Mejoramiento Genético Vegetal. Principios y Procedimientos

Transcripción

1 Mejoramiento Genético Vegetal Principios y Procedimientos 2014 C. A. Biasutti M. C. Nazar

2 Índice Página Introducción 3 Sistemas de Reproducción de las Plantas Cultivadas 7 Endocría y Heterosis 30 Recursos Genéticos Vegetales 41 Herencia Cuantitativa 54 Heredabilidad 66 Generación de Variabilidad 73 Selección 82 Interacción Genotipo Ambiente y Adaptación 91 Mejoramiento de Plantas Autógamas 102 Mejoramiento de Planta Asexuales 117 Mejoramiento de Poblaciones de Alógamas 123 Variedades Híbridas 145 Producción de Semilla 155 Biotecnología 168 2

3 Unidad 1. Introducción. Los incrementos en la productividad en la agricultura resultan del amplio uso de las modernas variedades de plantas. Las implicaciones de la transformación agrícola para proveer de fuentes de alimento a un mundo más necesitado y la importancia de conservar un ambiente no contaminado para las futuras generaciones, mediante un empleo adecuado de los recursos genéticos disponibles, marca la importancia de un adecuado conocimiento de los procesos técnicos, legales y políticos que conllevan a la obtención y diseminación de nuevos cultivares. Ejemplos como la llamada Revolución Verde y, sus repercusiones sobre la adopción y el reemplazo de poblaciones vegetales por nuevos cultivares, que no siempre cumplen su objetivo de asegurar una producción sustentable, aumentan la importancia de un conocimiento cabal cuando se deben adoptar nuevas tecnologías. El 50% del incremento en la productividad de los principales cultivos, de los cuales depende la alimentación de la humanidad, son debidos al mejoramiento genético de dichos cultivos. En marzo de 2000, el premio Nobel Norman Borlaug remarcó que las investigaciones en agricultura deben orientarse al desarrollo y aplicación de tecnologías que incrementen, en forma económica y ambientalmente sustentable, los rendimientos de granos en un 75% en los próximos 25 años. En este escenario, para que nuestro sector agropecuario fortalezca su posicionamiento competitivo, es indispensable integrar a los programas de mejoramiento de cultivos, con las nuevas biotecnologías y con las tecnologías de análisis de información que contribuyan a acelerar la obtención de materiales genéticamente superiores en un marco de sustentabilidad. El Mejoramiento Genético Vegetal comprende la síntesis de conocimientos adquiridos en lo concerniente a conceptos estadísticos, la metodología experimental y un conocimiento fundamentado de la estructura genética y reproductiva de las poblaciones vegetales. Lo anterior es imprescindible para comprender el manejo adecuado de diferentes estructuras poblacionales que resultan de la aplicación de los llamados métodos de selección que permiten mejorar en sus frecuencias génicas a una población determinada. El mejoramiento genético vegetal es considerado una ciencia, basada en la observación, identificación, descripción, investigación experimental y explicación teórica de los fenómenos naturales, y una tecnología, como la aplicación de la ciencia a objetivos industriales o comerciales. Antecedentes históricos Se puede decir que la mejora genética vegetal comenzó con el inicio de la agricultura sedentaria y la domesticación de los primeros cultivos. Los primeros cultivos domesticados fueron los cereales, y en ellos se observa ya en los primeros tiempos una rápida eliminación de características indeseables como 3

4 la dehiscencia o la latencia de sus semillas. Es lógico asumir que la necesidad de recolectar los frutos, semillas y raíces para la alimentación humana, debió de ir acompañada de un aumento en el conocimiento de la biología de las plantas sobre todo de aquellas características relacionadas con el potencial alimentario del cultivo. Hasta el primer decenio de este siglo la mejora genética vegetal estaba en manos de "expertos" que en muchos casos fueron incapaces de conseguir grandes progresos debido a la falta de conocimientos científicos, siendo más bien la mejora genética vegetal un "arte" basado más en la pericia o habilidad del mejorador que en conocimientos científicos. Uno de los eventos, quizá y con seguridad el de mayor trascendencia, fue el redescubrimiento de los trabajos de Mendel (1865) por Tschremak, Correus y Vries, entorno a 1900 en los que se determinaron las leyes de la herencia. Estos autores ya indicaron la importancia de los mismos para el desarrollo de la genética como disciplina independiente, así como para la mejora de los organismos sobre la base de sus principios. El nacimiento de la Genética estuvo íntimamente ligado con la Mejora Vegetal, como lo demuestra el hecho de que, lo que hoy se consideran los tres primeros congresos internacionales de genética tuvieran como títulos "International Conference of Hibridization" (Londres, 1899), "Conference of Plant Breeding and Hibridization" (New York, 1902) y "International Conference of Hibridization and Plant breeding" (Londres, 1906). En este último congreso, Bateson afirmó "que la actividad de los mejoradores de plantas y animales había dejado de ser un misterio para convertirse en una ciencia" y propuso el nombre de Genética para dicha ciencia. Definiciones Existen numerosas definiciones del Mejoramiento Genético Vegetal, la mayoría de las cuales hace énfasis en la combinación de ciencia y arte: La ciencia cuyo objetivo es cambiar el genotipo, mejorándolo para un determinado medio y según el aprovechamiento para el que se vaya a destinar de acuerdo con las necesidades del hombre (Frankel, 1958). El arte y la ciencia de mejorar el genotipo de las plantas en relación con su utilización económica (Smith, 1966). Es arte y ciencia, permitiendo cambiar y mejorar la herencia de las plantas (Phoelman, 1965). El arte y la ciencia de cambiar genéticamente las plantas (Allard, 1967). En el mejoramiento se busca un buen rendimiento, si el rendimiento es bueno todo lo demás es bueno (Fasoulas, 1967). 4

5 La utilización de un sistema organizado de manipulación genética para modificar una especie vegetal, con el fin de hacerla más útil o aceptable para un uso específico (Johnson, 1981). Es el arte y la ciencia de mejorar genéticamente las plantas (Fehr, 1987). A partir de todas estas definiciones, estamos en condiciones de establecer las tres premisas más importantes para el planteamiento de cualquier programa de mejora genética vegetal: 1. La existencia de variabilidad o la posibilidad de crearla 2. La capacidad o habilidad de detectar la variabilidad 3. La capacidad para manipular la variación para producir un nuevo cultivar. Objetivos de la mejora genética vegetal. El mejoramiento genético vegetal apunta a mejorar las características de la planta para que sean más deseables agronómica y económicamente. Por lo tanto, el objetivo principal de mejoramiento es desarrollar variedades mejoradas de plantas de cultivo que serán comercialmente exitosas. En general, una variedad exitosa es aquella que presenta un balance de los rasgos que la hace más rentable para los productores que cualquier otra que pueden elegir. Por esta razón los criadores son cautelosos acerca de enfatizar una característica a la exclusión de los demás. Sin embargo, la mejora en algunos rasgos específicos de determinados cultivos puede convertirse en un objetivo prioritario por diversas razones agronómicas y económicas. Por lo tanto, los objetivos específicos dependerán de las condiciones ambientales y económicas. Los principales objetivos del mejoramiento pueden resumirse como sigue: Aumento de la producción Rendimientos más altos: La mayoría de los programas de cría tienen como objetivo mayor rendimiento de los cultivos. Esto se logra mediante el desarrollo de genotipos más eficientes. Por ejemplo las variedades híbridas de maiz Mejora de la calidad y valor nutricional La calidad del cultivo determina su idoneidad para diversos usos. Por lo tanto, la calidad es un aspecto importante para los criadores de plantas. Caracteres de calidad como por ejemplo la granulometría, color, y cualidades para hornear en trigo (Triticum aestivum); cocina de calidad en el arroz y garbanzo (Oryza sativa, Cicer); malteado calidad en cebada (Hordeum vulgree), el tamaño, color y sabor de frutas, manteniendo la calidad de hortalizas, contenido de proteína en cereales y leguminosas; contenido de lisina en cereales, metionina y triptófano contenidos en leguminosas, etc. 5

6 Mejora de la adaptación a factores adversos Las variedades resistentes ofrecen el método más económico y conveniente para enfrentar enfermedades y ataque de insectos. En algunos casos, ofrecen el único medio viable de control, Ejemplo las royas del trigo. Las variedades resistentes no sólo incrementar la producción sino también la estabilizan. Lo mismo puede decirse de la tolerancia a factores abióticos como la sequía, frío, falta de nitrógeno etc. Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Sleper D. A. and J. M. Poehlman, Breeding Field Crops, 5th Edition, Blackwell Publishing, 424 p. 6

7 Unidad 2. Sistemas de reproducción de las plantas cultivadas Biología de la floración y su relación con la mejora genética de las plantas. El conocimiento de los mecanismos reproductivos de una especie, si es de forma sexual y/o asexual, autógama, parcialmente alógama o alógama y su biología floral constituye un conocimiento básico para que se pueda planear convenientemente un plan de mejora. La biología floral y reproductiva inciden en un programa de mejora porque: a) Afectan a la manipulación del material vegetal durante el proceso de mejora. b) Determinan fundamentalmente la estructura genética de una población c) Delimitan en buena parte el tipo de nueva variedad: lineas puras, híbridos, variedades sintéticas o de polinización libre, etc. Además de la morfología floral existen otras características de las flores que influencian la polinización y la fertilización: La posición de los órganos masculinos y femeninos Plantas Hermafroditas, los órganos masculinos y femeninos están en la misma flor (>90% de las espcies). Monoicas, los órganos masculinos y femeninos están en la misma planta: maíz, cucurbitáceas. Dioicas, los órganos masculinos y femeninos están en plantas diferentes: palmera datilera, papaya, espárrago, pimienta negra. Existen formas de transición como adromonoicas (flores masculinas y hermafroditas en la misma planta), ginomonoicas (flores femeninas y hermafroditas en la misma planta), androdioicas (plantas masculinas y hermafroditas), ginodioicas (plantas femeninas y hermafroditas), etc. El momento de actividad de los órganos Homogamia: estigmas y polen maduran simultáneamente. o Cleistogamia: polinización a flor cerrada o Chasmogamia: polinización a flor abierta Homostilia: Pistilo y estambres del mismo largo o Heterostilia: pistilo y estambres con longitud diferente o Herkogamia: pistilo y estambres dispuestos de manera de impedir la autopolinización: Iris, Saintpaulia o Anteras en forma de cono: pistilo y estambres dispuestos de manera de promover la autopolinización: lechuga, tomate. 7

8 Dicogamia: los estigmas y el polen no maduran simultáneamente. o Protandria: polen madura primero: cebolla, zanahoria, maíz. o Protoginia: los estilos maduran primero: té, cacao. Reproducción sexual. En la reproducción sexual, característica de los seres superiores, un gameto femenino y un gamento masculino se fusionan para dar lugar al zigoto, el cual por sucesivas divisiones dará un nuevo organismo. En las plantas superiores implica la formación de gametos mediante la macrosporogénesis (gametos femeninos) y la microsporogénesis (gametos masculinos) a través de la meiosis, y la fecundación o fertilización a través de la polinización. La reproducción sexual permite crear gran cantidad de variabilidad por recombinación génica. Analizaremos dos sistemas muy importantes que inciden sobre el manejo reproductivo de la especie y sobre el tipo de cultivar a obtener, ellos son la incompatibilidad y la macho-esterilidad. Incompatibilidad. Introducción La incompatibilidad ocurre cuando determinadas plantas, las cuales producen gametos perfectamente funcionales, no producen semillas mediante la autopolinización. En la incompatibilidad las células sexuales son completamente viables, en contraposición con la esterilidad, la cual se caracteriza por la ausencia de gametos o la existencia de gametos no funcionales. Podemos definirla entonces como la incapacidad de gametos funcionales de efectuar la fertilización en combinaciones particulares entre genotipos. La incompatibilidad puede estar dada por la incapacidad del tubo polínico de penetrar el estigma o de crecer normalmente. En algunos casos el tubo polínico crece tan lentamente que no alcanza a fecundar los óvulos antes que estos sean no viables. La incompatibilidad impide la autofecundación y la endocría, y por ende, promueve la fertilización cruzada, es de amplia ocurrencia en plantas silvestres y cultivadas. La primera descripción de un fenómeno de incompatibilidad fue realizada por Koelreuter 1764 en Verbascum phoeniceum, por su parte, Darwin estudió el fenómeno y lo llamó autoesterilidad. Los genes que intervienen en la manifestación de la incompatibilidad son denominados como S-genes. La ocurrencia del fenómeno de la incompatibilidad ha sido documentado en alrededor de 3000 especies, pero se concentra predominantemente en unas pocas familias: compuestas, crucíferas, gramíneas y leguminosas que contienen el 50%, aproximadamente, del total de géneros que presentan incompatibilidad (Tabla 2.1). Principales características de los sistemas de incompatibilidad. Sistemas de Incompatibilidad Los sistemas de incompatibilidad pueden ser clasificados de acuerdo a: 8

9 1. Sitio de expresión de la reacción de incompatibilidad 2. Asociación con la morfología floral 3. Nivel de interacción génica 1. Sitio de expresión La reacción de incompatibilidad toma lugar en el período entre la deposición del polen sobre el estigma y la fertilización. La inhibición del crecimiento del tubo polínico puede ocurrir en tres diferentes niveles: 1.1 Inhibición en la superficie estigmática: Compositae, Cruciferae y Gramineae 1.2 Barrera al tubo polínico en el estilo: Solanaceae, Leguminosae y Scrophulariaceae 1.3 Barrera al tubo polínico en el ovario: Beta, Freesia, Cacao. 2. Asociación con la morfología floral Dos sistemas diferentes: la Incompatibilidad Homomórfica: donde no es posible distinguir ninguna diferencia morfológica entre apareamientos compatibles e incompatibles. Este tipo es el más común entre las especies de plantas autoincompatibles. En contraposición la Incompatibilidad Heteromórfica: en la cual la incompatibilidad está asociada con diferencias en tamaño y con la forma de las flores especialmente con relación a los órganos sexuales. Este tipo ocurre en un pequeño número de especies comparado con la homomórfica, y fue estudiado en el género Primula. En esta especie pueden ocurrir dos tipos de flores, una con estilos largos y estambres cortos (tipo Pin ), y flores con estilos cortos y estambres en largos filamentos (tipo Thrum ). Los tipos son autoicompatibles pero compatibles entre ellos. 3. Nivel de interacción génica De acuerdo al nivel de interacción génica podemos distinguir dos tipos de incompatibilidad: Incompatibilidad Gametofítica (GI) e Incompatibilidad Esporofítica (SI). La incompatibilidad en estos dos tipos está generalmente controlada por un locus con varios alelos. Sin embargo, en Gramineae es común un sistema gametofítico basado en 2 locus (S y Z). Los casos de control poligénico son excepcionales, pero pueden ocurrir. Incompatibilidad Gametofítica (GI) Sistema GI 1-Locus La incompatibilidad gametofítica (GI) está, en la mayoría de los casos, gobernada por un locus con series alélicas múltiples. El número de alelos puede ser considerablemente alto como en calabaza >50, ó en trébol rojo >200. Los alelos son identificados como S1, S2...Sn, de acuerdo a la 9

10 secuencia de su detección. No todos los alelos actúan al mismo nivel de supresión de la compatibilidad. Estos varían en su fuerza para conferir incompatibilidad, desde incompatibilidad completa (S-alelos fuertes ), existiendo algunos que admiten una fertilización ocasional (S-alelos débiles ) siendo éstos influenciados por el ambiente. Tabla 2.1. Distribución de la ocurrencia de la incompatibilidad en distintas familias y géneros de plantas. Familia Género Tipo de Incompatibilidad G Solanaceae Lycopersicon, Nicotiana, Petunia, Solanum, Physalis G Scrophulariaceae Antirrhimun, Nemesia, Veronica, Verbascum G Onagraceae Oenothera G Papaveraceae Papaver G Bromeliaceae Ananas G Rosaceae Prunus, Malus, Pyrus G Commelinaceae Tradescantia G Liliaceae Lilium, Hemerocallis G Papillionaceae Trifolium, Medicago, Lotus G Plantaginaceae Plantago G Gramineae Secale, Hordeum, Festuca, Phalaris, Lolium. Oryza G Ranunculaceae Ranunculus G Chenopodiaceae Beta G Euphorbiaceae Euphorbia G Cupuliferae Castanea S Compositae Cosmos, Crepis, Chrysanthemun, Bellis, Helianthus, Parthenium, Carthamus, Ageratum S Cruciferae Capsella, Iberis, Brassica, Raphanus, Cardamine S Sterculiaceae Theobroma, Cola S Primulaceae Primula S Lythraceae Lythrum S Plumbaginaceae Armeria S Linaceae Linum G: Gametofítica S: Esporofítica Características del Sistema GI 1-Locus 1. La inhibición del crecimiento del tubo polínico ocurre en el estilo 2. La incompatibilidad ocurre cuando el mismo S-alelo está presente en el grano de polen y en el tejido estilar. 3. La reacción del polen es completamente determinada por el genotipo haploide, no existe interacción con el esporofito. 4. Los S-alelos en el estilo actúan independientemente uno del otro. 5. Los granos de polen son casi siempre bicelulares. 6. La poliploidización suprime la incompatibilidad. 7. El número mínimo de S-alelos para mantener una población es 3. 10

11 Posibles resultados a obtener con relación al número de S-alelos mutuos en el sistema GI 1-Locus (i) Dos alelos en común Sa Sb x Sa Sb No hay fertilización (100% incompatible) (ii) Un alelo en común Sa Sb x Sa Sc Sa Sc + Sb Sc (50% incompatible) (iii) Ningún alelo en común Sa Sb x Sc Sb Sa Sc + Sa Sd + Sb Sc + Sb Sd (100% compatible) Cruzas recíprocas en (iii) dan idénticos resultados Cruzas recíprocas en (ii), la composición de la progenie cambia Sa Sb x Sa Sc Sa Sc + Sb Sc Sa Sc x Sa Sb Sa Sb + Sb Sc Como en (ii) el genotipo paterno aparece en la F1 (Sa Sc, Sa Sb). La probabilidad de ocurrencia de incompatibilidad en un cultivo (población, variedad) depende del número de S-alelos disponibles. Índice de Incompatibilidad I = 2 / n(n 1) Siendo n el número de S-alelos Con 2, 3,4 y 5 S-alelos los valores del índice serán: 1, 1/3, 1/6 y 1/10. El efecto de la incompatibilidad decrece rápidamente con el aumento del número de S- alelos. Sistema GI 2-Locus El sistema de incompatibilidad gametofítica condicionado por 2 locus es menos común que el sistema monofactorial. Se encuentra en Secale, y es común en pastos: Hordeum bulbosum, Phalaris coerulescens, y en flores nocturnas: Physalis ixocarpa, y en varias especies de Solanum Los S-Loci son identificados como S y Z. 11

12 Características del Sistema GI 2-Locus 1. La inhibición del crecimiento del tubo polínico ocurre en el estigma, no hay penetración en el estilo. 2. La reacción del polen esta exclusivamente determinada por su genotipo en relación al genotipo del pistilo diploide. 3. Existe ocurrencia de múltiple alelismo para ambos loci 4. Existe una acción complementaria entre los alelos S y Z. La incompatibilidad ocurre cuando los granos de polen tienen un alelo en común con el pistilo para ambos loci. 5. La Poliploidía no interfiere con este tipo de incompatibilidad. 6. El polen es usualmente tricelular 7. En principio 6 grupos de genotipos pueden resultar de la cruza, dependiendo del número de alelos comunes presentes en ambos padres (Tabla 2). 8. La homocigosidad puede ocurrir para uno de los locus. 9. Las cruzas recíprocas pueden dar resultados diferentes: Sa Sb Zc Zd x Sa Sa Zc Zd Incompatible Sa Sa Zc Zd x Sa Sb Zc Zd 50% compatible La probabilidad de obtener una combinación incompatible con el sistema GI 2- Loci puede calcularse: Número de S-alelos: n s Número de Z-alelos: n z Número de posibles S-genotipos: n s (n s + 1) / 2 Número de posibles Z-genotipos: n z (n z + 1) / 2 Consecuentemente: Indice de Incompatibilidad: 1: { ns (ns + 1) / 2 x nz (nz + 1) / 2 - ns nz } Con 3, 4 y 5 alelos S y Z en la población, la probabilidad de incompatibilidad es 1/27, 1/84 y 1/200. Incompatibilidad Esporofítica (SI) El sistema de incompatibilidad esporofítica es generalmente monofactorial, con excepciones en algunas compuestas: chrysantemum y girasol, la incompatibilidad está controlada por 2 3 loci. En cacao se basa en 3 genes complementarios y la barrera está en el ovario 12

13 Tabla 2.2. Grupos de genotipos resultantes dependiendo del número de alelos comunes presentes en ambos padres. Combinación Alelos diferentes % Polen Número de compatible Genotipos en F1 Sa Sb Za Zb x Sa Sb Za Zb Sa Sb Za Zb x Sa Sb Za Zc Sa Sb Za Zb x Sa Sc Za Zc Sa Sb Za Zb x Sa Sb Zc Zd Sa Sb Za Zb x Sa Sc Zc Zd Sa Sb Za Zb x Sc Sd Zc Zd Características del Sistema SI 1. La inhibición del crecimiento del tubo polínico ocurre en el estigma o en el ovario (cacao). 2. Generalmente existe alelismo múltiple 3. El grano de polen es tricelular 4. La popliploidía no afecta el sistema de incompatibilidad 5. La reacción del polen no está determinada por su genotipo haploide sino por la relación de dominancia en el esporofito 6. La reacción del pistilo está determinada también por relaciones de dominancia intra-locus. Las relaciones de dominancia en el polen y el pistilo pueden ser diferentes (Tablas 3 y 4) 7. La reacción de incompatibilidad ocurre cuando los mismos alelos se expresan en el polen y en el pistilo. Las interacciones entre los alelos S puede ser diferente en las anteras y en el estilo de la misma planta. Además de las relaciones de dominancia pueden existir relaciones de codominancia (Sx=Sy) Tabla 2.3. Tipos de interacción entre los genes S presentes en el polen y el pistilo Relación de Dominancia Polen Sx < Sy Sx < Sy Sx = Sy Sx = Sy Sx > Sy Pistilo Sx < Sy Sx = Sy Sx < Sy Sx = Sy Sx < Sy Tipo de Interacción I II III IV V 13

14 Supresión de la Incompatibilidad Con el objetivo de permitir la endocría y obtener líneas homocigotas, se han desarrollado varios métodos para suprimir la incompatibilidad, algunos de los cuales se detallan a continuación: Polinización en botón floral. Es quizá el método más antiguo, consiste en la polinización de estigmas inmaduros o de flores no abiertas. El efecto de esta polinización en botón floral se atribuye a la ausencia o a la acción incompleta de las substancias que impiden el desarrollo del tubo polínico. Se ha empleado con éxito en Petunia, Nicotiana y Trifolium. Retardo de la polinización. Consiste en la aplicación de polen fresco sobre estigmas después de tres o más días a partir de antesis, cuando las substancias inhibitorias han perdido su fuerza. Se ha probado con éxito en especies de Lilium Tratamientos físicos. Inmersión en agua caliente (~50 C) durante varios minutos, en Oenothera, Lilium. En otras, Brassica, Raphanus, Lycopersicum, la exposición de la planta a altas temperaturas (30 40 C) puede destruir el mecanismo de incompatibilidad. La sensibilidad a la temperatura parece estar controlada genéticamente. Tabla 2.4. Posibles resultados de una cruza en el sistema SI dependiendo de la relación interaalélica en ambos padres. Cruza Tipo de Interacción Compatibilidad F1 S1 S2 x S2 S3 I + S1S2, S1S3, S2S2, S2S3 S2 S3 x S1 S2 I + S1S2, S1S3, S2S2, S2S3 S1 S2 x S2 S3 II + S1S2, S1S3, S2S2, S2S3 S2 S3 x S1 S2 II - - S1 S2 x S2 S3 III - - S2 S3 x S1 S2 III + S1S2, S1S3, S2S2, S2S3 S1 S2 x S2 S3 IV - - S2 S3 x S1 S2 IV - - Los alelos subrayados indican expresión. Otros métodos que se han empleado contemplan la aplicación de reguladores del crecimiento como cito quininas y auxinas en Petunia, Nicotiana, Trifolium, Lilium, Lycopersicum y Raphanus, la Irradiación del estilo o del polen para provocar mutaciones de los alelos S, someter las plantas a condiciones de 14

15 crecimiento subóptimas., en Prunus, Brassica, Oenothera. También se ha empleado la compatibilidad de fin de estación, dado que se ha observado que la reacción de incompatibilidad se torna más débil a medida que se acerca el fin del ciclo reproductivo. Utilización de la incompatibilidad en el mejoramiento y la obtención de cultivares La incompatibilidad puede utilizarse para la producción de cultivares híbridos cuando la emasculación es muy compleja o muy costosa y no existan mecanismos alternativos de macho esterilidad (CMS) disponibles. Principalmente ha sido aplicada para la obtención de híbridos de Brassica oleraceae: repollos de Bruselas, repollo, coliflor, brócoli y rábano (Sistema 1- locus SI). La mayoría de los cultivares de colza en Japón, EEUU y en Europa son híbridos basados en el sistema SI de incompatibilidad Pasos para la producción de una variedad híbrida auto incompatible: 1. Colección de material (variedades, poblaciones) con buenas características agronómicas. 2. Selección de plantas homocigotas para el alelo S. De ser necesario mediante endocría forzada. 3. Elevar el nivel de homocigosis mediante repetidos procesos de autofecundación o cruzas endogámicas 4. Cruzamiento entre las líneas y prueba de las F1 en diferentes localidades y en diferentes años para la identificación de líneas con alta aptitud combinatoria específica 5. Propagación en masa de las líneas selectas mediante reproducción vegetativa y producción de semillas mediante cruzas entre líneas Aspectos a considerar Al utilizar líneas para la producción de híbridos no incluir alelos S débiles, ellos pueden permitir cierto grado de autofecundación impurificando el híbrido. Usualmente se encuentran líneas parentales en los híbridos a consecuencia de compatibilidad de fin de estación o debido a condiciones de estrés. Para el productor esto es no problemático siempre que no exceda un determinado porcentaje. Por el contrario para el criador u obtentor si es problemático debido a que sus líneas pueden ser copiadas por la competencia. Una solución a esto es cosechar semilla sobre uno solo de los padres o producir híbridos triples o dobles aunque para esto se requieren 3 a 4 líneas con alelos S diferentes. Producción de Híbridos Un método simple es producir híbridos entre clones que son autoincompatibles pero compatibles entre ellos. Se siembran en surcos adyacentes mediante reproducción vegetativa y se permite su intercruzamiento. Utilizando clones que 15

16 difieran en los S alelos (sistema gametofítico) se han obtenido híbridos de Bahíagrass o Pasapalum notatum (Poaceae). Este sistema también es utilizado para la producción de semilla de variedades sintéticas y de híbridos simples de alfalfa. En el caso de especies que se propagan por semilla es necesario emplear métodos que permitan la supresión de la incompatibilidad y de esta manera obtener líneas endocriadas. En las plantas pertenecientes a las Brasicaceas, que poseen el sistema esporofítico, se han desarrollado líneas endocriadas dado que este sistema permite la obtención de genotipos homocigotos para el alelo S. La producción de semilla para el mantenimiento de las líneas parentales se realiza mediante polinización en botón floral. Híbrido Simple Sa Sa x Sb Sb = Sa Sb Híbrido Triple Sa Sa x Sb Sb = Sa Sb x Sc Sc = Sa Sc + Sb Sc Híbrido Doble Sa Sa x Sb Sb x Sc Sc x Sd Sd = Sa Sb x Sc Sd: Sa Sc + Sa Sd + Sb Sc + Sb Sd Los híbridos triples y los híbridos dobles ofrecen mayor protección al mejorador en relación a la pérdida de líneas. Sin embargo los HS son preferidos debido a que son más simples para producir, son más productivos y más uniformes, permitiendo la cosecha mecánica y un manejo más eficiente de ésta, sobretodo en especies hortícolas. Macho Esterilidad Introducción La macho esterilidad es debida a la incapacidad de las plantas con flores de producir o liberar polen funcional. También existe la esterilidad femenina, que es la incapacidad de producir ovarios y o células madres funcionales. Generalmente la esterilidad femenina ha sido menos estable que la macho esterilidad. En las plantas que poseen macho esterilidad, estas no producen anteras funcionales o no producen polen viable, pero los ovarios son perfectamente funcionales. La macho esterilidad, es un mecanismo que favorece la polinización y fecundación cruzada, siendo esto de gran importancia y utilidad en el mejoramiento genético vegetal para la producción de semilla hibrida sin necesidad de emasculación. Esto es de mucha importancia en el caso de plantas autógamas en las cuales la remoción de los estambres es muy laboriosa y como resultado muy costosa. 16

17 Ocurrencia de la Macho Esterilidad La macho esterilidad está ampliamente distribuida entre las plantas con flores y formas hereditarias de macho esterilidad se han encontrado en mas de 600 especies y cruzas interespecíficas. Los casos descriptos de macho esterilidad se concentran en 5 familias a saber: Gramineae (21 géneros), Leguminosae (17 géneros), Compositae (11 géneros), Solanaceae (6 géneros) y Cruciferae (6 géneros). Causas Existen varias causas de macho esterilidad. Puede ser inducida por condiciones ambientales extremas como bajas temperaturas, baja intensidad lumínica y otros tipos de estrés. Cuando cesa el estrés esta esterilidad fenotípica, que puede provocar fallas a nivel de anteras y de la microsporogénesis, se torna no operativa. Las formas de macho esterilidad que pueden ser aprovechadas para la producción de semilla híbrida son aquellas cuya causa sean de origen genético y por ende heredables, por ejemplo la condicionada por la acción de genes nucleares recesivos o de citoplasma estéril. Clasificación De acuerdo a si la esterilidad es causada por genes nucleares o por aquellos situados en el citoplasma podemos clasificar los sistemas de macho esterilidad en: Macho Esterilidad Génica Macho Esterilidad Citoplásmica Génica Macho Esterilidad Génica Está condicionada por genes nucleares recesivos que provienen de mutaciones espontáneas o inducidas, cuya acción impide el normal desarrollo de las anteras. La expresión de estos genes puede ser completa, es decir no hay producción de polen viable ni producción de semillas en las plantas con flores macho estériles, o parcial, en la cual hay formación de polen fértil y producción de semillas. La expresión de los genes que condicionan la macho esterilidad puede variar frente a cambios en el ambiente. Genes que condicionan la macho esterilidad En el caso más común, existe un gen recesivo que es denominado comúnmente como ms, el alelo recesivo. El alelo dominante Ms condiciona la producción normal de anteras y polen. En el caso de una especie diploide, el genotipo ms ms resultará en macho estéril mientras que los genotipos Ms Ms y Ms ms serán fértiles. 17

18 Uno de los problemas de la macho esterilidad génica es su condición recesiva, dado que esto impide que se pueda mantener una población pura de plantas macho estériles. Los genes para macho esterilidad pueden ser mantenidos en una población en la cual coexisten genes para esterilidad y fertilidad. Si se cosechan las semillas producidas sobre plantas macho estériles, ms ms, estas pueden ser polinizadas tanto por plantas Ms Ms o Ms ms, lo que permitirá la segregación de los genes ms. En el caso de la obtención de híbridos será necesaria la remoción de plantas fértiles, lo que complica el proceso (Figura 1). Para facilitar lo anterior se debería contar con marcadores genéticos que se expresen antes de floración y así poder eliminar las plantas fértiles. Genes para macho esterilidad se ha detectado en maíz, cebada, sorgo, arroz, soja, trigo, tomate, cebada, pimiento y algodón. La incorporación de los genes para macho esterilidad se puede realizar a través de la retrocruza. Dado lo laborioso y el tiempo necesario para transformar una línea fértil en macho estéril, solo se justifica si el cultivar a transformar será utilizado en cruzas por varios años. Figura 2.1. Utilización de la macho esterilidad génica para la producción de híbridos y el mantenimiento de las líneas parentales.la línea madre y el 18

19 mantenedor deben ser isogénicas. El polinizador no debe estar relacionado genéticamente con las líneas I y II. Las plantas Ms ms deber ser removidas antes de floración. Macho Esterilidad Citoplásmica Génica (CMS) Este tipo de macho esterilidad está controlada por el citoplasma y por la interacción entre el ADN citoplásmico y el que se encuentra en los cromosomas. Su expresión fenotípica es igual que en el caso de la esterilidad génica, la no producción de polen viable o malformaciones en las anteras. El citoplasma que condiciona la CMS se lo denomina citoplasma estéril (CMS o S) en contraposición con el citoplasma normal (N o F), el cual permite el desarrollo normal de anteras y polen. El origen de estos citoplasmas esterilizantes a menudo es el resultado de cruzas interespecíficas, es decir, la introducción de cromosomas en un citoplasma diferente. En sorgo se obtuvo esterilidad citoplásmica al cruzar milo x kafir. Debido a que el citoplasma es transferido solamente mediante la célula huevo, la CMS es de herencia materna, es decir el citoplasma estéril solo es transferido por la madre. Figura 2.2. Herencia de macho esterilidad citoplásmica en sucesivas cruzas. La CMS permanece en reiteradas retrocruzas. La esterilidad citoplásmica puede ser modificada por la acción de genes restauradores de la fertilidad (Rf) que están localizados en los cromosomas del núcleo. Cuando está presente un alelo Rf en estado dominante (Rf Rf o Rf rf), la esterilidad citoplásmica no es operativa, y las flores producen anteras y polen de manera normal. Para la obtención de un híbrido fértil es necesario utilizar una línea que al ser CMS actuará como madre y una línea macho que posea los Rf en estado dominante. Los genes nucleares y el citoplasma interactúan para producir plantas macho estériles y macho fértiles. La existencia de los genes Rf solamente se detecta cuando se cruzan con una madre CMS. Asumiendo que un solo gen Rf es necesario para restaurar completamente la fertilidad, las cruzas por una madre CMS darán tres tipos de progenies: 19

20 (S)rfrf x (F)rfrf (S)rfrf x (F)Rfrf (S)rfrf x (F)RfRf (S)rfrf 100% estéril (S)rfrf 50% estéril (S)Rfrf 50% fértil (S)Rfrf 100% fértil En maíz y en trigo son necesarios dos genes dominantes (Rf1 y Rf2) para restaurar la fertilidad, además de genes modificadores cuya acción permite una total restauración de la fertilidad a través de una gran variedad de ambientes. Figura 2.3. Obtención de una F1 y F2 de la cruza entre un progenitor macho estéril y uno fértil con genes Rf. Para la obtención de un híbrido utilizando CMS son necesarias tres líneas: la línea A: CMS madre, el polinizador R, fértil y la línea B mantenedora de A (Figura 2.4) La CMS ha sido empleada extensivamente en la producción de semilla híbrida en maíz, sorgo, girasol y remolacha azucarera. En EEUU la utilización de la CMS ha reemplazado al sistema de eliminación a mano de la panoja en los campos de producción de semilla híbrida de maíz (Figura 2.5). Problemas con la CMS La inestabilidad de CMS frente a cambios ambientales puede provocar autofecundación o intercruzamiento de la línea madre, lo que resultaría en una mezcla de individuos híbridos y líneas parentales. Como se mencionó antes, la restauración de la fertilidad es generalmente controlada por más de un gen Rf, con lo que el proceso de obtención de un macho con todos los genes Rf necesarios y los genes modificadores, es complicado por el número de retrocruzas necesarias. A su vez, la expresión de los Rf es afectada por la carga genética de los progenitores y también son susceptibles a la influencia ambiental. Algunos tipos de citoplasmas esterilizantes, como el S en maíz, pueden causar anormalidades en el desarrollo en ciertos cultivos. En el caso de 20

21 especies autógamas como arroz y cebada, se han reportado una producción incompleta de semillas. Macho esterilidad inducida por agentes químicos Aquellos componentes químicos cuya acción elimine el polen ofrecen al mejorador una alternativa a la utilización de la macho esterilidad, ya sea génica o citoplásmica. Estos agentes se han denominado colectivamente como gametocidas o supresores de polen. Un gametocida con un efecto total y absoluto sobre el polen fue y es el sueño dorado de cualquier mejorador. La posibilidad de transformar una línea con flores completas, trigo, soja, en una línea madre simplemente con rociar un químico antes de la floración, eliminaría la necesidad de cruzas y retocruzas para obtener una línea macho estéril. Sin embargo, para que un gametocida sea aplicable debe poseer ciertos requisitos: Debe sctuar sobre el polen y no tener efecto sobre la fertilidad del óvulo No ser mutagénico De aplicación fácil y económica No debe ser peligroso para el hombre ni para las plantas Debe ser repetible Figura 2.4. Esquema de producción de un híbrido simple y mantenimiento de las líneas parentales utilizando esterilidad citoplásmica génica. A y B son líneas isogénicas. El carácter CMS se introduce mediante retrocruzas repetidas utilizando el material de cría como recurrente 21

22 Al presente ninguno de los distintos gametocidas ensayados en diferentes cultivos no han dado los resultados esperados por lo la investigación en este sentido continua hasta el presente. Figura 2.5. Obtención de híbridos dobles en maíz utilizando CMS. Alternativas: Substitución de línea 3 por (S)RfRf o (F)RfRf. Emasculación de línea 3. Utilización de (S)RfRf por (F)RfRf en línea 4 Reproducción asexual. Propagación Vegetativa La reproducción asexual consiste en la reproducción de individuos a partir de porciones vegetativas de la planta. Los cultivos que se pueden propagar vegetativamente son, generalmente, altamente heterocigóticos y poliploides (papa, batata, banana). En algunos casos son aneuploides como en la caña de azúcar. En otros la capacidad de florecer y producir semillas ha desaparecido como en ajo. Las especies que se pueden propagar clonalmente, en general son alógamas, las cuales muestran intolerancia a la endocría. La alta heterocigocidad presente en cada clon individual permite descubrir y explotar la presencia de heterosis. Es decir se puede fijar la heterosis observada en un clon en particular simplemente con su reproducción agámica. La coexistencia de la reproducción sexual y la propagación vegetativa en un individuo, presenta una ventaja evolutiva. La reproducción sexual permite la 22

23 evolución y la conquista de nuevos ambientes, mientras que la multiplicación vegetativa posibilita la fijación de genotipos adaptados a un ambiente. Tabla 2.5. Especies de reproducción asexual Especie Frutilla Plátano Piña Papa, Batata Cebolla, Ajo, Tulipán Cítricos, Café, Cacao Caña de Azúcar Piretro Multiplicación Estolones Rizoma Hijuelo Tubérculo Bulbo Injerto Tallos División de plantas CLONACION Concepto de Clon Material genéticamente uniforme derivado de un solo individuo y que se propaga de forma exclusiva por medios vegetativos. También es correcto definir a un clon como: Un conjunto de individuos genéticamente idénticos provenientes de la multiplicación vegetativa de una planta madre o de un conjunto de individuos pertenecientes a un clon precedente. En tanto el medio permanezca razonablemente constante, un clon mantendrá estabilidad en la expresión de sus características. Sin embargo, ante cambios drásticos de las condiciones ambientales, una especie propagada clonalmente estará en desventaja, debido a que no tiene oportunidad de desarrollar nuevas formas mejor adaptadas mediante la recombinación genética. Técnicas In-vitro La propagación de plantas mediante técnicas in-vitro permite incrementar la propagación vegetativa, permitir el saneamiento de cultivares con virosis, y en algunos casos, aplicar la propagación vegetativa a cultivos que normalmente se propagan por semilla. También se puede utilizar el cultivo de tejidos in-vitro para generar variabilidad genética, llamada variación somaclonal o gametoclonal. La propagación in-viro también permite la conservación de germoplasma en forma de tejidos en especies tropicales que no se pueden conservar mediante semillas ortodoxas (semillas recalcitrantes). Causas de Variación La posible variación genética entre los individuos pertenecientes a un clon (dentro de un clon) se debe fundamentalmente a dos causas: mutagénesis y 23

24 variación somaclonal. Estas pueden ser naturales o inducidas por el hombre para aumentar la variabilidad genética. Muchos de los cultivares de plantas frutícolas y hortícolas se han debido a mutaciones de yema u otros órganos de crecimiento. Entre éstos se encuentran la papa variedad Bintje, en Peral la variedad Williams; en manzano la variedad Golden Delicius y en ajo la variedad Rosado Paraguayo. Apomixis. Cuando la reproducción asexual se realiza por semilla y la misma no proviene de una unión sexual, ya que existen modificaciones o supresión de los procesos fundamentales como la meiosis y/o mitosis, esa semilla se denomina apomíctica (Amphimixis: reproducción sexual, Apomixis: sin reproducción sexual). En la reproducción apomíctica, los embriones se derivan de una división mitótica de la célula madre de las megáspora o célula somática del óvulo. La meiosis y fertilización no están comprometidas en el desarrollo del embrión y la progenie de plantas apomícticas son réplicas exactas de la planta madre. De esta manera la apomixis provee de un método para clonar plantas a través de su semilla y tiene una implicancia importante como herramienta de mejora genética de plantas. Una ventaja de la apomixis es que no transmite enfermedades causadas por virus, las cuales son uno de los mayores problemas en la propagación vegetativa. Ocurrencia de la Apomixis Se la ha detectado en al menos 40 Familias, Gramíneas, Rosáceas y Compuestas principalmente. También existen 125 pastos apomícticos aproximadamente, ej.: Poa pratensis y Cenchrus ciliaris. La gran mayoría de las sp apomícticas son alopoliploides, permitiendo la reproducción exitosa de estos genotipos que normalmente tienen una reducida fertilidad sexual. En sp naturales en las cuales coexisten individuos diploides y poliploides, las plantas diploides se reproducen casi exclusivamente por medios sexuales, mientras que los poliploides tienen una marcada tendencia a la reproducción apomictica. Ejemplos: Paspalum y Tripsacum dactyloides. Clasificación I. Propagación por semilla 1. Desarrollo de la célula huevo (Oosfera) no fertilizada. 1.1 Oosfera reducida Partenogénesis Haploide 1.2 Oosfera no reducida (Diplosporia) Partenogénesis Diploide 1.3 Célula somática no reducida (Aposporia) 24

25 2. Desarrollo de otras células del saco embrionario 2.1 Reducida 2.2 No Reducida 3. Desarrollo del núcleo masculino en la Oosfera 3.1 Núcleo femenino eliminado Androgénesis 3.2 Quimera de tejidos masculino y femenino Semigamia 4. Desarrollo de células somáticas Embrionía adventicia II. Propagación por partes vegetativas en la zona floral 1. Órganos vegetativos en lugar de flores Viviparidad 2. Órganos vegetativos junto con flores Seudoviviparidad En cuanto a la ocurrencia, las formas más comunes son la partenogénesis diploide, la Embrionía adventicia y la seudoviviparidad. * Partenogénesis es el desarrollo de un embrión a partir de una CM no fertilizada. En sp diploides la CM es haploide y, por lo tanto el embrión será haploide y estéril (partenogénesis haploide). Debido a la esterilidad de estos haploides existe una selección natural negativa en contra de la partenogénesis. Si se trata de sp poliploides la progenie tiene mayores chances de sobrevivir. La selección natural en contra de la partenogénesis puede ser reducida cuando, además de los embriones haploides, otros embriones somáticos adicionales (a partir de la nucela o de otros tejidos diploides) son producidos: Poliembrionia. Esta situación es común en pastos. La partenogénesis haploide se ha reportado en gramíneas como trigo, centeno y cebada, y en solanaceas como papa, tabaco y tomate. Además de la partenogénesis autónoma (en la cual el polen no toma parte) existe una forma de partenogénesis en la cual es necesaria la fertilización de la célula central (formación del endospermo), como un estimulo para el crecimiento de la CM no fertilizada. Esto se denomina partenogénesis pseudogamica, se encuentra en el genero Solanum, y mediante ella se puede obtener plantas 2x de papa Solanum tuberosum. * La partenogénesis diploide ocurre cuando una CM diploide se desarrolla en un embrión sin fertilización. El estado diploide es debido a fallas en la reducción del numero de cromosomas. En algunos casos en vez de producirse 4 células haploides, se forman 2 células diploides. Este fenómeno se denomina Diplosporia, ej.: Taraxacum y Poa. * En la Androgénesis la gameta masculina penetra en la célula femenina, pero no se fusiona con la célula huevo, si no que se desarrolla en un embrión. Este embrión tiene posee un genotipo paterno y un plasmotipo materno. 25

26 * Semigamia puede ser definida como una combinación de partenogénesis y androgénesis. La célula madre y el núcleo espermático del polen no se fusionan y, se dividen en forma autónoma y producen tejidos haploides que, juntos forman un embrión y planta quimérico, ej.: Gossypium. GENES QUE CONTROLAN LA APOMIXIS El descubrimiento de la sexualidad total o parcial en las plantas de especies apomícticas usualmente provee todo lo que se necesita para la manipulación del modo de reproducción en el mejoramiento de estas especies. En los cultivos sexuales, el problema sería más complejo, ya que primero sería necesario encontrar apomixis en las especies o en cruzas compatibles con parientes silvestres. La transferencia de la apomixis desde un pariente silvestre puede requerir una cierta investigación para establecer la relación filogenética y para superar las diferencias en el nivel de ploidía, relación entre los genomas, y "pools" de genes. Los genes que controlan altos u obligados niveles de apomixis se encuentran en especies silvestres emparentadas de algunas plantas cultivadas. Por ejemplo en Elymus rectisetus, un pariente del trigo (T. aestivum L.); Tripsacum dactyloides L., un pariente cercano del maíz y algunas especies silvestres de Pennisetum emparentados con el mijo. En las especies forrajeras tropicales y subtropicales tales como las del género Eragrostis; Paspalum; y Cenchrus. Se conoce que existe apomixis en las especies silvestres de remolacha (Beta vulgaris L ), frutilla y mango. La transferencia de los genes que controlan la apomixis desde las especies silvestres a sus parientes cultivadas y la utilización de estos genes en el mejoramiento de plantas es posible, pero ello no sería ni rápido ni fácil. Algunos progresos, en este sentido, se han logrado en mijo y maíz. Para producir exitosamente híbridos, el proceso de transferencia necesita comprender la manipulación de la ploidía tanto en el nivel de las silvestres como en la cultivada. Puede ser necesario efectuar cruzamientos puentes para lograr éxito. La transferencia exitosa de esos genes que controlan la apomixis desde las especies cultivadas requerirá poblaciones grandes y métodos de selección eficientes. Las nuevas técnicas de transformación genética a través del cultivo y regeneración de plantas desde protoplastos, parecen ser herramientas importantes en la transferencia de genes en el futuro. No obstante, se necesita mas información sobre el control genético de la apomixis y su interrelación con marcadores genéticos, antes que la técnica de biología molecular pueda ser utilizada. Altos niveles de reproducción apomíctica no se encuentran generalizadamente en las especies cultivadas. Es común en el genero Citrus donde se ha utilizado eficientemente para producir pies libres de virus. Se ha reportado la existencia de apomixis facultativa en sorgo y mijo. El desarrollo de cultivares apomícticos en Poa pratensis y Cenchrus ciliaris han demostrado la potencialidad de su uso en el mejoramiento vegetal. 26

27 INDICADORES DE APOMIXIS La apomixis expresada en diversos grados, es probablemente más común en las especies cultivadas de lo que se ha reportado, puede ser pasado fácilmente por alto como causada por una segregación no tradicional o por el resultado de un cruzamiento. Hay algunos indicadores de apomixis que pueden ser chequeados con pruebas adicionales de cruzamientos, pruebas de progenie, y/o métodos citológicos. Las desviaciones en el comportamiento normal de un material de cría que puede sugerir una posible apomixis, tanto en plantas cultivadas como silvestres pueden incluir las siguientes comparaciones: Progenie uniforme o idéntica a las plantas madres, en especies de polinización cruzada. Una prueba de progenie utilizando semillas de inflorescencia en polinización libre, provee un medio rápido de analizar un número grande de accesiones. Tipos maternal distintos entre las progenies F1. La confirmación de la apomixis puede requerir estudios citológicos del material materno Variación genética limitada o ausente en una progenie F2 de una cruza entre dos plantas distintas. Genotipos recesivos a partir de una cruza entre un genotipo supuestamente apomíctico con un gen recesivo, polinizado con un padre que es homocigoto dominante para ese marcador genético. Inusual alta fertilidad de semillas en aneuploides, triploides, cruzamientos amplios, u otras plantas para las que se espera una descendencia estéril. Número cromosómico aneuploide o heterocigosidad estructural que permanece constante desde los padres a la progenie. Múltiples plántulas por semillas, múltiples estigmas por óvulos, múltiples óvulos por flores, ovarios dobles o fusionados. La detección de uno o más de estos indicadores de apomixis debe continuarse con pruebas más detalladas y precisas. Estas pueden incluir la utilización de polen de plantas homocigotas dominantes para un marcador genético para polinizar plantas supuestamente apomícticas recesivas para ese marcador genético. Será necesario emplear algún tipo de emasculación. El porcentaje de plantas con los genes recesivos en la progenie de estas cruzas indica el grado de reproducción apomíctica o maternal. Observaciones citológicas también se pueden utilizar para confirmar la reproducción apomíctica o para determinar el mecanismo de apomixis. 27

28 Tipos de cultivares en relación al modo de reproducción. Factores que afectan el tipo de cultivares a obtener Los factores que afectan el tipo de cultivar son: el tipo de acción génica predominante, aditiva o dominante o ambas, la presencia de Incompatibilidad, lo que impediría la endocría, presencia de macho esterilidad, importante para la obtención de cruzas, si es factible endocriar el material para lograr líneas puras, si existe heterosis y en que nivel, si la especie se reproduce asexualmente y si existe apomixis. De acuerdo a la existencia de algunos de los factores mencionados o, una combinación de ellos es posible elegir el tipo de variedad a obtener por selección (Tabla 2.6) Tabla 2.6. Sistema Reproductivo, modo de propagación y tipo de variedades Sistema Modo de Tipo de Variedad Reproductivo Propagación Sexual Autogamia Autogamia Línea Asexual Parcialmente Autógamo Parcialmente Alógamo Cruza controlada de padres Propagación Vegetativa Apomixis Variedades Híbridas Variedades Clonales Híbridos Apomícticos Líneas Puras Las líneas puras son características de los cultivos autógamos. El concepto de línea implica alta homocigosis: 90% o más. Estos cultivares se obtienen por endocría combinada con diferentes métodos de selección a partir de poblaciones F2. En F6 o F7 ya se consideran líneas puras. Cultivares de polinización abierta Constituyen poblaciones heterogéneas compuestas de plantas genéticamente diferentes, con un alto porcentaje de heterocigosis. Son casi exclusivos de especies alógamas y se obtenienen por diferentes esquemas de selección masal, por progenies o recurrente. Cultivares Híbridos Estos cultivares son homogéneos y altamente heterocigotos. Pueden obtenerse híbridos simples, triples o dobles. Existen dos etapas: obtención y evaluación 28

29 de líneas endocriadas parentales y cruzamiento entre líneas superiores para obtener los híbridos con alta heterosis. Cultivares Clonales Los cultivares clonales son ltamente heterocigotas obtenidos por reproducción vegetativa. Las variedades clonales se desarrollan a partir de la cruza o de la autofecundación. La reproducción sexual se utiliza para crear variabilidad para selección pero no para reproducción. Las líneas o clones son mantenidas asexualmente Cultivares Sintéticos Estos cultivares resultan del entrecruzamiento de un número determinado de líneas, clones o poblaciones. Estos parentales han sido seleccionados en base a su aptitud combinatoria. Han sido particularmente exitosos en cultivos con cierto grado de autoincompatibilidad: alfalfa, centeno, mijo. Multilíneas Son mezclas de líneas isogénicas de especies autógamas. Su utilidad primaria fue para la resistencia a enfermedades. Cada línea difiere en la resistencia cualitativa a un mismo patógeno. El objetivo es reducir la posibilidad que el patógeno quiebre los diferentes alelos para resistencia. Compuestos Son el resultado del cruzamiento o la mezcla de dos o mas cultivares o líneas. Un compuesto siempre está cambiando su constitución (adaptación al ambiente). La constitución original no puede ser mantenida por el mejorador. Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Cubero, J., Introducción al mejoramiento genético vegetal. Mundiprensa, Madrid, 365 pp. Hayward, M. D., Bosemark, N. O., Romagosa, Plant Breeding: Principles and Prospects. I. Chapman and Hall Ltd. Marrewijk, G.A.M., Flowering biology and hybrid varieties. I Flowering and pollination. Wageningen Agricultural University, Wageningen, 132 pp. Sleper, D. A. and J. M. Poehlman, Breeding field crops. Fifth edition. Blackwell Publishing, 424 pp. 29

30 Unidad 3. Endocría y Heterosis Endocría Introducción La endocría es definida como el apareamiento entre individuos relacionados por poseer un ancestro en común (Falconer y Mackay, 1996). Es el apareamiento entre individuos que están más estrechamente relacionados entre sí que en comparación con aquellos individuos que se aparean al azar dentro de una población. De acuerdo a Sleper y Poehlman (2006), podemos definirla también como cualquier sistema de apareamiento que conduce a la homocigosis. Primeros trabajos Los primeros en experimentar con la endocría o endogamia fueron algunos botánicos como Koelreuter en 1763, quien describió los efectos de la endogamia y vigor en tabaco. Charles Darwin (1868), experimentó con algunas especies incluso con el maíz y de acuerdo a sus descripciones sobre los efectos perjudiciales de la endogamia el concluyó que:..la naturaleza aborrece la autofecundación perpetua... En Estados Unidos, los investigadores G. Shull y East (1908) y Jones (1918), experimentaron y describieron efectos de la endogamia y vigor híbrido en maíz, sentando las bases para el desarrollo y diseminación de los cultivares híbridos en USA. Shull en 1952, estableció la autofecundación como el procedimiento para el desarrollo de líneas puras (endocriadas) para su utilización como progenitores de híbridos. Tipos de apareamientos consanguíneos. Existen cuatro sistemas de apareamiento para incrementar la homocigosis en una población en mejoramiento: autopolinización, hermanos completos, medios hermanos y retrocruzas. La autopolinización ocurre cuando las gametas femeninas y masculinas que provienen del mismo individuo se unen para producir el embrión. Los hermanos completos se obtienen cuando se aparean dos plantas de la población. Cuando un individuo o planta es polinizado aleatoriamente por el polen de la población se obtienen medios hermanos. Finalmente, la retrocruza es el cruzamiento de un individuo por uno de sus padres en sucesivas generaciones. La forma más extrema de endocría es el apareamiento de un individuo por sí mismo, es decir la autopolinización (Figura 3.1). Consecuencia de la endocría Como consecuencia del apareamiento consanguíneo, en particular debido a la autofecundación de individuos heterocigotos, irán apareciendo homocigotos recesivos para genes deletéreos, aquellos que reducen la eficacia biológica del individuo, por ejemplo: disminución de la fertilidad, reducido vigor, etc. También 30

31 pueden surgir letales que directamente impiden el desarrollo y la reproducción del individuo. Coeficiente de endocría. Definición: La probabilidad que dos genes en el mismo locus sean iguales por descendencia (Malecot, 1948). Coeficiente de endocría en especies diploides: El coeficiente de endocría es calculado para determinar el nivel de homocigosis en una generación específica: En el caso de autofecundación F = ½ (1 + F ) F: coeficiente de endocría. F : coeficiente de endocría de la generación precedente. F = 1 homocigosis completa F = 0 Población en panmixia En una población en apareamiento al azar de plantas no endocriadas, por ejemplo una población de maíz, F=0. Luego de una generación de autofecundación: F = ½ (1 + 0) = 1/2 o 0,5 Considerando el valor de F en la ley de Hardy-Weimberg: Genotipo Frecuencia F= 0 Panmixia F=1 Endogamia AA p2 (1 F) + pf p2 p Aa 2pq (1 F) 2 pq 0 aa q2 (1 F) + qf q2 q Propósitos de la endocría. Uno de los principales propósitos de la endocría es el desarrollo de genotipos que puedan ser mantenidos a través de numerosas generaciones de producción de semillas. Los cultivares de plantas autógamas, trigo, soja, por ejemplo, son reproducidos por muchas generaciones sin que ocurran cambios en su composición genética (líneas puras). En alógamas, en el caso de la producción de híbridos, es indispensable el mantenimiento y reproducción de las líneas parentales homocigotas (líneas endocriadas) para la obtención del cultivar híbrido. La endocría permite reducir la frecuencia de alelos recesivos deletéreos en genotipos que luego podrán utilizarse como progenitores de una variedad sintética o de un cultivar de propagación asexual. 31

32 % Homocigosis Mejoramiento Genético Vegetal: Principios y Procedimientos Al permitir la expresión de alelos recesivos, la endocría incrementa la varianza genética entre individuos de una población, y de esta forma mejora la eficiencia de selección, al poder eliminar alelos que codifican para características no deseables. 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Generaciones MH HC A Figura 3.1. Porcentaje de homocigosis con relación al número de generaciones de endocría para tres sistemas de apareamiento: MH: medios hermanos, HC: hermanos completos y A: autofecundación. Depresión por endocría Wright, ya en 1922, estableció que la relación entre el comportamiento medio y la reducción de la heterocigosidad debería ser lineal, independientemente del grado de dominancia (parcial, completa o sobredominancia) a menos que están involucrados efectos epistáticos o de ligamiento. El grado de depresión por endocría está en función de la frecuencia alélica, la existencia de dominancia y del número de loci segregantes. En maíz se han observado claramente los efectos de la consanguinidad: pérdida de vigor, plantas deficientes en clorofila, tallos frágiles y quebradizos, plantas enanas, espigas pequeñas, panojas malformadas y reducción en la productividad. La disminución general en el vigor del organismo o Depresión por Endocría, se puede calcular mediante la relación entre las generaciones F1 y F2: ( F1 F2) DE(%) :100. F1 DE: depresión por endocría, estima la carga de genes deletéreos. A mayor diferencia entre la F1 y la F2 mayor será la carga de genes deletéreos. F1: 32

33 individuos heterocigotos, F2: individuos segregantes por autofecundación de la F1. Endocría en especies poliploides. En autotetraploides son necesarios cuatro alelos idénticos por locus para completa homocigosis comparados con los dos necesarios en una especie diploide, por lo tanto la homocigosis es alcanzada más tardíamente en autotetraploides que en diploides. Debido a este multialelismo, las especies autopoliploides pueden acumular una gran cantidad de alelos deletéros en comparación con las diploides. Esto puede producir una mayor depresión por endocría en estas especies. Respuesta a la endocría De acuerdo a la depresión por endocría es posible clasificar a las distintas especies de acuerdo a su tolerancia a la endocría: Cultivos poco tolerantes: Alfalfa: tras 2-3 generaciones de autofecundación las mayorías de las líneas se pierden. Remolacha azucarera y zanahoria son también muy sensibles a la endocría. Cultivos tolerantes: Las cucurbitáceas en general parecen poco afectadas, o sea que poseen alta tolerancia a la endocría. El maíz tiene una posición intermedia: % de las líneas llegan a altos niveles de homocigosis con respecto a la población original. Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Falconer, D. S. y T. Mackay, Introducción a la genética cuantitativa. Ed. Acribia, 494 p. Malecot, Les mathematiques de l heredité. Masson. Paris Sleper, D. A. and J. M. Phoelman, Breeding Field Crops. Blacwell, 424 pp. Wright, S., The effects of inbreeding and cross breeding on guinea pigs. US Dept Agric. Bull

34 Heterosis Introducción Es el incremento en vigor, tamaño, rendimiento o de una función determinada de la progenie híbrida en relación a sus padres. También llamada vigor híbrido que resulta de la cruza de padres genéticamente diferentes. Heterosis es el comportamiento superior de los individuos híbridos en comparación con los padres. Fenotípicamente es la manifestación de vigor en la F1 para uno o varios caracteres superando a los padres Primeros trabajos. Koelreuter (1776) reportó el incremento en el crecimiento en híbridos con especies de Nicotiana. Darwin (1862) trabajó con varias especies con autofecundaciones y cruzamientos incluyendo al maíz. Beal (1880) en EE.UU reportó incrementos en el vigor de plantas en cruzas entre poblaciones de maíz de distintos orígenes. Shull (1917) denominó a este fenómeno como heterosis y lo definió como la superioridad del híbrido sobre las poblaciones parentales. Estos y otros investigadores supusieron que la condición híbrida ejercía un efecto estimulante sobre los mecanismos fisiológicos de la planta lo que redundaba en un mayor crecimiento y vigor. Teorías que explican la heterosis Existen dos teorías que tratan de explicar el fenómeno de la heterosis, aunque hasta el presente no existe suficiente evidencia experimental para determinar cuál es la principal responsable de la ocurrencia de la heterosis. Más aun, se considera que las dos no parecen ser totalmente adecuadas para explicar el fenómeno. Teoría de la Dominancia Esta teoría asume que el vigor híbrido resulta de la acumulación de un gran número de genes favorables y con efecto de dominancia. De acuerdo a esto, los alelos que contribuyen al incremento en vigor son dominantes, mientras que los recesivos son de efecto neutral, perjudicial o deletéreo en el genotipo. Si los alelos dominantes de un padre se complementan con los alelos del otro padre en el híbrido (F1), la F1 poseerá una mejor combinación de genes favorables que cualquiera de los padres (Figura 3.1). De acuerdo a esta teoría sería posible obtener, mediante endocría en una población heterocigota como por ejemplo el maíz, una línea que fuera tan productiva como un híbrido. Dicho de otro modo, que en una línea se puedan concentrar todos los genes favorables en estado homocigoto. Esto no has sido posible hasta el momento y constituye lo que se considera una debilidad de esta teoría. Esto parcialmente es explicado como que, en una especie de polinización cruzada como el maíz, existen un gran número de alelos deletéreos para que sea posible obtener una línea con todos los suficientes loci 34

35 en estado homocigota dominante para que el vigor de la línea sea comparable al del híbrido. Cuando los padres difieren en un gran número de alelos que controlan un carácter cuantitativo, la probabilidad de obtener todos los alelos favorables en un solo individuo es muy remota. Teoría de la Sobredominancia De acuerdo a la sobredominancia, los loci heterocigotos contribuyen más al vigor híbrido que los homocigotos. El híbrido más vigoroso será el que posea el mayor número de loci heterocigotos, o sea que existe un mayor valor genotípico del heterocigota comparado con ambos homocigotas para un locus particular. Esta teoría supone que existen alelos contrastantes para un locus simple, ejemplo: dos alelos, a1 y a2, a1 produce el polipéptido p1, a2 produce el polipéptido p2, una planta homocigota producirá un polipéptido (p1 o p2) mientras que una planta heterocigota producirá ambos productos (p1 + p2), por lo tanto los heterocigotos son superiores a los homocigotas (Figura 1). Argumentos en contra de esta teoría es la escasa evidencia encontrada en caracteres cuantitativos y que, generalmente, un gen es activo a la vez. En general, la teoría de la dominancia es sindicada como la forma más plausible de explicar la heterosis y no existe evidencia de otra acción génica responsable como podría ser la epistasia dominante. La teoría de la dominacia es consistente con evidencia genómica reciente acerca de la diferencia en contenido génico en líneas endocriadas de maíz. La heterosis depende de la sumatoria de los efectos dominantes y de las diferentes frecuencias génicas entre los padres: HF 1 = Σ dy2 HF 1 : heterosis en la F1. d: efectos dominantes y2: diferencias en la frecuencia génica entre las líneas endocriadas. La magnitud de la heterosis dependerá de la distribución de las frecuencias alélicas entre los genotipos que darán lugar al híbrido. Por lo tanto si se producen individuos con diferentes frecuencias alélicas para un gran número de loci, la probabilidad de obtener híbridos con heterosis será mayor. Esto es lograr, mediante el mejoramiento, ejemplo: endocriando plantas de maíz, obteniendo líneas endocriadas con diferentes alelos para un mismo locus y con relación de dominancia entre ellos. Medición de la Heterosis El comportamiento de un híbrido con relación a sus padres puede ser expresado de dos formas. Heterosis media es el comportamiento del cultivar híbrido con relación al comportamiento promedio de sus padres. La heterosis con respecto al padre mayor es la comparación del híbrido con el comportamiento del mejor padre, este tipo de heterosis también se la denomina heterobeltiosis. 35

36 La heterosis es generalmente expresada en porcentaje de acuerdo a las siguientes fórmulas: Heterosis media (%): (F1 Xi) / Xi x 100 Xi: Media de los padres (P1 + P2) Heterosis con respecto al padre de mayor expresión (%): (F1 P)/P x 100 F1: Valor del híbrido P: Padre de mayor expresión Ejemplo: F1: 90; P1: 60; P2: 80 Heterosis media = (90 70/70) x 100 = 28,6% Heterosis con relación al padre mayor = (90 80/80) x 100 = 12.5% (Heterobeltiosis) AAbbCC X AABBcc = = 26 AABbCc No Dominacia = 25 No heterosis Dominancia = 30 Heterosis Sobredominancia Bb>BB o bb Heterosis Bb>12 Cc>8 AABbCc = 32 Figura 3.1. Ejemplo numérico de las teorías de la dominancia y sobredominancia como explicación de la heterosis. Tipo de variedades y heterosis. Cultivares diploides En una especie diploide con dos alelos por locus, la heterosis promedio de una cruza es mayor en las cruzas simples debido que el número de loci con un alelo dominante es mayor. En un híbrido triple la heterosis depende de la frecuencia de los loci que retengan un alelo dominante. Esto está en función de las relaciones genéticas entre el híbrido simple y la tercera línea que formarán 36

37 el híbrido triple. La frecuencia de loci con alelos dominantes generalmente es menor en un híbrido triple que en uno simple. En el caso de un híbrido doble la frecuencia de loci con alelos dominantes será menor que en el híbrido triple. Al incrementar el número de líneas que forman una cruza, aumenta la probabilidad que algunos loci sean homocigotas para genes recesivos lo que disminuirá la heterosis, de acuerdo a lo expuesto en las teorías que explican el fenómeno de la heterosis. Cultivares autopoliploides En número de alelos diferentes en un locus de una especie autotetraploide puede ir de uno a cuatro. Se ha postulado que la máxima heterosis es expresada por un locus tetragénico (abcd), y declinara en un trigénico (abcc), digénico (aaab) y en un locus monogénico (aaaa) (Busbice & Wilsie, 1966). De acuerdo a esto, un sistema de mejoramiento que maximice la frecuencia de loci con alelos múltiples maximizará la heterosis. La frecuencia de loci con alelos múltiples en un híbrido está asociada con el nivel de endocría de los padres. Lo híbridos dobles tendrán mayor número de loci multialélicos que los híbridos simples si los padres son endocriados (Figura 3.2). Diploides AABBccdd X aabbccdd Híbrido Simple AaBbCcDd Máxima heterosis AaBbCcDd X AABBccdd Híbrido Triple AaBbCcDd; AABbccDb; AABBccDd; etc Autopoliploides Aparecen loci en homocigosis y disminuye la heterosis aaaa x bbbb cccc x dddd aabb x ccdd abcd Máxima heterosis Figura 3.2. Heterosis en cultivos diploides y autopoliploides cuando los padres son líneas endocriadas homocigotas. 37

38 Implicancias de la heterosis en el Desarrollo de Cultivares La posibilidad de utilizar híbridos como producto final del mejoramiento para la producción comercial ha sido examinada en casi todas las especies. Los motivos excluyentes son la elevada productividad y uniformidad y la certeza de poseer un producto que debe ser adquirido todos los años por el agricultor, dado que no es posible su reproducción sin perder mucha de la productividad y uniformidad. Si el producto final es un híbrido, el sistema de mejoramiento deberá prever, principalmente si la obtención del híbrido se justifica, es decir, si la heterosis compensará el costo extra de la obtención de la semilla híbrida. La facilidad o no obtención de líneas endocriadas u homocigotas, si el sistema reproductivo de la especie lo permite. Estas líneas deberán ser evaluadas en combinaciones híbridas preliminares para descartar aquellas que no posean buena aptitud combinatoria. Finalmente para la producción comercial la facilidad de obtener semilla híbrida a gran escala. El fenómeno de la heterosis varía en las diversas especies. Generalmente es mas frecuente e intenso en alógamas que en autógamas, por ejemplo: 10% en trigo, 200% en maíz (Tablas 3.1 y 3.2). Tabla 3.1. Heterosis promedio en cereales y leguminosas Cultivo Heterosis % Trigo Autógama 10 Soja 13 Arroz 15 Colza Girasol Alógama 40 Maíz 100 Estrategias comerciales para la explotación de la heterosis Desde la perspectiva de las empresas semilleros se deberá tener en cuenta si los híbridos van ha satisfacer las necesidades del cliente. El retorno a la inversión debe ser, al menos, 3 veces el costo de la semilla híbrida. El precio de la semilla híbrida debe ser suficientemente alto para permitir un retorno del 10-15% (compañías privadas), y permitir una inversión del 5 10% de las ventas para investigación. Integrar variables - clave para el éxito. En síntesis para que la obtención de variedades con heterosis el mejorador debe tener en cuenta las siguientes variables: 38

39 1. El sistema de polinización del cultivo 2. Las opciones para manipular el sistema de polinización 3. El Costo de la emasculación u otros preparativos para la hibridación 4. El Rendimiento del cultivo 5. El Valor comercial del cultivo por unidad de tierra 6. La producción de semillas del cultivo 7. El rendimiento en semillas en el campo de producción de semilla híbrida. 8. El rendimiento extra esperado debido a la heterosis 9. La uniformidad del híbrido 10. La facilidad de mejorar el cultivo para otros caracteres (ej.: tolerancia) 11. La facilidad de demostrar la superioridad del híbrido 12. La disponibilidad de líneas públicas o privadas Tabla 3.2. Heterosis promedio en cultivos hortícolas Cultivo Heterosis (%) Pimiento Autógama 35 Tomate 60 Brocoli Alógama Repollo Cebolla Espinaca Espárrago Dioica Consideraciones Finales La heterosis es el fenómeno opuesto a la depresión por endocría y depende principalmente de efectos de dominancia y posiblemente de tipos de epistasia dominante. Si la acción génica predominante es estrictamente aditiva no se detectará heterosis con relación a los padres. En general cruzas entre genotipos con gran divergencia genética (frecuencias génicas distintas) muestra una F1 con alta heterosis. La manifestación de la heterosis depende del grado de endocría de los padres. Las causas genéticas, las teorías, de la manifestación de la heterosis son aún motivo de debate. Por último, sigue vigente el interrogante de porqué existe heterosis en algunas especies y en otras no. Perspectivas A pesar que la base genética no está bien dilucidada aún, el desarrollo de nuevas técnicas podrá proveer de información adicional sobre los tipos de acción génica importantes en la expresión de la heterosis (Hallauer, 1999). Empleo de marcadores moleculares para predecir heterosis, identificando 39

40 grupos heteróticos, antes de la evaluación a campo. Estudiar la correlación entre la distancia genética y la heterosis puede permitir la elección de las líneas de mayor divergencia. Localización de la acción génica: loci individualizados con sobredominancia (Molecular y QTL mapping): Genes duplicados, es posible detectar subregiones con las misma actividad sobre uno o varios caracteres cuantitativos. A nivel de ADN se están estudiando la posible influencia de cambios en contenido, supresión, activación, paramutaciones, amplificaciones y cross-over desbalanceado para desentrañar las causas de la heterosis. Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Falconer, D. S. y T. Mackay, Introducción a la genética cuantitativa. Ed. Acribia, 494 p. Hallauer, A. R., Heterosis. What have we learned? What have we done? Where are we headed? In: The genetics and exploitation of heterosis in crops. ASA, CSSA. Hallauer, A.R. and J.B. Miranda, F.O., Quantitative Genetics in Maize Breeding. 2nd ed., Iowa State University Press, Ames, IA, USA. Sleper D. A. and J. M. Poehlman, Breeding Field Crops, 5 th Edition, Blackwell Publishing, 424 p. Sprague, G.F., Heterosis in maize. Theory and practice. In: Monographs on Theoretical and Applied Genetics, Vol 6 Heterosis, R. Frankel (ed.), pp Van Marrewijk, G. A. M., Heterosis, In: Flowering Biology and Pollination, Wageningen Agricultural University, The Netherlands, 136 pp. 40

41 Unidad 4. Recursos Genéticos Vegetales Importancia de los Recursos Genéticos Vegetales En la agricultura existe un proceso que se repite continuamente, el reemplazo de variedades existentes en cultivo por otras con mejores aptitudes. Las variedades reemplazadas no son cultivadas por los agricultores, se convierten en obsoletas y, si no se mantienen de alguna manera pueden llegar a perderse. Las causas por las que una variedad es reemplazada por otra son fundamentalmente: 1. Su rendimiento es menor que las variedades modernas o recientes. 2. Son susceptibles a nuevas razas de un patógeno determinado 3. El consumidor ha cambiado su demanda Sin embargo, muchas características de la variedad reemplazada como contenido y/o composición de proteína, tolerancia a estrés, resistencia a determinadas razas de patógenos, pueden ser de considerable valor para la obtención y el mejoramiento de nuevas variedades. Las variedades obsoletas pueden poseer caracteres que no son de importancia actual, pero pueden convertirse en una inestimable fuente de variabilidad o de caracteres específicos para modernas variedades en el futuro. Por esta razón es que las variedades obsoletas que se han retirado del cultivo deben ser mantenidas en colecciones para su utilización cuando las condiciones o requerimientos así lo demanden. Los mejoradores de plantas manejan un número reducido de colecciones de germoplasma de una especie que posee caracteres de interés para los fines específicos del mejorador. Por razones de tiempo, costo y espacio, los mejoradores no pueden mantener grandes colecciones de germoplasma. Si el mejorador cambia el objetivo de la mejora, por ejemplo necesita incorporar tolerancia a una determinada enfermedad, todo el material que disponía hasta ese momento puede tornarse de poco valor para él. Si ese material no se reproduce adecuadamente, puede perder su viabilidad y ser desechado. Sin embargo, este material, como hemos visto es fuente de variación genética y debe conservarse para su posible uso posterior por otros mejoradores. Los estudios de filogenia, evolución natural o artificial y taxonomía de las plantas también necesitan de acceso a material, sobre todo aquel no domesticado o salvaje, por lo que no solo los mejoradores se benefician de la conservación de los recursos genéticos. La tarea de colección y mantenimiento del germoplasma queda o debe quedar en manos de instituciones nacionales e internacionales para su utilización posterior. Estos bancos de germoplasma conservan y documentan el material, el cual debe ser de libre acceso a las personas o instituciones interesadas en el. 41

42 Distribución de los Recursos Fitogenéticos Vavilov en 1920 fue el primero en identificar áreas con características geográficas similares donde se encontraba la mayor variabilidad genética para la mayoría de las especies cultivadas. Zhukovsky (1965), un asociado de Vavilov, identificó 12 centros de diversidad de las plantas cultivadas (Tabla 4.1). Fuentes de Variación Genética Variedades Modernas Las variedades modernas se cultivan a gran escala y están compuestas por líneas puras en el caso de las autógamas, híbridos en alógamas y clones en aquellas especies de reproducción asexual. Estas variedades son genéticamente homogéneas, la línea pura consta de un único genotipo homocigota, los híbridos de la F1 de dos líneas (ej.: maíz), y los clones de material heterocigota pero homogéneos, es decir todas las plantas de la variedad presentan la misma constitución genética. Estas variedades cuando son reemplazadas se convierten en variedades obsoletas. Tabla 4.1. Plantas cultivadas y sus centros de diversidad. Región Plantas Cultivadas Chino-Japonesa Soja, Citrus, Durazno, Bambú, Te. Indochina - Indonesia Arroz, Cucurbitáceas, Mango, Banana, Árbol del Pan, Lima, Australia Eucaliptus, Acacia, Indostán Arroz, Pimienta Negra, Pimienta Verde, Garbanzo, Yute, Zapallo, Sésamo, Caña de Azúcar, Asia Central Trigo, Centeno Ajo, Cebolla, Espinaca, Lenteja, Garbanzo Manzano, Castaño, Almendro, Pistacho, Melón. Lúpulo, Cannabis, Sésamo, Medio Oriente Trigo (T. durum; T. aestivum), Cebada, Centeno Garbanzo, Lenteja Mediterráneo Trigo (T. durum; T. turgidum), Avena Lechuga, Colza Olivo, Trifolium, Lupino, Apio África Trigo Arroz Africano, Sorgo, Europa-Siberia Durazno, Manzano. América del Sur Papa, Batata, Xanthosoma. Amaranto, Chenopodium, Cucurbita, Tomate, Tabaco, Lupino. América Central y México Maíz, Papa, Cucurbita, Pimienta/Chilli, Amaranto, Chenopodium, Tabaco, Sisal, Algodón. América del Norte Girasol, Frutilla 42

43 Variedades Obsoletas y Antiguas La variedades obsoletas comprenden variedades locales (landraces) y variedades mejoradas que fueron reemplazadas por nuevas variedades. En algunos países existen y todavía son cultivadas las denominadas tipos primitivos o variedades primitivas que poseen muchas características que no han sido mejoradas por selección. Esto es frecuente en países que no cuentan con estaciones de mejoramiento o en los cuales no se han introducido variedades modernas. En otros países estas landraces han sido reemplazadas por variedades mejoradas y se han convertido en variedades obsoletas. Sin embargo, estas pueden ser todavía cultivadas por agricultores que no tienen acceso a las nuevas. Variedades antiguas, en un tiempo las variedades antiguas fueron variedades modernas que fueron reemplazadas por nuevas y mejores variedades. Las variedades antiguas fueron las que reemplazaron a las variedades locales. Ellas fueron obtenidas por selección de líneas dentro de una variedad local o por la cruza de dos variedades locales, luego de la cual se practicó selección. En las especies alógamas la selección masal fué la responsable de la obtención de las primeras variedades mejoradas a partir de las variedades locales (land varieties). Malezas Las malezas crecen junto a los cultivos domesticados. En general, ellas se originaron de la adaptación de tipos salvajes a tipos adaptados al manejo del hombre, de cruzamientos entre tipos salvajes y domesticados o a partir de involución de tipos domesticados. La convivencia de las malezas y de los cultivos domesticados puede formar un canal para el flujo génico entre los tipos salvajes y domesticados. Debido a los modernos métodos de eliminación de malezas y de purificación de semillas, las malezas pueden disminuir su presencia en el fututo. Sin embargo, en los sistemas agrícolas altamente desarrollados algunos tipos salvajes pueden persistir. Un ejemplo lo constituye una forma salvaje de la remolacha azucarera en Europa y América del Norte. Tipos derivados de la cruza entre domesticados y salvajes son anuales, ellos producen semillas antes que el cultivo domesticado es cosechado (bianual). Las semillas del tipo salvaje tienen una larga dormición, por alrededor de 10 años, los cual va ha producir tipos salvajes en los cultivos de remolacha. Ancestros salvajes y especies relacionadas. La ancestros de las plantas domesticadas deben ser preservadas debido a que poseen muchos genes que condicionan características relevantes. La preservación puede realizarse mediante la colecta de semillas o mediante la preservación de ejemplares en su lugar (in situ) impidiendo su extinción por la naturaleza o el hombre. Para asegurarse que un tipo salvaje puede ser de utilidad, se debe investigar la posibilidad de que se cruce con un tipo domesticado, la existencia de barreras a la hibridación, etc. 43

44 Tabla 4.2. Posibilidad de encontrar recursos genéticos y su valor para el mejoramiento. Área Tipo de Recurso Genético Centro de Diversidad Área de Cultivo Estación de Mejora Estación de Investigación Valor para el Mejoramiento Cultivares Modernos Ausente/ Posiblemente presente Presente Presente Posiblemente presente Complejos génicos de alto valor. Sin variación genética Cultivares Obsoletos Ausente/ Posiblemente presente Presente Presente Posiblemente presente Complejos génicos de mediano valor. Baja variación genética Razas de campo (Landraces) Presente/ Posiblemente ausente Presente/ Posiblemente ausente Presente Posiblemente presente Complejos génicos de bajo valor. Alta variación genética Malezas Presente/ Posiblemente ausente Presente/ Ausente Presente Posiblemente presente Complejos génicos de bajo valor. Alta variación genética Colección del Mejorador Ausente Ausente Presente Posiblemente presente Depende de la colección Colección del Especialista Ausente Ausente Ausente Presente Depende de la colección Colección del Mejorador (Breeding Stock) Mucho del germoplasma del mejorador no llega a constituir una nueva variedad, sin embargo este material posee genes de valor. Dependiendo del los objetivos del mejorador su colección puede comprender materiales de su propia región, materiales foráneos, tipos salvajes, etc. Colección del Especialista Son colecciones para fines específicos, no siempre destinados a obtener una nueva variedad. Consisten en colecciones de mutantes, aneuploides, translocaciones, líneas que poseen ciertos genes específicos, etc. 44

45 Estas seis fuentes que juntas forman el reservorio de genes pueden ser divididas en clases de acuerdo a el sitio o a los sitios donde el material fue recolectado o de las colecciones ya existentes de las cuales se las obtuvo (Tabla 2). 1. Colección a partir de los centros de diversidad, especialmente para la fuente 2 y 3. si el centro de diversidad coincide con el área donde los tipos salvajes se encuentra, como es común, la fuente 4 debe ser incluida. 2. Colección a partir del área de cultivo, para las fuentes 1, 2, 3, 5 y 6. Si el área salvaje está comprendida dentro del área de cultivo, se debe agregar la fuente Colección a partir de estaciones de mejoramiento y de instituciones de investigación, para las fuentes 1 a 6. Variación Genética, Homogeneidad y Valor Genético En general la variación de un germoplasma es cuantificada visualmente como baja, moderada o alta. En estos casos la evaluación se centra en características fácilmente observables y distinguibles a simple vista. Este tipo de variación es llamada homogeneidad. Sin embargo, a pesar de que una muestra aparezca como homogénea ella puede variar en forma considerable para caracteres que no son fácilmente observables, por ejemplo el rendimiento. El valor genético es un ítem discutible dado que diferentes mejoradores pueden aplicar diferentes criterios para valorar una fuente de germoplasma. Una fuente de material no adaptado y que a priori no sea de valor para obtener una nueva variedad, puede, no obstante, ser portador de genes valiosos si ellos condicionan, por ejemplo, la resistencia a una nueva enfermedad. Colecta de Germoplasma Centros de Diversidad Cuando Vavilov estudió la distribución de la variación de un cultivo domesticado, el encontró que: a) la más alta variación se encontraba en una o unas pocas áreas y b) que esas áreas y los diferentes cultivos se solapaban en varias regiones. El nombró a tales regiones como Centros de Origen. Más tarde esta denominación fue cambiada por el de Centros de Diversidad o Centros de Variación, debido a que un área con la mayor diversidad no necesariamente es también el área de origen del cultivo domesticado. También se descubrió que varios cultivos tienen más de un centro de diversidad. La región o centro donde un cultivo es domesticado es llamado Centro Primario de Diversidad, mientras que los otros centros o áreas con gran diversidad son llamados Centros Secundarios de Diversidad. Cuando mas datos de mas cultivos fueron obtenidos se tuvo que ampliar la denominación de los centros como megacentros, donde varios cultivos fueron domesticados en varios lugares al mismo tiempo, poseyendo lo que se denominó como un centro difuso. 45

46 De acuerdo a lo expuesto, la mayor variación de encuentra en estos centros de diversidad, y por lo tanto las expediciones de colecta deben ser dirigidas a esas áreas. Estrategias de Colecta Exploración. Se realiza una recolección en forma general sin medidas especiales para asegurarse que todos los genes hayan sido recolectados. Este tipo de recolección se realiza cuando no hay tiempo para un estudio riguroso del área y de la dispersión y/o variabilidad presente. Esto puede ocurrir cuando una especie en determinada región está en riesgo de desaparición por la introducción y reemplazo por nuevas variedades comerciales del cultivo, o por un cambio en la especie cultivada. Reconocimiento y muestreo. Esto implica un mejor conocimiento del cultivo y del área de dispersión del mismo. Se conoce más acerca del cultivo y de las características a buscar en particular. Se puede buscar determinadas plantas que presenten los rasgos deseados y proceder a una recolección intensiva de esos tipos. Después del estudio meticuloso del germoplasma recolectado se puede volver al lugar para realizar una recolección mas exhaustiva del germoplasma. Cuanto Recolectar El tamaño de la muestra a recolectar depende de la especie, su homogeneidad, la uniformidad del terreno, la distribución y la historia de la especie en esa área y de los medios disponibles para la recolección. Si por ejemplo, en un área determinada existen plantas, y entre esas plantas existen 50 genotipos que se pretende recolectar y estos no pueden ser individualizados visualmente. Si recolectamos 100 plantas, la probabilidad de que al menos recolectemos uno de los genotipos deseados es del 5%. Una especie alógama posee en general dos alelos diferentes por locus, por lo tanto una semilla poseerá dos alelos. En autógamas existe un único tipo de alelo por locus, por lo tanto en estas especies se debería recolectar mas plantas para asegurarse que ambos tipos de alelos sean muestreados. Una población de plantas de propagación vegetativa consiste generalmente de unos pocos clones, al ser estos altamente heterocigotos, solo se necesita muestrear unos pocos propágulos de la población. Bancos de Germoplasma Los bancos de germoplasma se pueden dividir en 1. Bancos Naturales y 2. Bancos Artificiales Bancos Naturales Los bancos naturales, también llamados reservorios de plantas salvajes, conservan especies de plantas salvajes in situ. Es importante para los mejoradores de plantas y otros investigadores, que los ancestros salvajes y 46

47 especies relacionadas con las plantas domesticadas sean preservados en su área de dispersión natural. Estas áreas son donde se encuentra la máxima variabilidad genética de la especie. La preservación de estas especies puede requerir de un manejo adecuado del área para prevenir la posible extinción de algunas especies. En Israel, luego de proteger ciertas áreas del sobrepastoreo causado por cabras y ovejas, se constató que un ancestro del trigo, el Triticum dicoccoides, elevó su número de individuos. Se debió controlar también los árboles que mediante el sombreado impedían el normal desarrollo de esta especie. Los campos con vegetación natural, las llamadas comúnmente malezas o malas hierbas, pueden constituir importantes reservorios de especies y, lugares donde, por evolución y selección natural pueden aparecer algunos ancestros de plantas domesticadas. Ejemplo de lo anterior son las ocurrencia de especies relacionadas con los tulipanes en reservas naturales del norte de Europa. La mejor forma de preservar las especies en un área natural es crear un conjunto de áreas protegidas, las que deben ser estudiadas exhaustivamente para determinar si es necesario un manejo adicional para preservar una determinada especie (caso del Triticum dicoccoides). En estas áreas existe la probabilidad de flujo de genes de especies domesticadas que pueda alterar la composición del lugar no es demasiado alta, desde que los genes domesticados no sobreviven mucho tiempo en condiciones salvajes. Bancos de Germoplasma Artificiales Tareas Un banco de germoplasma es una institución que colecciona y mantiene plantas. Estas instituciones constan de oficinas, habitaciones con regulación de temperatura para depósito de materiales, laboratorios, herbario, invernaderos y campo para reproducción de los materiales ex situ. Las tareas que se llevan a cabo en un banco son: 1. Conformación de una colección 2. Registro 3. Evaluación 4. Almacenamiento 5. Mantenimiento 6. Distribución 7. Construcción de bases de datos Conformación de una colección El banco de germoplasma puede organizar expediciones de colecta de material. Estas expediciones deben incluir a todos los especialistas con interés en la determinada especie y en esa región en particular, para que la recolección sea satisfactoria y pueda satisfacer las necesidades de los posibles interesados. 47

48 Cuando un mejorador desea descartar una colección o una parte de ella, el debería enviarla a un banco de germoplamsa. Si el mejorador es temeroso de que algún otro especialista o competidor pueda aprovechar su material, puede pedir que su donación sea mantenida como una colección cerrada por un período de tiempo determinado. Registro El material recibido debe ser cuidadosamente estudiado para detectar la presencia de pestes y enfermedades. El material infectado debe se puesto en aislamiento. Cada muestra, a la cual se le asigna un número para su identificación conjuntamente con su nota de campo, debe ser dividida en dos partes, una para ser almacenada inmediatamente y la otra para ser sembrada y estudiada. Evaluación El valor de la muestra de germoplasma debe ser estudiado para determinar sus características. Características botánicas y de la especie deben ser determinadas y se debe guardar un espécimen en el herbario para referencia. Se determina su reacción frente a enfermedades e insectos y su contenido de proteína y composición. Almacenamiento Un banco puede almacenar semillas, tejidos, polen y plantas enteras con el fin de preservar la variación genética Almacenamiento de semillas Las especies pueden ser divididas en aquellas que producen semillas ortodoxas o semillas recalcitrantes. La semillas ortodoxas son relativamente fáciles de conservar, mientras que las recalcitrantes necesitan condiciones especiales que pueden variar según la especie. Las semillas ortodoxas pueden conservarse por largos períodos de tiempo luego de secarlas y mantenerlas a baja temperatura (menor a 0 C), sin oxígeno y sin luz. Las recalcitrantes no sobreviven a baja temperatura y sin la presencia de oxígeno. Las semillas almacenadas, luego de cierto número de años van perdiendo paulatinamente su viabilidad. Por esto, deben ser sembradas y reproducidas para obtener semilla fresca. Almacenamiento en cultivos de tejidos Partes del tejido puede ser almacenado en recipientes a temperaturas inferiores a 0 C. La criopreservación es un método utilizado en algunas especies. Cada especie puede requerir distintas condiciones de almacenamiento, por ejemplo un congelamiento rápido o lento. Cuando lo que se conservan son masas indiferenciadas de tejidos, denominadazas callos, es posible que ocurra algún tipo de variación o mutagénesis en el material, alterando el material originario (variación somaclonal). 48

49 Almacenamiento de polen El polen de ciertas especies puede ser almacenado a bajas temperaturas luego de ser deshidratado completamente o no. El problema es que los costos son mayores al almacenamiento convencional de semillas y que solo se puede aplicar en algunas especies. Mantenimiento del material Todo material en almacenamiento debe ser reproducido cuando la capacidad germinativa baja o cuando el stock disminuye demasiado. El principal cuidado es evitar toda contaminación ya sea por polen o por mezcla. Si la muestra consiste de varios genotipos esta mezcla debe ser reproducida de modo que no se altere la composición original. El mantenimiento de especies autógamas no es tan dificultoso como el de alógamas. En autógamas no es necesario mantener lotes de aislamiento, salvo en algunos casos y con ciertos tipos de germoplasma (ej: ciertos ancestros de los cereales que tienen mayor porcentaje de alogamia). En alógamas, es necesario el aislamiento en tiempo y en espacio o el embolsado de todas las inflorescencias de los genotipos bajo reproducción, lo que complica la tarea y demanda mayores recursos. En contraposición el mantenimiento de clones es relativamente fácil. Distribución El material se envía a instituciones o mejoradores particulares que lo requieran. Hay casos en que se crea otra colección (duplicado), que se mantiene en otro banco, para reducir el peligro de pérdida de genotipos. Con la distribución se pueden presentar algunos problemas. Muchos genes son almacenados fuera de su región o país de procedencia. Esto ha causado problemas debido a que los países menos desarrollados aducen que genes valiosos son tomados en sus países y utilizados en los países en desarrollo. El gen luego es incorporado en el genoma de un cultivo por un mejorador, después de lo cual el país menos desarrollado debe comprar la variedad con su gen. Podemos agregar que el mejorador va a pretender un precio por el trabajo que el realizó con el gen. Se dice que el gen fue robado de un país y que tiene que ser retornado a él. Como los genes pueden ser reproducidos incontables veces este retorna con el genoma del cultivo mejorado. Por otra parte, es aceptado que el material es libre de ser trasladado de un país a otro. No deberían existir fronteras para los materiales fitogenéticos. Los recursos fitogenéticos son un patrimonio de la humanidad y consecuentemente deben estar disponibles sin restricciones. Sin embargo, este principio puede inducir a los mejoradores a no enviar sus productos avanzados a un banco de germoplasma, debido que pueden ser utilizados por competidores para desarrollar materiales mejorados y competir en el mercado. Con las técnicas de ADN recombinante, genes de otras especies son introducidos en cultivos, Bt en maíz, RR en soja como ejemplos. Entonces, en 49

50 ciertos países desarrollados estos genes se patentan y entonces su empleo debe ser pagado cada vez que se lo utiliza. Bases de Datos Los datos recolectados deben ser almacenados en sistemas digitales para permitir su comparación y distribución a los interesados en ciertos datos de cierto germoplasma en particular. Clases de Bancos Artificiales de Germoplasma Bancos Mundiales Estos recolectan y mantienen tanto como le es posible. Constan principalmente de una estación principal y varias subestaciones distribuidas en varias regiones para el mantenimiento de las colecciones. Ejemplos son el USDA Genebank en Beltsville, USA y el Vavilov Institute of Plant Industry, con su oficina principal en Leningrado, Rusia. Bancos Interregionales y Bancos Regionales Recolectan y preservan materiales de regiones que incluyen varios países. Ejemplos: Izmir Genebank, que conserva materiales de la región comprendida entre Turquía y Afganistán, Bari genebank, que mantiene germoplasma de los países que bordean al mar Mediterráneo y el Braunschweig en Alemania que mantiene colecciones del centro de Europa. Bancos Internacionales Bancos de germoplasma costeados por dos o más países. Ejemplo: Solanum Genebank, mantenido en colaboración por Holanda y Alemania. Bancos de Instituciones Nacionales Comprende las colecciones mantenidas por un país o por un instituto de investigación. Ejemplos: la colección de variedades de tulipán conservadas en Holanda. En nuestro país el INTA, a través de sus estaciones mantiene una gran cantidad de especies. Facultades, como la colección de Prosopis mantenida en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de Córdoba (Tabla 4.3). Tipos de Colecciones Las colecciones se pueden clasificar de acuerdo al propósito para el cual la colección fue realizada. Colección de Accesos: Para mantenimiento a largo plazo, deben ser almacenadas en dos bancos (duplicados) para reducir el peligro de pérdida de materiales. 50

51 Colección Básica o Colección de Trabajo: Colecciones de una especie en particular que estén disponibles para su distribución. Colección de Tipos Espontáneos: Consiste en el mantenimiento de semillas y frutos de especies salvajes y/o malezas. Colección Genética (Genetic Stock): colección de mutantes, translocaciones, etc. Colección en Masa: todos los accesos son conservados mezclados y son multiplicados todos juntos. Tabla 4.3. Ejemplos de algunas especies conservadas en las EEA del INTA Estación Experimental Alto Valle Anguil Balcarce La Consulta Manfredi Marcos Juarez Pergamino Saenz Peña Salta Especies Forrajeras, frutales de pepita Forrajeras Papa, forrajeras, girasol Hortalizas, frutales de carozo, olivo, vid Maní, sorgo, girasol, alfalfa Trigo, soja Maíz, girasol, forrajeras Algodón, forrajeras, forestales Poroto, tabaco, caña de azúcar, leguminosas de grano Bibliografía Vavilov, N. Y The Origin, Variation, Immunity and Breeding of Cultivated Plants. Chronica Bot. 13: 1-36 Zeven, A. C. & P. M.. Zhukovsky, Dictionary of cultivated plants and their centres of diversity. PUDOC, Wageningen, the Netherlands. 219 pp. Zeven, A. C. & J. M. J. de Wet,, Dictionary of Cultivated Plants. Wageningen, 263 pp. 51

52 ANEXO Lista de Instituciones Relacionadas con los Recursos Fitogenéticos GCIAI: Grupo Consultivo sobre Investigación Agrícola Internacional FAO: Organización para la alimentación y Agricultura de las Naciones Unidas IARC: Centro de Investigación Internacional en Agricultura IBPGRI: Instituto Internacional para los Recursos Genéticos de las Plantas Lista de centros del Grupo Consultivo sobre Investigación Agrícola Internacional (GCIAI) ADRAO - Asociación para el Desarrollo del Cultivo del Arroz en el Africa Occidental. Bouake, Côte d'ivoire. Fundada en Se ocupa del mejoramiento del arroz en el Africa occidental, realizando investigaciones sobre el arroz en manglares y tierras pantanosas interiores, en condiciones de tierras altas y en condiciones de regadío. CIAT - Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia. Fundado en 1967 para ocuparse del mejoramiento de los cultivos de la agricultura tropical de las tierras bajas de América Latina. La investigación comprende el arroz, los frijoles, la yuca, los forrajes y los pastos. CIFOR - Centro de Investigación Forestal Internacional, Bogor, Indonesia. Fundado en 1992 para ocuparse de la investigación sobre la conservación y el desarrollo sostenible de los bosques. CIMMYT - Centro Internacional de Mejoramiento del Maíz y del Trigo, México D.F., México. Fundado en Se ocupa del mejoramiento de los cultivos de maíz, trigo, cebada y triticale. CIP - Centro Internacional de la Papa, Lima, Perú. Fundado en Se ocupa del mejoramiento de la papa y la batata, con especial atención a la ecología de determinadas regiones montañosas. ICARDA - Centro Internacional de Investigación Agrícola en las Zonas Secas, Alepo, Siria. Fundado en Se ocupa del mejoramiento de los sistemas agrícolas de Africa del Norte y Asia occidental. La investigación comprende el trigo, la cebada, el garbanzo, la lenteja, las leguminosas de pasto y los pequeños rumiantes. ICLARM - Centro Internacional para la Ordenación de los Recursos Acuáticos Vivos, Makati, Metro Manila, Filipinas. Fundado en Investigación sobre todos los aspectos de la pesca, para mejorar la eficacia y la productividad de la piscicultura y las capturas. ICRAF - Centro Internacional para la Investigación sobre Agrosilvicultura, Nairobi, Kenya. Fundado en Se ocupa de iniciar y respaldar la investigación sobre la integración de los árboles en los sistemas de utilización de la tierra en los países en desarrollo. 52

53 ICRISAT - Instituto Internacional de Investigación de Cultivos para las Zonas Tropicales Semiáridas, Patancheru, Andhra Pradesh, India. Fundado en Se ocupa del mejoramiento de las plantas cultivadas y de los sistemas de cultivo del sorgo, el mijo, el garbanzo, el guandú y el maní. IIMI - Instituto Internacional de Ordenación del Riego, Colombo, Sri Lanka. Fundado en Se ocupa de la mejora del riego en los países en desarrollo. IIPA - Instituto Internacional de Investigaciones sobre Políticas Alimentarias, Washington, D.C., EE.UU. Fundado en Se ocupa de las políticas alimentarias y la investigación socioeconómica relativa al desarrollo agrícola y la creación de instituciones en países en desarrollo. IIRF - Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos, Roma. Fundado en Conservación de acervos génicos de cultivos y forrajes. IITA - Instituto Internacional de Agricultura Tropical, Ibadán, Nigeria. Fundado en Se ocupa del mejoramiento de los cultivos y la ordenación de la tierra en las zonas tropicales húmedas y subhúmedas y de los sistemas de cultivo de maíz, yuca, caupí, plátano, soja, arroz y ñame. ILRI - Instituto Internacional de Investigación sobre el Ganado, Addis Abeba, Etiopía, y Nairobi, Kenya. Fundado en Investigación para mejorar la productividad del ganado y la sanidad animal, teniendo a su cargo el programa de investigación sobre el ganado de todo el sistema del GCIAI. IRRI - Instituto Internacional de Investigación sobre el Arroz, Manila, Filipinas. Fundado en Investigación sobre el mejoramiento mundial del arroz. ISNAR - Servicio Internacional para la Investigación Agrícola Nacional, La Haya, Países Bajos. Se ocupa del fortalecimiento y mejoramiento de los sistemas nacionales de investigación agrícola. 53

54 Unidad 5. Herencia Cuantitativa. Introducción Naturaleza de los caracteres cuantitativos. La Genética Cuantitativa tiene por objeto el estudio de la herencia de las diferencias entre los caracteres. Los caracteres cuantitativos están determinados generalmente por muchos genes y la segregación simultánea de ellos da como resultado un rango de genotipos que se distribuyen en forma semejante a una distribución normal. En 1909 W. Johansen introdujo la importante diferencia entre genotipo y fenotipo, al plantear la teoría de la línea pura. El fenotipo de un organismo es su apariencia, lo que nosotros podemos observar y el genotipo es la constitución genética que ha heredado. Durante la vida de un individuo, el fenotipo puede cambiar, mientras que el genotipo permanece constante. Esta variación también incluye los efectos del ambiente sobre la expresión fenotípica de un genotipo, dando un rango de variación que permite la acción seleccionadora del hombre, favoreciendo formas o ideotipos determinados (tabla 5.1). Esto lo demostró Nilsso-Elhe al plantear su hipótesis de los factores múltiples, mostrando experimentalmente la segregación de genes que afectaban el color de granos en trigo. De estas experiencias se comprobó que la variación contínua está ocasionada por: El número de pares génicos que segregan Las variaciones debidas al ambiente TABLA 5.1: Comparación entre caracteres cualitativos y cuantitativos. Caracteres Cualitativos Caracteres Cuantitativos Número de Genes Análisis Influencia Ambiental Acción génica El carácter está regido por uno o pocos genes, denominados genes mayores u oligogenes. Se analizan por conteo o por pruebas como la de Chi cuadrado Están poco influenciados por el ambiente Están afectados por ligamientos, epistasis y pleitropismo Muchos genes, genes menores o poligenes Se analizan mediante parámetros poblacionales: media, varianza, desvíos, coeficiente de variación, covarianza. Muy afectados por el ambiente, un mismo genotipo puede variar su expresión en diferentes ambientes. Existe ligamiento, epistasis y pleiotropismo, pero resulta difícil su determinación. 54

55 Los caracteres que tienen mayor importancia desde el punto de vista del mejoramiento genético pueden evaluarse con eficiencia a través de medidas de escala continua y que pueden ser representados por su media y la dispersión de los mismos Principios básicos. Efectos genéticos y ambientales sobre los caracteres cuantitativos De acuerdo a la Genética Mendeliana si se conocen las interacciones alélicas para un gen en particular, se puede emplear el genotipo para predecir el fenotipo. Si una característica está controlada por un solo gen tenemos tres genotipos posibles AA, Aa y aa y dependiendo de las interacciones alélicas (dominancia total o dominancia incompleta) podemos tener dos o tres fenotipos. A medida que aumenta el número de genes que controlan una característica tendremos un número cada vez mayor de genotipos. Para predecir el número de genotipos posibles a partir del número de genes que controlan el carácter, se emplea la fórmula: 3 n, siendo n el número de genes involucrados. En la tabla 1 se muestran los genotipos posibles para un número dado (n) de genes que controlan una característica cualquiera. Tabla 5.2. Genotipos posibles de acuerdo a número de genes involucrados empleando la fórmula 3 n. Número de genes Número de genotipos Si disponemos de dos genes: A y B, y les asignamos valores arbitrarios a cada uno, por ejemplo: el alelo A contribuirá con 4 unidades mientras que el alelo a proveerá 2 unidades. En el otro locus, el alelo B contribuirá con 2 unidades y el alelo b proveerá 1 unidad. Con dos genes controlando una característica tendremos 9 genotipos posibles. En la tabla 2 vemos los genotipos y los valores métricos asociados a cada uno. Tabla 5.3. Genotipos, frecuencias y valores métricos para una característica controlada por dos genes. Genotipo Proporción en la F2 Valor métrico AABB 1 12 AABb 2 11 AAbb 1 10 AaBB 2 10 AaBb 4 9 Aabb 2 8 aabb 1 8 aabb 2 7 aabb

56 Frecuencia Mejoramiento Genético Vegetal: Principios y Procedimientos Estos resultados pueden representarse gráficamente: Genotipos Figura 5.1. Distribución de frecuencias de los genotipos de la tabla 5.3 Esta figura posee la forma de campana indicadora de una distribución normal, y este hecho tiene importantes implicancias en la manera en que se analizan los caracteres cuantitativos. El ejemplo en particular, demuestra una acción génica aditiva, y esto significa que cada alelo tiene un valor específico que contribuye al fenotipo final. Es así que cada genotipo tiene un valor métrico que difiere levemente de los otros, y resulta en una distribución (o curva) de valores métricos que se aproxima a una curva de valores continuos. Existen otras interacciones génicas entre los caracteres cuantitativos tales como la dominancia o la epistasis que afectan el fenotipo. Por ejemplo si una acción génica dominante controla una característica, entonces el homocigota dominante y el heterocigota tendrán un valor fenotípico igual. Por lo tanto el número de fenotipos es menor que para la acción génica aditiva. El número de fenotipos que resultan de genotipos específicos se reducirá aún más si existen interacciones epistáticas entre los distintos loci que afectan al fenotipo. Los efectos aditivos, dominantes o epistáticos pueden contribuir al fenotipo de un carácter cuantitativo, pero generalmente las interacciones aditivas son las más importantes. Todos los factores mencionados son de naturaleza genética pero también existen factores ambientales que afectan a los caracteres cuantitativos. El efecto primario del ambiente es el de cambiar el valor para un genotipo en particular. Si usamos el ejemplo anterior, el valor del genotipo AaBb puede variar entre Esta variación sería el resultado de los diferentes ambientes en que creció el genotipo. La consecuencia de estos efectos ambientales es que la distribución de la frecuencia fenotípica se asimila aún más a una distribución normal. Segregación Transgresiva Los caracteres poligénicos pueden presentar lo que se denominan segregaciones transgresivas. Estas consisten en la aparición en la F2 de individuos con mayor valor que el padre de mayor valor o menor valor que el padre de menor valor. Supongamos un carácter determinado por cinco loci cada uno de los cuales tiene dos alelos posibles, los alelos denominados con letras mayúsculas suman un valor de 2 (dos) al carácter y los denominados con letras minúsculas suman un valor de 1 (uno). 56

57 El genotipo AAbbccDDEE tendrá un valor de 16 y el genotipo aabbccddee 14. Si se cruzan ambos genotipos: Padres AAbbccDDEE x aabbccddee F1) AaBbCcDdEe 15 La F1 resulta intermedia entre ambos padres y en F2 observaremos una gama de fenotipos, algunos presentarán valores que superan al padre de mayor valor y otros tendrán menor valor que el padre de menor valor. F2) AABBCCDDEE.AABBCcDDEE....aaBbccddee.aabbccddee En la F2, uno de 243 individuos presentará un valor igual a 20 y uno igual presentará el valor 10. Componentes genéticos de medias. Las propiedades genéticas de una población se expresan a través de las frecuencias génicas y genotípicas. Para los caracteres métricos o cuantitativos se considera el concepto de valor, el cual se expresa en las unidades en que se mide el carácter (ejemplo: cm para el carácter longitud de espiga, Kg para el peso, etc.). Cuando se mide el carácter de un individuo, el valor observado es el valor fenotípico. A partir de estos valores fenotípicos se calculan los parámetros como medias, variancias y covariancias, que se emplean en el análisis. Para analizar las propiedades genéticas de una población se particiona el valor fenotípico en partes atribuibles a diferentes causas. Cada parte del valor fenotípico (P), tiene un determinado significado. La primera división que se hace de P es en componentes atribuibles al genotipo y aquellos atribuibles al ambiente. El genotipo es el arreglo particular de genes que presenta el individuo y el ambiente son todas las causas no genéticas que influyen en el fenotipo. Genotipo y ambiente son los únicos determinantes del fenotipo. El genotipo es el responsable del valor al individuo y el ambiente causa una desviación, en más o en menos, de dicho valor. La desviación ambiental media de la población en su conjunto, se considera igual a cero, debido a que el ambiente actúa favoreciendo a algunos de los individuos y desfavoreciendo a otros. En el promedio los efectos del ambiente se anulan, la suma de las desviaciones debe ser igual a 0. Así el valor 57

58 fenotípico medio se considera igual al valor genotípico medio. La expresión media de la población se refiere tanto al valor fenotípico como genotípico. Si idealmente no existieran cambios en la influencia ambiental, es decir el ambiente permanecira constante, la media de la población permanecerá constante de generación en generación en ausencia de cambios genéticos. El valor genotípico no es medible en situaciones experimentales, sino que se trata de inferir a través del valor fenotípico. Para el estudio de los caracteres métricos o cuantitativos, emplearemos un modelo asignando valores arbitrarios a los genotipos. Considerando un locus simple, con dos alelos posibles A y a (A es el alelo que aumenta el valor del carácter). Se denomina al valor del genotipo de A A a ó +a ; al de aa -a y al heterocigota d. Estos valores son tomados como desvíos respecto del valor medio entre los dos homocigotas o punto de origen del segmento que a continuación se grafica: Genotipos A A Aa aa Valores genotípicos -a d +a PM El punto de origen o valor cero del segmento, corresponde al punto medio entre los individuos homocigotas. El valor d depende del grado de dominancia: - d = 0 si no hay dominancia y el valor del heterocigota es igual a la media entre los dos homocigotas - d positivo si A domina sobre a - d negativo si a domina sobre A - d = a si hay dominancia completa de A - d = -a si hay dominancia completa de a - d mayor que a si hay sobredominancia hacia el alelo A - d menor que a si hay sobredominancia hacia el alelo a. - - El grado de dominancia puede expresarse como: - - GD = d / a Para caracterizar una población se debe determinar su valor medio y estimar los valores que pueden obtenerse a partir de ella. Es necesario conocer los componentes de esos valores. Se tienen en cuenta los efectos de aditividad y dominancia, excluyendo los efectos de epistasia, pleiotropismo u otro tipo de interacción génica para simplificar el análisis. Es necesario establecer que los efectos aditivos son aquellos determinados por los valores de los individuos 58

59 homocigotas con respecto a la media de la población. Constituyen los desvíos de los individuos homocigotas con respecto al punto medio. Los efectos de dominancia implican los desvíos respecto a la media de la población, manifestados por la generación F1. Sean dos genotipos con valores distintos para la expresión del carácter: P1 y P2, el punto medio será: Los efectos aditivos a = P1 PM Los efectos de dominancia = F1 PM Tipos de efectos génicos Existen cuatro tipos de acción génica: aditiva, epistática, dominancia y sobredominancia. Debido a que los efectos génicos no siempre caen en categorías bien definidas, y que los caracteres cuantitativos están regidas por genes con efectos pequeños individuales, a menudo se describen por su acción génica en lugar de por el número de genes por el cual ellos están codificados. Debe señalarse que la expresión acción génica es la misma para genes mayores como para los genes menores, la diferencia esencial es que la acción de un gen menor es pequeña y significativamente influenciada por el ambiente. Acción Génica Aditiva El efecto de un gen es aditivo cuando cada gen adicional aumenta la expresión del rasgo por incrementos iguales. En consecuencia, si un gen añade una unidad a un rasgo, el efecto de aabb = 0, Aabb = 1, AABb = 3 y AABB = 4. Para un solo locus (A, a) el heterocigoto sería exactamente intermedio entre los padres (es decir, AA = 2, Aa = 1, aa = 0). Es decir, el rendimiento de un alelo es el mismo independientemente de otros alelos en el mismo locus. Esto significa que el fenotipo refleja el genotipo en acción aditiva, suponiendo la total ausencia del efecto ambiental. Efectos aditivos se aplican a la relación alélica en el mismo locus. Además, un fenotipo superior se mostrará también superior en la próxima generación, haciendo más eficaz la selección para el carácter. La selección es más eficiente si solo existe varianza aditiva; pues se puede fijar por selección, por ejemplo al desarrollar una línea pura. Efecto Aditivo Considere un gen con dos alelos (A, a). Cada vez que el alelo A reemplaza al alelo a, se agrega un valor constante para el genotipo. Al reemplazar a por A en el genotipo aa causa un cambio de una de las unidades. Cuando ambos aa son reemplazados, el genotipo es 2a unidades de aa. 59

60 AA PM Aa aa +a -a d El valor medio (promedio) entre los dos progenitores homocigóticos está dada por el PM (representando a un efecto combinado de ambos genes para que los padres que poseen alelos similares y silmilar influencia ambiental). Esto también sirve como punto de referencia para medir las desviaciones de los genotipos. De acuerdo a esto: AA = PM + a A aa = PM - a y Aa = m + d A Donde aa es el efecto aditivo del alelo A, y d el efecto de dominancia. Este efecto sigue siendo el mismo independientemente del alelo con la cual se combina. Efecto promedio En una población de apareamiento al azar, se utiliza el término efecto promedio de alelos porque no hay líneas homocigóticas. En cambio, los alelos de una planta se combinan al azar con los alelos del polen para mediante la hibridación generar la progenie. En efecto, el alelo de interés reemplaza su forma alternativa en un número de individuos al azar en la población. El cambio en la población como resultado de esta sustitución constituye el efecto promedio del alelo. En otras palabras, el efecto promedio de un gen es la desviación promedio de la población media de los individuos que recibieron un gen de uno de los padres, mientras que el gen del otro padre vino al azar de la población. Valor de Cría Los efectos promedio de los genes de los padres determinarán el valor genotípico promedio de la progenie. El valor de un individuo en base al valor promedio de su progenie se llama el valor de cría del individuo. Este es el valor que se transfiere de un individuo a su progenie. Este es un efecto medible, a diferencia del efecto promedio de un gen. Sin embargo, el valor de cría debe estar siempre con referencia a la población a la cual un individuo pertenece. Desde un punto de vista práctico del mejoramiento, el efecto de genes aditivos es de mayor interés para los mejoradores debido a su comportamiento es previsible, produciendo mejoras que aumentan linealmente con el aumento del número de alelos favorables en la población. 60

61 El valor de cría (también llamado valor reproductivo o breeding value) puede ser medido. Si se aparea un individuo con otros individuos en forma aleatoria dentro de la población, su valor de cría es igual al doble de la desviación estándar de la progenie: VC = 2σ p Es el doble dado que el progenitor contribuye con la mitad de los genes en la progenie, los otros genes provienen al azar de la población. Acción Génica de Dominancia La acción génica de dominancia describe la relación de los alelos en el mismo locus. La varianza de dominancia tiene dos componentes: la varianza debida a alelos homocigóticos (que es aditivo) y la varianza debido a valores genotípicos heterozigóticos. Los efectos de dominancia son desviaciones de aditividad que hacen que el heterocigoto se asemeja a uno de los padres más que al otro. Cuando la dominancia el completa, el valor del heterocigoto es igual que el homozigoto de efectos (por ejemplo, Aa = AA). Esto implica que el mejorador no puede distinguir entre los fenotipos heterozigóticos y homocigóticos. En consecuencia, ambos tipos de plantas serán seleccionados, y en la próxima generación los homocigotas no segregarán (true breeding) mientras que los heterocigotos segregarán, es decir, lafijación de genes superiores será menos eficaz cuando exista acción génica de dominancia. Efecto de Dominancia El grado de dominancia (da) se calcula como la desviación del heterocigoto, Aa, del promedio o punto medio (PM) de los dos homocigotos (AA, aa). Además, da = 0 cuando no hay dominancia, mientras que d es positivo si A es dominante y negativo si a es dominante. Además, si la dominancia es completa d A =a A, mientras que da < aa de dominancia incompleta (parcial) y da > aa si hay sobredominancia. Para un solo locus: m = 1/2(AA + aa) aa = 1/2(AA aa) da = Aa 1/2(AA + aa). Acción Génica de Sobredominancia La acción génica de sobredominancia existe cuando cada alelo en un locus produce un efecto independiente sobre el fenotipo, y su efecto combinado excede el efecto independiente de los alelos (aa = 1, AA = 1, Aa = 2). Desde el punto de vista del mejoramiento, el criador puede fijar los efectos de 61

62 sobredominancia solamente en la primera generación (es decir, cultivos de híbridos F1) mediante la clonación o apomixis o a través de la duplicación cromosómica. Acción Génica de Epistasia Los efectos epistáticos en características cualitativas a menudo se describen como el enmascaramiento de la expresión de un gen por uno en otro locus. En la herencia cuantitativa, epistasis se describe como la interacción de genes no alélicos. Cuando dos genes interactúan, puede producirse un efecto cuando no había ninguno (por ejemplo, Aabb = 0, aabb = 0, pero A B = 4). La estimación de la acción génica o varianza genética requiere el uso de grandes poblaciones y un diseño de apareamiento específico (Análsis de medias generacionales). Media de la población Las frecuencias génicas influyen en la media del carácter en la población. De acuerdo a esto, si p y q son las frecuencias de A y a respectivamente: Genotipo Frecuencia Valor Frecuencia x Valor AA p2 a a p2 Aa 2pq d d 2pq aa q2 -a -a q2 M = a p 2 + d 2pq + q 2 (-a) El valor medio de la población se obtiene multiplicando el valor de cada genotipo por su frecuencia y sumando luego los resultados de los tres genotipos. M = a p 2 + d 2pq + q 2 (-a) = a (p 2 q 2 ) + 2dpq = a (p + q) (p q) + 2dpq Como (p + q) = 1 Entonces: M = a (p q) + 2dpq M representa el valor genotípico medio como también el valor fenotípico medio de la población para el carácter bajo estudio. Para cada locus la contribución a la media de la población tiene dos términos: a ( p q ) atribuible a los homocigotos 62

63 2 d p q atribuible a los heterocigotos. Componentes de la variancia fenotípica y su estimación. La descripción de la variación fenotípica es el punto de partida para el análisis de un carácter poligénico. La variación de estos caracteres es de naturaleza contínua y, por lo general, las observaciones o medidas forman una población cuya distribución corresponde a la curva normal. Las medidas mas importantes que se usan para describir una población son la media y la varianza. Como ya se describió el fenotipo es función del genotipo y del ambiente que se expresa en forma lineal como: P = G + E Sin embargo, los efectos del genotipo y del ambiente no son independientes. La respuesta fenotípica a un cambio en el ambiente no es la misma para todos los genotipos. Esta variación en la respuesta fenotípica se denomina interacción genotipo-ambiente. Incluyendo este término en la ecuación anterior nos queda: P = G + E + (GE) Un efecto importante de la interacción GE es el reducir la correlación entre fenotipo y genotipo, lo cual complica las inferencias sobre el valor genotípico a partir del fenotipo. Los efectos genotípicos y ambientales normalmente se expresan como desviaciones en la media de la población,, por lo tanto, la expresión anterior se transforma en: P - = (G - ) + (E - ) + (G - ) (E - ) P - = g + e + ge Las desviaciones de la media generalmente se representan por letras minúsculas. De esta manera se establece un modelo lineal para representar el fenotipo, el cual generalizamos al agregar los subíndices i y j. P ij = + gi + ej + (ge)ij Dados que los efectos gi, ej y geij se definen como desviaciones de la media, es obvio que la suma de ellos debe ser igual a cero, esto es: i gi = j ej = i j (ge)ij = 0 63

64 Consideremos una población de n variedades (genotipos) que son sembradas en m ambientes. Si pij es el valor de un atributo fenotípico (ej.: rendimiento en grano), que muestra el i-ésimo genotipo en conjunción con el j-ésimo ambiente, habrá un total de mn valores fenotípicos, que pueden organizarse en una tabla factorial e dos entradas tal como se muestra en el siguiente ejemplo (tablas 5.4 y 5.5): Tabla 5.4. Peso en gramos de 100 semillas de cuatro cultivares de soja sembrada en cuatro ambientes. Ambientes Total Media Desviación Genotipos e1 e2 e3 e4 Gi gi G1 22,4 25,1 28,5 28,0 104,0 26,0 5,0 G2 22,6 23,7 23,0 23,1 92,4 23,1 2,1 G3 19,0 23,0 20,0 20,8 82,8 20,7-0,3 G4 12,8 13,4 14,5 16,1 56,8 14,2-6,8 Total 76,8 85,2 86,0 88,0 336,0 0 Media ej 19,2 21,3 21,5 22,0 21,0 Desviación ej -1,8 0,3 0,5 1,0 0 Tabla 5.5. Fenotipos expresados como desviaciones de la media e1 e2 e3 e4 Suma G1 1,4 4,1 7,5 7,0 20,0 G2 1,6 2,7 2,0 2,1 8,4 G3-2,0 2,0-1,0-0,2-1,2 G4-8,2-7,6-6,5-4,9-27,2 Suma -7,2 1,2 2,0 4,0 0 La varianza fenotípica ( 2 P ) se puede calcular directamente a partir de las desviaciones de la tabla 2. 2 P = (Pij - ) 2 /m.n = P 2 ij/mn n = genotipos; m = ambientes. 2 P = 1/16 [ (1,4) 2 + (4,1) 2 + (7,5) 2 + (7,0) 2 + (1,6) (-4,9) 2 ] 2 P = 21,4113 La varianza genotípica ( 2 g), la ambiental ( 2 x ) y la de interacción ( 2 gx ), se calculan a partir de las desviaciones de las tablas 1 y 2 de la siguiente manera: 2 g = gi 2 /n = (5,0) 2 + (2,1) 2 + ( 0,3) 2 + ( 6,8) 2 / 4 = 18, e = xj 2 /m = (-1,8) 2 + (0,3) 2 + (0,5) 2 + (1,0) 2 / 4 = 1, ge = 2 P - 2 g - 2 e = 21, ,9350 1,1450 = 1,

65 La partición de la varianza en sus componentes genéticos y amientales nos permite estimar proporción de varianza genética total o de su componente aditivo en relación al fenotipo. Esto es muy importante en mejoramiento genético pues, nos permite estimar la heredabilidad, el cual es un parámetro que se utiliza para impotantes decisiones en el mejoramiento como lo son la elección del método de selección, la medición de la respuesta a la selección y la conformación de un criterio de selección, entre las aplicaciones más importantes. Bibliografía Falconer, D. S., Introducción a la genética cuantitativa. CECSA, Méjico. 65

66 Unidad 6. Heredabilidad. La heredabilidad es la proporción de la variación fenotípica que es atribuible a causas genéticas. Los componentes de la variación fenotípica que hemos visto en la unidad anterior nos van a permitir calcular la heredabilidad en diferentes situaciones experimentales. Hay dos formas o tipos de heredabilidad: la heredabilidad en sentido amplio y en sentido estricto. La heredabilidad en sentido amplio se refiere que proporción de la varianza genética está contenida en la varianza observable en la población. A esta determinación se le conoce indistintamente como heredabilidad en sentido amplio (H), porcentaje de variación genética (%Vg) o grado de determinación genética (GDG). Tal como se presenta, esta estimación puede asumir valores entre 0 y 1. Alcanza valores próximos a 0, cuando no existe V G y la variación presente se atribuye al ambiente. Esto es, por ejemplo, dentro de una única línea pura. El %Vg puede tener un valor cercano a 1, cuando toda la variación observada está originada en diferencias genéticas y no hay efecto ambiental. Esto podría verse en un conjunto de isolíneas, diferenciadas por una serie alélica para un único locus. Este tipo de estimación (%Vg), es útil en los casos de selección en una población de individuos no segregantes. Una población heterogénea homocigota en autógamas o una población de propagación asexual, donde cada individuo transfiere a su descendencia todo su genotipo. Cuando la selección se realiza sobre material segregante, se requiere una estimación más específica. Las poblaciones segregantes son aquellas que están en proceso de endocría. En las autógamas, luego de un cruzamiento entre dos o más progenitores, las descendencias segregan formas recombinantes a la vez que aumentan paulatinamente su porcentaje de homocigosis. Mientras que en las alógamas un proceso análogo ocurre cuando se forman líneas endocriadas o cuando se aplican métodos de mejoramiento de poblaciones. En estos casos la determinación de heredabilidad se basa en relacionar cuanto de la varianza aditiva (V A ) está disponible en la varianza observable o fenotípica (VP) y se denomina heredabilidad en sentido estricto (h 2 ). Dado que la varianza aditiva es la que se puede fijar por selección, la heredabilidad en sentido estricto es considerada la verdadera heredabilidad. Métodos de Estimación Existen varias metodologías para la estimación de la heredabilidad. Dependiendo del material y, si la estimación es intrageneracional o intergeneracional, podremos calcular la heredabilidad en sentido amplio o estricto. Como la heredabilidad en un cociente entre varianzas, cualquier 66

67 metodología que permita estimar los componentes de varianza de una población permitirá estimar la heredabilidad. Veremos los siguientes métodos de estimación de la heredabilidad: Componentes de Varianza La varianzas para la estimación de la heredabilidad pueden ser obtenidas a partir de un análisis de varianza, por ejemplo si disponemos de un conjunto de líneas puras en un arreglo experimental con repeticiones tendríamos una tabla de ANAVA como: F.V. gl SC CM F E(CM) Líneas (entre) L-1 SCL CML CML/CME σ 2 E + n. σ 2 L Error (dentro) N-L SCE CME σ 2 E Total N-1 En un ANAVA correspondiente a un ensayo en varios ambientes, la esperanza matemática del cuadrado medio del factor genotipos será un estimador de la variancia genética (VG) en poblaciones alógamas, y de la variancia aditiva (VA) en el caso de autógamas (siempre que sean líneas puras). La estructura del ANAVA para un ensayo con "g" genotipos (en este caso familias) en "a" ambientes (localidades, años o localidades y años), es como sigue: Fuente de variación G.L. C.M. E(CM) Ambientes (a-1) Rep/Ambientes a(r-1) Familias (g-1) M 1 2 e + r. 2 ga + r.a 2 g Familias x Ambientes (g-1)(a-1) M 2 2 e + r. 2 ga Error a(g-1)(g-1) M 3 2 e Los estimadores de 2 e (variancia del error), 2 ga (variancia de familias o genotipos por ambientes), 2 g (variancia de genotipos), 2 p (variancia fenotípica) y heredabilidad, se obtienen de la siguiente manera: 2 e = M3 2 ga = (M2-M3)/r 67

68 2 g = (M1-M2)/r.a 2 p = 2 e + 2 ga + 2 g h 2 = 2 g / 2 p Método de Regresión Progenie Progenitor Se toma una muestra al azar representativa de individuos de la población a analizar, se mide el carácter de interés y se cosechan individualmente. Las descendencias individuales (hijos o progenies) de cada planta se siembran individualmente y miden en la generación siguiente. Los valores medios del carácter observado en la progenie (y) se regresiona con los respectivos valores de uno o de los dos padres (x). La ecuación de la recta que marca la tendencia de esta relación es Y = a+b.x, en donde a es la ordenada al origen y bi es el coeficiente de regresión lineal. Este coeficiente resulta de la relación entre la covarianza entre padres e hijos y la varianza de los progenitores. La covarianza entre padres e hijos es un estimador que representa la mitad de la varianza aditiva (½Va). La varianza de los progenitores, en razón de ser una muestra representativa de la población original, se constituye en un estimador de la varianza fenotípica. Regresión sobre un progenitor bi= coeficiente de regresión Cov op = ½ σ 2 A σ 2 p = σ 2 fenotipica Regresión sobre el promedio de ambos progenitores 68

69 Cuando el valor medio de cada progenie se regresiona el valor promedio de dos padres (P 1 + P 2 )/2, se interpreta que la varianza de los promedios de todos los progenitores de la muestra representan a la mitad del de la varianza fenotipica, por lo cual ahora la heredabilidad es directamente igual a bi. Método de Correlación Intraclase Esta metodología se centra en la comparación de grupos de individuos de tal manera que mediante la estimación de la variación entre y dentro de ellos permita estimar la h 2. Estos grupos pueden ser familias de medios hermanos o hermanos completos que son obtenidas a partir de la población que se pretende caracterizar. El análisis considera la variación entre las familias como asi también la variación dentro de cada familia. Podemos expresar el grado de parecido entre parientes como la proporción de la variancia entre grupos o famílias con respecto al total de la variancia de la población, y esto es denominado Coeficiente de Correlación Intraclase (t) σ 2 b: Varianza entre familias σ 2 w: Varianza dentro de familias Cuanto mayor sea la similitud dentro de los grupos mayor será la diferencia entre los grupos Familias de medios hermanos (MH) Consideramos un individuo cualquiera de la población que actúa como macho, que se combina aleatoriamente con otros individuos (hembras) de la población. Estas progenies están relacionadas entre sí por un padre común, es decir que son medios hermanos. (Frecuencias génicas de 0,5). El coeficiente de correlación intraclase (t) es igual a ¼ de la h 2. Por lo tanto: Familias de hermanos completos (HC) h 2 = 4.t MH 69

70 Estas familias se producen por el apareamiento de a pares de plantas de la población. El coeficiente de correlación intraclase (t) es igual a 1/2 de la h 2. Por lo tanto (en ausencia de dominancia): h 2 = 2.t HC El coeficiente t puede tomar valores entre 0 y 1 Si t = 1 no hay variación dentro de las familias Si t = 0 todas las familias tienen la misma media y hay variabilidad solo dentro de las familias Si t = 0,5, el 50% de la variación total es causada por diferencias entre las medias de familias y el 50% restante se debe a la variación de los individuos alrededor de la media de su familia. Tabla. Resumen de las estimaciones de h 2 correlación basadas en la regresión y Método Regresión (b) o correlación intraclase (t) Progenie y un parental bi = ½ h 2 Progenie y media de los parentales bi = h 2 Grupos de medios hermanos t = ¼ h 2 Grupos de hermanos completos t = ½ h 2 Método de las Retrocruzas. Esta metodología emplea las medias y varianzas del carácter en estudio estimadas sobre dos líneas parentales, su F1, F2 y las retrocruzas R1 (F1 x P1) y R2 (F1 x P2). Todos los genotipos se llevan a experimentación en uno o varios ambientes. A partir de los datos fenotípicos se calculan las medias y varianzas y se calculan los compenentes de la varianza: 70

71 σ 2 A: Varianza aditiva σ 2 d: Varianza de dominancia σ 2 E: Varianza ambiental σ 2 G: Varianza genética La principal desventaja de este método es el número de generaciones necesarias para obtener las seis poblaciones (P 1, P 2, F 1, F 2, RC 1 y RC 2 ). Además para estimar las varianzas cada generación debe estar representada por un número alto de individuos. Factores que afectan la estimación de la heredabilidad. La heredabilidad es un parámetro que corresponde a un carácter en una población dada, que se desarrolla en un ambiente particular. Esto quiere decir que un mismo carácter en dos poblaciones distintas puede mostrar distintos valores de heredabilidad, por ejemplo la estimaciones de h 2 a partir de una F2 serán diferentes comparados con la estimaciones realizadas en une F6. Un mismo carácter en una misma población puede tener distinta heredabilidad cuando lo que cambia es el ambiente (localidad, año, sequía, etc.). La selección puede cambiar la heredabilidad al actuar intencionalmente sobre la variabilidad genética de una población. El método de estimación de la h 2 puede influir sobre la cuantificación de la heredabilidad. Debido que no se pueden medir todos los individuos de una población es necesario tomar una muestra al azar de la población y sobre ella estimar la h 2. Aplicaciones de la heredabilidad. La estimación de la heredabilidad nos indica que, si ella es lo suficientemente alta en el carácter objeto de selección podremos emplear métodos basados en el fenotipo como la selección masal, pero, si la h 2 es moderada o baja se deberán emplear métodos basados en la selección familiar o de la evaluación de la descendencia para que la selección sea eficiente. El otro propósito muy importante de la estimación de heredabilidad es comparar las ganancias genéticas esperadas a partir de diferentes estrategias de selección. Se pueden emplear las estimaciones de h 2 para predecir la ganancia por selección basada en valores de parcelas sin repeticiones y compararla con la ganancia si los materiales son repetidos en varios ambientes. Las estimaciones de h 2 son útiles para comparar la ganancia bajo diferentes diseños experimentales con variable número de repeticiones, años de evaluación y localidades que pueden ser empleados para la óptima asignación de recursos en un programa de mejora. Cuando la interacción genotipo x ambiente causa cambios de orden significativos entre los genotipos evaluados en diferentes ambientes, la h 2 basada sobre las medias de todos los ambientes pueden ser comparadas con 71

72 la h 2 calculada en base a ambientes particulares para determinar la elección del ambiente de selección más conveniente. La estimación heredabilidad basada en diferentes estructuras familiares derivadas de la misma población pueden ser comparadas para determinar que tipo de familia permitirá la máxima ganancia genética. Como la heredabilidad varía entre poblaciones diferentes, la h 2 estimada puede ser útil para elegir la mejor población base en la cual la selección será más efectiva. La heredabilidad estimada para diferentes caracteres en una misma población, conjuntamente con la estimación de la correlación genética entre los caracteres, se puede emplear en esquemas de selección indirecta. Bibliografía Allard, R W, Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona. Falconer, D. S., Introducción a la genética cuantitativa. CECSA, Méjico. Mariotti, J. A., Fundamentos de genética biométrica. Aplicaciones al mejoramiento genético vegetal. O.E.A. Serie de biología, monografía nº 32. Washington, D.C. 72

73 Unidad 7. Generación de Variabilidad La existencia de variabilidad genética es primordial para el éxito de todo programa de mejoramiento. Esta variabilidad puede ser natural o generada artificialmente mediante diversos procedimientos. A continuación se describen algunas metodologías para el aprovechamiento de la variabilidad natural y para la generación de variabilidad en forma artificial. Empleo de los recursos genéticos en el mejoramiento. Una vez identificado y adquirido el recurso genético, existen alternativas para su empleo: Introgresión Comprende la transferencia específica de uno o varios genes de un recurso genético a un material de cría. Apunta a mejorar una característica cualitativa de alta heredabilidad como, por ejemplo, la resistencia a una enfermedad o genes restauradores de la fertilidad. El método regularmente empleado es la retrocruza. El método varía en su complejidad dependiendo si los genes son dominantes o recesivos. Incorporación Es el desarrollo de nuevas y altamente variables poblaciones a partir de los recursos genéticos con un nivel aceptable de comportamiento. El objetivo es ampliar o enriquecer la base genética para caractres cuantitativos. El método dependerá si la especie es autógama o alógama. Inicialmente la selección se concentra en caracteres de alta heredabilidad dejando los productivos para etapas mas tardías. Se trata de maximizar la diversidad y recombinación empleando una intensidad de selección mínima. Premejoramiento Acciones básicas que se llevan a cabo para que un material de difícil adaptación o uso directo pueda ser incorporado a un programa de mejoramiento. Los materiales silvestres, exóticos o aquellos derivados de cruzas intergenéricas o interespecíficas, generalmente requieren de metodologías de fertilización especiales como rescate de embriones o cruzas puentes. Transferencia de genes Comprende la transformación genética mediante la introgresión de genes mediante biotecnología, donde las técnicas son independientes de las barreras a la hibridación. Los pasos necesarios son: la identificación y aislamiento del gen de interés, el clonado del gen, la transferencia y expresión del mismo en la especie de interés. 73

74 Selección de progenitores y estrategias de cruzamientos. Una de las necesidades más importantes en un programa de mejora genética de plantas de cualquier especie, es disponer del material sobre el cual seleccionar. A este material inicial se le llama población original o población base, o germoplasma parental. El material inicial se debe seleccionar sobre la base de un claro entendimiento de los objetivos del proyecto de cría. Aquí, se pueden considerar dos posibilidades: a. La existencia de una población con suficiente variabilidad genética para el o los caracteres a seleccionar, o bien b. la necesidad de conformar una población base a recombinación de germoplasma parental. Frente a la necesidad de crear una población inicial, el camino es el cruzamiento entre germoplasmas. En esta instancia se debe analizar la posibilidad de: a. Recombinar variedad o cultivares, que contengan diferencias heredables entre y dentro de ellas. Esto se realiza con la presunción de que la recombinación por si misma aumenta la variabilidad genética de todos los caracteres. Esta manera de generar la población base ha sido utilizada en los antiguos programas de mejora. b. Cruzar progenitores por caracteres específicos. En este caso los padres a recombinar se eligen por que tienen aspectos fenotipitos similares para algunos caracteres agronómicos (altura de planta, precocidad, color de granos, etc.) pero, además se conoce que ellos aportan caracteres que se desean reunir en la nueva variedad. Esto es el procedimiento que se utiliza en los métodos actuales de mejora clásica. c. Cruzar progenitores por genes específicos. Este es el caso en que se recombinan padres por que aportan un gen determinado. Si bien esto se incluye en la mejora clásica para la transferencia de genes simples, su concepto también incluye las técnicas modernas de transferencias de material hereditario por biotecnología. a. Identificación de los caracteres en función de la necesidad. Los objetivos generales del Mejoramiento Genético Vegetal son aumentar el rendimiento, la resistencia a factores adversos y la calidad. No obstante se plantean ciertos objetivos específicos como la altura de despeje en soja, el color de garbanzo para exportación, sabor y color en frutales. De todas 74

75 maneras, cualquier objetivo en un programa de mejora se debe basar en responder a las necesidades de los productores y de la sociedad. 17.b. Cantidad de caracteres a mejorar. La probabilidad de éxito en el desarrollo de un programa de mejora genética aumenta cuando mas caracteres se consideran simultáneamente. Sin embargo, en la práctica es necesario asignar prioridades a los caracteres con el fin de seleccionar solo los mas importantes. Esto se debe a que, en la población recombinante, la probabilidad de aparición de un individuo que reúna la expresión deseada para caracteres que aportan los padres, será igual al producto de las probabilidades de aparición de cada caracteres en su respectiva población parental. Así, por ejemplo, en la tabla siguiente se detallan 4 poblaciones parentales (A, B, C y D), portadoras respectivamente de la expresión deseada de un carácter de interés (C1, C2, C3 y C4) y su respectiva frecuencia genotípica. POBLACIÓN CARÁCTER FRECUENCIA A C1 1/10 B C2 1/20 C C3 1/100 D C4 1/200 En la población resultante de recombinar estos cuatro padres, la probabilidad de encontrar en un individuo con los caracteres deseados será: C1, C2, C3, C4 = 1 / C1, C2, C3 = 1 / C1, C2 = 1 / 200 C1, C3, C4 = 1 / C1, C3 = 1 / C1, C4 = 1 / c. Cantidad de padres a recombinar. En los atributos de herencia simple, la integración de una generación recombinante se puede lograr por cruzamientos simples entre padres portadores de una expresión deseada seguido, en algunos casos, de unas pocas retrocruzas. la cantidad de padres es igual a la cantidad de caracteres bajo mejora. Sin embargo, se debe considerar la posibilidad de que un padre aporte la expresión buscada de mas de un carácter. La decisión respecto de la cantidad adecuada de padres, resultará de analizar las probabilidades citadas en 17.b.. Cuando uno o más caracteres a mejorar son de herencia cuantitativa, es apropiado la formación de poblaciones complejas por la integración de más de cuatro progenitores. La ventaja potencial de un cruzamiento complejo comparado con uno simple, está en que la cantidad de alelos posibles para 75

76 cada locus se incrementa en la población con la cantidad de padres que participan. Esto relaciona individualmente a los loci con dos o mas alelos, uno de los cuales es mas favorable. Dos padres homocigotas solamente pueden contribuir con un alelo cada uno. En un cruza simple entre padres homocigotas, puede ser que uno, ambos, o ninguno tenga el alelo más favorable posible. Para un carácter cuantitativo controlado por muchos genes, cada uno con efecto pequeño, el mejorador no puede conocer cuales alelos están presentes en un padre. La probabilidad, de que al menos un padre tenga el alelo más favorable para cada locus, se incrementa tanto como se incrementa la cantidad de padres en la población. La elección de un procedimiento para formar una población compleja depende de la importancia que el mejorador de a factores tales como: a. la necesidad de combinar alelos de todos los padres, b. a la cantidad de padres comprometidos, c. la contribución de cada padre a la población, y d. la cantidad de tiempo disponible para formar la población original. La cantidad de combinaciones de alelos que se pueden lograr entre los miembros de una población estará determinada por la cantidad de generaciones de intercruzamiento que se realicen antes de iniciar la selección. En una cruza simple, la oportunidad de que un individuo segregante contenga alelos de los dos padres requiere solo una cruza, pero si los padres son tres o cuatro se necesitan como mínimo dos intercruzamientos, si son cinco a ocho se necesitan tres y así sucesivamente. Esto se ilustra con ocho padres (1 a 8) que intercambian cuatro alelos (A hasta D). PRIMER CRUZAMIENTO P1 x P2 -- A1A2B1B2C1C2D1D2 P3 x P4 -- A3A4B3B4C3C4D3D4 P5 x P6 -- A5A6B5B6C5C6D5D6 P7 x P8 -- A7A8B7B8C7C8D7D8 SEGUNDO CRUZAMIENTO (P1 x P2) x (P3 x P4) -- puede producir una combinación como esta: A1A3B2B4C1C3D2D4 (P5 x P6) x (P7 x P8) -- puede producir una combinación como esta: TERCER CRUZAAMIENTO A5A7B7B8C6C8D5D6 [ (P1 x P2) x (P3 x P4) ] X [ (P5 x P6) x (P7 x P8) ] -- que puede producir una combinación como esta: 76

77 A1A5B2B8C3C7D4D6 En este caso, la incorporación de cada padre incrementará teóricamente la cantidad de alelos diferentes posibles. Por lo tanto, se ampliará la posibilidad de incrementar la varianza genética de la población resultante. A veces, sin embargo, es dificultoso encontrar una gran cantidad de padres que tengan un comportamiento de nivel aceptable para todos los caracteres bajo selección. Así, por ejemplo, si sobre un grupo de genotipos disponibles un 25% tiene un comportamiento superior para un carácter, un 25% estar por encima del promedio, 25% por debajo del promedio y el 25% restante manifestar un comportamiento inferior. El mejorador deberá decidir si recombinar solo el 25% de los genotipos superiores para lograr una población recombinante con potencial de alta expresión del carácter y limitada variabilidad, o utilizar una mayor cantidad de padres para incrementar la variabilidad genética potencial sacrificando el nivel medio de comportamiento. Mutación El mejoramiento vegetal requiere de variación genética útil para obtener nuevos cultivares. En algunas especies o para algunos caracteres esa variación no existe o es muy reducida. Los agentes mutagénicos como la radiación y algunos agentes químicos pueden ser empleados para generar variaciones genéticas a partir de las cuales una variación o mutación puede ser seleccionada. La inuducción de mutaciones ha probado ser una via de crear variación en una especie determinada. Ofrece la posibilidad de crear variantes que no se encuentran naturalmente o que se han perdido en el curso de la evolución de las plantas debido a la selección natural y artificial. Los tratamientos mutagénicos alteran genes o rompen cromosomas- Las mutaciones génicas ocurren naturalmente como errores en al replicación del ADN. Muchos de estos errores son reparados, pero algunos pasan por sucesivas divisiones celulares para quedar establecidos en las progenies de esas plantas como mutaciones espontáneas. Aunque las mutaciones observadas en un gen en particular son raras, hay probablemente genes en una célula de una planta superior. Esto significa que todas las plantas pueden llevar uno o más mutaciones espontáneas en la próxima generación. Las mutaciones génicas sin expresiones fenotípicas (visibles) generalmente no son reconocidas. En consecuencia, la variación genética aparece bastante limitada y los científicos tienen que recurrir a la inducción de la mutación. No hay otra manera de alterar genes excepto esperar por mucho tiempo por mutación espontánea que se produzca. La inducción artificial de las mutaciones por radiación ionizante se remonta a principios del siglo XX. Pero se tardó unos 30 años para probar que tales cambios podrían utilizarse en el fitomejoramiento. Las primeras tentativas de inducir mutaciones en plantas fueron utilizando rayos X mayormente, más tarde, en los albores de la "era atómica", la radiación gamma y de neutrones fueron empleados. 77

78 Variación Somaclonal Introducción El cultivo de tejidos es un procedimiento donde varios tipos de hormonas incorporados en un medio en distintas concentraciones pueden modificar el crecimiento en forma diferenciada o no. La diferenciación incluye la producción de raíces o tallos, mientras que la indiferenciación produce callos que son masas de células. Este cultivo más o menos diferenciado es llevado a distintos medios a fin de obtener la regeneración de plantas completas. La facilidad y eficiencia con que estas manipulaciones pueden ser realizadas varía enormemente de especie en especie. Lo explantos iniciales para un cultivo in vitro provienen virtualmente de todos los órganos o tipos de células incluyendo embriones, microsporas, raíces, hojas y protoplastos. Históricamente el ciclo lo de cultivo in vitro era un método de clonación de un determinado genotipo, a fin de logra una rápida multiplicación. Esto implica que las plantas regeneradas a partir del cultivo in vitro deben ser copias exactas del material parental. Sin embargo se observaron cambios fenotípicos en la plantas regeneradas. Se supuso que eran diferencias epigenéticas, y no merecedoras de atención. Luego se observo que algunas de esas variaciones eran persistentes y heredables. El cultivo de tejidos apareció entonces como una fuente alterna de variación genética. A esta variación se la denominó Variación somaclonal. Podemos definir a la variación somaclonal como: cambios genéticos estables producidos durante un cultivo de tejidos. Origen de la variación Toda discusión respecto a las causas de la variación a nivel de cultivo in vitro es hasta ahora especulativa, sin embargo hay un número de hechos que deben mencionarse. Lo importante es entender estos procesos y lograr control sobre ellos de modo que la variación pueda ser incrementada cuando ese es el objetivo o suprimida cuando el objetivo del investigador es la propagación, sin alteración genética alguna, de un genotipo determinado. El ciclo y/o el medio de cultivo producen variación, ej.: con la aplicación de 2,4 D. Acumulación de mutaciones en tejidos indiferenciados más las que podrían ocurrir luego en los diferenciados. Cambios en el cariotipo, implica cambios bruscos, tales como aneuploidía o polipliodía. Sin embargo, la evidencia indica que no necesariamente es una causa principal de variación somaclonal. Por otra parte, es obvio que tales cambios pueden ser selectos durante la regeneración de plantas, especialmente en el caso de especies diploides. 78

79 Cambios cripticos, pequeños cambios asociados con reacomodamiento de los cromosomas, ej.: ruptura y fusión, translocaciones de cromosomas no homólogos. Estos reacomodamientos, ademas de afectar los genes que están localizados en el lugar de ruptura, también afectan a los genes vecinos, particularmente aquellos que poseen una transcripción coordinadamente regulada. Se afectan genes distantes en el cromosoma. Estos cambios no solo pueden resultar en la pérdida de genes y sus funciones, si no que también pueden permitir la expresión de genes que hasta ese momento habían permanecido en "silencio". Por ej.: la eliminación del alelo dominante y la expresión del recesivo, fenómeno conocido como hemizigocidad. En cebada se han observado procesos de ruptura y fusión, multicentros, translocaciones en plantas derivadas del cultivo de tejidos. Translocaciones de cromosomas no homólogos han sido observados en avena. En maíz se han observado cromosomas heteromórficos apareados. Transposición de elementos (Transposones), ciertos elementos de transposición en el DNA mitocondrial están implicados en la reversión espontanea hacia fertilidad del citoplasma estéril S en Zea mays L. El medio en el cual se desarrolla el cultivo de tejidos permite una alta probabilidad de ocurrencia de la transposición secuencial de DNA. Los elementos de transposición tendrían como primera función asegurar su propia subsistencia en el genomio, de este modo se incrementaría la adaptación hacia el nuevo medio como ocurre en el cultivo de tejidos. Incremento del crossing over, debido a la "presión" del medio de cultivo, que puede ser particularmente importante si los cambios son asimétricos o entre cromosomas no homólogos. La variabilidad observada es válida solamente si es manipulada adecuadamente y las variantes útiles son seleccionadas y evaluadas cuidadosamente. Si la variación es extensiva, la simple elección del primer somaclon con el atributo deseado seria poco eficiente, ya que, de allí en adelante pueden ocurrir cambios genéticos en detrimento o no del carácter. Cada serie de somaclones potencialmente útiles deben ser evaluados bajo condiciones de campo. En síntesis la eficiencia de la obtención de genotipos a través de la variación somaclonal depende de cuan bueno sea el sistema de selección in vitro empleado. Los fines específicos son obtener resistencia a toxinas de patógenos, herbicidas, estres osmótico, frío, etc. 3. Variación Gametoclonal La variación observada entre plantas regeneradas de cultivos de tejidos somáticos ha sido observada también entre plantas derivadas de gametas. A pesar de que la variabilidad observada puede ser similar con la somaclonal, los fenómenos difieren: 79

80 1. Desde que los gametoclones son, en principio individuos haploides, las mutaciones controladas por genes recesivos pueden ser observadas en las plantas regeneradas (diploides homocigotas), en contraste con los somaclones que deben ser autofecundados y su progenie analizada para detectar mutaciones recesivas. 2. La plantas derivadas del cultivo de gametas son haploides, el número cromosómico debe ser doblado para restaurar la fertilidad para la formación de semillas. Esto se consigue con tratamientos químicos que impiden la formación del huso. Uno de esos agentes, la colchicina, también ha sido indicada como agente mutagénico lo que contribuye a la variación de los doble haploides resultantes. En los genotipos obtenidos se suele observar un marcado incremento del vigor sobre el genotipo parental. Esto podría ser contradictorio, ya que la mayoría de las mutaciones son deletéreas. Una posible explicación sería que las mutaciones, cuando ocurren al azar y cuando son heterocigotas (no letales), pueden tener un efecto favorable sobre la viabilidad y adaptación en un espectro genético homocigota. O sea que el aumento en la heterosis y en la viabilidad se debería a la presencia de un alelo mutante y otro no, o sea un estado heterocigota. Si lo anterior es cierto, o sea la sobredominancia de un gen es la explicación, al menos en parte, para la formación de individuos superiores a partir de cultivos es necesario tener en cuenta que: 1. Los genotipos superiores recobrados deben ser heterocigotas para las mutaciones ocurridas, o sea llevarían consigo un carga heterótica. Esta condición solo es aceptable si el cultivo es propagado vegetativamente, pero inaceptable si es por semilla sexual. 2. La variación debe recuperarse necesariamente en diploides o poliploides. 3. El empleo moderado de agentes mutagénicos puede incrementar la frecuencia de variación deseable a través del cultivo de tejidos. En el caso específico de los cereales se deben producir un gran número de plantas para superar el problema de mutantes albinos que ocurren con alta frecuencia entre las plantas derivadas de gametas. La ocurrencia de albinos parece deber su causa a delecciones en el genomio de los cloroplastos. A pesar de que esto puede ser un aspecto negativo de la variación gametoclonal, posee un valor potencial en la producción de variabilidad citoplásmica, dado que los genes codificados en el DNA mitocondrial y en los cloroplastos son difíciles de manejar mediante el mejoramiento convencional. 4. Conclusiones La variación somaclonal puede ser una técnica adicional potencialmente útil para ofrecer a los mejoradores de plantas nueva variación genética, pero 80

81 todavía no existe una razón para esperar que algo fundamentalmente nuevo pueda revolucionar la obtención de variabilidad genética. Ejemplos de cultivares obtenidos de esta forma son: tomate resistente a Fusarium, pimiento (paprika) sin semillas y varios cultivares de caña de azúcar con resistencia a ciertas enfermedades (enfermedad de Fiji). Bibliografía Kermicle, J. L., Androgenesis conditioned by a mutation in maize. Science 166: Lacadena, J R., Genetica Vegetal. 2da. Edición, pp. 429, Agesa, Madrid Larkin, P. J. and W. R. Scowcroft, Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. T.A.G 60: Sanchez Monge, E., Fitogenética. Monografías I.N.I.A.; n 12, pp 456, Madrid. Sprague, G.F.; W. A. Russel and L. H. Penny, Mutations affecting quantitative traits in the selfed progeny of doubled monoploids maize stocks. Genetics 45: Van Harten, A. M., Mutation Breeding, In: Introduction to Plant Breeding II. Genetic Variation. Dep. of Plant Breeding, Wageningen Agricultural University, Wageningen, The Netherlands, 84 p. 81

82 Unidad 8. Selección Introducción Los mejoradores de plantas han tratado de incrementar el rendimiento de los cultivos a través de la selección por caracteres individuales desde el principio de la mejora genética. El principal efecto de la selección es un cambio en la frecuencia génica de una población. Como los caracteres cuantitativos son controlados generalmente por un gran número de genes y su expresión es afectada por el ambiente, el efecto de la selección se manifiesta en cambios en los valores fenotípicos como el valor medio del carácter en cuestión, sus varianzas y covarianzas. Cuando se aplica selección sobre uno o sobre varios caracteres en forma simultánea, se debe tener en cuenta que se puede afectar el comportamiento de otros caracteres. Por ello es necesario conocer la estructura de correlación entre los caracteres que son objeto de selección y los demás, para no provocar cambios no deseados. Un ejemplo de lo anterior es la relación inversa entre contenido de proteína y rendimiento en los cereales. Selección de caracteres cualitativos y cuantitativos. Los caracteres cualitativos son fácilmente agrupados en clases y de este modo permiten su identificación a campo en forma relativamente sencilla. Como su expresión está dominada por uno o pocos genes que no tienen, o es mínima, influencia ambiental, e posible identificar el genotipo del individuo a partir del fenotipo. Por ejemplo en el caso de una resistencia condicionada por un alelo dominante, R, los genotipos posibles para este locus serían, obviamente RR, Rr y rr. El homocigota recesivo es fácilmente removido dado que se mostraría totalmente susceptible, mientras que el heterocigota podría ser identificado mediante la endocría. De este modo, en pocos ciclos el carácter podría ser fijado en la población. Contrariamente, los caracteres cuantitativos al ser regidos por muchos genes sumado a la alta influencia ambiental, no son tan sencillamente identificados y para fijar los genes responsables de un determinado carácter son necesarios varios ciclos de selección que pueden disminuir la frecuencia de los genes que condicionan el carácter, pero no eliminarlos completamente como en caso de la selección en poblaciones de plantas alógamas. Para efectuar selección en forma eficiente sobre caracteres cuantitativos es necesario conocer varios parámetros como ser la variabilidad genética, la heredabilidad, la correlación con otros caracteres de interés, la respuesta a la selección y los diferentes criterios y modalidades de selección que pueden aplicarse sobre estos caracteres. Respuesta a la Selección, Avance Genético e Intensidad de selección. La respuesta a la selección (R) en un carácter es el producto de la heredabilidad del carácter (h 2 ) por el diferencial de selección (δ s ). De manera que cuando el material es genéticamente homogéneo (h 2 =0), no hay respuesta a la selección (Figura 1), pero, cuando la heredabilidad es máxima, la respuesta a la selección es igual al diferencial de selección. La situación 82

83 intermedia es lo más frecuente en el análisis de caracteres cuantitativos en donde tienen efectos la variación genética y las modificaciones ocasionadas por el ambiente. R = h 2. δ s De existir apareamiento en forma aleatoria en la población original, la relación R/δ s no es otra cosa que la regresión de las medias de las progenies en la generación de sobre las medias de los padres en la PO, es decir b op, lo que corresponde a la h2 del carácter en la población original: b op = h 2 R/S = h 2 1-0/ s - 0 = h 2 R = h 2. δ s En principio, la predicción de la respuesta es válida para una sola generación de selección. La respuesta depende de la heredabilidad del carácter en la generación en la cual se seleccionaron a los progenitores. Dado que la selección cambia las frecuencias génicas, las propiedades genéticas de la generación filial, en particular la heredabilidad, no son las mismas que en los progenitores. Puesto que son desconocidos los cambios en las frecuencias génicas no podernos predecir la respuesta de una segunda generación de selección sin calcular la heredabilidad. Figura 1. Resultados posibles de la respuesta a la selección. Po = población original 83

84 En el mejoramiento de plantas el interés es calcular la respuesta luego de varios ciclos de selección para por ejemplo comparar diferentes métodos de selección para los mismos caracteres. Para estimar esta respuesta se debe implementar ensayos, generalmente en varias localidades y años, con todos los ciclos de selección realizados, los que constituirán los tratamientos. Por ejemplo, si se quiere estimar la respuesta a la selección masal a lo largo de 10 ciclos de selección, se deberá implementar un ensayo con los diez ciclos de selección (C0 a C10), en parcelas predeterminadas con un adecuado número de repeticiones y localidades (ambientes). Durante el crecimiento de las plantas se toman datos sobre las características de interés, particularmente aquella que fue objeto de selección directa, pero ejemplo: menor altura de planta, rendimiento, ciclo, etc. y otras variables que sean de importancia y/o que estén correlacionadas con la principal. Una forma simple de estimar la respuesta a la selección mediante la comparación del último ciclo de selección Cn, con el inicial, generalmente denominado C0. Se calcula la diferencia entre los ciclos y se estima el cambio con respecto al ciclo inicial (C0) como porcentaje del mismo. Sin embargo, en la mayoría de los estudios sobre la respuesta a la selección se busca estimar las tendencias a lo largo de la selección, y para ello se utiliza la técnica de regresión. Esta técnica tiene la ventaja de integrar los datos y que el coeficiente de regresión bi es un estimador adecuado para medir las respuestas a la selección. Si se expresa el valor de b como porcentaje (%) del promedio del ciclo inicial o de partida (C0), se puede obtener un estimador de las ganancias por ciclo (como % del C0). A modo de ejemplo emplearemos los datos de la tabla 1: a) Altura de inserción de espiga De acuerdo a lo anterior podemos estimar la respuesta de dos maneras: a1) La diferencia entre C2 con C0 es 117,5 127,0 = -9,5 cm. Si se expresa este valor como % del C0 tendremos (-9.5/127)*100 = -7,48 %. a2) Si se realiza la regresión de promedio de altura de inserción de espiga para los ciclos C0, C1 y C2 sobre ciclo de selección (0,1 y 2) tendremos la ecuación de regresión: 124, (ciclo) Donde 4,75 es el valor del coeficiente de regresión bi. La significancia de este valor de bi (usando el test t para la hipótesis nula que Ho: b = 0.0), provee de un test estadístico para confirmar la significancia de la respuesta a la selección. Se puede expresar el valor del coeficiente de regresión b como porcentaje del ciclo original. El valor del C0 puede ser el valor observado (127,0) o el valor del intecepto (124,58). Por lo tanto la ganancia por ciclo será: 84

85 o bien: -4,75/127*100 = -3,74% por ciclo, -4,75/124,58*100 = -3,81% por ciclo, Dependiendo si se utiliza el valor real del C0 o el estimado Ejercicio: Realice los cálculos para estimar la respuesta a la selección para los otros caracteres: acame y prolificidad utilizando ambos procedimientos descriptos en a1 y a2. Datos: Ecuaciones de regresión Acame: 14,925 4,545 Prolificidad: 0, ,035 Tabla 1. Cambios en tres variables cuantitativas a lo largo de 2 ciclos de selección masal en maíz Ciclo de Selección Altura de inserción de espiga (cm) Acame (vuelco de plantas) (%) C C C Respuesta -3,74% Prolificidad (n de espigas/planta) Tal como se presenta, la estimación de la R s se realiza luego de haber realizado la selección. Sin embargo, en la formulación de un plan de mejora es necesario estimar la respuesta antes de realizar la selección a fin de definir la cantidad de ciclos de selección necesarios y la proporción de individuos a seleccionar en cada ciclo. Para ese fin se estandariza la ecuación de la respuesta. A esta ecuación se la llama avance genético, y al diferencial de selección estandarizado se lo denomina intensidad de selección: δs: diferencial de selección σ: desviación típica 85

86 La I es la distancia que se mide entre la media de la población original y la media de la muestra a seleccionar. Es decir que existe un valor de I para cualquier porcentaje de individuos de la población entre 0 y 50%. Estos valores se disponen en tablas y el mejorador puede elegir la presión de selección que más le conviene en función de la heredabilidad del carácter, la variabilidad y el tiempo disponible. Heredabilidad realizada. A partir de la respuesta a la selección se puede estimar la heredabilidad a partir del resultado de la selección que se ha practicado: Siendo: R la respuesta a la selección y δ s el diferencial de selección. Esta fórmula proporciona la descripción empírica más útil de la efectividad de la selección, la cual permite hacer una comparación de experimentos diferentes cuando la intensidad de la selección no es la misma. El término heredabilidad realizada es empleado para denotar el cociente R/S, independientemente de su validez como medida de la heredabilidad verdadera o realizada. Respuesta correlacionada. Al practicar selección sobre un determinado carácter, por ejemplo el carácter x, esta acción podrá o no tener consecuencias o cambios sobre otro carácter y. La respuesta en el carácter x, o sea el carácter seleccionado, es equivalente al valor reproductivo medio de los individuos seleccionados o sea el valor aditivo. El cambio en el carácter y se da, entonces, por medio de la regresión del valor reproductivo (aditivo) de y sobre el valor reproductivo o aditivo de x: 86

87 r: correlación genética entre x e y o sea la correlación entre los valores reproductivos Si la respuesta de carácter x, seleccionado directamente es: Rx = i.h 2 x.σ x La respuesta correlacionada en el carácter y es: RC y = b yx. R x Por lo tanto sise conocen las correlaciones genéticas y las heredabilidades de los dos caracteres se puede predecir la respuesta correlacionada a la selección. Criterios de Selección. Selección por rendimiento. Selección mediante componentes del rendimiento. En el mejoramiento de plantas la selección puede realizarse teniendo en cuenta: a. Un único carácter b. Múltiples caracteres c. Un ideotipo de planta Selección por un único carácter Generalmente la selección basada en un solo carácter ha sido practicada utilizando el rendimiento como carácter de selección. La selección por rendimiento puede ser realizada mediante la medición del rendimiento de una planta individual, de una familia o de una línea. El éxito de la selección va a depender de: a. La generación en la que se comienza la selección b. El método de evaluar las generaciones segregantes La selección se efectúa en generaciones tempranas, por ejemplo en F2 o F3, el éxito de la selección para rendimiento es generalmente pobre dado los fuertes 87

88 efectos de dominancia y epistasia en estas generaciones y que luego desaparecen, al acercarse a homocigosis, en generaciones tardías en plantas autógamas. Por otra parte el éxito de la selección puede variar si la evaluación del rendimiento se realiza sobre una planta o sobre familias. En el caso de plantas, además de los efectos génicos mencionados, existe una gran influencia ambiental y el mejorador cuenta con una única medición. La selección puede ser más exitosa si la selección es basada en familias, en las cuales el rendimiento es un promedio del rinde individual de cada componente de la familias, y si se practica sobre generaciones F4/5. Selección para más de un carácter: Tándem, Selección por niveles independientes e Índice de selección. En la práctica la selección para más de una característica o carácter es común. Generalmente el carácter de interés es el rendimiento en grano, pero existen otros caracteres que son deseables desde el punto de vista agronómico como altura de planta, resistencia al quebrado de tallo o vuelco, resistencia a enfermedades e insectos, etc., que deben ser incluidos en un plan de mejora. Existen tres procedimientos para la selección de varias características: Selección en Tándem Selección por Niveles Independientes (o descarte individual) Índice de Selección Selección en Tándem La selección en tándem enfatiza la selección para un solo carácter durante un determinado número de generaciones. Luego se comienza por otro carácter que se selecciona también durante varias generaciones. Es decir un carácter es seleccionado hasta alcanzar un nivel satisfactorio, para después seleccionar por otro carácter y así sucesivamente. Uno de los problemas de la selección en tándem es determinar el número de generaciones de selección para el mejoramiento de cada carácter. Si se utiliza una alta presión de selección la variabilidad decrece rápidamente y la ganancia por selección se reduce después de pocas generaciones. Es necesario establece un orden de importancia para cada carácter, el límite requerido para el carácter y la heredabilidad del mismo deben ser determinados antes de la aplicación de la selección en tándem. Las correlaciones entre los caracteres deben conocerse para evitar efectos indeseables al aplicar la selección, dado que por ej., la selección para aumentar el rendimiento puede causar un aumento en la altura de la planta lo que es contrario al moderno ideotipo de planta en cereales. La efectividad de la selección en tándem aumenta cuando las correlaciones genéticas no existen o son muy bajas, por ej. entre rendimiento y resistencia a enfermedades, luego de incrementar el rendimiento se puede aumentar el nivel de resistencia a enfermedades. 88

89 Selección por Niveles Independientes Es la selección secuencial para varios caracteres en la misma generación. Usualmente se disponen de datos de valores medios obtenidos a partir de experimentos con varias repeticiones. Si se disponen de 500 familias para ser empleadas como población base de selección una forma de selección sería: Procedimiento: Población base 500 Familias de maíz Intensidad de Selección (%) Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etc. 200 Familias selectas por rendimiento 100 Familias selectas por altura de inserción de espiga 50 Familias selectas por resistencia al quebrado del tallo Intensidad de selección total aplicada: 0,4 x 0,5 x 0,5 = 0,10 o 10 % Cantidad de familias a recombinarse para reiniciar el próximo ciclo de selección: 50. Estas familias pueden recombinarse en libre polinización, medios hermanos o hermanos completos, en lotes aislados de otra fuente de polen. La semilla cosechada después de la recombinación se utilizará para un nuevo ciclo de selección. Índice de Selección Mediante este procedimiento la selección para diferentes caracteres se realiza simultáneamente. La decisión que toma el mejorador se basa en el mérito relativo que se le asigna a cada carácter. La experiencia y la capacidad visual de discernir (selección visual) tienen mucha importancia en este tipo de selección. Los caracteres cuantitativos pueden ser medidos con cierta precisión en el campo, pero otros no. La resistencia o tolerancia a un patógeno usualmente se mide de acuerdo a una escala prefijada: 0 = tolerante; 5 = susceptible, en la que obviamente influye el criterio del seleccionador para asignar valores a los genotipos bajo selección. Se considera que la selección por índice es superior a la selección por tándem y a la por niveles independientes, cuando el número de caracteres incluidos es grande. Si las correlaciones genéticas entre los caracteres son bajas o nulas mayor será la eficiencia de utilizar un índice de selección. 89

90 Selección en base a un ideotipo de planta Un ideotipo es una planta hipotética descripta en relación a los caracteres que se piensa incrementarán el rendimiento potencial. El mejoramiento en base a un ideotipo se basa en la modificación de caracteres individuales en donde el objetivo para cada carácter es claramente especificado. Bibliografía Hayward, M. D., Bosemark, N. O., Romagosa, Plant Breeding: Principles and Prospects., I. Chapman and Hall Ltd. Sleper D. A. and J. M. Poehlman, Breeding Field Crops, 5th Edition, Blackwell Publishing, 424 p. 90

91 Unidad 9. Interacción genotipo ambiente y adaptación Introducción La estabilidad de un cultivar es definida generalmente como la capacidad genética de mantener un rendimiento alto y estable a través de una serie de ambientes. La causa principal de las diferencias entre genotipos respecto a la estabilidad de los rendimientos es la amplia ocurrencia de la interacción genotipoambiente. Esta interacción es manifiesta cuando la respuesta fenotípica producida por un cambio en las condiciones ambientales no es la misma para todos los genotipos. De acuerdo a lo anterior el orden de los genotipos puede variar dependiendo el ambiente particular donde son cultivados. Esta interacción de los genotipos con el ambiente puede ser parcialmente explicada como el resultado de una reacción diferencial frente a factores ambientales como sequía ó enfermedades. Generalmente, solamente una parte de las interacciones genotipo ambiente puede ser atribuido a condiciones ambientales conocidas, la mayor parte es frecuentemente de origen desconocido en el análisis de estabilidad. Cuando las variaciones ambientales son predecibles, la interacción genotipo ambiente puede ser reducida mediante la estratificación del ambiente y la asignación de los diferentes genotipos a cada ambiente. La variaciones impredecibles son causa de importantes interacciones genotipo ambiente impidiendo la estratificación antedicha. La solución es seleccionar genotipos estables que mantengan su comportamiento, ej.: rendimiento, a través de una gama de ambientes. El término "Estabilidad Fenotípica" es usado para referirse a fluctuaciones en la expresión fenotípica del rendimiento mientras la composición genotípica de las variedades ó poblaciones permanece estable. Conceptos básicos Existe acuerdo entre los criadores de plantas sobre la importancia de alcanzar rendimientos altos y estables, pero en lo que respecta a la definición de "estabilidad" y a los métodos para calcularla las opiniones varían. Frecuentemente los términos estabilidad fenotípica, estabilidad de los rendimientos y adaptación son empleados de distinta manera y/o con distinto significado. Quizá debido a esta confusión de terminología, Dorst, ya en 1957, remarcó: "la palabra adaptación posee una gran adaptabilidad" y Lin en1986 "el 91

92 concepto de estabilidad es definido de muchas maneras dependiendo cómo el investigador desea encarar el problema". Estabilidad estática y dinámica Dependiendo de los objetivos y del carácter bajo consideración existen dos conceptos de estabilidad: el estático y el dinámico (Figura 9.1). Concepto estático. De acuerdo a éste un genotipo posee un comportamiento constante, independientemente de cualquier variación del ambiente. Este genotipo no muestra desviación en el comportamiento esperado del carácter, siendo su varianza entre ambientes igual a cero. Concepto dinámico. Permite una respuesta predecible frente al ambiente. Implica que los genotipos pueden reaccionar en forma distinta frente a distintos ambientes, pero su comportamiento se puede predecir. Lo que es importante es que el nivel de comportamiento predicho esté de acuerdo con el nivel medido experimentalmente. Carácter A Ambientes B Ambientes Figura 9.1. A) Estabilidad estática (biológica) y B) dinámica (agronómica). Se ha denominado a este último como el concepto "agronómico" de estabilidad, diferenciándolo del estático al que se llamó "biológico". 3. Métodos biométricos de estimación. Se utilizará un modelo lineal para representar los distintos métodos de estimación de estabilidad: Xij = µ + ej + gi + (ge)ij + Eij 92

93 Donde: Siendo: Xij = valor fenotípico medio del individuo i (i = 1..., G) en el ambiente j (j = 1,..., E). µ = media poblacional. ej = efecto del ambiente j-ésimo. gi = efecto del genotipo i-ésimo. (ge)ij = efecto de la interacción entre el genotipo i-ésimo y el ambiente j-ésimo. Eij = error aleatorio medio del genotipo i-ésimo en el ambiente j- ésimo. Xi. = media del genotipo i. X.j = media del ambiente j. X.. = media general. Varianza ambiental De acuerdo al concepto estático la estabilidad fenotípica puede ser estimada empleando la varianza de un genotipo a través de los ambientes: Varianza ambiental S2xi = j (Xij - Xi.)2/ A - 1 Siendo: A: número de ambientes Esta varianza ambiental detecta toda desviación de la media genotípica. Un genotipo deseable no debe reaccionar a través de los diferentes ambientes. Por lo tanto un genotipo estable poseería una S2xi = 0. Este concepto de estabilidad es útil para aquellos caracteres que deban ser mantenidos a nivel constante, ej.: la calidad panadera de los trigos ó la resistencia a enfermedades. Sin embargo, el mejorador busca que los genotipos tengan un rendimiento alto y estable. Es decir que respondan favorablemente a un mejoramiento en las condiciones ambientales. Por lo tanto, para caracteres como el rendimiento es preferible utilizar el concepto dinámico en la evaluación de su estabilidad. 93

94 3.2 Varianza de los Rendimientos ajustados. La selección de genotipos basados en el rendimiento medio a través de localidades generalmente conduce a obtener genotipos adaptados a condiciones optimas. Algunos autores sugieren el uso de la transformación de los rendimientos de acuerdo a la media ambiental, el rendimiento relativo. El empleo del rendimiento relativo asigna igual "peso" a cada ambiente, facilitando la interpretación del comportamiento de los diferentes genotipos evaluados en distintos experimentos en la misma localidad y en el mismo año. Además transforma la varianza de los rendimientos a través de distintos ambientes convirtiéndola en un concepto agronómico de estabilidad. El rendimiento de un genotipo puede se expresado como relativo al rendimiento medio del experimento o ensayo, o a la media de los testigos, o relativo al mejor testigo del experimento considerado. Este puede ser expresado como: Yij RYij Y. j Donde: Yij: es la media del genotipo i en el ambiente j Y.j: rendimiento medio del ambiente j RY: rendimiento relativo La varianza de los rendimientos relativos es: S2i = (RYij - RYi.)2 / A - 1 Donde: RYi.: es el rendimiento relativo medio del genotipo i A: número de ambientes. De acuerdo a la Tabla 9.1, analizando los datos sin transformar, el genotipo R posee la menor varianza y, por lo tanto, es estable en el sentido biológico. Esto se debe a que su rendimiento es constante a través de los ambientes, a pesar de que los tres ambientes tienen grandes diferencias en el rendimiento medio. El genotipo P es el de mayor respuesta a mejores condiciones y posee la 94

95 mayor varianza. Q, cuya respuesta sigue el rendimiento medio de los ambientes posee una varianza intermedia. Tabla 9.1. Ejemplo teórico de comparación entre el rendimiento sin transformar y el rendimiento relativo. a) Rendimiento sin transformar Ambientes Genotipo x y z Media Var P Q R Media b) Rendimiento Relativo Ambientes Genotipo x y z Media Var P Q R Media El empleo del rendimiento relativo remueve el efecto medio de los rendimientos de los ambientes. Ahora Q tiene varianza cero, y es considerado estable en un sentido agronómico. P es un genotipo que responde a cambios en el ambiente y R no, ambos poseen varianza mayor a cero, y por lo tanto son considerados inestables. Regresión Coeficiente de Regresión En 1934, Strinfield y Salter fueron probablemente los primeros en caracterizar la respuesta genotípica a factores climáticos cambiantes mediante el empleo de la regresión linear. Esta técnica fue adoptada y utilizada por numerosos autores. 95

96 Yates y Cochran, en 1938, describieron un modelo en el cual la variación del rendimiento de variedades en diferentes ambientes era separado en dos partes. Una parte de la variación fue asignada a la respuesta lineal del comportamiento individual de una variedad con respecto a un índice ambiental (la media de todas las variedades en un ambiente particular). La otra parte de la variación son debidas a desviaciones de este modelo lineal. El modelo tiene la siguiente forma: Yij = + j j + ij Donde: Yij: rendimiento medio de la variedad i en el ambiente j : media general j: coeficiente de regresión linear de la variedad i en el ambiente j j: rendimiento medio de todas las variedades en el ambiente j ij: desviación de el rendimiento esperado de la variedad i en el ambiente j Finlay y Wilkinson (1963) examinaron el rendimiento de variedades de cebada en un rango de ambientes mediante la implementación de una serie de ensayos en varias localidades y años. El rendimiento medio del ensayo en cada localidad y en cada año fue utilizado como una medida del ambiente en el cual se implantó el ensayo. Los rendimientos de cada variedad fueron apareados con los rendimientos medios de cada ensayo con el fin de implementar la técnica de regresión. La variedad que poseía una respuesta media frente a cada ambiente tuvo una pendiente de regresión de uno (bi=1). Ellos concluyeron que una variedad "ideal" debería tener un alto rendimiento promedio y un coeficiente de regresión de uno (bi=1). Si una variedad posee un coeficiente mayor que uno (bi>1) es adaptada a ambientes óptimos, si bi<1, la adaptación es hacia ambientes pobres. Finalmente, sugirieron que la adaptación y el rendimiento deben ser considerados como atributos distintos de un mismo genotipo. La técnica descripta fue ampliamente adoptada, sin mayores modificaciones, y ha sido utilizada hasta nuestros días para estimar la estabilidad en muy diversos materiales. Sin embargo se le han efectuado algunas críticas: a) El índice ambiental no es independiente de los datos bajo análisis, debido a que es extraído del mismo conjunto de datos. Freeman and Perkins (1971) sugirieron el uso de una medida independiente del ambiente. Esto puede ser obtenido mediante la omisión del genotipo bajo estudio ó por un índice confeccionado en base a un conjunto distinto de genotipos. 96

97 b) La variable independiente, la media ambiental, es frecuentemente medida con error. Este error depende del número de genotipos probados y de la relación entre la media ambiental y el error. Si se utilizan diseños bien planeados y en ambientes contrastantes el error puede ser pequeño. c) La varianza del error, comúnmente, no es homogénea entre las distintas localidades y/o años. Por lo tanto las comparaciones pueden estar viciadas de nulidad desde el punto de vista estadístico. A pesar de las objeciones descriptas, la regresión es el método más usado en la estimación de parámetros de estabilidad. Desviación de Regresión Eberhart and Russell (1966) propusieron la utilización de la desviación de la regresión (di), además del coeficiente de regresión bi, como un parámetro de estabilidad. De esta manera los cuadrados medios residuales de la regresión describen la contribución de un genotipo a la interacción genotipo ambiente. Es posible describir los genotipos en base a las combinaciones en función de bi y di. Altos valores de bi y di (alta interacción genotipo ambiente) indicarían una tendencia a rendir mejor en ambientes cercanos al óptimo, pero inapropiados para ambientes pobres (Tabla 9.2). Un comportamiento altamente pronosticable en un ambiente de calidad conocida, puede derivar en un menor grado de interacción con los componentes ambientales en general, o bien como una respuesta repetible en función de la calidad del ambiente (Mariotti, 1986). Agrupamiento de Genotipos Francis y Kannenberg (1978) desarrollaron un método por medio del cual los genotipos son agrupados en base al rendimiento promedio y al coeficiente de variación (cv). El cv, en este caso es una medida de la consistencia de los rendimientos. En base a esta agrupación se distinguen 4 grupos (Figura 1): Grupo I: Altos rendimientos, bajo C.V Grupo II: Altos rendimientos, alto C.V Grupo III: Bajos rendimientos, bajo C.V. Grupo IV: Bajos rendimientos, alto C.V. El grupo I aparece como el más deseable de todos. De acuerdo a esto un genotipo estable es aquel que posee un rendimiento alto y consistente (Figura 3). Por lo tanto el grupo I es considerado estable. El grupo III, que puede ser considerado estable, posee un comportamiento pobre en la mayoría de los ambientes. 97

98 Baja S2di Alta Estabilidad Ambientes Pobres Ambientes Óptimos Baja Estabilidad Alta S2di bi < 1 bi > 1 Figura 9.2. Clasificación de acuerdo al coeficiente de regresión bi, y a la desviación de regresión, di, como estimadores de la estabilidad fenotípica Los límites de tolerancia para el rendimiento y el cv son bastante flexibles. Una forma es tomar datos de cultivares homogéneos tales como híbridos o líneas puras, y establecer límites para el rendimiento y el cv. Con estos valores se establecen las coordenadas y se ubican cada uno de los genotipos a evaluar. 4. Número y elección de los ambientes. Si la estimación de estabilidad es a partir de muchas localidades, pero dentro de un año solamente, no se toma en consideración la ocurrencia de la interacción genotipo-año. Por lo tanto una diferencia significante entre dos genotipos basados en un solo año no necesariamente se repetirá en los siguientes años, aún cuando el número de localidades utilizadas fuera de 15 ó 20 (León and Becker, 1988). En ensayos que cubren muchos años es posible calcular la regresión sobre las localidades promedio en varios años, ó considerar cada combinación localidadaño como un macroambiente (Eberhart and Russell, 1966). Regresiones sobre localidades ó sobre macroambientes conducen, usualmente a los mismas conclusiones. Sin embargo la regresión sobre macroambientes es una herramienta más poderosa para detectar diferencias en di, y por lo tanto es preferible su uso en muchos casos (Becker, 1984). Generalmente, la distribución óptima de los ensayos en localidades y años se obtiene con dos repeticiones por situación. Cuando las interacciones genotipo x año son mas importantes que las genotipo x localidad es recomendable probar mas años que localidades. Tipos de ambientes La evaluación de un conjunto de cultivares a lo largo de años y distintas localidades demanda mucho tiempo y recursos. Esto a menudo impide la estimación de la estabilidad en los programas de mejora ó puede no ser 98

99 suficientemente confiable por ser pocos ambientes y/o repeticiones, falta de contraste entre localidades, etc. Rinde Grupo I Grupo II (q/ha) Grupo III Grupo IV Coeficiente de Variación (%) Figura 9.3. Método de agrupamiento de genotipos sobre la base del rendimiento y el coeficiente de variación. Una solución posible es la creación de ambientes artificiales, que pueden ser implementados por la variación de prácticas culturales como la fecha de siembra, fertilización, irrigación, etc. En algunas experiencias resulto en un rango similar de genotipos probados también en diversas localidades (Das and Jain, 1971; Bains, 1976). Calcular la estabilidad en base a pocos ambientes no es recomendable pues su confiabilidad es baja. Localidades, años y ambientes creados artificialmente, pueden ser utilizados conjuntamente, debiéndose tener en cuenta el tipo de material y la región. Selección para estabilidad La estabilidad, como cualquier otro carácter, puede ser influenciado durante el proceso de crianza por el tipo de variedad, por la elección de los progenitores y por la selección. Tipo de variedad Los tipos de variedades difieren principalmente en dos aspectos: a) el grado de heterocigocidad de los individuos. b) la dimensión de la heterogeneidad genética dentro de la variedad. En general se asume que los genotipos heterocigotas son menos influenciados por cambios ambientales que aquellos homocigotas, y que las poblaciones heterocigotas tienen una ventaja sobre las homocigotas en condiciones cambiantes. A través de la experimentación se demostró que los genotipos 99

100 homocigotas presentan una mayor interacción genotipo ambiente que los heterocigotos. En maíz las lineas homocigotas (lineas endocriadas) presentan una baja estabilidad causada por la endocría en materiales cuyo modo natural de reproducción es la polinización cruzada. En cultivares híbridos de maíz se observo una mayor estabilidad en los híbridos dobles que en los híbridos simples En autogamas, la estabilidad fenotípica de una mezcla de lineas (población heterogénea homocigota), puede ser superior a cualquiera de sus componentes cultivados por separado. Esto fue observado en cebada, avena, sorgo, algodón, soja y garbanzo. Elección de los progenitores Se debe considerar la estabilidad de cada uno de los progenitores, la que se puede obtener de un número alto de ensayos con los probables padres. La elección de padres con altos o bajos valores de bi se reflejan en la descendencia, por ejemplo en trigo. No ocurriría lo mismo con la desviación de regresión, di. Si se desean obtener variedades con valores excepcionalmente altos o bajos de bi, la elección de progenitores podría ser una vía efectiva de alcanzar este objetivo Selección directa e indirecta La selección directa para estabilidad es limitada por la baja heredabilidad de la misma. Es conveniente la selección indirecta para características que aumenten la estabilidad de los genotipos. Por ejemplo la selección para resistencia a enfermedades, para tolerancia a factores abióticos como sequía y frío, para resistencia al acame. En el caso específico de maíz los caracteres que se emplean son: la prolificidad, reducido intervalo entre antesis y emisión de estilos, profundidad de grano y largo de espiga. También se ha indicado que la selección en base a un mejor índice de cosecha contribuiría a la estabilidad de los genotipos. Conclusiones El análisis de regresión es aconsejable cuando se tiene un número alto de ambientes contrastantes, como podría ser en el caso de los ensayos finales con cultivares en las ultimas etapas, pero no en ensayos preliminares cuando solo unos pocos sitios son empleados. En este caso seria preferible utilizar el rendimiento relativo. Teóricamente, el empleo de la desviación de la regresión puede ser incorrecto, pero se ha probado su utilidad practica, siempre que el número de ambientes sea elevado, en general mayor a diez (10). 100

101 Muchos autores consideran a bi no como una medida directa de la estabilidad, sino como un indicador de la respuesta de un genotipo dado a condiciones ambientales favorables. La mejora de la resistencia a enfermedades y a factores abióticos contribuye a incrementar la estabilidad de los rendimientos. En este punto hay que ser cuidadoso con los materiales bajo evaluación, dado que un genotipo que posea una característica adaptativa especial, por ejemplo tolerancia a la sequía, frío, suelos salinos, etc., puede ser un causante de una alta interacción genotipo ambiente dentro de un grupo de genotipos carentes de tal característica En programas comerciales de mejoramiento existe una tendencia a reducir el énfasis en la precisión de la experimentación en localidades individuales pero incrementar el número de ambientes testeados. Es recomendable ensayos de rendimiento de generaciones intermedias o avanzadas en varios sitios representativos, en vez de solamente en la estación de cría. Bibliografía Allard, R. W. and A. D. Bradshaw, Implications of genotypeenvironmental interactions in applied plant breeding. Crop Sci. 4, Becker, H. C. and J. León, Stability analysis in plant breeding. Plant Breeding 101, Comstock, R. E. and R. H. Moll, Genotype-environment interactions. pages In Statistical Genetics and Plant Breeding. Nat. Acad. Sci. - Nat. Res. Counc. Publ. No 982. Washington, D.C. Dorst, J. C., Adaptation. Euphytica 6, Eberhart, S. A. and W. A. Russell, Stability parameters for comparing varieties. Crop Sci. 6, Finlay, K. W. and G. N. Wilkinson, The analysis of adaptation in a plant breeding programme. Autr. J. Agric. Res. 14, Francis, T. R. and L. W. Kannenberg, Yield stability studies in shortseason maize. I. A descriptive method for grouping genotypes. Can. J. Plant Sci. 58: Mariotti, J. A., Fundamentos de Genética Biometrica. Aplicaciones al Mejoramiento Genético Vegetal. Monografía no. 32. OEA, 152 pp. 101

102 Unidad 10. Métodos de Mejoramiento en plantas autógamas Introducción Las variedades de especies autógamas consisten en principio de genotipos homocigotas, idénticos genéticamente. La homocigosis es alcanzada rápidamente por la autogamia, o fertilización a flor cerrada. Los individuos fuera de tipo pueden ocurrir por mutación o por mezcla accidental con otros genotipos. Entre los cultivares comerciales de autógamas también pueden encontrarse formas híbridas como por ej. : tomate, pimiento, arroz y trigo. La semilla híbrida es producida mediante el empleo de la machoesterilidad citoplásmica génica o por emasculación a mano y posterior polinización y fertilización. La mayoría de los métodos de selección aplicables a plantas autógamas son adaptaciones de las ideas desarrolladas por Johannsen (1903, 1909), las cuales asumen que genotipos homocigotas superiores son obtenidos ya sea por selección entre plantas completamente homocigotas o líneas derivadas por endocría a partir de una población segregante. La selección puede practicarse a partir de una cruza o no, por lo tanto, los métodos o esquemas de selección pueden ser divididos en aquellos que no involucran cruzamientos, es decir selección entre individuos homocigotas, y aquellos que involucran cruzamientos, es decir selección entre individuos segregantes. Los programas de selección son precedidos por un programa de cruzas para crear variación y promover la recombinación génica. Una o más líneas se cruzan para obtener las formas híbridas F1, las que luego segregarán en F2 y en generaciones sucesivas, en distintos genotipos al sucederse las generaciones y la autofecundación. En la generación F2, o en F3 es cuando se aplican los distintos métodos de selección. En la mayoría de los programas de mejoramiento de plantas autógamas el método de selección es una mezcla entre varios métodos. Es una práctica común, luego de un cruzamiento entre dos spp., autógamas, dejar avanzar la segregación hasta la generación F4 o F5 en masa o Crianza Masal y luego continuar con el método de pedigree o Crianza Genealógica. Se debe notar que las distinciones entre los métodos son a fin de lograr una claridad conceptual. En definitiva, es el mejorador quien decide cuál combinación de los métodos se ajusta mejor a sus objetivos. Métodos de selección Selección entre individuos homocigotas. Selección en poblaciones heterogéneas homocigotas 102

103 La selección masal y la individual tienen en común que la población original no es creada artificialmente, sino que se aplican sobre poblaciones ya existentes, denominadas poblaciones locales, ecotipos o landraces. Selección Masal Es la selección de plantas individuales sobre la base de su apariencia fenotípica. La semilla cosechada de las plantas selectas es mezclada para sembrar la generación siguiente. Si plantas fenotípicamente mejores son selectas, el procedimiento se llama selección masal positiva. Es negativa si solamente las plantas con menor expresión para el carácter son removidas, ej.: susceptibilidad a una enfermedad. En autógamas, al contrario que en alógamas, la selección masal tiene un uso restringido. Es un método que permite el mejoramiento de variedades primitivas. Estas variedades (landraces) o ecotipos, consisten de mezclas de líneas homocigotas. Es posible que genotipos heterocigotas estén presentes como resultado de cierto porcentaje de fertilización cruzada y (en menor medida) a mutaciones espontáneas. Una variedad producida por varios ciclos de selección masal tendrá un mejor nivel de adaptación ambiental, comparada con la variedad original. Fenotípicamente será uniforme para caracteres como altura de planta, época de floración, madurez y en menor medida, calidad. Una considerable cantidad de variación genética permanecerá oculta en la mezcla de genotipos. La selección masal será efectiva para caracteres con heredabilidad moderada a alta, pues de esta manera las progenies derivadas en las generaciones subsiguientes serán similar a las plantas selectas. Cuando la heredabilidad es baja, la correspondencia entre los valores genotípicos y genotípicos es muy pobre para que la selección sea efectiva en cambiar la media de la población. Como no existen cruzas entre los genotipos durante el proceso de selección (excepción por un bajo porcentaje de polinización cruzada), la selección masal lleva a la obtención de una mezcla de líneas puras, cuyo número depende de la diversidad genética de la población original. Las variedades producidas por selección masal consisten en una mezcla de líneas homocigotas. Ellas difieren de la población original por el hecho de que las líneas de pobre adaptación han sido, en su mayor parte, eliminadas, o la frecuencia de plantas pertenecientes a líneas de pobre desempeño ha sido reducida. Actualmente la selección masal es aplicada sobre poblaciones naturales que no han sido objeto de selección intensiva, por ej.: pastos, legumbres forrajeras, o cuando otros métodos más eficientes, la selección individual, no pueden ser aplicados. Para el desarrollo de cultivares de alto rendimiento y comportamiento la selección masal no es eficiente como los otros métodos. 103

104 Selección individual La teoría de la selección sobre la base de la línea pura fue establecida por el botánico danés Johannsen en La unidad de selección es un individuo como en la selección masal, pero con la diferencia que cada progenie es mantenida en forma separada. Variedades obtenidas de esta manera son numerosas, ya en el siglo XIX la estación de mejoramiento de Svalov en Suecia tuvo un notable éxito en la creación y propagación de variedades por este sistema. La etapa inicial en la selección individual es identificar las plantas superiores o panojas, en el caso de que las plantas no puedan ser reconocidas como en los cereales de grano fino. La segunda etapa es la prueba y selección de líneas o progenies que derivan de las semillas cosechadas en cada planta seleccionada en la primera etapa. Luego en una tercera etapa las progenies superiores se seleccionan y a su vez se multiplican para disponer de mayor cantidad de genotipos para pruebas más extensas y su comparación con cultivares testigos. La selección individual es más eficiente que la selección masal dado que en ésta solamente se pueden eliminar plantas fuera de tipo, mientras que en la individual se pueden eliminar progenies completas. El resultado final de la selección individual es la obtención de una o varias líneas puras, homocigotas y perfectamente individualizadas. Selección entre individuos segregantes. Selección en poblaciones heterogéneas heterocigotas La selección comienza en poblaciones segregantes, generaciones con individuos altamente heterocigotas: F2-F3, que provienen de la cruza o hibridación de varios genotipos. Cada generación segregante es genéticamente diferente de la que le precedió y de la que le sucederá debido al proceso de autofecundación que conduce paulatinamente a la homocigosis en todos los loci en segregación. Hibridación Una población derivada de una hibridación planeada en base a diferentes variedades es la mejor población para la selección de genotipos superiores y la obtención de nuevos y mejores cultivares. La hibridación tiene por finalidad: 1. Crear variabilidad genética, seleccionar esa variabilidad en generaciones segregantes y luego evaluar y multiplicar los materiales seleccionados. 2. Complementación: cuando se quiere reunir en una sola variedad las características de otras elegidas como progenitores. 104

105 3. Transgresividad: cuando se desea obtener variedades que superen a ambos progenitores en la expresión de una o varias características cuantitativas. 4. Para cumplir con estos objetivos es fundamental conocer las técnicas de emasculación y cruzamiento, manejo y cuidados de las F1 y de las generaciones segregantes. Cruzas simples La situación más simple es un cruzamiento entre dos variedades o líneas que difieran para varios alelos: P1 X P2 A1 A1 B1 B1 C1 C1 D1 D1 F1 A 1 A1 B2 B2 C2 C2 D1 D1 A1 A1 B1 B2 C1 C2 D1 D1 Cruzas Múltiples Estas emplean tres o más padres. Una cruza triple sería: P1 X P2 A1 A1 B1 B1 C1 C1 D1 D1 A 1 A1 B2 B2 C2 C2 D1 D1 F1 X P3 A1 A1 B1 B2 C1 C2 D1 D1 A 2 A 2 B1 B 1 C3 C3 D2 D2 F1 A 1 A2 B1 B1 C1 C3 D1 D2 A 1 A2 B1 B1 C1 C3 D1 D2 Etc. La ventaja de las cruzas múltiples es que los genes de varios padres diferentes son combinados. Esto incrementa la variación genética en la progenie comparada con las cruzas simples. Cruzas Compuestas No existe una diferencia manifiesta entre las cruzas múltiples y las compuestas. La transición es gradual. En general, si el número de padres es mayor de 8 o 10, la cruza se denomina compuesta. Pueden intervenir hasta 50 o 60 padres en combinación, para lograr esta combinación se requieren varios ciclos de 105

106 cruzamiento. Esto aumenta la labor manual, emasculación y polinización, por lo que el uso de machoesterilidad puede ser una alternativa a considerar. Las cruzas compuestas se denominan balanceadas, cuando todos los padres contribuyen en partes iguales en los genotipos producidos al final del ciclo de cruzamientos. En muchos programas de mejoramiento las cruzas son desbalanceadas, algunos padres contribuyen en mayor o menor proporción en la progenie final. Selección en poblaciones segregantes Se denomina así a la forma como se conduce y selecciona el material segregante a partir de la generación F2 para la obtención de líneas puras homocigotas las que constituirán los nuevos y mejores cultivares. 1. Método de Crianza Masal o Bulk. 2. Método de Crianza Genealógico o Pedigree. 3. Selección en generaciones tempranas. 4. Descendencia de semilla única y modificaciones. 5. Retrocruzamiento. 6. Doble Haploides Método de Crianza Masal o Bulk El método de crianza masal o en bulk fue desarrollado por Nilsson-Elhe en la Swedish Seed Associaton con sede en Svalov, Suecia, a principios del siglo XX. El método fue adoptado en los Estados Unidos siendo utilizado por mejoradores de cebada, trigo, avena y soja. Este método se utiliza para endocriar material segregante hasta llegar a la obtención de un nivel deseado de homocigosis. El método consistió originalmente en someter a la población segregante a severas condiciones ambientales desde la F2 a F5/F6 permitiendo, de este modo, actuar a la selección natural. Las plantas débiles o con signos de susceptibilidad al ambiente son removidas manualmente antes de efectuar la cosecha. En la generación F6, cuando el 96,9% de homocigosis para todos los caracteres ha sido alcanzado, se comienza la selección individual de aquellos genotipos que posean características deseables. Las mejores líneas puras (plantas) son seleccionadas para su prueba preliminar en ensayos comparativos durante el siguiente año. La influencia de la selección natural debe ser considerada cuando se selecciona los ambientes en los cuales se sembrará la población a seleccionar. El mejorador debería, dentro de lo posible, seleccionar aquellos ambientes en los cuales la selección natural favorecerá los genotipos deseados por el mejorador. Si se selecciona por resistencia a una enfermedad el patógeno debe ser inoculado para reducir o eliminar las plantas susceptibles de la población. 106

107 Es motivo de discusión la presión de selección que se ejerce entre los individuos bajo crianza masal debida a la competencia entre diferentes genotipos en una misma población. La selección natural tiene lugar en una población de individuos híbridos que son cultivados en masa debido a que los genotipos difieren en su fertilidad y productividad y en su reacción frente al ambiente. Algunos genotipos son favorecidos por encima de otros cuya frecuencia decrece en forma gradual hasta su completa eliminación en algunos casos. Si dos genotipos están en competencia su supervivencia depende de: a) el número de semillas producidas por cada genotipo y b) el número de semillas producidas por sus progenies. F2 Siembra y cosecha masal F3 Siembra y cosecha masal F4 Idem F3 F5 Idem F4 F6 F7 F7 F7 F7 F7 F7 Selección de mejores Plantas o espigas ECR F8 F8 F8 ECR F9 F10 F9 F10 Líneas superiores Multiplicación Figura Método de Crianza Masal o Bulk en poblaciones segregantes Un experimento muy conocido fue conducido por Suneson (1949) quien condujo cuatro cultivares de cebada en mezcla (cv Atlas, Club Mariout, Hero y Vaughn). Cada uno de los cuatro cultivares tenía una frecuencia en la población original de 25%. Luego de quince años, el cultivar Atlas poseía una frecuencia de 88%, Club Mariout 11%, Hero 1%, mientras que el cultivar Vaughn fue eliminado completamente de la mezcla. Sin embargo, cuando estos cultivares fueron cultivados puros, el cultivar Vaughn superó en rendimiento al cultivar Atlas. Los mejores competidores en mezclas no siempre son los que alcanzan el mayor rendimiento cuando son cultivados en forma pura. Si los genotipos cuya frecuencia se incrementa generación tras generación son también superiores en rendimiento, la selección natural es de ayuda a la selección artificial practicada por el mejorador. El efecto de la selección natural en poblaciones en masa varía de acuerdo a las condiciones ambientales y de acuerdo al carácter a mejorar. Si se incrementa la distancia entre las plantas cultivadas en masa se puede neutralizar los efectos de la competencia entre los genotipos o plantas. 107

108 Se han sugerido algunas variantes del método masal para incrementar su eficiencia. Uno es denominado el Método Masal Mejorado, en el cual el material híbrido se cría en masa solo hasta la F4 en vez de hasta la F6. En la generación F4 se comienza con una selección individual de plantas sobresalientes, cuyas progenies son mantenidas y seleccionadas en forma individual durante las próximas generaciones. Es una combinación del método de crianza masal (hasta la F4) y del método genealógico o de pedigrí (F4 en adelante). Otra variante citada por el mismo autor es la Crianza Masal con Selección Positiva o Negativa. Esta variante requiere que ciertas características puedan ser selectas visualmente. La selección positiva para incrementar la frecuencia de plantas de altura media a baja comienza en F3. Para eliminar las plantas altas o muy altas, se visualizan y se seleccionan todas las plantas bajas o de altura media, cuyas progenies pasan a constituir el siguiente ciclo de selección (F4). La mayoría de las plantas altas tenderá a eliminarse de la población. Selección negativa se puede aplicar en contra de plantas que florezcan muy tardíamente simplemente removiéndolas del campo. Las que permanezcan, las más precoces serán cosechadas y sus progenies constituirán el próximo ciclo de selección. Método de Crianza Genealógico o de Pedigrí Este método se basa en practicar selección individual continuada en una población segregante conjuntamente con la valoración y evaluación de las progenies de cada planta selecta individualmente (pedigrí) hasta desarrollar líneas homocigotas. La selección no sólo es basada en el fenotipo sino que también en el genotipo lo que le confiere eficiencia al método para la obtención de líneas superiores a partir de poblaciones segregantes. Obviamente requiere de mucha mano de obra y trabajo adicional que si lo comparamos con el método masal o en bulk. Para que este sistema pueda ser llevado a cabo se debe tener en cuenta lo siguiente: Número de familias a manejar. Recursos disponibles. El personal capacitado para hacer la selección. El lote disponible para la siembra. La tasa de multiplicación de la especie. Implementación La selección genealógica o de pedigrí comienza en la generación F2 y continúa hasta completar el desarrollo de líneas homocigotas: Ciclo1: La población F2 (S0) se planta espaciadamente para permitir una completa expresión de su dotación genética y permitir la selección. Las plantas F2 son selectas sobre la base de características deseadas y cosechadas individualmente. 108

109 Ciclo 2: La progenie F3 de cada planta F2 selecta (Línea F2:3) son cultivadas por separado, usualmente en un surco. Se deja un espacio adecuado entre plantas dentro del surco para facilitar la selección. Los mejores surcos o progenies son selectos, luego se procede a seleccionar las mejores plantas F3 dentro de cada surco seleccionado. F2 Selección de plantas F3 F4 Selección entre y Dentro de familias Selección entre y Dentro de familias F5 Selección de líneas F6 F6 F6 F6 F6 ECR F7 F7 F7 F7 F7 F7 ECR F8 F8 F8 ECR F9 F10 F9 F10 Líneas superiores Multiplicación Figura Método de Crianza Genealógico o de Pedigrí Ciclo 3: La progenie F4 de cada planta F3 selecta (línea F3:4) son cultivadas por separado en un surco. Las progenies de plantas que provienen del mismo surco seleccionado selecto en el ciclo 2 son cultivadas en surcos adyacentes como familias. Las mejores familias son selectas, luego los mejores surcos dentro de cada familia selecta anteriormente y por último las mejores plantas dentro de cada surco son seleccionadas. El procedimiento descripto en el ciclo 3 se repite hasta que se obtienen líneas homocigotas identificadas, usualmente hasta F6/F7. Estas líneas son cosechadas individualmente y evaluadas en ensayos comparativos durante los próximos ciclos Observación dentro de la línea de algún carácter desfavorable. Realización de ensayos comparativos de calidad. ECR en diversas localidades y ambientes. Este método es apto para caracteres de alta heredabilidad, de manera de identificar aquellas plantas que corresponden al carácter en una generación temprana F2/F3. Este sistema está asociado con la selección visual, lo que significa tener habilidad para discernir, entre una influencia genética de una ambiental en la expresión del fenotipo. El sistema de crianza genealógico requiere de un ambiente donde se puedan expresar las diferencias genéticas. 109

110 Selección en generaciones tempranas La selección en generaciones tempranas es utilizada en plantas autógamas para estimar el potencial de un individuo, línea o población en un estado temprano de endocría. El objetivo es eliminar líneas o poblaciones que no ameriten consideración en las próximas generaciones de endocría y selección. En autógamas la selección en generaciones tempranas fue considerada un método de identificar poblaciones segregantes que podrían contener o dar lugar a líneas superiores. Immer (1941), trabajando con cruzas en cebada, indicó que ensayos repetidos de poblaciones segregantes en las generaciones F2 o F3 proporcionan un comportamiento medio del rendimiento de las diferentes cruzas. Los de mayor rendimiento son los que contienen la mayor proporción de genotipos de alto rendimiento. Los genotipos segregantes selectos son luego avanzados hasta alcanzar el nivel de homocigosis requerido. Otra alternativa es la selección de plantas F2 que dan lugar a progenies superiores a través de ensayos repetidos. Luego se selecciona entre y dentro de las líneas derivadas de cada planta F2 selecta hasta lograr un nivel de homocigosis adecuado. Esta variante fue utilizada por primera vez por H. Nilsson-Elhe en Suecia. Implementación Evaluación de poblaciones híbridas segregantes Poblaciones F2 provenientes de distintas cruzas son evaluadas. El número de localidades, años y repeticiones depende de los caracteres de interés. Caracteres con baja heredabilidad y alta interacción genotipo-ambiente requerirán extensiva evaluación que aquellos caracteres con alta heredabilidad y baja interacción genotipo-ambiente. Después de seleccionar las poblaciones se continúa la endocría hasta el nivel deseado de homocigosis y luego se seleccionan plantas individuales. Las líneas derivadas de estas plantas son probadas como potenciales nuevos cultivares de la misma manera que otras líneas derivadas de otros métodos. Ciclo 1: Semillas F2 son cosechadas de un gran número de poblaciones cruza en segregación. Ciclo 2: Ensayos repetidos con la semilla F2 cosechada. Las F2 con desempeño pobre son descartadas. Ciclo 3: Ensayos con semilla F3 cosechadas sobre poblaciones F2 selectas en ciclo anterior. Las F3 con desempeño pobre son descartadas. Ciclo 4: Semillas F4 de poblaciones selectas son cultivadas y se seleccionan plantas individuales Ciclo 5: Líneas F4:5 son evaluadas por características de interés 110

111 El mejorador puede utilizar la semilla de los ensayos para avanzar a homocigosis solo si no existen mezclas con otras poblaciones o si no existió un elevado porcentaje de fertilización cruzada. Las líneas F4:5 pueden ser avanzadas a homocigosis por el método de pedigree o por la descendencia de semilla única. En cualquier caso las pruebas de cruzas en masa miden solamente el promedio de una cruza, pero no dan una idea de la variabilidad dentro de la cruza. Por otra parte, la selección temprana requiere tiempo y esfuerzo que los mejoradores no siempre están dispuestos a realizar. Evaluación de líneas derivadas de plantas F2 Este método se conoce como líneas derivadas de F2 o método de selección familiar en F2. Ciclo 1: Se cultiva la generación F2 y las plantas con características deseables son cosechadas individualmente de cada población Ciclo 2: Líneas F2:3 son cultivadas y aquellas con los caracteres requeridos son cosechadas en masa. Ciclo 3: Líneas F2:4 son incluídas en ensayos repetidos descartando aquellas líneas con pobre desempeño. Ciclo 4: Las semillas F5 de plantas selectas son sembradas y se procede a seleccionar plantas con características favorables las cuales son cosechadas individualmente a partir de cada línea. Ciclo 5: Se evalúan las líneas derivadas de plantas F5 para caracteres de interés. La líneas selectas a través de ensayos (ciclo 5) son avanzadas a homocigosis mediante el método en masa, pedigree o SSD. Factores a considerar 1. Las líneas se pueden derivar de la generación F2 o de la F3 2. Las pruebas de las líneas mediante ensayos dependen de la cantidad de semilla disponible de cada línea. Es posible que se necesite en algunos casos una generación extra de reproducción para disponer de suficiente semilla para los ensayos, sobre todo si se cuenta con una o pocas plantas selectas de una misma línea F2 o F3. 3. El mejorador debe asegurarse que la semilla obtenida en cada etapa debe estar lo más pura posible, es decir, libre de contaminación por mezcla con otras líneas o con un elevado porcentaje de fertilización cruzada. 111

112 4. A mayor cantidad de plantas selectas de cada línea heterogénea, mayor la probabilidad de evaluar la variabilidad genética dentro de la línea. Esto debe estar, por supuesto, balanceado por el mejorador de acuerdo a los recursos con que dispone. El éxito del método de líneas derivadas de F2 depende en gran parte de la rapidez de fijación de los genes que gobiernan caracteres cuantitativos. Una alternativa sería identificar líneas que son relevantes para un carácter y proceder a combinar estas líneas como padres obteniéndose nuevas cruzas. De esta forma se incrementaría la probabilidad de recombinación génica y la posibilidad de ruptura de ligamientos lo que da lugar a una forma de selección recurrente como la que se practica comúnmente en alógamas. Un serio contratiempo es que la cruza artificial en autógamas es más trabajosa y dificultosa que en plantas alógamas, sobre todo cuando se tienen que recombinar numerosos padres, como ocurre en cereales de invierno. Ventajas y desventajas de la selección en generaciones tempranas Ventajas 1. Individuos inferiores, líneas o poblaciones pueden ser descartadas en una etapa temprana del proceso de endocría 2. Se pueden obtener más de un cultivar a partir de una misma población o línea heterogénea Desventajas 1. Una gran cantidad de recursos son necesarios a medida que aumenta el número de poblaciones o líneas a evaluar 2. La prueba en diferentes localidades y/o años puede extender el tiempo requerido para la obtención de un nuevo cultivar. Descendencia de semilla única (SSD) El método de la descendencia de semilla única, representado de aquí en adelante por sus siglas en inglés: SSD (Single Seed Descent), consiste en avanzar poblaciones híbridas mediante la cosecha en cada generación de una única semilla de cada planta.el objetivo de este método es lograr en un menor tiempo el nivel de homocigosis deseado en una población en endocría. Es un método apto para su desarrollo en condiciones de invernadero o de contraestación. Debido a que las poblaciones SSD son pequeñas comparadas con aquellas requeridas para la selección por pedigrí o por bulk, este método permite un avance más rápido hacia la homocigosis mediante la utilización de cámaras de cría o invernaderos. Como solo se busca obtener, al menos, una semilla viable por planta, se puede utilizar mayor densidad de siembra. Siempre que la pérdida de plantas sea reducida, el SDD mantiene toda la mayor parte de la 112

113 diversidad genética durante las generaciones. Las pérdidas pueden resultar de fallas en la germinación, muerte de plantas por enfermedades o simplemente que algunas plantas no produzcan semillas. A pesar que el método SSD, puede acelerar el proceso comparado con el método de pedigrí, no se realiza selección alguna durante la endocría. Se ha propuesto que, para mejorar la eficiencia, rapidez y economía del método, es mejor combinar el método de pedigrí y el SDD. Esto se realiza mediante una fuerte selección en F2 y F3 para caracteres de alta heredabilidad utilizando el método de pedigrí y luego seguir con el SSD hasta F6/F7. Procedimiento El procedimiento clásico es cosechar una semilla de cada planta perteneciente a la población, mezclar las semillas y plantarlas en masa en el próximo ciclo. Ciclo 1: Se cultivan plantas F2. Una semilla F3 de cada planta es cosechada de todas las plantas de la población, mezclándose las semillas. Otra muestra de semillas es cosechada como reserva Ciclo 2: Se siembra las semillas F3 en masa. Una semilla F4 de cada planta es cosechada de todas las plantas de la población, mezclándose las semillas. Otra muestra de semillas es cosechada como reserva El procedimiento se repite hasta alcanzar el nivel deseado de homocigosis. En esta etapa se cosechan plantas individuales y las líneas derivadas de ellas son evaluadas para las características de interés. Un problema con este método es que el tamaño de la población puede decrecer debido a fallas en la germinación o la no producción de semillas por parte de algunas plantas. Este procedimiento asegura que cada uno de los individuos en la población final pueda ser remontado a su original individuo F2. Sin embargo no asegura que un individuo F2 en particular estará representado en la población final (F5-F6), debido a que una falla en la germinación automáticamente elimina toda la familia que partió de una planta F2. Retrocruza El método de retrocruzamiento se utiliza para transferir resistencia a un cultivar que presenta buenas características agronómicas pero que es susceptible a una determinada enfermedad. El objetivo es el mejoramiento de un cultivar ya existente, no el desarrollo de un cultivar completamente nuevo. El procedimiento de cruza y selección varía si la resistencia a transferir está condicionada por genes dominantes o recesivos. 113

114 F2 F3 Siembra y cosecha de una semilla por planta Idem F2 F4 Idem F3 F5 Idem F4 F6 F7 F7 F7 F7 F7 F7 Cosecha de todas las plantas Multiplicación a Campo F8 F8 F8 ECR F9 F10 F9 F10 Líneas superiores Multiplicación Figura Esquema del método de descendencia de semilla única (SSD) para la obtención de líneas puras. Transferencia de genes dominantes Se dispone del cultivar A (padre recurrente) que es susceptible a la roya del tallo (rr) que debe ser cruzado con otro cultivar B (padre donante) que posee los genes para resistencia (RR) para la roya (Puccinia graminis f.sp. tritici). El objetivo del método es obtener plantas del tipo del padre recurrente pero con resistencia a la enfermedad. Las plantas F1 resultantes de la cruza son resistentes pero heterocigotas (Rr) y ellas deben ser retrocruzadas por el padre recurrente A. La progenie de la primera retrocruza (RC1F1) segrega 50% de plantas resistentes (Rr) y 50% de plantas susceptibles (rr). Para separar plantas resistentes de las susceptibles se prueban las mismas en el estadio de plántula en invernadero. Las pruebas se repite en plantas adultas en el invernadero y a campo. Solamente aquellas plantas cuya resistencia se confirma son cruzadas por el padre recurrente (RC2F1), repitiéndose el procedimiento en la tercera retrocruza (RC3F1). Como el objetivo es obtener plantas del tipo del padre recurrente pero resistente, es necesario dejar segregar la generación F2 (RC3F2) para poder seleccionar las plantas deseadas. Esta generación es usualmente cultivada en el campo e inoculada para comprobar su nivel de resistencia. Las plantas resistentes y que respondan al tipo paterno son individualizadas y cosechadas. Las semillas son cultivadas en la generación F3. Plantas resistentes de RC3F3 son de nuevo cruzadas don el padre recurrente y aquellas plantas BC4F1 que demuestren resistencia son seleccionadas. Estas 114

115 plantas son retrocruzadas con el padre recurrente una vez (RC5F1) o dos veces (RC6F1). En principio no son necesarias más retrocruzas pues el padre recurrente ha sido restituido en un 96,9%. Las líneas son seleccionadas por el método genealógico o de pedigrí y probadas en su rendimiento y en su resistencia. Transferencia de genes recesivos Cuando los genes a transferir son recesivos el procedimiento, si bien es similar al anterior, es más complejo y puede demandar más tiempo comparado con el de transferencia de genes dominantes. Es necesario evaluar cuidadosamente las progenies y autofecundar los genotiposa fin de separar las plantas con los genes en homocigosis de aquellas con genes en heterocigosis Una forma de reducir esta evaluación extensiva de progenies es contar con marcadores moleculares fuertemente ligados al carácter de interés, en este caso a los genes recesivos. Padre Recurrente (R) Variedad Comercial Susceptible Padre Donante (D) Raza, ecotipo Resistente P1 aa x AA F1 Aa x aa 50% R RC1 aa Aa x aa 75% R RC2 aa Aa x aa 87,5% R RC3 aa Aa x aa 93,75% R RC4 aa Aa x aa 96,87% R RC5 aa Aa x aa 98,43% R Autofecundación Aa AA Aa aa AA AA Aa aa Figura Transferencia de genes dominantes mediante retrocruza 115

116 Genes Recesivos Padre Recurrente (R) Variedad Comercial Susceptible Padre Donante (D) Raza, ecotipo Resistente P AA x aa 50% F1 Aa x AA RC1 AA Aa 75% No segrega, eliminar Autofecundación RC2 AA Aa aa x AA 87,5% RC3 Aa x AA 93,75% R Figura Transferencia de genes recesivos mediante retrocruza Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Cubero, J., Introducción al mejoramiento genético vegetal. Mundiprensa, Madrid, 365 pp. Hayward, M. D., Bosemark, N. O., Romagosa, Plant Breeding: Principles and Prospects., I. Chapman and Hall Ltd. Sleper D. A. and J. M. Poehlman, Breeding Field Crops, 5th Edition, Blackwell Publishing, 424 p. 116

117 Unidad 11. Métodos de Mejoramiento en plantas asexuales. Selección clonal La selección clonal se basa en tres aspectos: Distinción, Homogeneidad y Estabilidad. Estos se reparten en tres etapas de la selección: Obtención, Comparación y Multiplicación. 1ra Etapa: Obtención de los clones Poblaciones naturales sin selección, poseen generalmente gran variabilidad y la discriminación entre individuos es relativamente sencilla. Poblaciones naturales que hayan sido seleccionadas empíricamente (selección masal). La variabilidad es reducida y la discriminación más dificultosa Poblaciones resultantes de la cruza sexual de dos o más clones. Los clones parentales deben poseer caracteres contrastantes para asegurar una gran variabilidad y/o complementación en F2. Dependiendo la especie (anual o perenne), y de la variabilidad genética existente, esta etapa puede requerir varios años de evaluación, sobre todo en el caso de ser necesario la evaluación de potenciales clones para su cruzamiento. La heterogeneidad de la población deberá ser lo más grande posible para permitir obtener un adecuado progreso genético por selección 2da. Etapa: Comparación y selección de los clones Selección de plantas individuales y clonación de las mismas. Los clones deben presentar caracteres netamente visibles y estables en el tiempo para su distinción. La comparación a través de la experimentación debe poner en evidencia esas diferencias entre los clones. En esta etapa, cuando el número de clones se reduce por selección, se introducen los cultivares testigos para su comparación (ECR). Esta comparación se continúa en la etapa 3. 3ra. Etapa: Multiplicación de clones selectos Consiste en aumentar el número de individuos pertenecientes a los clones selectos. Los clones selectos deben permanecer estables y libres de enfermedades a través de los ciclos de multiplicación. Esta etapa concluye con la descripción varietal, la inscripción de la nueva variedad y su liberación a los agricultores. 117

118 UTILIZACIÓN DE LA APOMIXIS EN EL MEJORAMIENTO VEGETAL La cría de cultivares apomícticos sería posible en cualquier especie donde las cruzas entre plantas sexuales por apomícticas pueden ser recuperadas en la F1 y/o generaciones sucesivas. Los cruzamientos entre plantas sexuales y apomícticas usualmente originan una gran cantidad de variación genética debido a la heterocigosidad de los padres apomícticos. Esta heterocigosidad no se libera en un individuo apomíctico a menos que sea cruzado como progenitor masculino con una planta sexual. Las características ideales de los genes que controlan la apomixis en un programa de cría incluye herencia simple, dominancia, expresión obligada, estabilidad ambiental, y formación normal del embrión y del endospermo. Diferentes niveles de expresión y mecanismos pueden existir en un mismo género; por lo tanto, seleccionando las especies o genotipos con el mayor número de estas características podría realizarse exitosamente el mejoramiento de plantas utilizando la apomixis. La herencia de los genes que controlan la apomixis, determinara en alto grado el método de mejora a aplicar. Las investigaciones han mostrado que la apomixis, usualmente, está determinada por unos pocos genes que pueden ser tanto recesivos como dominantes. La apomixis controlada por genes recesivos puede ser introducida mediante cruzamientos por el padre o madre heterocigota. Las progenies resultantes consistirán tanto de plantas sexuales como apomícticas. Posteriormente, una planta sexual heterocigota puede ser autofecundada para producir más progenie sexual o apomictica. Las plantas apomícticas superiores de cada F1 o generación autofecunda puede disponerse para evaluar su comportamiento en ensayos. Algunos métodos de cría ha sido delineados para una acción génica recesiva o dominante incompleta. La apomixis controlada por gene(s) dominantes solo puede ser introducida a través del progenitor masculino apomíctico. Las progenies resultantes consiste tanto de plantas apomícticas como de sexuales porque muchos apomícticos serán heterocigotas debido al método de reproducción. El mejoramiento podría continuarse repitiendo el cruzamiento de plantas superiores con machos polinizadores superiores apomícticos. Las plantas apomícticas obligadas superiores son elegidas (seleccionadas) en cada generación y cada una de ellas representa potencialmente un nuevo cultivar. La reproducción apomíctica puede variar desde obligada a facultativa (parcialmente sexual) con lo cual varia el grado de apomixis tanto entre como dentro de las especies y genotipos. La apomixis obligada es lo más deseable como mecanismo para utilizar en el mejoramiento de plantas. La apomixis facultativa es más difícil de manipular y se necesitan esfuerzos tales como intercruzamiento entre plantas con altos niveles de apomixis para aumentar la frecuencia de apomícticos. Se necesitan muchas pruebas de progenie en los tipos facultativos para identificar al mejor apomíctico y para evaluar a los genotipos para su estabilidad genética. 118

119 MEJORAMIENTO EN PLANTAS APOMICTICAS Esquema General 1 Etapa: Elección de progenitores Si se cuenta con padres con apomixis obligada es necesaria la inducción de la floración para permitir la recombinación sexual. Si los padres conservan la reproducción sexual se procede a realizar cruzamientos directamente entre ellos. 1 año: Inducción de apomixis facultativa (de ser necesario), cruzamiento y obtención de F1, cosecha de semilla F1. 2 año: siembra masal de semilla F1 a campo, obtención de plantas F1 (altamente heterocigotas), selección de plantas F1, posible manifestación de heterosis, cosecha individual de semillas de cada planta F1. 2 Etapa: Determinación de la presencia de Apomixis Obligada 3-5 años: parcelas progenies con la semilla de plantas F1, conjuntamente con parcelas clonales de la misma planta F1. Se determinan las progenies con apomixis obligada (indicadores de apomixis)),. Esta etapa dura hasta comprobar la existencia de apomixis en las parcelas de plantas F1 seleccionadas. Si las F1 selectas no muestran un alto grado de apomixis, puede ser necesario retrocruzarlas por el padre con alto grado de apomixis. 3 Etapa: E.C.R con semilla F1 de Apomixis Obligada Selecta, 2 3 años. Multiplicación por semillas. Descripción e inscripción del nuevo cultivar. En la figura 1 se muestra un esquema general para la obtención de un cultivar apomíctico. El método puede admitir variantes dependiendo del grado de apomixis, posibilidad de autofecundaciones para eliminar genes deletéreos, etc: Se puede comenzar con la autofecundación de una parcialmente apomíctica en vez de realizar la cruza entre una sexual y otra apomíctica. Combinación de autofecundación e intercruzamientos entre sexuales y apomícticos y entre las F1 s. Para identificar las apomícticas es necesario utilizar los indicadores de apomixis o realizar estudios a nivel de saco embrionario. 119

120 Sexual x Apomíctica Siembra y Autofecundación de las F1 Apomícticas + Sexuales Selección de las mejores apomícticas obligadas Nuevo Cultivar Figura Esquema general de mejora para el desarrollo de cultivares apomícticos obligados. APLICACIÓN DE LA APOMIXIS EN EL MEJORAMIENTO GENÉTICO VEGETAL Cruzas de individuos con apomixis facultativa. Partenogénesis diploide en Poa pratensis. Método 1 Madre con alto grado de apomixis X Padre con alto grado de apomixis Bajo número de híbridos obtenidos, pero con alto grado de apomixis Híbridos superiores selectos pueden ser mantenidos y propagados asexualmente 120

121 Método 2 Madre con bajo grado de apomixis X Padre con alto grado de apomixis Alto número de híbridos, pero con bajo grado de apomixis. Mayor variabilidad para la selección que en el método 1. Híbridos superiores deben ser fijados mediante cruzas con individuos con alto grado de apomixis Método 3. Cruzas interespecíficas en Poa. Cuando se cruzan una especie sexual por otra especie apomíctica, los híbridos resultantes son casi siempre sexuales. En las generaciones siguientes hay que aumentar el grado de apomixis de los recombinantes seleccionados. LL P.longifolia Sexual - hexaploide X PaPa P. pratensis LPa X Nueva Variedad PbPb Repetidas retrocruzas con PbPb o con otros PP genotipos Durante el procedimiento de retrocruza el mejorador debe mantener los cromosomas L responsables de la sexualidad hasta la última generación. 121

122 Método 4. Cruzas interespecíficas en Poa. Cuando se desea obtener iguales contribuciones de los dos genotipos: A y B. LL x PaPa LPa X LL x PbPb LPb Ej: PaPb 122

123 Unidad 12. Métodos de Mejoramiento en plantas alógamas. Introducción El desarrollo de poblaciones de polinización libre mejoradas constituye un proceso que apunta a aumentar la frecuencia génica de alelos deseables en una población determinada, que es una mezcla de genotipos diferentes y, al mismo tiempo, mantener un alto grado de heterocigosis. El aumento de frecuencia de los genes favorables se consigue a través de diferentes métodos de selección, constituyendo un proceso dinámico en que el mejoramiento es conducido de una manera continua y progresiva. La tasa de aumento de las frecuencias génicas, como efectos de una selección, depende de muchos factores interrelacionados, entre los que se pueden mencionar: la variabilidad genética presente en la población original, el método de selección empleado, el tamaño efectivo de la población, la precisión en las evaluaciones de los genotipos, la influencia del ambiente (localidades y años), los efectos pleitotrópicos y las correlaciones fenotípicas y genotípicas. Hay varias modalidades de selección, entre las cuales, las principales diferencias se refieren al modo de control parental de los progenitores seleccionados, existencia o no de evaluación de progenies y el control del ambiente (Figura 12.1). Métodos de Mejoramiento Selección masal La selección masal es el procedimiento más antiguo de mejora genética de plantas. Implica seleccionar individuos en una población sobre la base de su fenotipo, mezclar sus semillas y cultivarlas en un ciclo siguiente con el fin de obtener una nueva población mediante la recombinación de las plantas selectas por su fenotipo (Figura 2). El proceso es cíclico y se repite hasta conseguir una nueva población adecuada a las necesidades planteadas o hasta que la respuesta a la selección no justifique su continuidad. La teoría detrás de este tipo de selección es que los genotipos que mejor se adapten a las condiciones ambientales van a prevalecer sobre los menos adaptados. En cada ciclo de selección se producen cruzamientos entre plantas seleccionadas en la generación anterior, con lo cual se aumenta la posibilidad de obtener nuevas combinaciones génicas que no existían en la población original. El mejorador puede dejar que las plantas se crucen libremente entre ellas, lo que se denomina polinización abierta, o seleccionar plantas individuales y permitir solo el cruzamiento entre ellas. 123

124 POBLACIÓN ORIGINAL REINICIAR SELECCIÓN NUEVO CULTIVAR RECOMBINACIÓN SELECCIÓN EVALUACION REPRODUCCION COSECHA Figura Etapas generales en el mejoramiento de poblaciones de plantas alógamas Dado que las plantas son escogidas por su apariencia fenotípica, sin valoración genotípica, la selección masal ha demostrado ser eficiente en el mejoramiento de caracteres de alta heredabilidad, tales como la prolificidad, la longitud de mazorca y la altura de mazorca en maíz. Sin embargo, se ha logrado mejorar indirectamente el rendimiento de maíz a través de selección masal por prolificidad. Con resultados satisfactorios ha sido utilizada para la obtención de sintéticos y compuestos y para la adaptación de material exótico. Luego del redescubrimiento de las Leyes de Mendel los mejoradores prefirieron otros métodos como la selección por pedigrí y selección de líneas puras, ya que estos permiten una ganancia más rápida por selección. En el caso del maíz se citan las siguientes causas como motivo de la falta de eficiencia de la selección masal: 1. No se controla el padre masculino 2. El fenotipo no es confiable debido a la ocurrencia de la interacción genotipo ambiente y a la incidencia de variabilidad del suelo sobre la expresión fenotípica. 3. La evaluación es subjetiva. 4. El carácter principal bajo selección, el rendimiento, es de baja heredabilidad. 5. Cuando la muestra selecta es pequeña hay depresión por endocría. 124

125 Figura Esquema general del método de selección masal en alógamas Luego del desarrollo de la teoría y técnicas experimentales para la estimación de la heredabilidad, conjuntamente con la acción génica para caracteres cuantitativos, la selección masal puede ser exitosa sí: 1. La acción génica para el o los caracteres seleccionados es aditiva. 2. La heredabilidad estricta del carácter es alta. 3. Los caracteres seleccionados están correlacionados genéticamente. 4. El tamaño de muestra es lo suficientemente grande para evitar endocría. Selección masal simple Básicamente consiste en cosechar las mejores plantas y utilizar sus semillas mezcladas para la siembra de la próxima generación. El control parental es realizado solamente a través del progenitor femenino, toda vez que las gametas masculinas provienen de toda la población. Tampoco hay control del ambiente, de tal manera que las mejores plantas generalmente son aquellas que ocurren en las partes más fértiles o más favorables del terreno. A pesar de estas limitaciones, la selección masal ha sido intensamente practicada dada su facilidad de implementación y los pocos recursos necesarios. Este tipo de selección fue la responsable del elevado grado de domesticación y aumento en la productividad de muchos de los actuales cultivos, por ejemplo en maíz de una espiga produciendo en promedio de 15 a 20 granos, fueron obtenidas variedades con espigas de 500 o más granos. 125

126 Al final del siglo pasado y primera década del presente, varios programas de selección masal fueron conducidos en los Estados Unido. De modo general, esos programas no condujeron a resultados alentadores. Más recientemente, la selección masal principalmente para características agronómicas, ha sido utilizada para la obtención de sintéticos y compuestos para favorecer la recombinación o para la adaptación de germoplasmas exótico. En muchos casos han sido obtenidos resultados significativos para cada carácter, incluyendo la producción de granos. Es importante como fue mencionado, que la variación genética predominante sea del tipo aditiva, para que a selección masal sea efectiva. Selección masal estratificada Con el objeto de hacer a la selección masal más eficiente, se empleo un esquema que permite un cierto control sobre la heterogeneidad del suelo. Se trata básicamente de dividir al campo en parcelas o estratos, procediéndose a la selección de plantas en cada estrato independientemente de los demás. Cada estrato representa una unidad ambiental independiente. A modo de ejemplo, se siembra un lote aislado con cerca de plantas con espaciamiento regular (por ejemplo 0,3 m entre plantas y 0,7 m entre líneas). A la cosecha, el campo es dividido en parcelas o estratos. Un tamaño usual para el estrato, puede ser aproximadamente 10 m2 (una hilera de 10 m o dos hileras de 5 m). En la cosecha la selección se efectúa separadamente para cada estrato, basándose en la premisa que, dentro de cada parcela no debería existir gran heterogeneidad del suelo debido a su reducido tamaño. Se escoge la intensidad de selección deseada, la cual se usa en cada estrato, siendo la más empleada del 5 al 20 %. En el caso de usar un 10 % de intensidad de selección, como cada estrato debe tener 33 plantas, se escogen las 3 o 4 mejores. Se procede de manera semejante en los demás estratos. La selección se realiza para plantas competitivas (las que no presentan fallas vecinas). Las espigas de las plantas seleccionadas proveerán la semilla para la próxima siembra. Para garantizar una muestra adecuada, se retira el mismo número de semillas de cada espiga. Entre las ventajas de la selección masal estratificada, podemos mencionar las siguientes: 1) Control sobre la heterogeneidad del suelo. 2) El tamaño efectivo de la población es grande. 3) Puede aplicarse una fuerte intensidad de selección (1 al 5 %). 4) Se obtiene un ciclo por año. Entre las limitaciones podemos mencionar: 126

127 1) No hay control de la descendencia. Plantas fenotípicamente buenas, podrán dar descendencias inferiores, debido a condiciones del ambiente y a interacciones génicas especiales. 2) El material es evaluado en una sola localidad. Con el tiempo la tendencia es aumentar la adaptación para áreas específicas. No se obtiene por lo tanto, poblaciones con adaptación amplia. 3) Hay tendencia de las plantas más altas a ser más productivas por la fuerte competición entre ellas. Plantas bajas potencialmente buenas se verán perjudicadas, no expresando su potencial. El uso de espaciamiento más largo disminuye ese problema, el que puede llevar a una población que no soporte espaciamientos más densos. Otros esquemas de selección masal Después de los progresos obtenidos por la selección masal estratificada, ese esquema pasó a interesar a muchos mejoradores. Con el propósito de aumentar su eficiencia, varias modificaciones fueron sugeridas, algunas de las cuales experimentadas en pequeña escala como la siguiente: a) Selección Masal Estratificada Genéticamente Este esquema procura controlar la heterogeneidad del suelo a través de la siembra intercalada de plantas de genotipo constante. Ejemplificando, un híbrido doble o simple (siendo preferible este), que corresponde a un genotipo constante, es sembrado después de cada dos golpes de semilla de la población que está siendo seleccionada. La disposición a campo es la siguiente: En donde los círculos llenos representan las plantas de la población y los círculos vacíos las plantas del genotipo constante (híbrido). Cada estrato esta por lo tanto, formado por las dos plantas adyacentes al genotipo constante. La selección será hecha en función de las producciones de plantas ajustadas en relación a la producción de la planta de genotipo constante del estrato. Por lo tanto, si en un estrato la planta del híbrido produce 200 grs y las plantas adyacentes producen 220 y 190 grs, respectivamente, eso indica que esas plantas producirán 110 y 95 % en relación al híbrido. Con el fin de evitar problemas de contaminación de las plantas de genotipos constantes en la población, pueden usarse dos alternativas: a) Uso de una población homocigota para un gen recesivo con expresión en el endosperma y que por lo tanto exhibe el efecto de xenia. En ese caso los granos provenientes de los cruzamientos son identificados y serán eliminados. Tal es el caso de poblaciones de granos blancos o maíz opaco. b) la otra alternativa es el empleo de plantas de genotipo constante (híbrido) machoestériles. C) Las plantas genotipo constante deben ser despanojadas. 127

128 b) Selección Antes de Floración Con la finalidad de mejorar la eficiencia de la selección masal algunos investigadores han sugerido la eliminación de las plantas inferiores antes de floración. Lo que aumenta la eficiencia de selección. Como la producción de maíz solo es visualizada después de la floración, el reconocimiento de las plantas inferiores antes de floración es muy difícil. Solo aquellas plantas más débiles, enfermas, poco vigorosas, etc., pueden ser reconocidas. c) Selección masal con control de ambos sexos La selección masal para prolificidad con control en ambos sexos fue propuesta para incrementar el control parental. El objetivo es aumentar la prolificidad permitiendo que solo las plantas prolíficas se polinicen entre ellas. Consiste esencialmente en proteger las segundas espigas (espiga inferior) de las plantas prolíficas, antes de la aparición de los estigmas. Luego de cubrir las espigad de un número adecuado de plantas, por ejemplo 500 individuos, todas las plantas no prolíficas son despanojadas. Seguidamente se renueven las bolsas de las segundas espigas, siendo estas libremente polinizadas por las plantas prolíficas las que se cosecharán para el siguiente ciclo. Selección en base a prueba de progenie La prueba de progenie fue definida como la Evaluación de genotipos de los progenitores con base en el fenotipo de sus descendientes. Tradicionalmente la prueba de progenie ha sido usada para evaluar el genotipo de animales, plantas perennes y de propagación vegetativa. Después de la obtención y evaluación de las progenies, son identificados los progenitores superiores que darán origen a las progenies. Estos progenitores superiores, son los que serán utilizados para la obtención de la generación siguiente mejorada (Figura 3). En maíz, que es un cereal anual, las plantas no sobreviven en relación a su progenie, siendo necesario por lo tanto, usar a sus descendientes para la continuidad de su contenido genético. Cuando son utilizadas progenies autofecundadas para perpetuar las plantas probadas, se espera que la estructura gamética producida por esa progenie sea equivalente a la producida por la planta madre. Por eso, cuando se utilizan otros tipos de progenie (medios hermanos o hermanos completos) para representar a la planta madre, o prueba de progenie, pierde eficiencia por un menor grado de afinidad resultante entre el material probado y el material utilizado para reproducción de la planta madre. La selección por prueba de progenie es de mayor eficiencia en relación a selección de plantas individuales (selección masal o fenotípica), debido a que la selección se basa en el valor medio de varios individuos para un carácter determinado. En cambio en la selección masal se basa la selección en el valor único para el carácter de un solo genotipo. Debido a que la selección se realiza en base a valores medios es posible mejorar caracteres de menor heredabilidad con mayor eficiencia comparada con la selección masal. 128

129 Metodología 1.- Selección de plantas 1. Población original: variedades de polinización libre, F2 de híbridos, variedades sintéticas, variedades con amplia base genética. 2. Caracteres a mejorar: de alta o baja heredabilidad ej. Altura de planta, altura de inserción de la primera mazorca, ciclo, componentes del rendimiento. 3. Tamaño de la población: aproximadamente plantas. 4. Intensidad de selección: %. 5. Tipos de progenies: Medios hermanos, Hermanos completos y progenies autofecundas (S1). De cada espiga cosechada se separan dos muestras, una para los ensayos de la 2da. Etapa y la otra para la recombinación en la 3ra.etapa. 2.- Evaluación y selección de progenies 1. Disposición de las progenies en un diseño experimental adecuado. 2. Tamaño de parcela: usualmente de 1 a 3 surcos de 5 a 7 m de longitud 3. Inclusión de testigos, uno de los cuales es la población original. 3.- Recombinación de las progenies seleccionadas en 2 con semilla remanente. Esquemas de Selección Espiga por hilera Posiblemente la mayor limitación de la selección masal es la falta de control o evaluación de la descendencia. El progreso solo es conseguido en función de la superioridad de los descendientes y no tanto de los progenitores. Louis de Vilmorin ya había descubierto en 1840 que la evaluación de la descendencia era vital para el mejoramiento. Verificó que raíces de remolacha de alto tenor de azúcar, pueden dar descendencia de alto o bajo tenor de azúcar. Basado en ese descubrimiento, creo un método que lo denominó Principio de Aislamiento, consistiendo esencialmente en evaluar las progenies de raíces de remolacha y escoger aquellas que daban descendencia de alto tenor de azúcar. 129

130 Figura Esquema general de la selección en base a prueba de progenies en plantas alógamas El éxito de Vilmorin indujo a investigadores de Estados Unidos a utilizar un procedimiento similar en maíz para selección de bajo y alto tenor de aceite y proteína. Esos trabajos se iniciaron en Illinois, en 1896, y alcanzaron éxitos en la modificación de los tenores de aceite y proteína. El proceso recibió el nombre de selección espiga por hilera, pues se sembraba la descendencia de cada espiga en una hilera para evaluación. Selección entre y dentro de familias de medios hermanos En 1964 Lonnquist sugirió una modificación de la selección espiga por hilera denominando al esquema selección espiga por hilera modificado. Este esquema tuvo buena aceptación y se mostró de eficiencia satisfactoria. Se trata de evaluar y seleccionar las mejores progenies de medios hermanos y luego, seleccionar las mejores plantas dentro de las progenies seleccionadas. Paterniani (1967) propuso la denominación de selección entre y dentro de progenies de medios hermanos, para este esquema. El método consiste en seleccionar un número determinado de espigas de polinización libre de la población a ser mejorada. Las espigas son trilladas y las semillas de cada progenie son colocadas en bolsas individuales. Las progenies de medios hermanos son evaluadas en ensayos de producción, en donde se anotarán todos los caracteres de interés. Generalmente son evaluadas de 200 a 500 progenies. En función de los resultados de los ensayos, son escogidas las mejores progenies. Generalmente se practica una intensidad de selección entre el 10 y el 20 %. Esta etapa constituye la selección entre progenie. Las mejores progenies así seleccionadas son recombinadas entre sí en la generación siguiente. Para eso se usan las semillas remanentes de esta progenie. 130

131 En el momento de la cosecha, se elige dentro de cada hilera femenina las mejores plantas. Esa etapa constituye la selección dentro de progenie. Las espigas de esas plantas formarán las nuevas progenies de medios hermanos y serán sembradas en la generación siguiente iniciándose así un nuevo ciclo. Selección entre y dentro de familias de hermanos completos Las familias de hermanos completos corresponden a la descendencia de cruzamiento entre 2 plantas. En una población a ser mejorada pueden obtenerse innumerables progenies de hermanos completos a través de cruzamiento de plantas de a pares, así 200 progenies de hermanos completos son obtenidas de 400 plantas de la población. El procedimiento es igual al anterior de medios hermanos, o sea las progenies son evaluadas en ECR y las mejores recombinadas para iniciar un nuevo ciclo. El método de selección de progenies de hermanos completos fue propuesto por Harland en1946, que consiguió resultados sustanciales en el mejoramiento. Selección entre y dentro de familias endogámicas S1 o S2 Esta selección empleando progenies endogámicas con una (S1) o dos generaciones de autofecundación (S2) es similar en metodología a los mencionados anteriormente, es decir se obtienen un número adecuado de progenies, se las evalúa en ECR y las mejores son recombinadas. Si se desea obtener progenies S2, el esquema se alarga un ciclo para, mediante autofecundación de plantas a partir de las progenies S1, se obtendrán progenies S2. Esa recombinación puede hacerse del mismo modo que en los demás tipos de progenie, esto es, en lotes aislados, en donde las hileras femeninas (por eliminación de la panoja) constituyen las progenies seleccionadas y las hileras masculinas una mezcla de esas progenies. Las semillas obtenidas de esa recombinación representan el primer ciclo de selección. En el caso de que se desee efectuar una recombinación más completa, el material será sembrado por más de una generación. Esa recombinación completa es más deseable, aunque sea necesario emplear una generación adicional. Después de la recombinación, se inicia el ciclo siguiente autofecundándose las mejores plantas de la población del ciclo 1. El uso de progenies endogámicas en el mejoramiento de poblaciones, es recomendado para caracteres de baja heredabilidad, porque la endogamia aumenta la variancia genética entre progenies y conduce al aumento del progreso esperado por la selección. El método requiere polinización controlada y el tamaño efectivo es el menor de todos, cuando se lo compara con el mismo número de progenies seleccionadas por otros métodos. 131

132 Tabla 12.1 Respuesta para rendimiento en siete métodos de selección en la misma población de maíz (media de 12 ambientes). Método de Selección Respuesta Promedio (%) Hermanos completos 1,4 Medios hermanos 1,6 Masal 0,6 Espiga por hilera 3,6 H.C. Recíprocos 2,6 S1 1,9 S2 4,5 La selección recurrente entre líneas S1 ha probado ser muy efectiva en el mejoramiento poblacional de maíz, dado que aprovecha muy bien los efectos aditivos. Este método es además conocido por reducir la depresión endogámica al poder reducir la frecuencia de los alelos recesivos. Los métodos de selección recurrente de progenies o líneas autofecundadas de una (S1) y dos generaciones (S2), son los más usados para mejorar la resistencia a plagas y enfermedades. Distintos autores han mostrado resultados significativos de selección para varios caracteres, tales como resistencia al taladro del maiz (Ostrinia nubilalis), resistencia a el achaparramiento en maíz (Corn stunt), y tolerancia al frio. La elección del tipo de progenie radica en varios aspectos a considerar: la acción génica que gobierna el carácter objeto de selección, los recursos disponibles, la posibilidad de emplear contra estación, etc. Diferentes tipos de progenies pueden dar respuestas diferentes a la selección (Tabla 12.1). Selección recurrente La expresión selección recurrente fue introducida en 1945 por Hull, con el propósito de procederse a la selección generación tras generación, con intercruzamiento de los materiales seleccionados a fin de promover la recombinación génica. El concepto de selección recurrente es bastante amplio y significa un proceso continuo de mejoramiento en donde se suceden ciclos de recurrencia. El método consiste básicamente en la selección de individuos superiores de una población, seguidamente esos individuos son evaluados y los seleccionados son intercruzados entre sí para obtener la población del primer ciclo. En la población resultante el proceso es repetido, obteniéndose el ciclo siguiente. 132

133 La selección recurrente tiende a aumentar continuamente la frecuencia de los genes favorables a través de los sucesivos ciclos de selección. Se pueden considerar todos los métodos de selección de poblaciones como algunos tipos diferentes de selección recurrente. Algunos métodos has sido descriptos en la bibliografía como clases bien definidas y particulares de selección recurrente. Esos métodos fueron clasificados en cuatro modalidades, Selección Recurrente Fenotípica, Selección Recurrente por Aptitud Combinatoria General y Específica y Selección Recurrente Recíproca. Selección recurrente fenotípica El fenotipo de las plantas S0, constituye la unidad de selección. Aquellas plantas seleccionadas son autofecundadas y su semilla (S1) es evaluada para ciertos caracteres de interés. Las progenies S1 seleccionadas son intercruzadas y se reinicia el ciclo de selección (Figura 4). Es aplicable para caracteres de alta heredabilidad, esto es, aquellos relativamente poco influenciados por el ambiente, y con altos efectos génicos aditivos. En este esquema no es necesario que los genotipos a ser evaluados, sean cruzados con un probador, toda vez que los caracteres puedan ser debidamente evaluados en los propios individuos. Para los caracteres que puedan ser evaluados antes de floración, no es necesario tampoco la autofecundación, pudiéndose completar un ciclo en cada generación. Caracteres que han sido seleccionados eficientemente por ese tipo de selección son resistencia a plagas y enfermedades, composición química del grano y capacidad de expansión del maíz pisingallo. Selección recurrente por aptitud combinatoria general Este tipo de selección es el más adecuado para los caracteres cuya herencia es en gran parte debida a genes de efectos aditivos y muy influenciados por el ambiente, teniendo por eso una heredabilidad relativamente baja. Hay necesidad de proceder a la autofecundación y cruzar los genotipos autofecundados con un probador para evaluar la capacidad general de combinación. Este esquema fue sugerido por Henkins (1940) como un método de obtener variedades sintéticas superiores, aunque la expresión selección recurrente solo fue usada mas tarde. 133

134 SELECCIÓN RECURRENTE SIMPLE (FENOTIPICA) S 1 S 1 S 1 TRILLA INDIVIDUAL Y ANALISIS EN LABORATORIO D E S C A R T A D A RECOMBINACION DE LAS S 1 SELECCIONADAS MEZCLA DE SEMILLA POBLACION MEJORADA Figura Esquema general de la selección recurrente simple o fenotípica en plantas alógamas. El método consiste en autofecundar un buen número de plantas en una población heterogénea, cruzando estas plantas autofecundadas con un probador de base genética amplia, que puede ser una variedad o un híbrido doble. En el caso de efectuarse la autofecundación y el cruzamiento al mismo tiempo, con plantas prolíficas, debe tenerse cuidado de usar una buena muestra del probador para cruzar con cada genotipo. Seguidamente se conducen ensayos comparativos de rendimiento y los mejores genotipos S1 son intercruzados entre sí para obtener el primer ciclo (Figura 5). Selección recurrente por aptitud combinatoria especifica El esquema de Selección Recurrente por Aptitud Combinatoria Específica, fue propuesto originalmente por Hull (1945). El esquema básico es semejante al de la Selección Recurrente por Aptitud Combinatoria General, diferenciándose en que el probador utilizado, es de base genética estricta, por ejemplo una línea autofecunda, como fue la idea original. Tal esquema fue sugerido para explotar los genes con efecto de sobredominancia, que se indican como responsables del vigor híbrido, de esta manera el método ofrece la posibilidad de concentrar en una población heterogénea, genes que dan la máxima heterosis en relación a un probador particular. Los genotipos derivados de varias ciclos de selección por este esquema tendrán una alta aptitud combinatoria con la línea endocriada (o líneas) utilizada como probador. De esta forma se pueden desarrollar nuevas líneas para formar un híbrido con una línea ya establecida. 134

135 SELECCIÓN RECURRENTE POR APTITUD COMBINATORIA POBLACION ORIGINAL PROBADOR MEZCLA DE ECR F 1 MEZCLA DE SEMILLA S 1 RECOMBINACION POBLACION MEJORADA Figura Esquema general de la selección recurrente por aptitud combinatoria general en plantas alógamas. Selección recurrente reciproca La Selección Recurrente Recíproca fue sugerida como un método para mejorar la respuesta heterótica entre poblaciones. Dos poblaciones, por ejemplo denominadas A y B, son empleadas. En cada ciclo, los mejores genotipos de A, que dan más vigor en cruzamientos con B, son recombinados entre sí, obteniéndose nuevas poblaciones de A y B. El procedimiento original sugerido contempla las siguientes etapas (Figura 6): 1) Autofecundación de plantas de la población A y cruzamiento simultaneo por plantas de la población B. De manera idéntica, plantas de la población B, son autofecundadas y cruzadas por plantas de la población A. Para los cruzamientos F1, el polen de las plantas autofecundadas es colocado en estigmas de 4 o 5 plantas de la otra población. 2) Evaluación de las F1 en ensayos comparativos de rendimiento. 3) Recombinación de las mejores líneas S1 de A, de acuerdo con los resultados de los ensayos. Lo mismo es realizado con las mejores líneas S1 de B. De esta manera son obtenidas las dos poblaciones del primer ciclo, A1 y B1. Un nuevo ciclo se puede iniciar, repitiéndose las etapas indicadas. Es generalmente aceptado que la SRR es un método genéticamente correcto y teóricamente de eficiencia semejante o superior a otros esquemas de selección recurrente cuando loci con diferentes niveles de dominancia están actuando. 135

136 SELECCIÓN RECURRENTE RECIPROCA POBLACION ORIGINAL A POBLACION ORIGINAL S 1 Y F 1 DE CADA PTA SELECCIONADA PTA X POB. B PTA X POB. A F 1 Y S 1 DE CADA PTA ECR CON LAS F 1 Y SELECCION ECR CON LAS F 1 Y SELECCION RECOMBINACION DE LAS S 1 SELECCIONADAS RECOMBINACION DE LAS S 1 SELECCIONADAS POBLACION MEJORADA A 1 POBLACION MEJORADA B 1 Figura Esquema general de la selección recurrente recíproca en plantas alógamas. De las poblaciones obtenidas por esta metodología se pueden derivar líneas endocriadas (A y B) que presentarán buena aptitud combinatoria entre ellas, por lo que también la probabilidad de obtener híbridos superiores entre las líneas A y B es alta. BIBLIOGRAFIA Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Elliot, F., Mejoramiento de las plantas. CECSA, México, 474 pp. Falconer, D.S., Introducción a la Genética Cuantitativa. 2nd Ed. Longman Inc. New York., 430 pp. Hiorth, G.E Genética Cuantitativa. Volumen I. Fundamentos biológicos, Volumen II Selección, F.C.A., U.N.C. Variedades Sintéticas Introducción La forma más racional de explotar la heterosis en especies de polinización cruzada es a través de la obtención de híbridos. Sin embargo, este método puede ser usado solamente si se puede controlar la polinización mediante la emasculación o la esterilidad. Si esto no es posible, la producción de híbridos es muy costosa o imposible. En estos casos el mejorador puede, para constituir una variedad, realizar determinados cruzamientos entre líneas o genotipos. 136

137 Estos genotipos pueden ser endocriados o no, diploides o poliploides. El procedimiento más simple, pero a la vez efectivo, es mezclar las mejores familias seleccionadas a partir de, por ejemplo, medios hermanos o hermanos completos, permitiendo su libre cruzamiento. Una alternativa que brinda mejores perspectivas es si las líneas, familias o clones a cruzarse son seleccionadas no solo por su valoración per se, sino también por su aptitud combinatoria general (ACG). Este sistema, propuesto por primera vez por Hayes y Garber en 1919, resultó en lo que se llamó posteriormente Variedades Sintéticas, a la que podemos definir como: Una variedad sintética es una población que resulta de la cruza entre progenitores que han sido seleccionados por su aptitud combinatoria general, y que es mantenida y propagada como una variedad de polinización abierta. Es necesario agregar que una variedad sintética que puede ser reconstruida a partir de sus componentes. Factores que influencian la heterosis en las variedades sintéticas Como se mencionó anteriormente, el comportamiento de una variedad sintética y la heterosis producto de las cruzas entre sus componentes debe ser posible de predecirse o estimarse convenientemente para poder elegir la mejor combinación de padres y el número óptimo de estos (Tabla 1), para constituir la mejor variedad posible. Rendimiento esperado de una variedad sintética (diploides) F F1 2 F1 P n F2 = Rendimiento esperado de la variedad sintética F1 = Media de todas las cruzas posibles entre los padres P = media de los padres n = número de padres La diferencia entre la F1 (sin 1) y la F2 (sin 2) es igual a la superioridad de los híbridos F1 sobre los componentes (progenitores) dividido por el número de componentes. Esto significa que si nosotros tenemos solamente 2 líneas, perderemos el 50% de la heterosis, con 4 líneas el 25%, etc. Las consecuencias de variar el número de componentes y sus valores pueden ser ilustrado mediante el siguiente ejemplo: a) F1 = 110; P = 90; n = 4 F2 = 110 (110-90)/4 F2 = 105 b) F1 = 110; P = 70; n = 4 F2 = 110 (110-70)/4 F2 =

138 c) F1 = 110; P = 70; n = 8 F2 = 110 (110-70)/8 F2 = 105 La reducción en la F2 (Sin 2) es mayor a medida que mayor sea la diferencia entre la F1 y P, y menor el número de componentes que conforman la F1. Tabla 1. Nivel de ploidía, especie y número promedio de padres empleados en la formación de variedades sintéticas Ploidía Especie N padres Diploide Zea mays 4 9 Secale cereale 3 8 Lolium perenne 4 6 Lolium multiflorum 8 Festuca pratensis 5-10 Tetraploide Medicago sativa 2-9 Dactylis glomerata 4-10 Hexaploide Phleum pratense 4-10 Octoploide Bromus inermes 4 De acuerdo a la ley de Hardy-Weinberg, no debería haber reducción del rendimiento después de la Sin 2 generación, o sea que la generación Sin 3 y posteriores rendirán igual que la Sin 2 (Figura 1). Sin embargo, esto es válido en el caso de variedades diploides, en ausencia de epistasis, en completa panmixia y ausencia de selección durante la multiplicación. Desde que diferencias en el tiempo de floración entre los componentes como así también los efectos de selección no intencional, y la polinización con otras fuentes resultan en un gradual deterioro de la variedad, las variedades sintéticas son usualmente reconstruidas después de un determinado número de años. Esto requiere que los componentes sean mantenidos. Variedades sintéticas en maíz. En el caso del maíz, donde lograr líneas endocriadas es relativamente fácil, el desarrollo de un cultivar sintético comprende tres etapas: 1. Desarrollo y evaluación fenotípica de líneas endocriadas. 138

139 2. Evaluación de las líneas en base a su ACG. 3. Entrecruzar las mejores líneas para la producción de la sintética. La líneas endocriadas pueden ser líneas con homocigosis parcial, S2 o S3, o sea líneas que han sido evaluadas fenotípicamente y además, has mostrado una buena ACG. También pueden ser líneas totalmente homocigotas, en este caso, de acuerdo a la teoría, la heterosis de la sintética sería mayor, comparada con la producida con líneas no completamente homocigotas. En maíz el mercado, en nuestro país y en la mayoría de los desarrollados desde el punto de vista agrícola, está casi exclusivamente compuesto por híbridos, dado la facilidad de obtener líneas en maíz y el gran vigor hibrido (heterosis) exhibido por las cruzas simples. Esto ha hecho que las variedades sintéticas sean obtenidas en especies donde no se puede obtener líneas fácilmente, por ejemplo en alfalfa y otras especies forrajeras. Años 1 Sin 1 (F1) 2 Sin 2 3 Sin 3 Sin 1 4 Sin 4 Sin 2 5 Sin 5 Sin 3 Sin 1 6 Sin 6 Sin 4 Sin 2 7 Sin 5 Sin 3 8 Sin 6 Sin 4 9 Sin 5 10 Sin 6 Figura 1. Producción de variedades sintéticas asumiendo la comercialización de semilla a partir de la Sin 3. Las generaciones en recuadro son las que se comercializan Variedades sintéticas en plantas forrajeras Mientras que en especies como el maíz no existen dificultades para realizar las cruzas necesarias para evaluar la aptitud combinatoria entre los potenciales padres, en muchos cultivos forrajeros las cruzas controladas son difíciles o imposibles de realizar. En esos casos la única forma de cruzar los padres es a través de la cruza natural. Métodos Progenies de libre cruzamiento Las progenies son derivadas de plantas pertenecientes a variedades de polinización libre mejoradas, que se han cruzado con otras plantas vecinas, por ejemplo medios hermanos. De todos los métodos este es el más simple y menos costoso, pero al mismo tiempo el menos efectivo. 139

140 Prueba top-cross La semilla es obtenida de individuos (por ej.: clones) selectos los cuales han sido cultivados en surcos alternados con el probador o tester, o como plantas aisladas dentro de las plantas del probador. La semilla top-cross consiste entonces de semillas originadas por la cruza de las plantas con el tester y de intercruzas con otros individuos selectos o clones. Esta semilla es sembrada en ensayos comparativos a partir de los cuales se seleccionan los clones con mejor comportamiento en cruzas. Este método es relativamente barato pero su eficiencia depende de cuán bien el probador discrimine entre los buenos y pobres combinadores y del porcentaje de semilla top-cross obtenida. Prueba de cruzas simples Mediante las cruzas simples entre un grupo de genotipos de pueden estimar las aptitudes combinatorias de cada uno de ellos. Como lo que interesa es la ACG, se tendrá que calcular la aptitud combinatoria promedio de cada línea o clon, es decir el comportamiento promedio que exhibe un genotipo al cruzarlo por una serie determinada de genotipos Si el número de líneas (n) es pequeño un esquema de cruzas dialélicas (n(n-1)/2) es la mejor opción, pero usualmente el número de líneas o clones es grande, por lo tanto un dialélico completo no es posible. Es estos casos de contar con muchos genotipos y/o con problemas para efectuar los cruzamientos, por ejemplo, flores pequeñas, castración dificultosa, etc., se puede emplear la prueba de policruzamiento. Prueba de Policruza Este método fue desarrollado de manera independiente por varios investigadores entre 1940 y Esta prueba requiere que todos los materiales selectos deben ser cultivados juntos en libre polinización. Se requiere de una nursery de la policruza, donde la semilla de policruza es producida, y una prueba de progenie donde la semilla debida al policruzamiento es evaluada. En la nursery de policruzamiento, que debe ser aislada de toda fuente de polen extraño, se debe diseñar de tal modo que, dentro de lo posible, la semilla producida en una línea o en un clon, sea como una muestra o compuesto de todas las cruzas posibles de esa línea o clon con todas las demás líneas o clones. A cosecha iguales cantidades iguales de semilla son cosechadas de cada genotipo de cada repetición y mezcladas para disponer de semillas para ensayos de rendimiento conjuntamente con variedades testigos. Además de rendimiento, las características de floración y resistencia a enfermedades son evaluadas. Si es posible los ensayos se siembran en más de una localidad. Luego de esto se seleccionan la mitad de las líneas o clones con ACG superior que serán incluidas en un segundo ensayo de rendimiento. Al final unas 6 a 10 líneas o clones serán las que formarán la nueva sintética. 140

141 Variedades sintéticas en plantas autotetraploides Existen importantes diferencias entre las variedades sintéticas formadas por individuos diploides de aquellas formadas por individuos autotetraploides. Mientras que no existe mayor reducción del rendimiento después de la Sin-2 en diploides, en autotetraploides los cambios en el rendimiento entre las Sin-1 a la Sin-4/5 dependen de la contribución genética de los componentes. Si los componentes son endocriados no relacionados, la mayor heterocigocidad y el mayor rendimiento será alcanzado recién en la generación Sin-3/4. Si por otra parte los componentes son altamente heterocigotos y no relacionados, la máxima heterocigocidad y el rendimiento máximo se alcanzará en la generación Sin-1 con una pequeña declinación en el rendimiento en las próximas generaciones. Similarmente, si las líneas están relacionadas, la endocría en la Sin-1 y la que pueda ocurrir en las generaciones siguientes reducirá la heterocigocidad y el rendimiento. Por lo tanto, cuando se desea formar una variedad sintética en alfalfa, los clones parentales deberán ser escogidos de manera tal que no se incluyan clones relacionados genéticamente. Si se utilizan clones no relacionados la experiencia ha demostrado que la Sin-1 más rendidora es aquella obtenida con un número limitado de clones. No ha sido posible demostrar que la adaptación de una variedad sintética de alfalfa se incrementa a medida que se incrementa el número de clones parentales. Esto se ha corroborado desde que aun una variedad sintética de alfalfa basada solamente en 2 clones posee probablemente tanta diversidad genética como un híbrido doble de maíz En el caso de la alfalfa el valor de los parentales endocriados ha sido muy discutido. Se ha argumentado que el rendimiento de una sintética depende tanto de el valor de los padres per se, el valor de sus híbridos y del porcentaje de endocría que puede originarse en las generaciones siguientes. Si es posible utilizar padres endocriados con buen rendimiento y alta ACG el potencial genético de la futura sintética se incrementa. Rendimiento esperado de una variedad sintética (poliploides no endocriados) 2k 1 C S Y C k n Y = Rendimiento esperado C = Media de todas las cruzas posibles entre los padres S = media de los padres K = nivel de ploidía n = número de padres 141

142 Nursery Selección fenotípica de los mejores clones Policruza Evaluación genética de los clones (ACG) Clones selectos para formar la Variedad Sintética Sintética-1 Figura 2. Procedimiento general de mejora para el desarrollo de variedades sintéticas a partir de clones de alfalfa Para la producción de semilla comercial en sus diferentes etapas antes de lanzar la variedad al mercado, hay que tener en cuenta, obviamente, el grado de endocría y las relaciones genéticas entre los componentes. Esto es importante dado que el productor recibe la Sin-3 o generaciones más avanzadas como semilla comercial. Las variedades sintéticas rara vez están basadas en menos de 4 clones aún si estos son altamente heterocigotos y no relacionados. Tabla 2. Aspectos generales a considerar en la obtención de una Variedad Sintética 1. Padres Composición genética: endocriados o no. 2. Selección de padres superiores Método de evaluación: con/sin ACG, Policruza. 3. Recombinación de los mejores Número óptimo de padres a padres recombinar. 4. Multiplicación de la sintética Número generaciones de multiplicación antes de liberar la semilla comercial. 5. Mantenimiento de la variedad sintética Por polinización libre o ser regularmente reconstruida a partir de los padres. 142

143 1 Año Selección de plantas Plantas 2 Año Parcelas Clonales 500 clones (20 plantas por clon) Selección de clones 3 Año Policruza etc clones con repeticiones 4 5 Años 6 año Ambiente 1 Ambiente 2 Ambiente 3 ECR con la semilla recolectada en los clones de la parcela de policruza Clones Selectos por ACG 7 Año Multiplicación Los clones se siembran en mezcla y se cosecha la semilla comercial Figura 3. Diagrama esquemático del método de policruza para la obtención de una variedad sintética (modificado de Frandsen y Frandsen, 1948). 143

144 O O O O O O O O O O O 1 O O 2 O O 3 O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 1 O O 2 O O 3 O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 1 O O 2 O O 3 O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O 4 O O 5 O O 6 O O O O O O O O O O O O O: Plantas pertenecientes al probador. 1,2.6: plantas a evaluar por su habilidad combinatoria general. Todas las plantas rotuladas con el número 1 se cosechan juntas, todas las 2 juntas, etc. Figura 4. Diagrama esquemático de la cruza (top-cross) de familias con un probador común. Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Cubero, J.I., Introducción a la Mejora Genética Vegetal. Mundiprensa, Madrid, 365 pp. Falconer, D.S., Introducción a la Genética Cuantitativa.2nd Ed. Longman Inc. New York., 430 pp. Hallauer, A.R., J.B. Miranda, F.O., 1988 Quantitative Genetics in Maize Breeding. 2nd ed., Iowa State University Press, Ames, IA, USA Marrewijk, G.A.M., Flowering biology and hybrid varieties. I Flowering and pollination. Wageningen Agricultural University, Wageningen, 132 pp. 144

145 Unidad 13. Variedades Híbridas Introducción Los cultivares híbridos son la descendencia en primera generación de la cruza entre dos parentales genotípicamente diferentes. Si bien a la descendencia de cualquier cruza puede llamársela híbrido, el concepto hace alusión principalmente a los híbridos simples, triples y dobles, obtenidos a partir de materiales con alta endocría. La historia del desarrollo de los híbridos está ligada a los estudios sobre maíz de G. H. Shull en 1909, quien propuso la metodología para la obtención de cultivares híbridos. Los conceptos establecidos por Shull y otros autores son aún hoy la base para el desarrollo de cultivares híbridos en maíz y en otras especies. Obtención de Híbridos Los cultivares híbridos modernos son el resultado de la cruza entre líneas homocigotas diferentes. Estas líneas parentales, llamadas líneas endocriadas, son creadas mediante la endocría a partir de poblaciones segregantes. Básicamente, para producir un híbrido en una especie alógama como el maíz o el girasol, se necesita: Obtener y desarrollar líneas endocriadas Producir y evaluar diferentes híbridos Distribuir el híbrido selecto como una nueva variedad Fuentes de material Como en todo programa de mejora se debe tener u obtener un material original a partir del cual se obtendrán las líneas endocriadas que actuarán como futuros parentales de híbridos. El mejorador cuenta con varias opciones como población de partida para, mediante la endocría, obtener líneas. Estas alternativas comprenden: Compuestos Variedades de polinización libre Cruzas entre híbridos (F2) Variedades sintéticas Líneas de segundo ciclo Como regla general, y en base a la experiencia, actualmente se prefiere utilizar materiales que hayan sido seleccionados durante varias generaciones para rendimiento y otras características agronómicas. Estos materiales ya poseen 145

146 una alta frecuencia de alelos favorables y un buen potencial de rendimiento, como por ejemplo las variedades sintéticas y las líneas de segundo ciclo. Obtención y desarrollo de líneas Una línea endocriada es una línea homocigota desarrollada y mantenida mediante la autopolinización. Los métodos empleados son similares a los empleados en plantas autógamas, siendo el objetivo obtener líneas homocigotas (o endocriadas) a partir de una población de individuos heterocigotos. Con las sucesivas generaciones de endocría, la homocigosis y al uniformidad se incrementan dentro de cada línea. La varianza genética dentro de líneas se va reduciendo, mientras que la varianza entre líneas se incrementa. La selección durante las primeras generaciones de endocría se basa principalmente en la observación y selección visual de plantas vigorosas, resistentes al acame y a enfermedades y con buena producción de semillas y rendimiento. Durante el período de endocría se puede exponer a las líneas en desarrollo a adversidades como altas densidades, sequía, altas o bajas temperaturas, deficiencias de nitrógeno, etc. De esta forma es posible identificar líneas adaptadas a diferentes condiciones ambientales dependiendo del objetivo del programa de mejoramiento. Entre los métodos para desarrollar líneas se hallan la selección por pedigrí, el método de doble haploides, la descendencia de semilla única y el reciclaje de líneas. Las tres primeras ya fueron descriptas cuando se trató la selección en plantas autógamas por lo que aquí solo se hará una breve referencia a las mismas. Selección por pedigrí También conocida como procedimiento clásico o estándar es comúnmente empleada en maíz y en otras especies alógamas y autógamas, comprende las siguientes etapas: 1. Selección y autofecundación de plantas en la población original sobre la base de caracteres deseados por el mejorador. 2. Cultivar surcos de 10 o más plantas de cada una de las progenies de plantas autofecundas (S1) obtenidas el año anterior. Selección de los mejores surcos o progenies y dentro de ellos selección y autofecundación de las mejores plantas. Se descartan los otros surcos y plantas. La selección se practica entre y dentro de los surcos. Luego de la cosecha se realiza una selección a nivel de espiga y de semilla de las plantas seleccionadas. 3. Se repite el esquema de selección descripto en 2. El procedimiento se repite por 5 a 7 años o hasta lograr el nivel deseado de homocigosis. Para comprobar si se ha alcanzado la completa homocigosis de las líneas desarrolladas se puede realizar la prueba de homocigosis práctica. Esta consiste en cruzar plantas hermanas, que pertenezcan a la misma línea, si la 146

147 F1 resultante no manifiesta heterosis con respecto a los padres se ha alcanzado la homocigosis práctica. Doble Haploides La mayor ventaja de los haploides en la mejora genética vegetal es que un individuo haploide puede ser duplicado, permitiendo la inmediata obtención de completa homocigosis. P1 x P2 F1/F2 Cultivo artificial de granos de polen Plantas Haploides Duplicación Plantas 2n Homocigotas Transplante a campo y selección. Figura 1. Esquema para la obtención de líneas endocriadas utilizando doble haploides. Descendencia de Semilla Única (SSD) El método de la descendencia de semilla única al igual que en plantas autógamas consiste en avanzar poblaciones híbridas mediante la cosecha en cada generación de una única semilla de cada planta. No se practica selección durante la endocría. Estas semillas se mezclan para generar la siguiente generación. El procedimiento se continúa hasta alcanzar la generación F5 o F7 en la cual los genotipos son homocigotos en su mayoría. Este método se aplica en el reciclaje de líneas en maíz como un medio de acelerar la obtención de líneas endocriadas a partir de cruzas entre líneas elite. Líneas de segunda generación Cuando la selección por pedigrí aplicada en variedades de polinización abierta ha producido un número razonable de líneas endocriadas con excelentes características (líneas elite), poblaciones F2 desarrolladas mediante la cruza entre líneas con caracteres complementarios se convierten en una nueva fuente de germoplasma para el desarrollo de nuevas líneas endocriadas, llamadas líneas de segundo ciclo. En el presente existen numerosas líneas de 147

148 segundo, tercer y aún líneas de cuarto ciclo obtenidas por la cruza entre líneas mejoradas. El desarrollo de líneas mediante este procedimiento se basa en que la probabilidad de obtener líneas elite mediante autofecundación de plantas pertenecientes a poblaciones de polinización libre que no han sido suficientemente mejoradas es bastante baja. Por otra parte las líneas de segundo u otros ciclos obtenidas son más vigorosas que las líneas originales y dan como resultado híbridos con mayor rendimiento. Estas vigorosas líneas endocriadas han hecho posible la producción comercial de semilla a partir de cruzas o híbridos simples. Sin embargo, en el largo plazo, un gran énfasis en el desarrollo de líneas a partir de cruzas simples puede resultar en un aumento de la consanguinidad entre las líneas y, por ende, en una menor heterosis y un menor rendimiento en los híbridos resultantes. Una solución a este problema es la formación de grupos de líneas, por ejemplo sobre la base de una aptitud combinatoria equivalente, y cruzar entre sí líneas que pertenezcan a distintos grupos, llamados grupos heteróticos. Líneas Elite Parentales Intercruzamiento Nueva población con alta frecuencia de alelos favorables Endocría (SSD o doble haploides) Obtención de líneas de 2 Ciclo Nuevos Híbridos Figura 2. Esquema de obtención de híbridos a partir del reciclaje de líneas elite. Mejoramiento de líneas endocriadas Retrocruza La retrocruza es particularmente útil para la transferencia de uno o dos caracteres de herencia simple. El método es básicamente el mismo que el descripto para especies autógamas. En el mejoramiento de líneas endocriadas el objetivo de este método es mejorar una línea la cual es satisfactoria para muchas características pero deficiente en uno o dos caracteres. El padre recurrente es la línea que necesita ser mejorada y el padre no recurrente es el que actúa como donante del carácter deseado. Después de repetidas retrocruzas el genotipo dominante es fijado por autofecundación. 148

149 Características que pueden ser mejoradas vía retrocruza son la resistencia a enfermedades, altura de espiga, madurez, etc., es decir caracteres que puedan ser identificados con razonable precisión a campo. Actualmente la retrocruza se utiliza en maíz para la transferencia de transgenes de un genotipo modificado a una línea elite, por ejemplo en el caso del gen Bt. En general el método de retrocruza es predecible y adecuado aunque un método conservador de mejorar líneas endocriadas. Selección convergente En el método de selección convergente se utiliza una retrocruza recíproca para mejorar características presentes en las líneas endocriadas constituyentes de un híbrido simple. La F1 es retrocruzada por ambos padres por espacio de dos o tres generaciones o hasta las progenies resultantes muestren el fenotipo de los padres. Los genes deseados se fijan a través de varias generaciones de autofecundación y las líneas mejoradas son evaluadas en ensayos de campo. La idea de la selección convergente es incrementar la productividad de las líneas endocriadas sin modificar el comportamiento de las mismas en las combinaciones híbridas. Este método es empleado para la producción de líneas isogénicas (A ) utilizadas en la producción se semillas mediante los híbridos simples modificados (A x A x B). Evaluación de líneas endocriadas La utilidad de una línea endocriada es determinada por su contribución genética en la progenie híbrida cuando es cruzada con otra línea endocriada y no por su comportamiento per se. Sin embargo, y como se mencionó anteriormente, es necesario que las líneas sean lo suficientemente vigorosas y con buena producción de semillas para asegurar su mantenimiento como parental. La habilidad de una línea de trasmitir buenas características a la progenie híbrida se la conoce como aptitud (o habilidad) combinatoria. Aptitud combinatoria general La aptitud combinatoria general (ACG) de una línea es su contribución promedio al comportamiento híbrido a través de una serie de combinaciones híbridas. Esta contribución promedio se compara con la de otras líneas para identificar aquellas que posean una alta ACG. Esta característica no es posible de predecir a través de la simple observación visual de una línea. La ACG de una línea se evalúa al cruzar la línea por otras líneas y comparando el comportamiento de las cruzas en que interviene cada línea. La ACG evalúa la magnitud de la varianza aditiva de cada línea para los caracteres de interés. Cuando el número de líneas es grande, es prácticamente imposible realizar las cruzas todas contra todas y evaluar los híbridos resultantes en ensayos comparativos. El número de todas las posibles combinaciones de acuerdo al número de n líneas disponibles es igual a n(n 1)/2. Con solo 10 líneas 149

150 tendríamos 45 híbridos a evaluar, siempre y cuando no se consideren los híbridos recíprocos, y con 100 líneas, el número total de combinaciones asciende a la cifra de 4940, los cual está más allá de las posibilidades de cualquier programa de mejora (Tabla 2). Para solucionar este problema y cuantificar la ACG de numerosas líneas, los mejoradores de maíz empezaron a utilizar la llamada prueba top cross, la cual consiste en cruzar a todas las líneas en proceso de endocría con un genotipo en común. Este genotipo (llamado probador o tester) es generalmente de alta variabilidad genética, por ejemplo una población o una sintética, el cual producirá una gran diversidad genética en sus gametas. A partir de resultados de ensayos experimentales se demostró que el rendimiento de la cruza de las líneas por el probador o tester, estaba fuertemente correlacionado con el comportamiento de la línea en una amplia gama de ambientes. Esto permitió que esta prueba, (llamada testcross o topcross en maíz) sea comúnmente utilizada para la evaluación temprana de un gran número de líneas. Estudios posteriores demostraron que la ACG es de alta heredabilidad, por lo tanto una línea que posea buena o mala ACG en etapas tempranas, S2 o S3, tendrá también buena o mala ACG en etapas avanzadas, S5 o S6. Por lo tanto se puede utilizar en etapas tempranas para eliminar líneas de pobre ACG, reduciendo el volumen de trabajo y los costos del programa de mejora. Aquellas líneas que demuestren una ACG superior son retenidas y una vez alcanzada la homocigosis se cruzan de a pares en combinaciones simples. Aptitud combinatoria específica Una vez que las líneas han superado la prueba de ACG y han llegado a un alto nivel de homocigosis (S6/S7) se realiza la prueba de ACE, que consiste en la cruza de las líneas todas contra todas. Si el número de líneas es no muy elevado, se puede realizar las cruzas de acuerdo a un sistema de cruzas dialélicas, en el cual cada línea es cruzada con todas las otras. Cuando el número de líneas hace imposible la cruza de todas contra todas (Tabla 2), es necesario agrupar a las líneas de modo de poder realizar cruzas entre grupos de líneas homogéneas para evaluar cuál es la cruza que explotará en mayor medida la heterosis y favorecerá la complementación de caracteres en el híbrido. La ACE mide la contribución de una línea en particular en una cruza específica con otra línea. Esta prueba evalúa la parte no aditiva de la varianza genética o sea la varianza de dominancia. Cada combinación es única y la razón de porque algunas cruzas son superiores a otras depende de la cantidad de genes favorables presentes en cada línea y como se complementan con los genes de la otra línea. Estos híbridos simples (F1) son evaluados en ensayos comparativos con cultivares testigos en distintas localidades y años. Las mejores combinaciones son las que tendrán superior ACE y potencialmente serán los híbridos simples que se producirán comercialmente o se cruzarán con otras líneas para formar híbridos triples, o con otro híbrido simple dando lugar a un híbrido doble. 150

151 En los primeros programas de mejoramiento de maíz se empleaban testers o probadores de amplia base genética, por ejemplo una población de polinización libre, para evaluar la ACG de las líneas endocriadas. Actualmente dado que con el avance de los programas de mejoramiento se producen constantemente una gran cantidad de líneas y sus correspondientes híbridos, la ACG es evaluada cruzando las líneas a probar con otra línea elite, una línea relacionada o con un híbrido simple, o sea un probador de base estrecha. Las razones del cambio son que en un programa avanzado de mejoramiento, frecuentemente lo que se desea es reemplazar una línea determinada de un híbrido ya establecido. En este caso la línea que permanecerá como constitutiva del híbrido, será el probador a usar. En el caso de que se quiera producir un híbrido triple, si ya se posee el híbrido simple, este será el probador de una serie de líneas endocriadas potenciales a formar parte de dicho híbrido. Se debe diseñar correctamente la experimentación para comprobar si la nueva línea corrige las falencias de la línea reemplazada a través de ensayos en múltiples localidades evaluando su comportamiento y la interacción genotipo x ambiente. Predicción del Rendimiento Si bien el rendimiento de los híbridos simples es difícil de predecir en base al comportamiento per se de las líneas parentales, es posible estimar el rendimiento potencial de los híbridos triples y dobles a partir de los datos de rendimiento de los híbridos simples evaluados a campo. A partir de la evaluación de ACE se dispone de datos de rendimientos de los distintos híbridos simples. Estos datos pueden ser empleados para predecir el rendimiento de los híbridos triples y dobles de acuerdo a la metodología propuesta por Jenkins. Por ejemplo si se dispone de 4 líneas parentales: A, B, C y D Podemos realizar 6 cruzas simples (tabla 2): A x B; A x C; A x D; B x C; B x D y C x D A partir de los cuales podemos obtener 3 cruzas dobles: (A x B) x (C x D); (A x C) x (B x D) y (A x D) x (B x C) De acuerdo a Jenkins, el rendimiento del híbrido doble (A x B) x (C x D) depende del promedio del rendimiento de las cruzas no-parentales Para predecir el rendimiento del híbrido doble: (A x B) x (C x D) Empleamos el promedio de las cruzas no parentales: (A x C)+(A x D)+(B x C)+(B x D)/4 En el caso de predecir el rendimiento de un híbrido triple: (A x B) x C 151

152 La predicción en base a las cruzas no parentales será: (A x C) + (B x C)/2 Híbridos no convencionales Se denomina híbridos no convencionales a otras formas híbridas en las cuales los parentales no son totalmente homocigotas y/o intervienen más de cuatro líneas. Tabla 1. Diferentes clases de híbridos Híbrido Intervarietal o Interpoblacional Top Cross Pedigrí Población x Población (A) x Población (A x B) x Población Híbrido Simple (A x B) Híbrido Simple Modificado Híbrido Triple (A x A 1 ) x B (A x A 1 ) x (B x B 1 ) (A x B) x C Híbrido Triple Modificado (A x B) x (C x C 1 ) Híbrido Doble (A x B) x (C x D) Población x Población Se cruzan dos poblaciones de buenas características agronómicas y que manifiesten cierto vigor en la F1. Son de fácil producción y mucho menos costosas que producir un híbrido convencional. Se les denomina también híbridos intervarietales. Se pueden emplear en regiones marcadamente marginales para el cultivo y donde los agricultores no posean la capacidad económica y de manejo para cultivar híbridos convencionales. Línea endocriada x Población (top cross) Se pueden seleccionar líneas que posean un comportamiento sobresaliente en la prueba de ACG y, utilizar la F1 como una variedad para distribuir a los agricultores. 152

153 Los híbridos no convencionales tienen mayor variabilidad genética que los híbridos dobles, triples y simples, un menor costo de obtención, pero menor uniformidad y un considerable menor potencial de rendimiento. Híbridos Modificados Hallauer y Miranda (1988), indicaron que las cruzas simples modificadas consisten en cruzamientos en donde uno o ambos progenitores son líneas emparentadas (líneas hermanas o que poseen un progenitor común en su ascendencia), con un grado de parentesco variable. En Estados Unidos de Norteamérica las cruzas simples modificadas se han utilizado principalmente por problemas de producción de semilla de las líneas endocriadas empleadas como madres, ya que las cruzas simples modificadas (A x A ) son más vigorosas que las líneas endogámicas debido a la manifestación de cierto vigor híbrido en la cruza. Además las cruzas simples modificadas presentan rendimientos, vigor y resistencia al acame considerablemente más elevados que las líneas puras originales, por lo que la semilla puede producirse con costos más bajos que las cruzas simples convencionales. Tabla 2. Cantidad de cruzas simples y dobles posibles de acuerdo al número de líneas intervinientes. Líneas Top Cross Híbrido Simple Híbrido Triple Híbrido Doble n n n(n-1)/2 [n( n 1)( n 2)] / 2 n(n-1)(n-2)(n-3)/8 Producción de Semilla Híbrida Para la producción de semilla híbrida hay varios procedimientos disponibles. La emasculación manual seguida de la polinización manual es normalmente utilizada para la producción de semilla híbrida en especies como el maíz donde los sexos están separados y la emasculación es relativamente fácil. Una vez emasculada la línea a utilizar como madre la prevención necesaria es un correcto aislamiento de otras fuentes potenciales de polen. La emasculación y polinización manual también es posible de utilizar en especies en las cuales la flor, a pesar de ser hermafrodita, es relativamente fácil de emascular y produce muchas semillas por flor fecundada, por ejemplo algodón y tabaco entre los cultivos extensivos y tomate, pimiento y melón entre los hortícolas. En especies 153

154 en las cuales la emasculación es dificultosa es necesario recurrir a sistemas de macho esterilidad, ya sea la citoplásmica génica en cebolla o la génica en cebada, sorgo y trigo. Estos sistemas también pueden emplearse en maíz, por ejemplo en países donde la mano de obra necesaria para la emasculación es escasa o muy costosa. Otros procedimientos de producción de semilla híbrida incluyen el empleo de la autoincompatibilidad gametofítica, la propagación clonal de la semilla F1, la utilización de la apomixis y la utilización de emasculación química. Mayores detalles de la producción de semilla híbrida se abordarán en el capítulo de Producción de Semilla. Consideraciones acerca del empleo de las variedades híbridas Las variedades híbridas posen como gran ventaja sobre los otros tipos de cultivares no híbridos su alto vigor y uniformidad lo que se traduce en una mayor producción por unidad de superficie. Además en un híbrido se pueden combinar caracteres presentes en distintos padres. Otra ventaja muy importante es que los híbridos protegen los derechos de los obtentores, dado que no se pueden reproducir por su alta segregación, por lo tanto, las líneas parentales son imposibles de recuperar a partir de la semilla F2 recolectada sobre un híbrido. Esto último puede ser considerado una desventaja para el agricultor, al no poder propagarlo y tener que adquirir semilla nueva cada año. Por otra parte la elevada uniformidad genética puede predisponer a los híbridos a una mayor vulnerabilidad a las epidemias. Además su costo es mayor que otros tipos de cultivares y su requerimientos en disponibilidad de nutrientes y agua son mayores para alcanzar su rendimiento potencial. Con respecto a los híbridos simples, éstos presentan el mayor potencial de rendimiento, máxima heterosis (ver tema heterosis) y mayor uniformidad, con respecto a los híbridos triples y dobles. Estos, por su parte, presentan una mayor flexibilidad genética y al posibilidad de combinar más genes en un solo genotipo. Con respecto a la producción de semillas, lo más ventajoso es producir un híbrido simple, ya que se sólo se deben mantener y reproducir dos líneas, mientras que al aumentar el número de líneas, tres en los triples y cuatro en los dobles, el proceso de mantenimiento y reproducción resulta más costoso. Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. Hallauer, A.R. and J.B. Miranda, F.O., Quantitative Genetics in Maize Breeding. 2nd ed., Iowa State University Press, Ames, IA, USA. Sleper, D. A. and J. M. Poehlman, Breeding Field Crops, 5th Edition, Blackwell Publishing, 424 p. 154

155 Unidad 14. Producción de semilla de cultivares mejorados INTRODUCCIÓN El empleo de semillas de alta calidad constituye una de las inversiones con efecto multiplicador más elevado en la economía. De allí que se dedique tiempo y recursos a la investigación y desarrollo de tecnología en ese campo. La experiencia demuestra que la industria de semillas no puede desarrollarse satisfactoriamente sin una legislación adecuada. La legislación cumple la función de salvaguardia de los intereses de los productores como los de los usuarios. Sin embargo esta es motivo de constantes revisiones pues la calidad es relativamente mas difícil de controlar en semillas que en otros artículos, ej. la pureza genética, el vigor, % de germinación, etc. son factores que requieren instrumental, tiempo y personal calificado. Las semillas son el potencial genético para la producción de mayores cosechas, y el agente de cambio en las situaciones de producción agrícola, serán éstas favorables o no. De ahí que las semillas no sean solamente algo que los agricultores siembran. Para que la semilla sea esa fuerza de cambio, deben existir programas de producción y suministro constante de semillas. La investigación sobre el mejoramiento genético de los cultivos que resulta de mejores variedades e híbridos es la base de un exitoso programa de semillas Ley de semillas y creaciones fitogeneticas En Argentina la producción y el comercio de semillas está legislado mediante la Ley de Semillas y Creaciones Fitogenéticas, ley Nº donde se consagran tres finalidades básicas: Promover una eficiente actividad de producción y comercialización de semillas. Asegurar a los productores agrarios la identidad y la calidad en la simiente que adquieren. Proteger la propiedad de las creaciones fitogenéticas. En su artículo 9 la ley establece que la semilla expuesta al público o entregada a usuarios a cualquier título debe estar debidamente identificada. A su vez, en este artículo se especifica que datos se debe indicar en los rótulos del envase de esta clase de semilla (por ejemplo: nombre y dirección del identificador de la semilla y su número de registro, nombre del cultivar y pureza varietal del mismo si correspondiere, en caso contrario deberá indicarse la mención Común ; procedencia, para la semilla importada; categoría de la semilla si la tuviere). La autoridad de aplicación es el INASE (Instituto Nacional de Semillas). Comprende la legislación de comercio de semillas, cuyo propósito general es la protección del usuario, a través de la veracidad de los rótulos, registro de 155

156 variedades, clases y categorías de semillas, certificación, registro de productores y comerciantes. Clases y categorías de semillas Clase Identificada Es la que expuesta al publico o entregada al usuario deberá estar identificada en el rotulo con las indicaciones que establece la ley en su artículo noveno. Puede ser: * Común: cuando no se debe mencionar el nombre del cultivar. * Nominada: debe expresarse el nombre del cultivar. Clase Fiscalizada Es la que además de cumplir son el artículo noveno y demostrado su buen comportamiento en ensayos probados oficialmente, es sometida a control oficial durante su ciclo de producción. Comprende las categorías: * Original (básica o fundacional) * Certificada de primera Multiplicación (Registrada). * Certificada de otros grados de multiplicación * Híbrida Registros Existen distintos Registros a fin de cumplimentar con las finalidades de la ley dispuestas en su artículo 1º. Ellos son: Registro Nacional del Comercio y Fiscalización de Semillas: deberán inscribirse las personas que importen, exporten, produzcan semilla fiscalizada, procesen, analicen, identifiquen o vendan semilla. Registro Nacional de Cultivares en el que se inscribirá todo cultivar que sea identificado por primera vez. Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares: tiene como fin proteger el derecho de propiedad de los creadores y descubridores de nuevos cultivares. Éste último registro es el que otorga el título de propiedad a los obtentores. Dispone la ley que hasta que el título de propiedad no sea otorgado, el cultivar respectivo no podrá ser vendido ni ofrecido en venta. 156

157 Etapas en la producción de semillas Criaderos y semilleros. Tanto el criadero como el semillero estarán a cargo de un ingeniero agrónomo, la diferencia es que en el criadero se obtiene la semilla básica de la nueva variedad, y queda a cargo del semillero la multiplicación de la misma, todo bajo control de calidad (pureza), a cargo del profesional. Existen actualmente unos 100 criaderos inscriptos, pero solo unos 30 activos, casi todos Asociados a la Asociación de semilleros argentinos (ASA) y a la asociación argentina de la protección de las obtenciones vegetales (ARPOV). Hay entre semilleros inscriptos y alternativamente activos y cerca de 4000 comerciantes de semillas. La suma de actividades necesarias para desarrollar, producir y difundir semillas mejoradas consta de: Obtener una nueva variedad a través del Mejoramiento vegetal. Producción de semilla genética y básica. Producción de semilla comercial Procesamiento industrial. Mercadeo. Cada etapa requiere de capacidades bien diferenciadas, debe contarse con aptitudes administrativas, financieras, técnicas y de mercadeo de alto nivel combinadas en posiciones claves para la empresa. Desarrollo, evaluación y caracterizacion La utilidad de una descripción varietal se puede determinar por la precisión que requieran los objetivos de sus usuarios. Para los estudios genéticos y evolutivos que se realizan básicamente en los bancos de germoplasma, es necesaria una descripción exhaustiva del material. La descripción varietal empleada por los fitomejoradores con fines de promoción comercial, en cambio, solo necesita realzar las características de interés agronómico y comercial de importancia para el agricultor. Entre estos dos extremos se encuentra la descripción varietal que se utiliza en la industria de semillas, cuyos objetivos son controlar las purezas genética y física de cada variedad e infundir credibilidad en el comercio de semillas. Los caracteres varietales deben contribuir a satisfacer tres funciones específicas. De acuerdo con la definición de variedad: una subdivisión de una clase que es diferente, uniforme y estable. Diferente en el sentido de que la variedad se puede identificar por una o mas características morfológicas, físicas o de otro tipo que la distinguen de otras variedades conocidas; uniforme, en el sentido que se puede describir la variación de las características esenciales y típicas; y estable, por cuanto la variedad permanecerá sin cambios y tendrá un grado razonable de confiabilidad. Para cada especie y aun para cada variedad, difieren los caracteres varietales que pueden determinar la identidad, la uniformidad y la 157

158 estabilidad, lo importante es que la descripción registrada sea útil para definir en cada caso estas funciones. Descripción del Fenotipo La descripción varietal se hace en el fenotipo observado de las plantas de una variedad y depende del potencial genético (genotipo) de cada planta y de su expresión (fenotipo) acorde con los efectos ambientales presentes. Por tanto, se debe conocer la manifestación de un fenotipo para tratar de diferenciar las variaciones debidas a los efectos genéticos de aquellas que ocurren por efectos ambientales, que no se pueden eliminar. Se pueden describir los efectos que determinan el fenotipo de una planta (individuo) de la siguiente manera: Donde: F = fenotipo G = genotipo A = ambiente GA = interacción genotipo ambiente F = G + A + GA Para mantener la pureza varietal, interesa principalmente el componente genético o genotípico (G), ya que los efectos ambientales (A), no se transmiten por semilla. Por ejemplo, una segregación genética será el resultado de un efecto debido a cambio en el genotipo; un efecto ambiental modificara el fenotipo pero no el genotipo. Es necesario por lo tanto, identificar las causas de las variaciones observadas entre plantas, ya que si aquellas se deben a efectos ambientales no se pueden considerar las plantas diferentes como plantas fuera de tipo. La pureza varietal no infiere necesariamente homogeneidad total de tipos; supone más bien, la identificaron de ámbitos o de variaciones que resulten, del trabajo de mejoramiento momento de liberar la variedad. Aun en caracteres de interes agronomico o comercial, es posible que el fitomejorador haya permitido alguna variación genética, la cual también deberá identificarse correctamente y cuantificarse en la frecuencia en que se deben aceptar. Caracteres descriptivos En los caracteres descriptivos deben diferenciarse los que son fijos de los variables. Los fijos dependen generalmente de uno o pocos genes que determinan una característica de distribución discreta, es decir, de fácil diferenciación entre las posibles alternativas fenotípicas, como por ejemplo, el color de la flor, color de granos, presencia de aristas. Los caracteres determinados por este mecanismo se denominan cualitativos y las modificaciones que experimentan por acción del medio ambiente son pocas. 158

159 Por el contrario, los caracteres descriptivos variables dependen generalmente, de un número mayor de genes y se manifiestan genotípicamente como una distribución continua donde aparece un ámbito variable en la expresión fenotípica. Estos caracteres reciben el nombre de cuantitativos y son más afectados por el medio ambiente. Ejemplo de ello son: la altura de planta, largo de guías, número de granos. La pureza varietal no indica necesariamente homocigosis o uniformidad total entre las plantas; lo que en realidad quiere decir es que la semilla multiplicada reproducirá fielmente el fenotipo característico de la variedad. Por ejemplo, si una variedad de maíz de grano amarillo segrega un 2 % de granos blancos y el fitomejorador, al liberar la variedad, no considera esto una limitación, la descripción varietal debe incluir esta desviación como aceptable, y su persistencia dentro del porcentaje tolerado en las nuevas generaciones, no se considerara como impureza. Las plantas observadas en el campo que no se ajustan a los caracteres tal como aparecen en la descripción varietal incluyendo su variación aceptada constituirán el grupo de plantas fuera de tipo o contaminantes, que deben eliminarse en los incrementos de semilla y considerarse en las tareas de inspección durante la producción y comercialización. Es muy importante el muestreo de las plantas en las cuales se harán las observaciones varietales y su medición, muestreo que debe hacerse aleatoriamente en poblaciones sembradas en condiciones y lugares típicos de la región en donde se recomienda la variedad. Elaboracion de la descripcion varietal El fitomejorador debe hacer la descripción varietal durante todo el desarrollo de las plantas que conforman la variedad, tomando para ello muestras aleatorias en el momento de liberar la variedad para su producción comercial. La precisión de esa descripción esta en función del número de localidades y fechas en que se describe la variedad; esto se hace con el fin de permitir una máxima exposición a los efectos ambientales variables. Por lo tanto se recomienda repetir cuanto sea posible estas descripciones para ajustarlas a los valores más reales, ante el supuesto de que los efectos ambientales tiendan a compensarse. Los encargados de multiplicar semilla genética y básica pueden y deben tomar datos complementarios y repetirlos periódicamente, para que se familiaricen al máximo con la descripción de la variedad. Para lograr una mayor confiabilidad de la descripción varietal se debe prestar atención especialmente a: el numero optimo de individuos para que debe describirse y el coeficiente de variación del carácter medido. Según aumenta el número de observaciones, el CV tiende a reducirse, por lo que el numero optimo de individuos para definir un carácter deber coincidir o aproximarse, al número donde el CV se estabiliza. 159

160 Purificacion varietal. Generalmente se piensa que cuando el fitomejorador ha liberado un material nuevo, ello representa el final de su actividad y marca el principio para la acción del especialista en producción de semillas. Sin embargo, existen una serie de factores que hacen imprescindible la intervención de las personas que estuvieron íntimamente relacionadas con la liberación del material: 1. La cantidad de semilla que el fitomejorador entrega al encargado de incrementar los materiales, es frecuentemente mínima. 2. Los incrementos sucesivos ponen en peligro la perdida de la identidad varietal, sobre todo en materiales de polinización cruzada, por lo que, 3. La presencia del fitomejorador o de sus asistentes en las prácticas de depuración son imprescindibles. A pesar de todas las precauciones y controles para lograr la pureza genética y física en la producción de semillas, a veces suceden contaminaciones involuntarias, el material todavía segrega plantas indeseables, e incluso se requiere alguna selección correctiva. Cuando esto sucede, es necesario realizar una siembra para confirmar y/o recuperar la purificación varietal, mediante la observación critica de la progenie de una muestra de cada lote de semillas sobre la base de la descripción varietal. Esto es particularmente importante en semilla genética y básica y debe constituir una práctica rutinaria en los programas de producción de semillas mejoradas, tanto oficiales como empresas privadas. Estos lotes reciben el nombre de parcelas de verificación genética. Producción de Semilla Cuando se ha logrado el cultivar deseado es necesario producir una cantidad adecuada de semilla la cual será reproducida para la producción comercial de la nueva variedad. Esta semilla es generalmente denominada Semilla del Mejorador, cuya producción es, generalmente, responsabilidad del mejorador más que del productor o comerciante de semillas. Es vital que el mejorador produzca semilla pura, libre de contaminación e impurezas y de óptima calidad. Esta Semilla del Mejorador es reproducida para obtener la Semilla de Fundación la que es utilizada para producir los diferentes niveles de Semilla Registrada o Certificada, la cual es vendida a los agricultores. Producción de Semillas en Especies Autógamas. Producir una semilla de calidad de una línea pura, es similar a los esquemas de mejoramientos aplicados para la obtención de la variedad. Básicamente existen dos métodos de producción de Semilla del Mejorador: el masal y el de progenie. 160

161 Método Masal Es el método más simple y de menores recursos, se toma una muestra de semilla de la línea a reproducir y se siembra para obtener la Semilla del Mejorador. En un solo año se puede obtener la reproducción de la semilla. La falta de uniformidad y problemas con la pureza genética, constituyen sus principales desventajas. Método Progenie Estos esquemas son similares a los esquemas de selección en bulk o masal y el de pedigrí vistos oportunamente al tratar los métodos de selección en plantas autógamas. Un número determinado de plantas son elegidas a partir de líneas avanzadas homocigotas. La semilla de cada planta cosechada en forma individual son sembradas al año siguiente en surcos progenies. Se verifica la uniformidad y presencia de plantas fuera de tipo y de acuerdo a esto se descartan surcos o progenies enteras. Los surcos restantes son cosechados individualmente y esta semilla será utilizada para sembrar parcelas progenies mas grandes al siguiente ciclo. Se repite la verificación de uniformidad y se inspecciona por progenies que manifiesten plantas no pertenecientes al tipo varietal. A la cosecha los surcos remanentes son recolectados en masa para obtener la Semilla del Mejorador. La ventaja de este método es su control por parte del mejorador lo que resulta en una mayor uniformidad y pureza del nuevo cultivar. Las desventajas son un mayor tiempo en obtener la semilla y el empleo de mayores recursos. Producción de Semillas en Especies Alógamas Poblaciones de polinización libre La producción de semillas de poblaciones de libre polinización comprende la toma de una muestra de la población a reproducir y, teniendo en cuenta que son especies alógamas, se la siembra en condiciones de estricto aislamiento de otras fuentes de polen. En maíz, por ejemplo, se recomienda una distancia mínima de 400 m entre campos de reproducción, sin embargo, esta distancia puede ser mayor si los campos se hallan en la misma dirección de los vientos dominantes. Además hay que considerar la existencia de barreras naturales, orografía, etc., en caso de especies polinizadas por insectos, por ejemplo alfalfa, las distancias estarán en función del radio de alcance del insecto. En el caso que la variedad esté compuesta por un número determinado de progenies (medios hermanos, hermanos completos o progenies de autofecundación) se pueden emplear algunas opciones para su intercruzamiento y obtener la Semilla del Mejorador. La primera es simplemente sembrar las progenies en aislamiento y permitir su libre polinización. Una segunda alternativa es sembrar las progenies y, en surcos alternos, por ejemplo, cada 2 o 3 progenies sembrar una mezcla de todas las progenies. Antes de panojamiento se eliminan la panojas de las plantas de las progenies. Una tercera alternativa es sembrar las mezclas de progenies y despanojar surcos alternos. Estas dos últimas alternativas impiden la 161

162 autofecundación de las plantas maximizando el intercruzamiento entre progenies. Variedades Sintéticas Para producir semilla de una variedad sintética los parentales selectos pueden intercruzarse del mismo modo que el descripto para una variedad de polinización libre. Esto puede realizarse mediante polinización manual con el objetivo de cruzar cada padre con todos los otros (dialélico). Si el número de padres es muy elevado o la polinización es dificultosa puede emplearse una policruza. Este bloque de cruzamientos debe realizarse en completo aislamiento. En caso de alfalfa para la producción de semilla se introducen abejas para favorecer la polinización entre los clones. La semilla recolectada será denominada Sintética-1 (Sint-1). La semilla de la Sint-1 es sembrada y mediante polinización libre se obtiene la Sint-2, y así también se obtiene la Sin- 3, etc. La Sint-1 correspondería a la Semilla del Mejorador, la Sin-2 a la semilla de fundación y la Sin-3 a la semilla certificada. Híbridos Como las líneas endocriadas parentales de los híbridos son líneas homocigotas su semilla se incrementa de la misma forma que para una línea pura de una especie autógama. La precaución es, obviamente, el aislamiento para impedir la contaminación con polen extraño. Con respecto a la producción de semilla híbrida, el principal aspecto es producir la semilla con los menores costos posibles, por ejemplo determinar la cantidad de surcos con líneas productores de semillas con relación a las polinizadoras (Tabla 1). Para llevar a cabo esto se dispone de cuatro métodos para la producción comercial de semilla híbrida. 1. Polinización manual Si las flores son hermafroditas es necesario la emasculación y posterior polinización manual o natural. En plantas dioicas simplemente se protege la flor femenina mediante bolsas especiales y luego se efectúa la polinización manual. La principal desventaja de este método es el costo en mano de obra y su eficiencia depende del número de semillas producida por cada polinización. Ejemplos de especies que se puede utilizar este método son tomate, pimiento, papa y maíz. 2. Machoesterilidad Génica La principal desventaja de este sistema es el carácter recesivo para su expresión, impidiendo la auto reproducción de la línea madre. Esto requiere un mantenedor heterocigota y además sería necesario identificar las plantas fértiles de la estériles antes de floración, lo que demandaría un marcador genético. Además este tipo de esterilidad es dependiente de cambios 162

163 ambientales. Se ha probado con distinto éxito en tomate, algodón, zanahoria, girasol y cebada. Tabla 1. Relación entre el número de líneas productoras de semillas y las polinizadoras para la producción de semilla híbrida en diferentes cultivos. Cultivo Línea productora de semilla Línea polinizadora Sorgo 3 1 Maíz 2 / 4 1 Girasol 2 / 7 1 Trigo 1 / Autoincompatibilidad Se siembran surcos intercalados de plantas autoincompatibles, pero compatibles entre ellas. Toda la semilla producida en los surcos será semilla híbrida. Los problemas con este método comprenden la necesidad de romper la incompatibilidad para la reproducción de cada línea parental y por otra parte la dependencia ambiental de este sistema. Como ejemplos se cuentan híbridos en especies hortícolas, en colza y en girasol. Producción de Semilla Híbrida en Especies Autoincompatibles Siembra de surcos alternados con las líneas parentales La producción de polen de cada padre determinará la cantidad de surcos a sembrar de cada uno: ej. 1:1, 2:1; 3:1, etc. Si se recolecta semilla sobre ambos padres la relación 1:1 es la más aconsejable. Si una de las líneas posee alelos S débiles, o es muy sensible al ambiente, la que posee alelos S fuertes debería superar en número a la anterior. Si un solo padre es cosechado la relación de líneas y polinizador es modificada por las condiciones ambientales del sitio de producción (estrés, condiciones no estables, etc.) 163

164 La producción de semillas en combinaciones híbridas, aún en condiciones óptimas, es menor que en variedades de polinización libre. Porcentajes de % en repollo son reportadas como promedio. En muchas de las especies la transferencia de polen es realizada por insectos, por lo tanto, las condiciones que alteran su comportamiento, alterarán la producción de semillas. 4. Machoesterilidad Citoplásmica-Génica. Este tipo de esterilidad es de amplia ocurrencia y puede ser introducido en genotipos adaptados mediante retrocruza. Necesita de genes restauradores de la fertilidad lo cual puede constituir un problema por el número de genes necesarios para la completa restauración de la fertilidad en el híbrido. Otro problema es que el citoplasma estéril ha causado efectos nocivos sobre el vigor de las plantas. También hay que considerar el costo de mantener las líneas necesarias para el mantenimiento del sistema de machoesterilidad (Tabla 2). Si el cultivo es polinizado por insectos, las plantas estériles pueden no ser visitadas por el insecto, que preferirá aquellas con polen, o sea el macho. Ejemplos de su empleo exitoso se han reportado en cebolla, zanahoria, remolacha azucarera, maíz y sorgo. Tabla 2. Número de parcelas necesarias para la producción de diferentes tipos de híbridos en maíz, incluyendo la reproducción de las líneas parentales, considerando empleo de la emasculación manual y esterilidad. Híbrido Emasculación Manual Empleo de Esterilidad Simple 3 4 Simple Modificado 5 6 Triple 7 6 Triple Modificado 7 9 Doble 7 9 Producción de Semillas en Plantas Asexuales La semilla de las plantas de propagación asexual difiere de la verdadera semilla de las especies sexuales. El principal problema de la propagación por órganos vegetativos, además de su laboriosidad, es evitar la propagación de 164

165 enfermedades a través de los distintos sistemas de reproducción: bulbos, esquejes, acodos, yemas, etc. Para evitar esto se emplea la propagación o multiplicación in vitro, la cual permite un rápido incremento de los clones y su mantenimiento libre de enfermedades. Como contrapartida, no todas las especies pueden ser propagadas fácilmente in vitro (por ejemplo las especies arbóreas). Determinación de volúmenes de semillas Para determinar la cantidad de semilla requerida para la producción de un número dado de plantas, deben considerarse la especie, la procedencia y el año de colecta; igualmente, se necesitan informaciones sobre el número de semillas/kg, la pureza y el porcentaje de germinación y, en algunos casos, el porcentaje de viabilidad en el cálculo, ya que las semillas vanas son extraídas antes del ensayo de germinación Cuando se requiere producir semilla para llegar a determinado volumen es necesario conocer: Rendimiento de la línea madre o productora de semillas La Densidad de Siembra El porcentaje de pérdidas Si es es una semilla F1 a producir la relación entre surcos madre y surcos del polinizador (1:1, 2:1, 3:1, etc.). Volumen a mantener como reserva para futuras reproducciones. Todos estos requerimientos son necesarios en la planificación de la producción de semilla de cualquier categoría. En base a ellos se podrá conocer la cantidad de hectáreas necesarias para la producción de determinado volumen de semilla. Derechos de los obtentores Los derechos de Propiedad Intelectual establecen normas para el control de las variedades creadas por el mejorador y varían de acuerdo a cada país. Usualmente rigen por un período de 15 a 20 años de acuerdo a la UPOV. En Argentina el título de propiedad sobre un cultivar es otorgado por un plazo máximo de 20 años. El derecho de propiedad de un cultivar inhibe a un tercero a explotarlo a título particular. En el caso de un cultivar extranjero, el representante legalmente autorizado y con domicilio en la Argentina es el autorizado para solicitar el título de propiedad, y éste será concedido siempre que el país donde fue originado reconozca similar derecho a las creaciones fitogenéticas argentinas. 165

166 La creación de la legislación es un estímulo para la industria privada y asegura un retorno a la investigación, pero por otra parte esta legislación protectora puede traer consecuencias sobre la disponibilidad de los recursos genéticos como restricciones en el intercambio de germoplasma, y una menor tendencia de los mejoradores a ceder germoplasma para investigación. La Argentina ah sido uno de los primeros países de América del sur en establecer la producción de semilla a nivel público y privado y la creación de programas de certificación de semillas (Tabla 3). Tabla 3. Cronograma del desarrollo de la industria de semillas en cinco países de América Latina Argentina Chile Colombia México Uruguay Iniciación del Mejoramiento Vegetal 1912 (Trigo) 1925 (Trigo) 1950 (Maíz, Papa) 1932 (Maíz, Trigo) 1912 (Trigo) Iniciación de la producción de semilla por el sector público Iniciación de la industria privada Arribo de compañías multinacionales 1919 (Trigo) 1950 (Maíz) 1970 (Girasol) Creación de programas de certificación de semillas Bibliografía Allard, R. W., Principios de la mejora genética de las plantas. Ed. Omega, Barcelona, 498 pp. 166

167 Tabla 3. Algunos ejemplos de cultivares inscriptos en el Registro Nacional de Cultivares de Argentina. Especie N de Cultivares Inscriptos Alfalfa 140 Algodón 22 Almendro 5 Arroz 31 Avena 46 Buffel Grass 5 Cebada 34 Cebolla 13 Centeno 23 Cerezo 6 Colza 23 Duraznero 5 Frutilla 19 Garbanzo 3 Girasol Híbrido 3 líneas 76 Girasol Híbridos Simples 67 Girasol Variedades 10 Maíz Dulce 15 Maíz Forrajero 1 Maíz Híbrido Tres Líneas 147 Maíz Híbrido Dobles 151 Maíz Híbrido Simples 100 Maíz Híbridos Intervarietales 6 Maíz Variedades 29 Maíz Pisingallo 4 Maní 13 Manzano 27 Naranjo 22 Papa 35 Soja 207 Sorgo Forrajero Híbrido 240 Sorgo Granifero 262 Trigo Fideos 10 Trigo Híbrido Pan 7 Trigo Variedades 106 Triticale

168 Unidad 15. Biotecnología Biotecnología La manera tradicional de asumir la mejora genética es, básicamente, cruzar genotipos seleccionados y a través de los distintos métodos de selección obtener recombinantes superiores que darán lugar a nuevos cultivares. Sin embargo, existen una variedad de técnicas que han sido y lo continuaran siendo de gran ayuda al mejoramiento tradicional. Estos procedimientos incluyen técnicas de cultivo de tejidos que han sido de gran utilidad para generar variación, permitir la transferencia entre especies distantes, seleccionara genotipos con ayuda de marcadores moleculares y obtener cultivares con características únicas como la resistencia a herbicidas. Cultivo de Tejidos La capacidad de regeneración a partir de células somáticas de plantas fue un hecho reconocido ya a principios del siglo XX. Haberlandt en 1902, citado por Borojević (1990), puntualizó la posibilidad de obtener plantas mediante el cultivo de tejidos. Definición Técnica mediante la cual un explante se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y en ambiente controlado. Aplicaciones Producción Comercial Saneamiento de Cultivares Conservación de Germoplasma Obtención de Variación Somaclonal Rescate de Embriones Obtención de Híbridos Somáticos Obtención de Haploides Transformación de Plantas Hibridación interespecífica e intergenérica Introducción El empleo más frecuente de la hibridación interespecífica e intergenérica es para la introducción de genes de especies silvestres en especies cultivadas. Las especies silvestres o salvajes, han evolucionado durante cientos de años, estando expuestas al ataque de patógenos, insectos y soportando cambios 168

169 bruscos en las condiciones ambientales. Como resultado de esta presión de selección, han desarrollado mecanismos de resistencia y/o tolerancia, que, sumado a grandes diferencias en suelos, altitud, clima resultaron en una gran variabilidad genética. El ciclo de siembra - recolección - siembra, conjuntamente con la selección por el hombre transformó, a través de los años, estos grupos de individuos en los actuales cultivares. Los trabajos de Mendel y el advenimiento del mejoramiento vegetal incrementaron notablemente las características deseables de las especies, resistencia a enfermedades, mayores rendimientos, adaptación, etc. De este germoplasma, mediante cruzamientos y selección, los mejoradores de plantas utilizaron la variabilidad existente para obtener nuevos cultivares. La variabilidad original se redujo y, con el paso del tiempo, los cultivos aumentaron su homogeneidad. El empleo de toda la tierra capaz de sustentar cultivos productivos hizo que muchas de las especies salvajes se perdieran. Esto motivó que, cuando un cultivar moderno mostraba una susceptibilidad a una determinada enfermedad, insecto ó condiciones ambientales extremas, se recurra a sus ancestros a fin de hallar en ellas soluciones a los problemas actuales. Es decir se trata de recuperar la variabilidad perdida. Antes que un grupo de individuos pueda ser convenientemente explotado, las disponibilidades de material y sus relaciones deben ser bien comprendidas. Desde Linneo, las plantas han sido agrupadas en taxones de acuerdo a diferencias morfológicas. Pero, cuando analizamos las especies en función de su compatibilidad en cruzas y la fertilidad de su descendencia, resultan estar emparentadas especies que morfológicamente pueden estar distantes. Debido a lo anterior se ha desarrollado el concepto de Especie Biológica, que comprenden aquellas especies que son compatibles en cruzas. Para describir más adecuadamente el germoplasma disponible para hibridación, Harlan y De Wet (1971) idearon un concepto de germoplasma ó pozo génico con los grupos de taxa compatibles. Definieron tres pozos génicos: I. Se incluyen aquí todas las especies que se hibridan libremente, producen descendencia viable, sus cromosomas se aparean regularmente e intercambian sus genes. II. Agrupa aquellas ssp que pueden ser usadas como fuentes de germoplasma, pero los híbridos son difíciles de obtener debido a diferentes niveles de ploidía, alteraciones cromosómicas ó barreras genéticas a la hibridación. Existe también, un cierto grado de esterilidad en la primera generación (F1) de los híbridos. 169

170 III. Los miembros de este grupo son difíciles de hibridar y sus individuos a menudo pertenecen a distintos géneros. Las cruzas se pueden efectuar a altos niveles de ploidía, existen altos niveles de esterilidad en las progenies. La fertilidad puede ser restaurada pero usualmente el porcentaje de zigotos viables es bajo. Barreras a la Hibridación El proceso de especiación conduce al desarrollo de mecanismos de aislamiento que mantienen la integridad de la especie restringiendo el flujo de genes de una especie a otra. Podemos definir especie como un conjunto de individuos que comparten un conjunto de genes. La distinción entre especies se produce cuando el intercambio genético entre individuos cesa. El mejorador trata de romper esas barreras, aunque sea temporariamente, para combinar especies o géneros distintos y obtener descendencia fértil. Generalmente se puede dividir las barreras a la hibridación en internas y externas. Barreras externas: diferencias en el tiempo y la duración de la floración, susceptibilidad al fotoperíodo y al frío. Esto se puede solucionar mediante tratamientos que modifiquen la extensión del día y/o la temperatura. Se puede prolongar el período de floración mediante injertos, por ej. Solanum en Lycopersicum. Barreras internas: autoincompatibilidad, diferencias en cruzas recíprocas, niveles diferentes de ploidía, degeneración del endosperma, muerte de embriones, eliminación de cromosomas. Manipulacion del material Comprende la metodología a seguir para tratar de salvar las dificultades a la hibridación entre especies comerciales y silvestres. Hibridación directa Igual número cromosómico: las posibilidades de conseguir éxito en la cruza son elevadas Distinto número cromosómico: a diferentes niveles de polidía de los taxones, los híbridos interespecíficos son difíciles de obtener. Muchas de las plantas cultivadas son poliploides: trigo, algodón, papa, caña de azúcar, etc. Los parientes silvestres de éstas tienen generalmente un número cromosómico más bajo, por lo que se encuentran distintos niveles de fertilidad según la cruza a realizar. Para solucionar esto se emplean cuatro metodologías distintas (Hadley and Openshaw, 1980): a) Hibridación directa. Es el método más común para la cruza: sp comercial poliploide x silvestre diploide. 170

171 La F1 parcialmente estéril resultante es tratada con colchicina a fin de lograr un apareamiento satisfactorio entre los genomios. Los triploides resultantes también pueden producir hexaploides a partir de gametas no reducidas. La retrocruza de el hexaploide con uno de los padres es un método de fijar los genes en la progenie. El éxito depende del nivel del apareamiento cromosómico y de cuantas sustituciones a nivel de cromosoma puedan tolerar las especies comerciales. b) Duplicación del número cromosómico de la especie silvestre antes de la hibridación. Se basa en la producción de autotetraploides ó anfidiploides en la especie salvaje antes de cruzarla por una especie poliploide comercial. Ventaja: Se eliminaría la esterilidad de los triploides. Desventaja: Los auto ó anfidiploides no siempre son vigorosos ó fértiles, por lo tanto es necesaria una selección anterior. Ejemplo: Nicotiana. c) Duplicación del número cromosómico de la especie comercial. Se trata de evitar el tratamiento posterior con colchicina. La progenie resultante se retrocruza necesariamente con la especie cultivada. Ejemplo: Nicotiana d) Reducción del número cromosómico de la especie poliploide. Es más problemático, se basa en la obtención de haploides y duplicarlos para cruzarlos con las especies silvestre Genomios básicos distintos. Se utilizan técnicas de sustitución y adición de líneas, inducción de translocaciones, etc. Cruzas Puente. Cuando es imposible la transferencia por métodos directos se han utilizado las llamadas cruzas puente. Este método trabaja solo en condiciones especiales: A cruza bien con B pero no con C, por ejemplo para transferir resistencia a Cercosporella (eyespot) del Aegilops ventricosa (resistente) al trigo pan, T. aestivum (susceptible): Este tipo de cruza tiene algunas desventajas: Metodología complicada Selección del carácter dificultosa. Sólo efectiva para monogenes dominantes Se debe efectuar una buena evaluación de los cruzamientos, pues la probabilidad de perder los genes deseados es muy alta. 171

172 1 Etapa Triticum turgidum x=7, 4x X Aegilops ventricosa x=7, 2x F1 2 Etapa Triticum aestivum x=7, 6x X F1 3 Etapa: se continúa con la retrocruza por T. aestivum Figura. Introducción de resistencia al trigo mediante una cruza puente 3.3 Manipulación Cromosómica Líneas de Adición y Sustitución. Las líneas de adición y sustitución han tenido generalmente poco valor comercial. Los univalentes ó bivalentes extra de una especie salvaje ó cultivada tienen efectos adversos sobre la fertilidad. Las especies poliploides usualmente toleran mejor los cromosomas extras que las especies diploides ("buffering"), pero el delicado balance del complejo génico a menudo es perturbado. Una excepción es el género Saccharum, donde la adición de cromosomas de una especie salvaje a la sp Saccharum officinarum L. (2n=80), es común en la mejora de esta sp. La sustitución de cromosomas, en algunos casos, tiene efectos menores sobre la expresión fenotípica comparada con la adición. El valor de la sustitución depende de: # La naturaleza del carácter a transmitir # Ligamientos no deseados # Divergencia entre la sp cultivada y la silvestre Se realiza en especies de las cuales se posee un extenso conocimiento de su citogenética. Se ha empleado en la transferencia de resistencia a la roya desde Agropyron a Triticum aestivum Translocaciones Cuando las sp a cruzar poseen cromosomas no homólogos y cuando la sustitución no es factible. Sears (1956) reportó el uso de translocaciones para transmitir resistencia a roya de Aegilops umbellulata hacia Triticum aestivum, con la ayuda de radiación y posterior transferencia del segmento de cromosoma que lleva los genes para resistencia. 172

173 3.3.3 Control del Apareamiento Cromosómico. Es una manipulación a nivel de cromosomas para facilitar el apareamiento de cromosomas no homólogos. 3.4 Manipulación Fisiológica Cultivo de Embriones. Aún cuando una cruza produzca un zigoto viable, interacciones de incompatibilidad a nivel génico pueden impedir el normal desarrollo del embrión ó del endosperma. Las técnicas de cultivo de órganos son usadas para proveer el medio adecuado al embrión para su crecimiento y desarrollo. Se trata de reemplazar la función que normalmente debería cumplir el endosperma en los cereales y los cotiledones en las dicotiledóneas. Triticum sp x Hordeum x=7, 2-6x x=7, 2-6x F 1 La F1 es tratada con ácido giberélico hasta 10 días y luego se remueve el embrión para su traslado a un medio artificial. 4. Desarrollo de Variedades Aunque en muchos casos exitosa, la transferencia génica entre especies distantes por métodos sexuales es laboriosa y con un alto costo de tiempo y recursos. Antes de que el cultivar llegue a producción comercial existen algunos problemas: Luego de seis generaciones de retrocruza seguida a una transferencia intraespecífica, el natural proceso de recombinación frecuentemente no separa genes fuertemente ligados. De lo anterior se desprende que genes que afecten alguna cualidad pasan junto con los genes deseados. Si el gen deseado es al fin aislado, su comportamiento y expresión pueden ser impredecibles. 5. Transferencia mediante métodos no sexuales El desarrollo de estos métodos ha sido posible debido a que células, órganos y tejidos pueden ser cultivados in Vitro. El éxito de esta metodología depende de la habilidad para producir plantas totalmente diferenciadas a partir de tejidos ú órganos no sexuales. 173

174 5.1 Fusión de Protoplastos La fusión de protoplastos provee un medio de combinar genomios de especies distantes genéticamente. Se emplean células desprovistas de su pared celular ó protoplastos. Estos protoplastos son inducidos a fusionarse mediante diversas técnicas. Se obtiene una mezcla de los genomios nuclear y de las organellas. Esta mezcla puede segregar en diferentes vías. El híbrido somático resultante es cultivado in vitro para producir callos a partir de los cuales se trata de regenerar la planta completa. Es factible obtener híbridos nucleares simétricos y combinaciones de los genomios de las organellas en diferente proporción de cada padre. Técnicas Fusión espontánea, luego de la remoción de la pared celular originando cuerpos multinucleados. Centrifugación a bajas r.p.m. PEG con la mezcla de protoplasma, actúa como un puente molecular. Impulsos eléctricos. Objetivos Combinar cromosomas de especies incompatibles Introducir el genomio de una sp. dentro del citoplasma de otra. Obtener un citoplasma mezclado, con organellas, cloroplastos y mitocondrias, de ambas especies. Esto se denomina Cíbrido. Incorporar esterilidad citoplásmica-nuclear. Ej. Nicotiana. Desventajas: Frecuente inestabilidad del Cíbrido Falta de regeneración Necesidad de repetidas retrocruzas y selección para fijar los caracteres deseados. Identificación y Selección de Células Híbridas Luego de la fusión, después de que las células recobren su pared y se multipliquen por mitosis, se dispone de un medio con: a) Células parentales b) Células heterocarióticas o híbridos Las células híbridas pueden ser diferenciadas de las otras por selección basada en la complementación: Si se fusionan protoplastos con distintos requerimientos para el desarrollo, se puede identificar lo híbridos al ponerlos en un medio que 174

175 no suplemente esos requerimientos, ej. para obtener híbridos somáticos autótrofos para auxinas en sp del género Nicotiana. Fusión de albinos, con alelos recesivos en distinto locus, y posterior selección para individuos fotosintéticos. Además, se pueden emplear otras técnicas: Empleo de marcadores morfológicos en combinación con mutantes albinos Selección visual (microscópica) y aislamiento mecánico. Separación de los heterocariotes por diferencias de densidad bajo centrifugación. Regeneración La habilidad de regeneración a partir de protoplastos parece comportarse como un carácter dominante en todas las células híbridas que han sido examinadas. En muchos casos, el híbrido es capaz de regenerarse aún cuando uno solo de los padres posee esa cualidad. 6. Transferencia génica mediante manipulación directa de DNA La transferencia de DNA mediante métodos no sexuales hace posible manipulaciones que están mas alla de las técnicas comunes de la mejora o de la fusión de células. Lo genomios pueden ser obtenidos de fuentes exóticas: plantas, animales, bacterias y virus e introducidas en una especie en particular. 6.1 Agrobacterium Se explota la habilidad natural de la bacteria de suelo Agrobacterium tumefaciens, de transmitir DNA a un cromosoma hospedante. A. tumefaciens es un patógeno que transmite un set de genes de una región denominada T- DNA (Ti-plasmid) dentro de las células de una planta en los sitios de infección. El patógeno tiene un amplio rango de hospedantes. El resultado de la transferencia es un crecimiento tumoroso llamado corona en el cual el T-DNA es integrado en forma estable dentro del cromosoma huésped. El sitio de integración es aleatorio. El tumor resulta de la expresión de los genes del T- DNA que altera el normal balance de fitohormonas en la célula. La técnica consiste en eliminar los genes que causan el tumor y reemplazarlos por DNA que codifique las características deseadas. El período crítico es la recuperación de una planta completa a partir de una célula transformada. Se ha empleado con éxito en tabaco, tomate soja y en petunia. Una gran desventaja es que no es activo en monocotiledóneas. 175

176 Aplicaciones más importantes: Transferencia de genes que anulan el efecto de herbicidas. Transferencia de genes que codifican proteínas obtenidas de Bacillus thuringiensis para prevenir el ataque de insectos. La ventaja de este método es que, luego de una selección para obtener plantas regeneradas con las características deseadas, estas son predecibles, heredables y estables. 6.2 Introducción directa de DNA Es una alternativa para especies que no admiten el empleo de Agrobacterium Absorción. Es la absorción por parte de los protoplastos de DNA de un medio de cultivo con la ayuda de ciertos agentes como el PEG o pulsos eléctricos Microinyección de DNA. Se inmoviliza la célula y mediante micropipetas se inyecta DNA sin alterar el organismo. Se ha utilizado en alfalfa y en Brassica napus. 7. Conclusiones La posibilidad de la transferencia exitosa de ciertos genes de una especie silvestre a otra cultivada depende del método utilizado, como así también del grado de parentesco entre las especies. Si existe la posibilidad de elegir la especie donora del carácter, se debe priorizar aquella mas cerca filogeneticamente. En orden de prioridad en la elección debe ser: otras variedades - variedades relacionadas botánicamente - especies ancestrales de la variedad - especies o géneros que posean uno o mas genomios en común con el cultivar receptor. A medida que el grado de parentesco entre las especies a cruzar disminuya, mas complicado será el método a emplear, y las posibilidades de éxito serán menores. Teniendo en cuenta los ejemplos mencionados anteriormente y en la tabla 1, el uso de especies ancestrales o no domesticadas es principalmente para incorporación de resistencia a enfermedades, sin embargo existen otros caracteres que fueron mejorados ( Ramanna and Jacobsen, 1993): Mejora de la Adaptación. En Rusia se ha introducido precocidad en soja, extendiendo de este modo este cultivo a regiones frías como Siberia. De la misma manera se ha introducido tolerancia al frío en trigo, centeno y en uvas. Trabajos en el Centro Internacional de la Papa (CIP) en Perú, han permitido el cultivo de papa en tierras bajas de los trópicos, donde los anteriores cultivares no producían tubérculos. En Holanda se esta tratando de incorporar tolerancia al calor y a menor intensidad de luz, para cultivar tomates en invernaderos, utilizándose Lycopersicum pimpinellifolium y L. minutum. 176

177 Mejora de la Calidad. Mejor textura en papa a partir de Solanum goniocalyx. Menor contenido de nicotina en tabaco a partir de Nicotiana debneyi. Mejor sabor en frutillas a partir de Fragaria vesca. Alto contenido de proteína en soja, arroz y avena, a partir de especies silvestres. Incremento en el Rendimiento. En este aspecto es muy poco lo logrado hasta el momento, sin embargo existen algunos antecedentes. Se han encontrado incrementos en los rendimientos en cruzas que, originariamente, fueron realizadas para incorporar resistencia: en avena cruzada por A. sterilis para conferir resistencia a roya; en papa con S. vernei, originalmente para resistencia a nemátodos y con S. demisum para resistencia a Phytophthora. Caracteres específicos. El carácter espigas ramificadas en trigo y centeno introducido de especies salvajes. Tabla 1. Ejemplos de caracteres transferidos por hibridación interespecífica o intergenérica. Los ejemplos se basan en aquellas familias en la cual la transferencia ha sido exitosa. Especie Cultivada Especie Donante Carácter Avena sativa A. sterilis Incremento en rendimiento Beta vulgaris B. procumbens Resistencia a nemátodos Gossypium hirsutum G. raimondii Resistencia a roya Lycopersicum sculentum L. peruvianum Resis. a nemátodos y virus TMV Solanum tuberosum S. acaule Resis. al virus X Solanum tuberosum S. demissum Resis al virus Y Triticum aestivum Aegilops ovata Alto contenido de proteína Triticum aestivum Aegilops speltoides Resis. a la roya del tallo Triticum aestivum Aegilops squarrosa Resis. a la roya de la hoja Triticum aestivum Agropyron elongatum Tolerancia a sequía Triticum aestivum Secale cereale Resis. a la roya amarilla y al frío Triticum durum T. monococcum Resis. a la roya del tallo Zea mays Tripsacum dactyloides Resis. a Helmintosphorium Haploidía 1. Introducción El número cromosómico somático de una planta, 2n, es debido a la unión de dos gametas con número haploide, o con n número de cromosomas. Haploides son aquellos organismos que se originan de un núcleo con n cromosomas. Teóricamente, ellos pueden originarse a partir de la célula huevo, de las sinérgidas y de las antípodas en el caso materno, y del núcleo vegetativo y 177

178 ambos núcleos generativos paternos. El desarrollo autónomo de un núcleo con n número de cromosomas en una planta completa puede ocurrir in vivo (partenogénesis y androgénesis haploide) e in vitro (cultivo de micrósporas). Una planta completamente homocigota produce gametas idénticas, y por lo tanto un solo tipo de haploides. Una planta heterocigota da lugar a diferentes tipos de gametas, y por tanto, a haploides genéticamente diferentes. 1.1 Definición Un haploide es un organismo que se asemeja a un esporofito, pero que posee una constitución cromosómica igual a la de los gametos normales de la especie (Lacadena, 1970, Hermsen y Ramanna, 1974). Estos individuos se llaman monoploides si derivan de una planta diploide y polihaploides si provienen de una planta alo o autopoliploide (Sanchez Monge, 1974). 2. Origen e Inducción de Haploides La ocurrencia de individuos haploides no depende de una especie, género o familia en particular. Se han encontrado haploides en alrededor de 250 especies de 25 familias. En el 60% de los casos ellos eran monohaploides y en el resto polihaploides Origen in vivo La modalidades difieren grandemente, pero ellas tienen en común que se originan después de la autopolinización o de la polinización cruzada. Esto significa que, los individuos haploides deben ser seleccionados a partir de poblaciones mezcladas (Diploides mas haploides) Ginogénesis (seudogamia) Una célula haploide del saco embrionario se desarrolla formando un esporofito completo. en este caso existe fertilización del núcleo secundario del saco embrionario para la formación del endosperma, permitiendo la sobreviviencia del embrión haploide. Este modo de origen de haploides ha sido investigado principalmente en maíz, papa y alfalfa (Figura 1) Androgénesis La célula huevo es expulsada y un núcleo espermático (paterno) toma su lugar dando un embrión haploide de origen paterno embebido en el citoplasma materno. El endosperma se desarrolla normalmente. La frecuencia de estos haploides es muy baja, por ejemplo en maíz es de 1 en , lo cual impide su utilización práctica (Chase, 1969). Para incrementar la ocurrencia de haploides Kermicle (1969) encontró un mutante recesivo, Ig (gametofito indeterminado) que causa un crecimiento indeterminado del saco embrionario, dando mas chances al núcleo paterno de desarrollarse androgenéticamente. El Ig gene aumenta la frecuencia en 2.3%. 178

179 Para detectar los individuos adrogenéticos es indispensable utilizar marcadores genéticos donde el padre es homocigota recesivo y la madre es homocigota dominante (en el caso de ginogénesis la situación es a la inversa) Semigamia Los núcleos masculino y femenino no se fusionan. Ellos se dividen independientemente y forman un embrión haploide quimérico en el cual existen tejidos haploides paternos y maternos. Los tejidos se pueden identificar en el esporofito desarrollado mediante marcadores, como ser distintos tipos de glándulas epidérmicas, o distintos tipos de hojas. Se encontró semigamia en algodón (Turcotte y Feaster, 1967) y en cacao Eliminación del genoma La eliminación natural de un genoma completo de uno de los padres después de la fecundación origina individuos haploides. Esto se ha encontrado en el género Hordeum, y especialmente en Hordeum bulbosum (Barclay, 1975). En la cruza H. vulgare x H. bulbosum los cromosomas de H. bulbosum son eliminados del embrión y también del endosperma. Al no ser viable el endosperma el embrión debe ser cultivado in vitro. La eliminación se produce en un estadio muy temprano del embrión y es independiente si H. bulbosum es utilizado como padre o madre. Se ha tratado de lograr haploides de trigo mediante cruzamientos con sorgo, mijo y con maíz. En la combinación trigo x maíz, ocurre fertilización del 20 al 30% de las espiguillas. Se forma el embrión pero carece de endosperma. Esto híbridos pierden rápidamente los cromosomas pertenecientes al maíz. El embrión debe ser cultivado en un medio artificial Origen in vitro. Los haploides in vitro pueden ser obtenidos por cultivos de anteras y ovarios. el número de especies en las cuales pueden producirse grandes cantidades de individuos es aún limitado. El estadio de desarrollo de la antera, el medio y la necesidad de tratamientos complementarios, ej.: frío, calor, varía enormemente de especie a especie. Se requiere: 1. Un medio de cultivo de micrósporas estandarizado. 2. Genotipos que respondan al tratamiento en alta frecuencia. 3. Buena regeneración de plantas a partir de células o callos. 4. Que el agente para la duplicación cromosómica no provoque mutaciones 3. Selección de haploides a partir de cruzas Como para la producción de haploides in vivo es necesario la polinización, es obvio que se obtienen progenies consistentes en híbridos + haploides. Por ello es necesario seleccionar los individuos haploides. Esto se puede realizar de distintas maneras: 179

180 b. Recuento de cromosomas. Este es un método muy laborioso, dado que en promedio se pueden obtener 20 plantas por día. c. Empleo de marcadores genéticos. Básicamente se necesita que la progenie híbrida de un cruzamiento controlado pueda diferenciarse de la no híbrida o haploide (partenogenética). Se requiere un genotipo homocigota para un gen o un complejo de genes dominantes que ocasionen una manifestación fenotípica temprana, en semilla o en plántula. Un ejemplo es el embrión púrpura en maíz, P que puede ser aplicado en el caso de plantas no coloreadas, pp (Nanda y Chase, 1966): pp x PP Pp Hibridos + p haploides 4. Duplicación Un genoma se duplica cuando todos sus cromosomas se duplican sin que exista una posterior división del núcleo. A fin de obtener individuos homocigotas y semillas viables el individuo haploide obtenido debe ser duplicado: Duplicación espontánea: esta se produce, pero en frecuencias muy bajas para las necesidades del experimentador. Duplicación inducida: para diploidizar un elevado número de haploides rápida y eficientemente, la técnica utilizada debe ser: a. Segura, simple y rápida b. Permitir el manejo de grandes cantidades de individuos c. Que no se produzcan daños fisiológicos y que no sea selectivo d. Que no produzca daños o cambios genéticos e. Que no origine otros niveles de ploidía f. De alta eficiencia y repetibilidad 5. Utilidad de los haploides a. Obtención de plantas diploides homocigotas a partir de individuos heterocigotas, especialmente plantas alógamas y plantas dioicas. b. Obtención de series monosómicas para estudios genéticos. c. Utilización directa, por ejemplo en ornamentales por su prolongada floración, ej: Pelargonium. 180

181 d. Los haploides androgenéticos permitirían la incorporación de núcleos en citoplasma de otra célula e. Dado que no existe relación de dominancia el genotipo del recesivo se expresa, siendo de utilidad en la mejora por mutación f. En alopoliploides como paso intermedio en la duplicación cromosómica a fin de conseguir homología. g. Para transferencia génica de sp poliploides a sp diploides. 6. Perspectivas y Conclusiones Desde el punto de vista del mejoramiento, la utilización de haploides como tales no es muy frecuente, salvo en ornamentales (punto c). Las mejores perspectivas las ofrece la posibilidad de obtener plantas 100% homocigotas partiendo de material heterocigota como clones, plantas alógamas, F2 y F3 de un cruzamiento en autógamas. Este procedimiento, producción de monoploides seguido de la duplicación, se conoce como el método doble-haploide (DH). En el caso de especies alógamas, ej.: maíz, con el método DH, se pueden obtener plantas homocigotas o líneas endocriadas en un solo paso, mientras que por el método usual, autofecundación, demanda 6 a 7 generaciones. En el caso específico del maíz, se evaluaron líneas homocigotas obtenidas por el método común y derivadas de haploides, a nivel de aptitud combinatoria no se encontraron diferencias sustanciales. Por ello, algunos autores, Sprague et al. (1960), están en contra del método DH dado que argumentan que es mas fácil la obtención de líneas por el método común. Mas aun, por el método convencional, las lineas que llegan a las ultimas etapas han sido evaluadas, y el mejorador posee información sobre características agronómicas y sobre la aptitud combinatoria de las líneas. En el caso de autogamas, el método DH ofrece la posibilidad de fijar genotipos individuales en etapas tempranas del programa de cría. De esta forma se pueden obtener variedades o material para el nuevo ciclo de recombinación y selección. En el caso de plantas dioicas, especies con fase juvenil demasiado larga y en aquellas que presenten autoincompatibilidad estricta, es difícil producir líneas homocigotas a través de autofecundaciones, siendo el método DH una alternativa a considerar. 181

182 Figura 1. Obtención de líneas puras mediante la utilización de haploides y mediante la metodología clásica. Bibliografía Barclay, I. R., High frecuencies of haploid production in wheat (Triticum aestivum) by chromosome elimination. Nature 265: Chase, S. S., Monoploids and monoploid derivatives of maize (Zea mys L.). Bot. Rev. 35: Goodman, R. M., H. Hauptli, A. Crossway and V. C. Kanuf, Gene Transfer in Crop Improvement. Science 236: Hadley, H. H. and S. J. Openshaw, Interespecific and Intergeneric Hybridization. Chapter 7, In Fehr, W. R. and H. H. Hadley (Eds.), Hybridization of Crop Plants, American Society of Agronomy, pp Harlan J. R. and J. M. J. De Wet, Towards a rational classification of cultivated plants. Taxon 20 (4):