verano 69 4,9% 56 4,0% 108 7,7% 120 8,5% Otoño 42 3,0% 32 2,3% 58 4,1% 60 4,3% Invierno 0 0% 0 0% ,1% ,6% Total ,9% ,5% ,5% ,1% Tabla 6. Distribución de la población por edades Rural Urbana N % N N % N [5,8) ,0% ,7% [8,11) ,7% ,3% [11,15) 109 7,8% 120 8,5% Total ,5% ,5% 95

106 Resultados Tabla 7. Distribución de la población por grupos de edades y estaciones del año en cada zona Rural Urbana N % N N % N [5,8) Primavera 68 4,8% 103 7,3% Verano 51 3,6% 102 7,3% Otoño 21 1,5% 20 1,4% Invierno 0 0% 136 9,7% [8,11) Primavera 135 9,6% 138 9,8% Verano 51 3,6% 120 8,5% Otoño 35 2,5% 58 4,1% Invierno 0 0% 138 9,8% [11,15) Primavera 68 4,8% 43 3,1% Verano 23 1,6% 6 0,4% Otoño 18 1,3% 40 2,8% Invierno 0 0% 31 2,2% 96

107 Resultados Tabla 8. Distribución de la población por grupos de edades, estaciones del año, y sexo en cada zona Rural Urbana Niñas Niños Niñas Niños N % N N % N N % N N % N [5,8) Primavera 27 1,9% 41 2,9% 55 3,9% 48 3,4% Verano 26 1,9% 25 1,8% 34 2,4% 68 4,8% Otoño 12 0,9% 9 0,6% 14 1,0% 6 0,4% Invierno 0 0% 0 0% 70 5,0% 66 4,7% [8,11) Primavera 71 5,1% 64 4,6% 73 5,2% 65 4,6% Verano 29 2,1% 22 1,6% 70 5,0% 50 3,6% Otoño 20 1,4% 15 1,1% 25 1,8% 33 2,3% Invierno 0 0% 0 0% 70 5,0% 68 4,8% [11,15) Primavera 29 2,1% 39 2,8% 20 1,4% 23 1,6% Verano 14 1,0% 9 0,6% 4 0,3% 2 0,1% Otoño 10 0,7% 8 0,6% 19 1,4% 21 1,5% Invierno 0 0% 0 0% 16 1,1% 15 1,1% 97

108 Resultados 3.2. Prevalencia de enteroparásitos Estudios de índice se parasitación simple (IPS) y corregido (IPC) Estudio comparativo de parasitismo según la zona Tabla 9. Distribución del tamaño muestral, número de personas parasitadas (NPP) y número total de parásitos observados (NTP) Rural Urbana TM NPP NTP TM: Tamaño muestral NPP: Número de personas parasitadas NTP: Número total de especies de parásitos Tabla 10. Distribución del IPS y del IPC por zonas Índices Rural Urbana IPS 0,66 0,61 IPC 0,94 0,77 IPS: Índice de Parasitación Simple IPC: Índice de Parasitación Corregido 98

109 Resultados 1 0,94 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,66 0,61 0,77 IPS IPC 0,3 0,2 0,1 0 Rural Urbana Gráfico 1. Representación gráfica del IPS y del IPC según la zona Estudio del IPS e IPC por edades Estudio comparativo del parasitismo según la edad Tabla 11. Distribución del tamaño muestral, número de personas parasitadas (NPP), y número total de parásitos encontrados (NTP), según la edad. [5,8) [8,11) [11,15) TM NPP NTP

110 Resultados Tabla 12. Distribución del IPS y del IPC según la edad [5,8) [8,11) [11,15) IPS 0,62 0,62 0,66 IPC 0,78 0,84 0,89 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,89 0,84 0,78 0,66 0,62 0,62 [5,8) [8,11) [11,15) IPS IPC Gráfico 2. Representación gráfica del IPS y IPC según la edad 100

111 Resultados Estudio comparativo del parasitismo según la edad en cada zona Tabla 13. Distribución del tamaño muestral (TM), del número de personas parasitadas (NPP), y del número total de parásitos encontrados (NTP), según la edad y la zona Rural Urbana [5,8) TM NPP NTP [8,11) TM NPP NTP [11,15) TM NPP NTP Tabla 14. Distribución del IPS y del IPC según la edad y la zona Rural Urbana [5,8) IPS IPC [8,11) IPS IPC [11,15) IPS IPC 0,64 0,61 0,86 0,75 0,65 0,60 0,98 0,78 0,72 0,59 0,97 0,81 101

112 Resultados IPS 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,72 0,64 0,65 0,61 Rural 0,60 Urbana 0,59 [5,8) [8,11) [11,15) Gráfico 3. Representación gráfica del IPS según la edad y la zona IPC 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,86 0,98 Rural 0,97 0,75 0,78 Urbana 0,81 [5,8) [8,11) [11,15) Gráfico 4. Representación gráfica del IPC según la edad y la zona 102

113 Resultados Estudio del IPS y del IPC por sexos Estudio comparativo del parasitismo según el sexo Tabla 15. Distribución del tamaño muestral (TM), número de personas parasitadas (NPP), y número total de parásitos encontrados (NTP), según el sexo Niños Niñas TM NPP NTP Tabla 16. Distribución del IPS y del IPC según el sexo Niños Niñas IPS 0,62 0,63 IPC 0,81 0,84 103

114 Resultados 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,81 0,62 0,63 Niños Niñas 0,84 IPS IPC Gráfico 5. Representación gráfica del IPS y del IPC según el sexo Estudio comparativo del parasitismo según el sexo y por zonas Tabla 17. Distribución del tamaño muestral (TM), del número de niños parasitados (NPP), y del número total de parásitos encontrados (NTP), según el sexo y en cada zona Rural Urbana Niños TM NPP NTP Niñas TM NPP NTP

115 Resultados Tabla 18. Distribución del IPS y del IPC según el sexo en cada zona Rural Urbana Niños IPS 0,68 0,59 IPC 0,93 0,75 Niñas IPS 0,65 0,62 IPC 0,96 0,79 IPS 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,68 Rural 0,65 0,59 Urbana 0,62 Niños Niñas Gráfico 6. Representación gráfica del IPS según el sexo en cada zona 105

116 Resultados IPC 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,93 Rural 0,96 0,75 Urbana 0,79 Niños Niñas Gráfico 7. Representación gráfica del IPC según el sexo en cada zona Tabla 19. Distribución del tamaño muestral (TM), del número de personas parasitadas (NPP), y del número total de parásitos encontrados (NTP), según el sexo y la edad en cada zona Rural Urbana Niñas Niños Niñas Niños [5,8) TM NPP NTP [8,11) TM NPP NTP [11,15) TM NPP NTP

117 Resultados Tabla 20. Distribución del IPS y del IPC según el sexo y la edad en cada zona Rural Urbana [5,8) [8,11) [11,15) IPS IPC IPS IPC IPS IPC Niñas Niños Niñas Niños 0,60 0,67 0,62 0,61 0,80 0,92 0,76 0,73 0,65 0,65 0,61 0,59 1,06 0,88 0,79 0,76 0,72 0,73 0,64 0,54 0,92 1,02 0,86 0,75 IPS 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Rural_Niñas Rural_Niños Urbana_Niñas Urbana_Niños [5,7] [8,10] [10,14] Gráfico 8. Representación gráfica del IPS según sexo y edad en cada zona 107

118 Resultados Estudio del IPS y del IPC según la estación de año Estudio comparativo del parasitismo según la estación del año Tabla 21. Distribución del tamaño muestral (TM), número de personas parasitadas (NPP), y número total de parásitos encontrados (NTP), según la estación del año Primavera Verano Otoño Invierno TM NPP NTP Tabla 22. Distribución del IPS y del IPC según la estación del año Primavera Verano Otoño Invierno IPS 0,65 0,62 0,64 0,57 IPC 0,85 0,80 1,07 0,68 108

119 Resultados 1,10 1,07 0,90 0,85 0,80 0,70 0,50 0,65 0,62 0,64 0,57 0,68 IPS IPC 0,30 0,10-0,10 Primavera Verano Otoño Invierno Gráfico 9. Representación gráfica del IPS y del IPC según la estación de año Tabla 23. Distribución del tamaño muestral (TM), número de personas parasitadas (NPP), y número total de parásitos (NTP), según la estación del año y distrito. Rural Urbana Primavera TM NPP NTP Verano TM NPP NTP Otoño TM NPP NTP Invierno TM NPP NTP

120 Resultados Tabla 24. Distribución del IPS y del IPC según la estación del año y distrito Rural Urbana Primavera IPS 0,65 0,66 IPC 0,87 0,82 Verano IPS 0,66 0,60 IPC 0,88 0,75 Otoño IPS 0,73 0,58 IPC 1,32 0,91 Invierno IPS 0 0,57 IPC 0 0,68 IPS 1,00 0,80 0,60 0,73 0,65 0,66 0,66 0,60 0,58 0,57 Primavera Verano 0,40 0,20 Otoño Invierno 0,00 Rural Urbana Gráfico 10. Representación gráfica del IPS según la zona y la estación del año 110

121 Resultados IPC 1,40 1,32 1,20 1,00 0,80 0,87 0,88 0,82 0,75 0,91 0,68 Primavera Verano 0,60 Otoño 0,40 Invierno 0,20 0,00 Rural Urbana Gráfico 11. Representación gráfica del IPC según el distrito y la estación del Tabla 25. Distribución del tamaño muestral (TM), número de personas parasitadas (NPP), y número total de parásitos (NTP), según la zona, edad y estación del año P=Primavera, V=Verano, 0=Otoño, I=Invierno Rural Urbana P V O I P V O I [5,8) TM NPP NTP [8,11) TM NPP NTP [11,15) TM NPP NTP

122 Resultados Tabla 26. Distribución del IPS y del IPC según la edad y estación del año P=Primavera, V=Verano, 0=Otoño, I=Invierno Rural Urbana P V O I P V O I [5,8) IPS 0,63 0,65 0,62 0 0,72 0,60 0,50 0,57 IPC 0,79 0,88 1,05 0 0,83 0,75 0,85 0,66 [8,11) IPS 0,63 0,63 0,77 0 0,62 0,59 0,62 0,58 IPC 0,89 0,84 1,51 0 0,82 0,77 0,93 0,68 [11,15) IPS 0,71 0,74 0,78 0 0,63 0,67 0,58 0,55 IPC 0,90 0,96 1,28 0 0,81 0,67 0,90 0,71 IPS 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 [5,8) [8,11) [11,15) 0,00 Rural_P Rural_V Rural_O Rural_I Urbana_P Urbana_V Urbana_O Urbana_I Gráfico 12. Representación gráfica del IPS según zona, edad y estación del año 112

123 Resultados IPC 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Rural_P Rural_V Rural_O Rural_I Urbana_P Urbana_V Urbana_O Urbana_I [5,8) [8,11) [11,15) Gráfico 13. Representación gráfica del IPC según zona, edad y estación del año 113

124 Resultados Tabla 27. Distribución del tamaño muestral (TM), número de personas parasitadas (NPP), y número total de parásitos (NTP), según el sexo, estación del año, edad y zona Rural Urbana Niñas Niños Niñas Niños P V O I P V O I P V O I P V O I [5,8) TM NPP NTP [8,11) TM NPP NTP [11,15) TM NPP NTP

125 Resultados Tabla 28. Distribución del IPS y del IPC según la estación del año, edad y sexo en cada zona Rural Urbana Niñas Niños Niñas Niños P V O I P V O I P V O I P V O I [5,8) IPS 0,59 0,58 0,67 0 0,66 0,72 0,56 0 0,80 0,47 0,57 0,57 0,63 0,66 0,33 0,56 IPC 0,67 0,77 1,17 0 0,88 1,00 0,89 0 0,95 0,47 1,00 0,70 0,71 0,88 0,50 0,62 [8,11) IPS 0,56 0,66 0,95 0 0,70 0,59 0,53 0 0,67 0,59 0,64 0,56 0,57 0,60 0,61 0,60 IPC 0,79 0,97 2,15 0 1,00 0,68 0,67 0 0,86 0,79 1,08 0,61 0,77 0,74 0,82 0,75 [11,15) IPS 0,66 0,79 0,80 0 0,74 0,67 0,75 0 0,75 0,50 0,58 0,63 0,52 1,00 0,57 0,47 IPC 0,72 1,00 1,40 0 1,03 0,89 1,13 0 0,90 0,50 0,84 0,94 0,74 1,00 0,95 0,47 115

126 Resultados 3.3. Estudio cualitativo Estudio de la prevalencia de enteroparásitos según la zona Tabla 29. Distribución de la prevalencia de las distintas especies de protozoos y helmintos según la zona Rural Urbana Total N % N N % N N % N Protozoos Giardia duodenalis 88 19, , ,5 Cyclospora cayetanensis 40 9,0 56 7,8 96 8,3 Entamoeba coli 17 3,8 21 2,9 38 3,3 Chilomastix mesnili 7 1,6 11 1,5 18 1,5 Entamoeba histolytica 8 1,8 3 0,4 11 0,9 Endolimax nana 6 1,4 3 0,4 9 0,8 Iodamoeba bütschlii 2 0,5 3 0,4 5 0,4 Cryptosporidium spp. 0 0,0 1 0,1 1 0,1 Isospora belli 1 0,2 0 0,0 1 0,1 Helmintos Hymenolepis nana 6 1,4 6 0,8 12 1,0 Enterobius vermicularis 3 0,7 8 1,1 11 0,9 Trichuris trichiura 2 0,5 7 1,0 9 0,8 Ascaris lumbricoides 0 0,0 8 1,1 8 0,7 Hymenolepis diminuta 3 0,7 4 0,6 7 0,6 Fasciola hepatica 0 0,0 2 0,3 2 0,2 Ancylostoma duodenales 0 0,0 1 0,1 1 0,1 Dicrocoelium dentriticum 1 0,2 0 0,0 1 0,1 Taenia saginata 1 0,2 0 0,0 1 0,1 Otros Blastocystis hominis , , ,6 116

127 Resultados Rural Urbana Total Otros Protozoos Helmintos Gráfico 14. Representación del número de parásitos: protozoos, helmintos y B. hominis en cada zona 100% 80% 60% 40% 20% 0% 3,6 5,0 4,5 38,1 31,3 33,9 58,2 63,7 61,6 Rural Urbana Total Otros Protozoos Helmintos Gráfico 15. Representación gráfica de la prevalencia de parásitos en cada zona 117

128 Resultados Gráfico 16. Representación gráfica de la prevalencia (%) de las distintas especies de parásitos en cada zona 118