Fluorimetría y sus aplicaciones en el Laboratorio Clínico. Integrantes : Edgardo Gonzalez Yuber Peña Mario Quiroz José Zapata

Transcripción

1 Fluorimetría y sus aplicaciones en el Laboratorio Clínico Integrantes : Edgardo Gonzalez Yuber Peña Mario Quiroz José Zapata

2 A.-Marco Teórico i.- Aspectos importantes de Fluorimetría ii.-tipos de Fluorímetros y sus partes ópticas B.-Aplicaciones i.-análisis con métodos de fluorescencia C.-Precauciones i.-posibles fuentes de error D.-Visita al Laboratorio i.- Inmunoanalizador UniCap100 ii.- Inmunoanalizador AxSYM

3 A.i.- Aspectos importantes de Fluorimetría: Técnica espectrofotométrica que se basa en la absorción de radiación por parte del analito a medir en una muestra y su posterior emisión. Su fundamento es la fluorescencia que es la emisión de radiación por electrones excitados. En el fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación electromagnética y debido a ello los electrones pasan de un estado basal a otra fase de excitación. Po cubeta P Fig. 1: Esquema de la dirección de la energía radiante incidente, transmitida y emitida en una cubeta de muestra.

4 Algunos de tales electrones perderán energía y caerán en una orbita energética inferior a la que habían alcanzado, antes de volver definitivamente a su orbita energética basal. La energía emitida al volver al estado basal es inferior a la absorbida. La longitud de onda de la luz emitida será más larga que la absorbida para la excitación debido a que la energía emitida es menos que al absorbida. El tiempo que transcurre entre la absorción de energía y la de su liberación en forma de luz, es aproximadamente 10-8 s. Un gran número de compuestos presentan el fenómeno de fluorescencia. Es posible transformar los compuestos no fluorescentes o con fluorescencia espontánea débil en derivados con alta fluorescencia, a través de reacciones químicas La intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la concentración de sustancias fluorescentes en soluciones diluidas. La fluorescencia es emitida por los compuestos en todas direcciones, pudiendo cuantificarse.

5 Esquema óptico general de un fluorímetro Fig. 2: Partes generales de un fluorímetro

6 A.ii Tipos de Fluorímetros y sus partes ópticas: -Fluorímetros de Filtro: Fuentes de luz de excitación: la fuente de radiación en los instrumentos de fluorescencia es una potente fuente de radiación ultravioleta. -Lámpara de vapor de mercurio: Es un dispositivo sencillo alimentado a voltaje constante, de bajo costo y de larga duración. Proporciona varias líneas de emisión intensas superpuestas a un espectro continuo débil. Los peaks de emisión de esta lámpara son: 313, 365, 405 y 436 nm. -Fuente de arco de xenón: Esta fuente se alimenta a voltaje constante, es de mayor costo y menor duración. Proporciona una intensa radiación en al región visible y UV, produciendo una emisión entre 200 y 700 nm.

7 Selector de longitud de onda primario: Se utiliza un filtro primario, generalmente es de vidrio o de cuarzo y en algunos modelos, filtros de interferencia. Se usa para: Cubetas: Suministrar a la muestra una energía de excitación monocromática adecuada. Permitir la disminución de la fotodescomposición de un analito Las cubetas que se utilizan son de cuarzo, ya que Muchos de los analitos a leer en fluorimetría se excitan antes por radiación UV Selector de longitud de onda secundario : El filtro secundario es de corte de vidrio. Selecciona la longitud de onda de emisión que será captada por el detector. Debe absorber cualquier radiación dispersada primaria, pero transmitir la luz fluorescente.

8 Detector: Utiliza como detector un tubo fotomultiplicador. Es muy sensible y posee gran rapidez en su respuesta. Amplifica de modo significativo la intensidad de una corriente, Es capaz de absorber luz y emitir electrones en proporción a la energía radiante que incide en la superficie del material sensible a la luz. Algunos modelos utilizan fotocélulas o fototubos. - Fluorímetro de haz sencillo: Utiliza monocromadores del tipo rejillas de difracción, para la selección de longitud de onda. El monocromador primario selecciona la longitud de onda de excitación que llegará a la muestra y el monocromador secundario selecciona la longitud de onda de emisión que se detecta. Estos monocromadores aportan al instrumento una gran versatilidad y selectividad.

9 -Fluorímetro de doble haz: Ocupa doble haz de luz, donde la fuente y el monocromador primario suministran luz incidente a un espejo desdoblador de haz que envía radiación alternativamente a la cubeta de la muestra y a la cubeta de referencia. La señal de fluorescencia de cada cubeta se detecta por separado en el fotomultiplicador, primero la de la muestra y luego la de referencia. La gran ventaja de este instrumento es que nos entrega una mayor precisión en las lecturas ya que se puede colocar el blanco de reactivos y la muestra, leyéndose así la diferencia entre ambas señales de fluorescencia.

10 B.- Aplicaciones Fluorimetría en Laboratorio Clínico: Las mediciones de iones inorgánicos tales como: Magnesio, Calcio, Cobre, Hierro, Zinc y Beridio. Determinación de aminoácidos y sustancias relacionadas con los mismos, tales como: fenilalanina, tirosina, triptófano, creatina, histidina, urobilina y bilirrubina. Medición de nucleótidos como: ATP, ADP, NADH y NADPH. Determinación de enzimas, tales como: deshidrogenasa láctica, transaminasas, alcoholdeshidrogenasa, fosfatasas ácidas y alcalinas, lipasa, colinesterasa, entre otras. Medición de esteroides tales como: cortisol, aldosterona, progesterona, testosterona, estrógenos, colesterol y ácidos biliares. Determinación de drogas, entre las que se incluyen: antibióticos, salicilatos, sulfonamidas, anticoagulantes, barbituratos, quinidina, antipalúdicos, antihistamínicos y alcaloides. Otras mediciones, como: triglicéridos y vitaminas.

11 C.i- Precauciones frente a posibles fuentes de error en Fluorimetría: i)los solventes que se utilicen no deben ser fluorescentes ni deben absorber radiación del espectro que se ocupe para la determinación. ii) Se debe utilizar cubetas de cuarzo, porque el vidrio blanco tiene una fluorescencia elevada. Las cubetas deben estar limpias, sin ralladuras para no aumentar la dispersión de la luz. La limpieza debe realizarse con detergentes no fluorescentes. iii) El agua y los reactivos que se utilicen en estas determinaciones no deben estar en contacto con tapones de goma negra, polietileno o baquelita, porque les pueden transmitir cierto grado de fluorescencia. iv) Es necesario controlar el ph, porque este tiene influencia sobre la fluorescencia que puedan presentar algunas sustancias. v) La temperatura es un factor importante que debe ser controlado, ya que al aumentar la temperatura disminuye la fluorescencia. vi) Las muestras que van a ser leídas no deben presentar burbujas de gas, sólidos suspendidos o enturbiamiento. Un exceso en la dispersión de la luz provocado por partículas o burbujas dará lecturas bajas de la radiación fluorescente.

12 D.-Visita al Laboratorio del Hospital Clínico de la Frontera Se visitó la sección de Inmunología, donde fuimos atendidos por la Tecnólogo Médico Gerty Schiele W., la cual nos mostró 2 instrumentos de análisis, en este caso inmunoanalizadores que ocupan como técnica de base la fluorimetría, los cuales son: D.1.-UniCAP 100: Este instrumento realiza lecturas fluorimetricas en el ámbito de la inmunología, tales como: -IgE total, Anticuerpos antigladinicos, IgA e IgG especificos, Enfermedades Celiacas, Proteína Eosinofílica Cationica, Anticuerpos antitiorideos:antipiroxidasa, TPO y antitiroglobulina.

13 AxSYM: El instrumento posee 2 programas para analisis de muestras, las cuales se describen a continuación: FPIA( Inmunoensayo de fluorescencia polarizada) Esta reacción esta basada en la medición de fluorescencia utilizando luz polarizada que permite la detección del analito en un medio que reacciona bajo las mismas condiciones de fluorescencia que el analito, utilizando la tecnología Enlace competitivo a las proteínas que requiere de dos sistemas de antígenos (analitos): el analito contenido en la muestra y el analito marcado con un trazador(por reactivos). El sistema AxSym mide el cambio de polarización de la fluorescencia emitida a medida que se forma el complejo analito-anticuerpo, ya que hace incidir sobre la muestra radiaciones polarizadas tanto en plano vertical como horizontal, para luego seleccionar la radiación emitida por la muestra fluorescente tan solo en el plano vertical, basándose en que moléculas libres del trazador del analito, de bajo peso, presentaran una rotación rápida emitiendo radiación en distintos planos y los complejos formados por el trazador del analito unido al anticuerpo, de mayor peso molecular, rotaran en forma mas lenta, emitiendo radiación solo en el plano que son excitados. De la energía captada por al fotomultiplicador, la concentración del analito es directamente proporcional a la diferencia las dos radiaciones.

14 MEIA (Enzimoinmunoensayo de microparticulas) Este tipo de análisis utiliza una solución de partículas submicrónicas de látex, recubiertas por una molécula de captura específica para el analito cuya concentración se va a medir. En la cubeta de reacción se combinan los reactivos y la muestra después de ser incubados, donde se unen el analito con las micropartículas formando un inmunocomplejo. Se traspasa la mezcla de reacción a una celdilla con matriz inerte y fibra de vidrio, a la cual se une en forma irreversible el inmunocomplejo, a lo cual se añade el conjugado marcado con fosfatasa alcalina, formando el complejo anticuerpo-analito-conjugado. A continuación es añadido el MUP (4- metilumbeliferilfosfato, sustrato fluorescente), que es catalizado por la fosfatasa del conjugado, disociándose y formando MU (4-metilumbeliferona). El sistema óptico de MEIA mide la tasa de formación de MU (el producto fluorescente) en la matriz. La tasa de formación de MU es proporcional a la concentración del analito en la muestra.

15 Conclusiones La fluorimetría es una técnica que posee gran sensibilidad y especificidad, pero el uso de fluorímetros es escaso y solo se realiza en laboratorios que poseen recursos suficientes para poner en marcha un método basado en este principio, debido al alto costo de los reactivos y de los instrumentos. Los laboratorios que poseen fluorímetros, generalmente están orientados para realizar mediciones inmunológicas. Finalmente como en toda técnica de alta especificidad y sensibilidad, deben controlarse adecuadamente todas las variables que puedan dar resultados erróneos.