UNIVERSIDAD VERACRUZANA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA PAPEL DE LA FSH EN EL CICLO ESTRUAL Y LA OVULACIÓN MÚLTIPLE EN LA HEMBRA BOVINA MONOGRAFÍA PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: FRANCISCO CÁRDENAS RUIZ ASESORES: MPA. BERTHA CLEMENTINA HERNÁNDEZ CRUZ DR. FELIPE MONTIEL PALACIOS VERACRUZ, VER. 2009

2 DEDICATORIA Por su amor y su apoyo, su comprensión y en especial por creer en mi. A mis papás Antonio y Elvia (Q.D.E.P.) con todo cariño y a mis hermanos Chela, Marytoña, Elvia, Toño y Felipe con todo afecto. A Rocío, el amor de mi vida. A mis hijos Valeria, Fey y Paco, que son el latir de mi vida. A mis amigos Carlos Briseño, Santiago Mier, Marisela Hernández, Elsa Cortez, Inés Figuereo, que siempre están en las buenas y en las malas.

3 AGRADECIMIENTOS A mis maestros de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, de la Universidad Veracruzana, que me forjaron y orientaron durante mi época de estudiante. Gracias: MVZ José Manuel Páez (Q.E.P.D.), MVZ. Sergio Castellanos, MVZ. Augusto Mancisidor. A mis asesores: MPA. Bertha Clementina Hernández Cruz, Dr. Felipe Montiel Palacios. A mi Honorable Jurado.

4 Índice Página Resumen Introducción Objetivo.. 4 Justificación Metodología Hormona folículoestimulante (FSH) Papel de la FSH en el ciclo estrual Ciclo estrual Desarrollo folicular Foliculogénesis Ovulación Papel de la FSH en la ovulación múltiple Sincronización del celo Tratamiento hormonal Conclusiones Literatura citada... 32

5 1 RESUMEN Francisco Cárdenas Ruiz. Papel de la FSH en el ciclo estrual y la ovulación múltiple en la hembra bovina. Monografía profesional. Asesores: MPA. Bertha Clementina Hernández Cruz, Dr. Felipe Montiel Palacios. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, Ver La hormona folículoestimulante (FSH) es producida en la hipófisis anterior y secretada en forma pulsátil a lo largo del ciclo estrual de la hembra bovina; es esencial para la función reproductiva normal, ya que regula el crecimiento y maduración de los folículos ováricos. Durante la fase folicular del ciclo estrual los niveles plasmáticos de FSH aumentan significativamente, dándose el desarrollo y maduración folicular. Durante la fase de selección, la mayoría de los folículos antrales inician su crecimiento bajo la acción de la FSH; en la fase de dominancia sólo uno de ellos se desarrolla, mientras los otros sufren atresia. La FSH se une a sus receptores en las células de la granulosa del ovario; esta respuesta se ve aumentada en hembras que reciben tratamiento para ovulación múltiple (OM). La OM es la inducción de más de una ovulación, mediante la aplicación de hormonas que estimulan los folículos produciendo un crecimiento intensivo, con el fin de que al momento de la inseminación artificial se produzca más de un embrión. Para realizar la OM se utiliza comúnmente FSH, que hace que en ambos ovarios se desarrollen varios folículos dominantes. Los tratamientos de inducción de OM con FSH comprenden inyecciones de la hormona en dosis decrecientes dos veces al día por 4 días, comenzando el día 10 del ciclo estrual. Aunque estos tratamientos en general resultan en un mayor número de folículos desarrollados, existe gran variación en la respuesta al tratamiento entre animales y en el mismo animal. Esta variabilidad puede deberse a diferencias en los tratamientos de OM, o a factores inherentes al animal y a su medio ambiente. Palabras clave: Bovino, ciclo estral, folículos ováricos, ovulación, sincronización.

6 2 INTRODUCCIÓN Las hormonas son sustancias químicas producidas por tejidos específicos, que se vierten directamente en el torrente sanguíneo en respuesta a determinados estímulos, provocando una respuesta específica que puede manifestarse de forma inmediata o mediata. Como resultado, la célula receptora del estímulo modifica su comportamiento a través de cambios metabólicos. Las acciones promovidas por las hormonas pueden ser modificación en la permeabilidad de las membranas o en los mecanismos de transporte, modificación de la síntesis proteica y/o de la actividad enzimática celular (Calandra y de Nicola, 1985). La producción hormonal es controlada por un sistema de retroalimentación negativa, en el que el aumento de la concentración de hormona origina una menor producción de la misma, usualmente mediante una interacción con el hipotálamo o hipófisis (Hafez, 2002). El eje hipotálamo-hipófisis-gónadas regulan la producción de hormona luteinizante (LH), FSH y esteroides ováricos, esenciales para la maduración folicular, ovulación, implantación y mantenimiento de la gestación (Ascoli y Segaloff, 1996). La producción de FSH inicia en el hipotálamo, con la liberación de hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), que es regulada por el núcleo arcuato ubicado en el hipotálamo medio basal. La GnRH es liberada en forma de pulsos por la vascularización portal, a través de la cual llega a la hipófisis anterior. Allí se une a los receptores de superficie de las células productoras de FSH y LH o gonadotropos, los que también las secretan en forma pulsátil (Rosell et al., 2004). En bovinos, se ha observado gran variabilidad en la respuesta del eje hipotálamohipósifis-gónada-órgano blanco al estímulo hormonal, ya sea fisiológico, o utilizando diferentes tratamientos para la inducción de ovulación múltiple (OM) (Mapletoft et al., 2002). Esto podría deberse a cambios estructurales en los genes de receptores hormonales, que podrían resultar no deseables en programas

7 3 reproductivos. Se ha comprobado que muchos trastornos cíclicos son de origen genético y afectan generalmente al ovario (Adashi y Hennebold, 1999). El desarrollo del sistema reproductivo inicia en el embrión. Después del nacimiento, se produce un estado de latencia hasta la pubertad, cuando el animal debe alcanzar el tamaño y peso adecuados para enfrentar un estado de futura madurez sexual o inicio del ciclo reproductivo, el cual es coordinado por las gonadotropinas FSH y LH, responsables de controlar la función ovárica. La FSH es esencial para la función reproductiva normal, es decir, para el desarrollo folicular en las hembras y la maduración sexual normal (Pearly et al., 2002). A nivel ovárico, la FSH actúa sobre los receptores en las células de la granulosa, regulando la maduración folicular (Dieidrich et al., 1998). La LH induce la ovulación y luteinización de las células de la granulosa y teca del ovario, en donde se liberan los estrógenos producidos por los folículos, y la progesterona secretada por el cuerpo lúteo (CL). Ambos regulan el ciclo reproductivo mediante mecanismos de retroalimentación que actúan sobre el hipotálamo y la hipófisis (Mukasa-Mugerwa, 1989). Esta revisión resume el papel de la FSH en el ciclo estrual y la OM en la hembra bovina, permitiendo conocer los factores que originan la variabilidad en la efectividad de los tratamientos de OM como parte de programas reproductivos.

8 4 OBJETIVO Recopilar y analizar información sobre el papel de la FSH en el ciclo estrual y la ovulación múltiple en la hembra bovina, a fin de generar un documento que permita el acceso al conocimiento de esta área. JUSTIFICACIÓN El conocimiento del papel de la FSH en el ciclo estrual y la ovulación múltiple en la hembra bovina permite conocer la fisiología y endocrinología que se ven involucradas en estos procesos, así como entender la respuestas a los tratamientos farmacológicos para OM, para aprovechar al máximo técnicas de mejoramiento genético como la inseminación artificial y la transferencia de embriones. METODOLOGÍA Se revisaron artículos publicados en revistas de arbitraje internacional y nacional relacionados con el tema el papel de la FSH en el ciclo estrual y la ovulación múltiple en la hembra bovina, publicados en los últimos 10 años, o anteriores cuando se consideró pertinente. Asimismo, se realizaron búsquedas relacionadas con el tema, utilizando bancos de datos electrónicos disponibles en bibliotecas y/o centros de investigación. 1. HORMONA FOLÍCULOESTIMULANTE (FSH) La FSH es una glicoproteína de alto peso molecular, secretada en pulsos de baja frecuencia desde los gonadotropos de la hipófisis, y es producto de la unión de la GnRH a los receptores acoplados a proteínas G en la hipófisis (Recabarren et al.,

9 5 2006). La FSH está compuesta por dos subunidades no covalentes α y β, codificadas por genes ubicados en cromosomas diferentes (Graus et al., 2001). La subunidad α es común para todas las hormonas glicoproteicas, mientras que la subunidad β confiere la especificidad hormonal (Pierce y Parsons, 1981). Sin embargo, el control de su secreción depende en parte de la estimulación ejercida por la GnRH secretada por el hipotálamo, y en parte de la interacción de inhibinas, que inhiben su secreción, y de activinas, que la estimulan (Carroll et al., 1991). La FSH cumple diferentes funciones biológicas, como la proliferación y secreción de células de Sertoli, influyendo en la espermatogénesis en machos (Kilgour et al., 1998), así como reclutamiento y selección de folículos ováricos y síntesis de estradiol a partir de precursores androgénicos en hembras (Campbell et al., 2004). La FSH ejerce su acción a través de un mecanismo en el cual la hormonoa llega al interior de las células blanco al unirse a receptores específicos encontrados en la membrana plasmática (Pierce y Parsons, 1981). La expresión de estos receptores en las células de la granulosa depende del estadío de la diferenciación celular en el ovario (Donadeu y Ascoli 2005). Sin embargo, por diferentes razones algunos receptores en el órgano blanco no reconocen la señal hormonal. La FSH es capaz de unirse a su receptor en las células de la granulosa, respuesta que se ve aumentada en vacas con inducción de ovulación múltiple (OM) por la alta producción de óvulos (Mapletoff et al., 2002). Los receptores para FSH son expresados tanto en células maduras como inmaduras, y cumplen dos funciones principales: reconocer la hormona por medio de un acople o ligadura de ésta, e iniciar los eventos químicos que dan lugar a la acción biológica del sistema hormonal específico, en este caso la maduración folicular, por la combinación receptor-hormona (Wangsness et al., 1981). Los receptores FSHR o metabotrópicos, pertenecen a una familia común de genes acoplados a proteínas G (GPCRS). Estos receptores están formados por siete

10 6 hélices insertadas en el plasmalema celular (Shemesh, 2001). El receptor para FSH pertenece a una familia de proteínas homólogas que atraviesan siete veces la membrana. Estos receptores transmembranales regulan a las proteínas G y tienen la función de transducir información del espacio extracelular al interior de la célula, estimulando o inhibiendo sistemas de segundos mensajeros (Kroese et al., 2003). Una vez que el receptor es expresado en las células de la granulosa, se inicia la señalización en cascada. La FSH se une a su receptor con alta afinidad, y los eventos de unión inician un cambio conformacional en el receptor, el cual activa a las proteínas G encargadas de iniciar la respuesta intracelular (Simoni et al., 1997). 2. PAPEL DE LA FSH EN EL CICLO ESTRUAL 2.1 CICLO ESTRUAL En la hembra bovina, el ciclo estrual se divide en dos fases, folicular (proestro y estro, terminando con la ovulación) y lútea (metaestro y diestro, terminando con la luteólisis), con una duración promedio de 21 días (Whittier, 2003). El 84% de los ciclos duran entre 18 y 24 días, siendo la manifestación de celo aproximadamente de 12 a 16 h. La ovulación ocurre 10 a 15 h después del final del celo (Hafez, 2002). La fase folicular dura de 2 a 4 días y comienza al final del ciclo que la antecede con un aumento significativo y progresivo de los niveles circulantes de FSH, comprendiendo los estadíos de desarrollo y maduración folicular o foliculogénesis. La fase lútea dura aproximadamente 18 días (Ownby, 2004). logy La FSH secretada en ondas a lo largo del ciclo estrual desempeña un papel fundamental para el crecimiento de un grupo de folículos. Las hembras Bos taurus y Bos indicus presentan generalmente dos a tres ondas de crecimiento folicular en su ciclo estrual, variabilidad que no está relacionada con la raza, edad y nivel de fertilidad de las mismas. El número de ondas de crecimiento folicular durante el ciclo estrual es determinado por la longitud de la fase luteal (Gigli et al., 2006).

11 7 En los ciclos estruales de dos a tres ondas, la emergencia de la primera onda folicular ocurre generalmente alrededor del día de la ovulación. La emergencia de la segunda onda ocurre en el día 9 10 para los ciclos de dos ondas, y en el día 8-9 para los de tres ondas. En estos últimos, la onda emerge en el día En las ondas foliculares anovulatorias, los foliculos sufren regresión sin ovular. El folículo dominante presente en el inicio de la luteólisis será el folículo dominante ovulatorio, y la emergencia de la próxima onda (primera del nuevo ciclo) se demorará hasta el momento de la ovulación. La primera, segunda y tercera onda folicular se observan durante las fases luteal temprana, luteal media y folicular, respectivamente (Ginther et al., 1997). En las ondas foliculares no ovulatorias, las concentraciones de estradiol circulante se mantienen bajas, pues a pesar de que el tamaño preovulatorio puede ser alcanzado, el folículo dominante no reúne las características funcionales preovulatorias, tales como la producción de estradiol. El folículo dominante (folículo estrógeno activo) de la última onda continúa su crecimiento y la biosíntesis de estradiol, hasta que se alcanza el nivel suficiente de estradiol circulante para producir la retroalimentación positiva sobre el área de control cíclico del hipotálamo que aumenta los pulsos de GnRH/ LH/ FSH, e induce el pico preovulatorio de LH y FSH, y por lo tanto, la ovulación. Después del pico de LH esta retroalimentación se interrumpe y las células de la granulosa sintetizan progesterona y se luteinizan. El mecanismo que regula la dinámica folicular está basado en las respuestas diferenciales a la FSH y LH (Johnson et al., 2004). Durante la fase de selección, la mayoría de los folículos antrales comienzan su crecimiento bajo la acción de la FSH; en la fase de dominancia sólo uno de los folículos seleccionados se desarrolla a expensas de los otros. Después de la ovulación, en la cavidad dejada por el folículo se forma una estructura similar a un coágulo, el cuerpo hemorrágico, que se transforma en CL hacia el día 5 del ciclo (día 0 = estro), iniciando la secreción de progesterona (P4). Hacia el día tres, las concentraciones plasmáticas de P4 son bajas (1 ng/ml), del día 7 al 18 aumentan

12 8 (6-10 ng/ml), y durante la luteólisis disminuyen en 24 a 36 h (Wright y Malmo, 1992). Hacia el día 15 del ciclo, la P4 declina bruscamente, desencadenando la secuencia de cambios hormonales que producen el estro y la ovulación; por lo tanto, el CL es el reloj biológico que controla la duración del ciclo estrual. El CL degenera si la vaca no resulta gestante, convirtiéndose en cuerpo albicans y permaneciendo visible en el ovario durante varios ciclos subsecuentes. Al mismo tiempo, la FSH estimula el desarrollo del folículo que ovulará en el siguiente ciclo (Hafez, 2002; Asprón, 2004). 2.2 DESARROLLO FOLICULAR El ovario bovino contiene un gran número de folículos primordiales al nacimiento, pero menos del 1% de éstos ovulan durante la vida reproductiva de la vaca (Eppig, 2003). La mayoría de los folículos que entran en el depósito de crecimiento están destinados a la atresia, aunque no se conoce el mecanismo por el cual ciertos folículos son elegidos para dejar la reserva de folículos primordiales y convertirse en folículos primarios continuando su desarrollo, obteniendose al final del ciclo sólo un folículo para ovular. Sin embargo, si se utilizan tratamientos para OM con gonadotropinas, éstas estimulan a más de un folículo a crecer a talla ovulatoria y ovular. La OM consiste en administrar durante el crecimiento folicular hormonas que provoquen el desarrollo de más folículos, no solamente de uno como normalmente sucede (Calva et al., 2001). Se necesitan alrededor de 60 días para que un folículo primordial llegue a preovulatorio o de Graaf, y alrededor de 47 días para que llegue de la etapa antral temprana (0.1 mm) a preovulatoria (13-16 mm) (Lussier et al., 1987). De esta manera, un folículo dominante se observa en cada fase. Durante el crecimiento del folículo dominante y cese del crecimiento de los otros folículos, aparece una onda folicular de emergencia después de que el folículo dominante cesó su crecimiento u ovuló (Hiroyuki et al., 1995).

13 9 En la fase ovulatoria o fase de atresia, el folículo dominante alcanza dimensiones preovulatorias o sucumbe a la degeneración, respectivamente. Al mismo tiempo, a lo largo del ciclo estrual se producen tres picos de estrógenos (E2), tanto en la circulación periférica como en las venas ováricas, que son coincidentes con los períodos de dominancia folicular (Perry, 2004). El reclutamieno cíclico tiene incio después de la pubertad y resulta del incremento de los niveles de FSH en la circulación sanguínea. No se conoce el mecanismo por el cual antes de la pubertad, un folículo primordial deja de formar parte de la reserva e inicia su crecimiento, aunque se han señalado algunos factores de crecimiento, ciertas neurotropinas y a la hormona inhibidora de los conductos de Muller involucrados en el proceso (Espinosa et al., 2007). 2.3 FOLICULOGÉNESIS Fase preantral y antral La primera fase de la foliculogénesis se conoce como preantral o fase independiente de gonadotropinas, y es caracterizada por el crecimiento y diferenciación del ovocito. La segunda fase, llamada fase antral o fase dependiente de gonadotropinas, se caracteriza por un gran aumento en la talla del folículo, aproximadamente arriba de 25 mm (Erickson, 2003). En la fase preantral, los factores de crecimiento producidos por el ovocito juegan un papel crucial en la regulación de la foliculogénesis (Erickson y Shimasaki, 2000). La fase preantral es controlada por factores de crecimiento producidos localmente, que actuan a través de mecanismos paracrinos y autocrinos. La segunda fase es regulada por la FSH y LH, así como otros factores de crecimiento que pueden estimular la proliferación celular y modular la acción de las gonadotropinas. En este mecanismo, la interacción de hormonas gonadotrópicas, factores de crecimiento y hormonas esteroides que intervienen tanto en la fase preantral como

14 10 en la folicular regulan negativa o positivamente la foliculogenésis, ovulación y luteogénesis (Erickson, 2003). La fase preantral se divide en tres estadíos: folículo primordial, primario y secundario (Erickson, 2003). Después de que ocurre la formación del antro, la tasa de crecimiento folicular se acelera y un folículo dominante es seleccionado de un grupo de folículos de la fase luteal del ciclo. La atresia puede ocurrir en el folículo secundario, pero la mayor incidencia es en el grupo de pequeños y medianos folículos (Henao et al., 2000). El proceso de la foliculogénesis ocurre en la corteza del ovario. Estos eventos inician en el folículo primordial (Hafez, 2002) Folículo primordial Todos los folículos primordiales se forman en el feto; como resultado, todos los ovocitos que una hembra tendrá en su vida reproductiva están presentes en el ovario al nacimiento. Este número de óvulos o folículos primordiales constituye la reserva ovárica (Hafez, 2002). El reclutamiento de folículos primordiales ocurre a una tasa relativamente constante en la vida productiva del animal. Las concentraciones plasmáticas de FSH actúan para acelerar la transición de primario a secundario. Un cambio en la forma de células escamosas a cuboidales y la adquisición del potencial mitótico en las células de la granulosa es seguido de la activación de ciertos genes y el subsecuente crecimiento del ovocito. Además, los mecanismos primarios que controlan el reclutamiento envuelven a las células de la granulosa y el ovocito, que es un tejido de respuesta de la activación primaria (Hafez, 2002). En esta etapa, a los activadores del reclutamiento folicular se les conoce como Kit de Ligandos de la Granulosa (Granulosa-Derived Kit Ligand; KitL) (Parrott y Skinner, 1999), formado por la proteína morfogenética derivada de la teca (Derived Bone Morphogenetic Protein) (Findlay et al., 2002), y altos niveles plasmáticos de FSH hipofisiaria (Fortune et al., 2000). En el KitL también se

15 11 encuentra la substancia mulleriana de inhibición (Müllerian Inhibiting Substance, MIS) que inhibe el reclutamiento folicular (Durlinger et al., 2002). En roedores, el KitL puede promover el crecimiento folicular (Packer et al., 1994), indicando que pudiera ser una parte del mecanismo de activación primaria del folículo, y el momento de su secreción estimula el crecimiento del ovocito; además, si esta proteína se encuentra ausente, no se desarrolla el folículo de Graaf y la hembra es infértil (Durlinger et al., 2002). Se ha observado que bajas concentraciones de FSH decrecen la tasa del KitL. Esto sugiere que una correcta concentración de FSH es crucial para la regulación de los factores paracrinos que promueven el desarrollo del ovocito, y que el KitL es hormonalmente regulado por FSH, y sin la presencia de FSH éste no se observa (Thomas y Vanderhyden, 2006). Se ha sugerido que el desarrollo del ovocito se daña cuando se inhibe la señalización de FSH, y que la comunicación entre el ovocito y las células de la granulosa se ve influida cuantitativamente por los FSHR (Thomas y Vanderhyden, 2006). Se ha demostrado que la FSH es capaz de regular las células de la granulosa para que se conecten con el ovocito (Combelles et al., 2004) Folículo primario El folículo primario presenta células cuboidales en la granulosa, las cuales son organizadas en una sola capa rodeando al ovocito. En el folículo primario ocurren eventos como la expresión de los receptores de FSH en las células de la granulosa, lo cual sucede por acción de la activina producida por las células de la granulosa, a través de mecanismos autocrinos y paracrinos. Otro evento es el crecimiento y diferenciación del ovocito (Erickson, 2003). Se ha observado en animales con altos niveles de FSH plasmática, que a pesar de no encontrarse en una fase dependiente de gonadotropinas, ésta sí puede acelerar el desarrollo del folículo primario, lo que sugiere la posibilidad de que la FSH pudiera afectar eventos en el folículo primario (Fortune et al., 2000).

16 12 El mecanismo de acción de la activina es controlado por la folistatina (FSRP, follistatin-related protein), una proteína que une a esta última y a la inhibina con una elevada afinidad (Knigth y Glister, 2001). Se ha sugerido que la activina puede jugar un papel importante como regulador local en el folículo ovárico, porque ambos (folículo y ovario) producen y responden a ésta (Erickson, 2003). La inducción del FSHR en las células de la granulosa es una etapa crítica en la fisiología reproductiva, ya que el desarrollo de grandes folículos es estimulado y depende de la FSH. La influencia estimulatoria de la activina sobre los FSHR es un mecanismo por el cual el folículo preantral llega a tener respuesta a la FSH (Woodruff et al., 1988), lo que aunado a la interacción de la señalización en cascada de péptidos y hormonas esteroides en el ovario, producen el crecimiento folicular, ovulación y luteinización (Richards et al., 2002). Posteriormente, la FSH estimula la expresión de receptores para LH y éstos a su vez la de receptores para P4, al tiempo que estimulan la producción de folistatina (proteína unidora de activina), la cual suprime el nivel de activina en las células de la granulosa, y por tanto su efecto sobre la expresión de los FSHR (Kishi et al., 1998). Los mecanismos locales de retroalimentación terminan la acción de la activina después de un corto período. Esta reducción de la actividad de la activina inducida por la FSH puede ser importante para el crecimiento normal de cada folículo (Tano et al., 1995). Conforme las células de la granulosa continúan su proliferación y el folículo va completando la formación de su antro, las concentraciones crecientes de estrógenos incrementan la síntesis de inhibina y folistatina, disminuyendo las concentraciones efectivas en el folículo, lo cual permitirá la expresión de los LHR en células de la granulosa y la teca; el incremento en la secreción de inhibinas permitirá la síntesis de novo de andrógenos, principalmente androsteniona, y la expresión de LHR en las células de la teca, además de disparar la progresión

17 13 meiótica en el ovocito detenido en diploteno I y de regular la síntes hipofisiaria de FSH a través de mecanismos de retroalimentación negativa (Findlay et al., 2002). Las inhibinas y activinas son producidas por las células de la granulosa del folículo dominante; están formadas por la unión de las subunidades α y β. La unión de la subunidad α con la subunidad βa, forma la inhibina A. La unión de la subunidad α con la βb, forma la inhibina B. En cambio la unión de dos subunidades αa o dos subunidades βb dan lugar a la hormona activina (activina A ó B de acuerdo a que subunidades la conforman). Tanto las inhibinas como las activinas actúan en forma parácrina, inhibiendo o estimulando el crecimiento de los folículos, respectivamente (Glister et al., 2001) La inhibina es una hormona glicoproteíca secretada por las células de la granulosa que actúa como inhibidor de la producción de FSH (Montaño y Ruiz, 2005). Ambos, inhibina y activina durante el proestro provocan mediante un sistema de retroalimentación negativa clásico entre el folículo y la hipófisis, disminución en los niveles periféricos de FSH, lo que bloquea el reclutamiento de nuevos folículos (Hafez, 2002). Las activinas también participan en la expresión de aromatasa en las células de la granulosa, inhibiendo a la vez la expresión de los LHR en las células de la granulosa y de la teca (Gigli et al., 2006). La inhibina y los estrógenos producidos por el folículo dominante son responsables del estímulo atrésico en los folículos subordinados, promueven la expresión de LHR en las células de la granulosa del folículo dominante y ejercen un estímulo inhibitorio sobre la liberación de FSH de la adenohipófisis, haciendo que el crecimiento del folículo dominante sea dependiente de LH hasta alcanzar el tamaño preovulatorio (Fortune et al., 2000). En este proceso se involucran también los factores de crecimiento semejantes a insulina (IGFI)-I y II, los que actúan como reguladores hipofisiarios del crecimiento folicular potencializando la acción de las gonadotropinas en el ovario por

18 14 mecanismos que no son del todo entendidos (Knight y Glister, 2006). La unión funcional de las vías de señalización entre FSH e IGF-1 se basan en la observación de que IGF-1, el receptor de IGF-1 (Igf-1r), y FSHR se localizan en las células de la granulosa de los folículos pequeños y preovulatorios (Velásquez y Mendieta, 2005). Las interacciones potenciales que ocurren en la transición de folículo primario a secundario involucran el KitL y factores básicos de crecimiento de los fibroblastos (bfgf) secretados por las células pregranulosas y ovocito, respectivamente, y tienen efectos estimulantes mutuos sobre el ovocito y las células de la granulosa. También promueven el reclutamiento de las células de la teca de la población de células intersticiales estromales. Las células intersticiales estromales y las células de la teca secretan BMP-4 y BMP-7, que promueven la activación y supervivencia folicular. El GDF-9 y/o BMP-15 secretados por el ovocito del folículo activado, promueven la proliferación de las células de la granulosa, la expresión del kitl y la formación de la teca. Al mismo tiempo, las células de la granulosa del fóliculo secretan AMH que al parecer actua como un freno en el reclutamiento de folículos primordiales (Knight y Glister, 2006). Un evento importante en el desarrollo del folículo primario es el desarrollo de uniones en hendidura (Gap junctions) entre el ovocito y las células de la granulosa (Eppig, 1994), que permiten el intercambio de información y moléculas. Los canales intercelulares, también llamados canales de las uniones en hendidura (CUH), son permeables a iones y moléculas pequeñas (menores de 1, 2 kda) y comunican el citoplasma de células adyacentes, permitiendo la coordinación de respuestas (metabólicas y eléctricas) de un conjunto de células frente a un determinado estímulo, tanto fisiológico como fisiopatológico (Eppig, 2003). Cada CUH lo constituyen dos hemicanales o conexones, cada uno es aportado por una de las dos células en contacto; a su vez, cada hemicanal está compuesto por seis subunidades proteicas denominadas conexinas (Cxs). Las Cxs son

19 15 codificadas por una familia de genes compuesta por al menos 20 genes diferentes en el humano y se denominan con el prefijo Cx seguido de un número que indica el peso molecular teórico aproximado (Brañez et al., 2004). Éstas se acoplan a células adyacentes permitiendo la difusión de iones, metabolitos y señales potenciales de moléculas tales como AMP cíclico y calcio (Saez et al., 2003). Después del reclutamiento folicular, la conexina 37 (Cx37) es sintetizada por el ovocito y forma uniones de comunicación alrededor de las células de la granulosa. Su interrelación en esta etapa es importante para la foliculogénesis y la fertilidad femenina en animales de laboratorio. Se cree que las células de la granulosa se conectan al ovocito vía conexina 37, y que mediante sus uniones de comunicación los materiales pasan de las células nodrizas de la granulosa hacia dentro del ovocito (Eppig, 1994). Estas células derivan materiales que son moléculas reguladoras y nutrientes, y que son requeridos para el crecimiento del ovocito y para la adquisición del potencial de reiniciar la meiosis (Webb et al., 2002). Los ovocitos con crecimiento completo rara vez reinician la meiosis durante la foliculogénesis (Thomas y Vanderhyden, 2006). Esto ha conducido al concepto de que existe un mecanismo de inhibición meiotica. Se sugiere que las altas concentraciones de AMP cíclico inhiben la maduración meiótica. La hipótesis es que al inducir FSH el AMPc en las células de la granulosa, éste se difunde dentro del ovocito a través de la Cx37, y su unión provoca la inhibición de la continuación de la meiosis (Webb et al., 2002) Folículo secundario La foliculogénesis continúa en el folículo preantral y la estructura del folículo comienza a cambiar. El mayor cambio ocurre durante la transición e incluye un acúmulo de un número aumentado de células de la granulosa y la adquisición de la teca. El desarrollo de un folículo primario a uno secundario de crecimiento completo resulta en la activación de mecanismos endocrinos y paracrinos que

20 16 regulan el proceso y que envuelven factores de crecimiento producidos por el ovocito (Espinoza et al., 2007). La transición de folículo primario a secundario inicia con la adquisición de una segunda capa de células de la granulosa (Pineda y Dooley, 2003). El estado primario y secundario es una etapa crítica regulatoria en el proceso de la foliculogenésis; el crecimiento y desarrollo folicular en el estadío primario en ratas y ovejas en ausencia de GDF-9 and BMP-15 se detiene (Chang, 2002). Estos factores derivados del ovocito son obligatorios para la transición de folículo primario a secundario y presumiblemente tienen la habilidad de estimular la mitósis y su patrón de arreglo (Espinoza et al., 2007). El desarrollo de un folículo secundario se encuentra también caracterizado por el desarrollo tecal (Erickson et al., 1985). En el momento de la transición de folículo primario a secundario, numerosas capas de células aparecen alrededor de la lámina basal (Gigli et al., 2006). En el desarrollo del folículo dos capas primarias de teca aparecen, teca interna que se diferencia en células de la teca intersticial, y teca externa que se diferencia en células de músculo liso. El desarrollo de la teca está acompañado por la formación de numerosos vasos presumiblemente a través de una angiogénesis por la acción de los factores de crecimiento angiogénicos que estimulan la vascularización (Antezak y Van Vlerkom 2000). Consecuentemente, la sangre circula alrededor del folículo trayendo nutrientes y gonadotropinas y sacando productos y desechos del folículo en desarrollo. Cuando se completa la fase antral de la foliculogénesis, un folículo secundario de desarrollo completo contiene cinco distintas unidades estructurales: un ovocito de desarrollo completo rodeado de la zona pelúcida, aproximadamente nueve capas de células de la granulosa, una lámina basal, teca interna, teca externa y una red de capilares en el tejido tecal (Erickson, 2003).

21 17 Cuando la teca se diferencía y se forma el antro, se da la expresión de una serie de genes que permite a las células intersticiales de la teca tener la capacidad de producir androstendiona. Esto pudiera indicar que la teca de todos los folículos de Graaf expresan este estado diferenciado (McNatty et al., 1979). En esta etapa, el folículo posee una cavidad o antro conteniendo fluido folicular, el cual es un exudado de plasma y está condicionado por los productos secretorios de las células de la granulosa. En este medio residen las células de la granulosa y el ovocito y las moléculas regulatorias entran y salen al microambiente (Brañez et al., 2004). El crecimiento del folículo se produce como respuesta a la acción de la FSH, la cual induce mitosis en las células de la granulosa, durante la cual se da una alta proliferación de células, característica del desarrollo del folículo dominante. Durante la fase folicular del ciclo, el número de células de la granulosa aumenta de 1 a 50 x 10 6 células en el estado preovulatorio. Cada folículo dominante tiene como destino completar la transición de pequeño (1-6 mm), mediano (7-11 mm), grande (12-17 mm), al estadío preovulatorio (18-23 mm). Un folículo atrésico falla de pasar del estado pequeño al mediano (1-10 mm) (Erickson, 2003). La teca interna contiene grandes células intersticiales típicas de células activas productoras de esteroides, en las cuales el citoplasma se llena de gotitas de lípidos. Las células de la teca intersticial poseen receptores para LH e insulina. En respuesta a su estimulación se producen altos niveles de andrógenos, mayormente androstendiona (Erickson, 1993). La teca interna está altamente vascularizada por una red capilar que rodea el foliculo de Graaf durante su crecimiento (Clark et al., 2004) Folículo de Graaf En el folículo de Graaf, las células de la granulosa y ovocito están distribuidos en una masa de células de forma y posición precisa, la cual da cuatro subtipos de células de la granulosa: la membrana, el área periantral, el cumulus oophorus y la

22 18 corona radiada. Todas las células de la granulosa expresan receptores de FSH durante el desarrollo del folículo de Graaf, sin embargo, cada grupo de células de la granulosa está influenciada por su posición para un estado de diferenciación específica en respuesta a la estimulación de FSH. Por ejemplo, las células de la membrana de la granulosa expresan P450aromatasa y receptores de LH, mientras que el área periantral, cumulus y corona radiata, no (Erickson, 2003). Al final de la fase luteal, el folículo dominante es seleccionado de una cohorte de folículos clase 5 y la mitosis de la granulosa parece incrementarse. A medida que la fase folicular prosigue, el folículo dominante crece rápidamente, lo que no sucede con el crecimiento de otros folículos de Graaf de la cohorte, en los cuales el crecimiento procede más lentamente. El mecanismo de selección envuelve el pico secundario de FSH plasmática, por lo que los niveles de FSH permanecen elevados a través del primer pico de la fase folicular del ciclo. Se cree que el decremento de estradiol e inhibina activados por el CL son la causa del pico secundario de FSH en la selección del folículo dominante (Simoni et al., 1997). El pico secundario de FSH produce un progresivo aumento en los niveles del fluido folicular en el microambiente del folículo dominante, lo que provocaría la entrada de FSH en el fluido folicular para permitir una obligatoria inducción de la selección. Sin embargo, existe la interrogante de cuál es el mecanismo por el cual un folículo tiene la capacidad de concentrar altos niveles de FSH dentro de su microambiente (Erickson, 2000). En la selección del folículo dominante, la FSH juega un papel obligatorio que ningún otro ligando posee por sí mismo. El mecanismo primario por el cual la FSH controla la selección es por la estimulación del receptor y por las vías de transducción de la señal en las células de la granulosa. Aunque la LH no es esencial para la selección, tiene cierta importancia en la regulación de la formación del folículo dominante a través de su capacidad para estimular la expresión del sustrato de aromatasa androstendiona (Marsters et al., 2003).

23 19 La mitosis caracteristíca de esta etapa, es un periodo sostenido de alta proliferación de las células de la granulosa y es característico del desarrollo del folículo dominante. Sin embargo, existen numerosos factores de crecimiento que también lo estimulan (Tamura et al., 1995). A medida que el folículo dominante crece, la granulosa adquiere el potencial de adquirir grandes aumentos de estradiol. La inducción de FSH produce la expresión en las células de la granulosa de P450aromatasa, quen causa la adquisición del potencial de estrógenos en el folículo. La P450aromatasa es detectada en el folículo dominante; su actividad incrementa progresivamente, alcanzando niveles muy altos en la célula de la granulosa del folículo preovulatorio en la fase folicular (Inkster y Brodie, 1991). El tipo I 17ß-hidroxiesteoride dihidrogenasa (17ß-HSD) es expresado en las células de la granulosa en folículos del estadío primario al preovulatorio (Zhang et al., 1996). Por la expresión de P450aromatasa y 17ß-HSD, las células de la granulosa se vuelven altamente activas para convertir androstediona a estradiol. El progresivo aumento en el nivel de la expresión del gen CYP19 y P450aromatasa hace posible la expresión de receptores a LH. Durante la fase folicular, las células de la granulosa también adquieren el potencial de incrementar el aumento de la progesterona. Existen numerosos procesos operativos envueltos en la adquisición del potencial de luteinización (Erickson, 1994). La contínua estimulación de las células de la granulosa por la FSH está involucrada en este proceso progresivo. Cuando ocurre la luteinización, las células de la granulosa expresan grandes aumentos de proteína reguladora aguda de esteroides (Steroid Acute Regulatory Protein, StAR). A pesar de que el aumento progresivo en el potencial de luteinización ocurre, éste parece suprimirse justo antes de la ovulación. La inhibición es causada por el ovocito e inhibidores de luteinización presentes en el fluido folicular (Erickson y Shimasaki, 2000). El tipo I

24 20 17ß-HSD, parece ser expresado en las células de la granulosa en folículos del estadío primario al preovulatorio (Zhang et al., 1996). La cascada de eventos del proceso folicular completo involucra mecanismos de las células de la granulosa en los cuales éstas sufren un proceso de diferenciación completo que incluye la adquisición de los receptores para FSH (FSHR) en el estado temprano de crecimiento folicular. El folículo dominante contiene altos niveles de RNAm para receptores de gonadotropinas, principalmente para el receptor de hormona luteinizante (LHR), así como receptores de estrógenos, y proteínas y enzimas involucradas en la síntesis de andrógenos y P4. El aumento del receptor LHR en las células de la granulosa del folículo dominante incrementa la actividad aromatasa en respuesta a las gonadotropinas, presentándose en ellos un aumento en la producción de algunos productos génicos que aparecen en los folículos secundarios como resultado de la estimulación de FSH, siendo del RNAm para la enzima P450 aromatasa, responsable de la biotransformación de andrógenos en estradiol, (Montaño y Ruiz, 2005), lo cual provoca un cambio de dependencia de FSH a LH). Esto aumenta o mantiene la capacidad del folículo dominante para producir más estradiol que los folículos subordinados (Fortune et al., 2000). El pico de LH permite que el folículo ovulatorio responda a su estímulo inductivo, debido a que la ovulación envuelve la expresión de receptores de LH en las células de la granulosa. La FSH juega un papel vital en la inducción del receptor de LH en las células de la granulosa. Al igual que los factores antes mencionados, la expresión de los receptores de LH permanencen suspendidos hasta la última etapa de la fase folicular. Hay evidencia en animales de laboratorio de que los inhibidores derivados del ovocito inhiben también la inducción de los receptores para LH por parte de la FSH (Simoni et al., 1997). El mecanismo fisiológico por el cual el folículo dominante produce estradiol se llama concepto de dos células-dos gonadotropinas. La llegada de la LH a la teca

25 21 intersticial permite la síntesis y secreción de androstendiona, y el aumento en la secreción de andrógenos refleja la presencia de moléculas regulatorias incluyendo insulina, IGF-I, lipoproteinas, activina e inhibina (Erickson, 1993). En esta etapa están presentes los factores de crecimiento que modulan la teca como la insulina, IGF-I, lipoproteina, activina, inhibina, GDF-9, y BMP-15 (Yamamoto et al., 2002), FGF (Factor de crecimiento de fibroblastos) e IGFBP (Factor de crecimiento similar a la insulina unido a proteínas) (Knight y Glister, 2006). Se ha observado, que el folículo dominante adquiere bajas concentraciones intrafoliculares de IGFBP-15 y aumento de estradiol lo que sugiere que IGFBP-15 hace que aumente el IGF-1 libre y modifique las respuestas a FSH lo que confiere una ventaja al folículo elegido (Yamamoto et al., 2002). En el ovario, el IGF-I estimula la proliferación de células de la granulosa, promueve la esteroidogénesis, la folículogénesis, la ovulación, la fertilización, la implantación y el desarrollo embrionario. El receptor tipo I está en estas células en folículos saludables o atrésicos, ya sea de estados primarios o preovulatorios (Spicer et al., 2002). El IGF-I influye en la función reproductiva promoviendo la síntesis de receptores de FSH y de LH seguido por la esteroidogénesis y la producción de inhibina en las células foliculares. En la vía esteroidogénica, el IGF-I estimula el sistema aromatasa, e incrementa la sensibilidad de las células foliculares a FSH y LH (Spicer et al., 2002). El IGF-I puede mediar el efecto estimulador de FSH sobre la proliferación de las células de la granulosa, produciendo un aumento gradual del crecimiento folicular hasta la formación del antro (Henao et al., 2000). 2.4 OVULACIÓN Para prepararse para la ovulación, los pequeños folículos deben madurar hasta el estado preovulatorio, tiempo durante el cual el ovocito, células de la granulosa y células de la teca adquieren características funcionales específicas. Así, después

26 22 de un prolongado periodo de descanso, el ovocito en estado preovulatorio reinicia la meiosis, las células de la granulosa adquieren la habilidad de producir estrógenos y responder a la LH vía los receptores de LH, y las células de la teca comienzan a sintetizar más andrógenos que sirven como sustrato para la enzima aromatasa en las células de la granulosa (Richards, 1994). Durante la secuencia ovulatoria, el núcleo del ovocito o la vesícula germinal tienen una serie de cambios que incluyen la ruptura de la vesícula geminal (GVBD), y por consecuencia, la progresión de la meiosis a la segunda metafase meiótica o etapa de primer cuerpo polar (Sato et al., 2001). La meiosis se detiene aquí y proseguirá hasta que el óvulo sea fertilizado debido a las altas concentraciones de AMPc dentro del ovocito, las cuales pueden inhibir la maduración meiótica. Así, el pico LH/FSH de alguna manera causaría que el nivel de AMPc fallara en el ovocito, debido en parte a la desensibilización y regulación hacia abajo (down regulation) de los receptores a LH y FSH en la granulosa. Durante la maduración meiótica, las células del cumulus sufren una mucificación resultado del dramático aumento en la secreción de mucopolisacáridos hacia el espacio extracelular, seguida de una expansión. El pico preovulatorio de FSH provoca la expansión del cumulus (Zhou et al., 2001). Las células que rodean al ovocito y las células de la matriz del cumulus están formadas por tres componentes principales: ácido hialurónico (HA) y al menos dos proteínas unidoras de HA, llamadas Factor de Necrosis Tumoral, (tumornecrosis factor-stimulated gene) y Gen supresor de tumor (TSG)-6 (tumor suppressor gene) (Yoshioka et al., 2000). La expansión del cumulus es inducida como consecuencia del pico de LH, y es dependiente de la inducción de genes específicos (Hess et al., 1999). Quizás el cambio más dramático durante la ovulación es la formación de la abertura en la superficie del ovario, la mácula pelúcida o estigma. Durante este proceso, el folículo produce proteasas que degradan el tejido ovárico. El pico de

27 23 LH está directamente involucrado en la formación del estigma, ya que induce genes específicos como el de ciclooxigenasa-2 (COX-2), la cual interviene en la síntesis de prostaglandinas (Sirois et al., 1992). La prostaglandina E2 (PGE2) se produce en respuesta al pico de LH; el folículo ovulatorio produce progesterona, PGE2 y receptores de PGE2; ambas son necesarias para el desarrollo del estigma en animales de laboratorio, ya que la hembra que carece de genes de receptores para progesterona o ciclooxigenasa no ovula y es infértil (Lydon et al., 1995). Una vez que se produce la ovulación disparada por el pico preovulatorio de LH, el cual a su vez se induce por la elevada concentración circulante de estrógenos producidos por el folículo preovulatorio, se inducen marcados cambios en el folículo que incluyen tanto el reinicio de los procesos de maduración del ovocito, como alteraciones funcionales en el complejo ovocito-células del cumulus, y modificaciones en la expresión génica de las células de la granulosa que la llevarán hacia otros cambios que provocarán la ruptura de la pared folicular (Hess et al., 1999). De esta manera es posible explicar el mecanismo en cascada de la ovulación: el pico de LH de la mitad del ciclo estimula la expresión del receptor de progesterona (PR) y la producción de progesterona, los ligandos de progesterona interactúan con PR en las células del folículo, las cuales a su vez inducen el gen que codifica para COX-2 que actúa sobre el gen prostaglandin sintasa-2, el cual codifica la biosíntesis de prostaglandinas y genes asociados con el complejo cumulo, las cuales interactuan con receptores específicos en las células de la superficie epitelial del estigma presuntivo y activan las vías de señalización que permiten la liberación de enzimas lisosomales (proteolíticas), las cuales degradan las capas internas del tejido y causan o provocan que la superficie epitelial se separe de la base de la membrana, lo que resulta en la formación del estigma del complejo ovocito-cumulus (Lydon et al., 1995).

28 24 Después del proceso de ovulación, se produce un aumento de FSH mientras la LH continúa alta debido a su lento metabolismo en el hígado. Primeramente se forma un coágulo de fibrina donde se localizaba el antro y el líquido folicular, en el cual se pierde tejido conectivo y hay invasión de células sanguíneas. Las células que forman el CL provienen de la membrana de la granulosa, la teca interna y externa y tejido sanguíneo; por su parte, las células de la granulosa logran un gran tamaño y se transforman en células luteínicas de la granulosa que contienen ésteres de colesterol en el citoplasma. Las células luteínicas de la granulosa tienen una alta capacidad de producir progesterona y estradiol (Chappell et al., 1997). En esta etapa, la LH es requerida para el mantenimiento de la esteroidogénesis por las células luteinizadas de la granulosa, las cuales tienen un potente efecto luteotrópico sobre la producción de progesterona (Carr et al., 1982). La alta afinidad de los receptores de LH de las células luteales permite que el CL se mantenga activo pese a las concentraciones bajas de esta hormona durante el diestro. De esta manera, si la implantación no ocurre, el CL degenera por el proceso de luteolísis. El útero es el órgano que determina la regresión del CL a través de la secreción de la hormona luteolítica prostaglandina F2α (PGF2α) (Hafez et al., 2002). Los estrógenos tienen un efecto importante, siendo necesario que la progesterona haya actuado previamente sobre las células endometriales. Los estrógenos tienen una retroalimentación positiva sobre ellos mismos al aumentar sus propios receptores en el endometrio; además, producen el aumento de los receptores para oxitocina. En rumiantes, el CL está formado por células de la granulosa y de la teca interna. Posee receptores para oxitocina y para estradiol, sugiriendo que los estrógenos tendrían una acción directa sobre la lisis del CL (Erickson, 2003). El primer signo de la muerte del CL es la reducción de las células luteinizadas de la granulosa; eventualmente la luteólisis destruye todas las células del CL y se

29 25 transforma histológicamente en cuerpo albicans que es un nódulo de tejido conectivo denso (Erickson, 2003). Para que el desarrollo de la foliculogénesis ocurra ininterrumpidamente hasta la ovulación, es necesario el éxito en la unión hormona-receptor. La presencia de alteraciones en la interacción FSH-FSHR, provocadas por cambios en la estructura del gen que regula a FSH, pueden afectar la habilidad reproductiva, especialmente en hembras y mujeres (Gromoll et al., 1996). La FSH y su receptor en el folículo constituyen la unidad estructural y funcional de los ovarios, permitiendo la maduración folicular (Gigli et al., 2006). La influencia de FSH en la fase independiente de gonadotropinas puede afectar el mecanismo de los factores autocrinos y paracrinos entre el ovocito y las células de la granulosa, los cuales permiten el crecimiento de folículos en los primeros estadíos de su desarrollo (Thomas y Vanderhyden, 2006). 3. PAPEL DE LA FSH EN LA OVULACIÓN MÚLTIPLE 3.1 SINCRONIZACIÓN DEL CELO Uno de los aspectos más importantes y que probablemente tiene mayor peso en los parámetros reproductivos en la ganadería tropical es la deficiente detección de celos. Porcentajes del 36% en la detección de calores reportados en México, contrastan con datos de explotaciones ubicadas en climas templados, cuyos porcentajes varían entre un 40 y un 65% (Favero et al., 1995). Entre las herramientas de manejo reproductivo que permiten eficientizar la inseminación artificial (IA) se encuentran la sincronización de celos y la sincronización de ovulaciones. Los métodos hormonales de sincronización se basan en el efecto luteolítico de la prostaglandina F2 alfa o el efecto lúteo de los progestágenos. La prostaglandina sólo funciona en animales ciclando y con CL, y son abortivas en animales gestantes. El empleo de progestágenos (progesterona