7. Captación de la imagen en microscopía confocal

Transcripción

1 7. Captación de la imagen en microscopía confocal

2 La mayor aplicación de la microscopía confocal es la captación mejorada de imágenes de muestras gruesas en una gran variedad de tipos de muestras. La ventaja del sistema confocal resulta de la capacidad de obtener imágenes de secciones ópticas individuales a elevada resolución en secuencia a través de la muestra. Hay varios modos de captación de imagen y todos se basan en la sección óptica como unidad básica

3

4 Secciones ópticas sencillas La sección óptica es la unidad de imagen básica en los métodos de microscopía confocal. Los datos se recogen de muestras fijadas y teñidas en uno o varios modos de iluminación (con diferentes longitudes de onda).

5 Secciones ópticas sencillas Las muestras con múltiple marcaje se recogen en múltiples imágenes cada una de un marcador.

6 Secciones ópticas sencillas

7 Secciones ópticas sencillas

8 Secciones ópticas sencillas La mayoría de los microscopios láser confocal tardan aproximadamente 1 segundo en adquirir una sección óptica sencilla aunque, a veces, se recogen varias y se promedian mediante software para mejorar la relación señal/ruido.

9 Lapsos de tiempo y células vivas Se pueden recoger secciones ópticas sencillas a diferentes intervalos de tiempo seleccionados. La obtención de buenas imágenes de células vivas requiere extremo cuidado durante todo el proceso de toma de imágenes en mantener condiciones tolerables en la platina del microscopio. Se deben cuidar los requisitos específicos de cada tipo de célula tales como temperatura ambiente, atmósfera, etc.

10 Lapsos de tiempo y células vivas Hay antioxidantes como el ácido ascórbico que se añaden al medio de cultivo para reducir el oxígeno que se puede liberar en la excitación de moléculas fluorescentes y que causaría la aparición de radicales libres que matan a las células. El daño por la luz del láser es acumulativo después de múltiples barridos por eso la exposición al haz debe mantenerse en el mínimo necesario para adquirir la imagen.

11 Lapsos de tiempo y células vivas Se debe utilizar la menor potencia de láser que permita obtener una imagen y recoger las imágenes tan rápido como sea posible.

12 Lapsos de tiempo y células vivas

13 Series-z e imágenes tridimensionales Una serie-z es una secuencia de secciones ópticas recogidas a diferentes niveles perpendiculares al eje óptico (el eje z) dentro de la muestra. Se recogen coordinando paso a paso cambios en el foco fino del microscopio con adquisición secuencial de imágenes a cada paso.

14 Series-z e imágenes tridimensionales A partir de una serie-z se pueden extraer varias imágenes de una región de interés y mezclarlas con un procesador de imágenes. Una vez recogida la serie-z es ideal para procesarla en una representación tridimensional de la muestra usando técnicas de visualización de volumen.

15 Series-z e imágenes tridimensionales

16 Series-z e imágenes tridimensionales

17 Imágenes en 4 dimensiones Las preparaciones vivas u otras muestras que exhiben fenómenos dinámicos presentan la posibilidad de utilizar el microscopio confocal para recoger secuencias en lapsos de tiempo de datos tridimensionales presentados con el tiempo como una cuarta dimensión.

18 Imágenes x-z Si se necesita una vista perfil de una muestra se puede obtener una sección x-z de dos formas: Barriendo una línea sencilla a través de la muestra (en el eje x) a diferentes profundidades de z cambiando el foco y mostrando la serie superpuesta en una imagen Cortando un plano en una reconstrucción tridimensional para extraer el perfil de una serie-z ya existente.

19 Imágenes x-z

20 Imágenes x-z

21 Imágenes luz reflejada, transmitida... Cualquiera de los modos de imagen comúnmente empleados en microscopía se puede utilizar en el microscopio confocal, incluyendo contraste de fases, contraste diferencial interferencial, campo oscuro o luz polarizada. Un detector de luz transmitida se utiliza para recoger la luz que pasa a través de la muestra y una fibra óptica transmite fotomultiplicadores. la señal a uno de los

22 Imágenes luz reflejada, transmitida... Una estrategia en algunos estudios es combinar la imagen de luz transmitida no confocal de la muestra con una o más imágenes fluorescentes de la misma muestra.

23 Imágenes luz reflejada, transmitida...

24 Imágenes luz reflejada, transmitida...

25 Series: Proyecciones Cada corte óptico, es decir, cada imagen individual, muestra la información de un solo plano de la muestra. Las estructuras que se extienden por toda la muestra se recogen de forma parcial en las diferentes imágenes.

26 Series: Proyecciones

27 Series: Proyecciones

28 Series: Proyecciones Para hacer visibles estas estructuras de forma global se precisan las proyecciones. Con los algoritmos de las proyecciones es posible seleccionar relevantes los fragmentos repartidos en de varias información imágenes individuales y hacerla visible en una sola imagen de dos dimensiones.

29 Series: Proyecciones

30 Series: Proyecciones Tipo de proyección: Proyección de valor máximo Proyección de valor medio Proyección transparente

31 Series: Proyecciones Proyección de valor máximo Se parte de la premisa de que los valores de intensidad máximos son información relevante para la reconstrucción de una estructura. Por ello, en esta proyección se busca el punto de exploración con el valor máximo de cada columna y se representa en la proyección bidimensional como representante de toda la columna.

32 Series: Proyecciones Proyección de valor máximo

33 Series: Proyecciones Proyección de valor medio Se considera que todos los valores de intensidad influyen en la proyección en igual medida. Por ello se calcula la media aritmética de todos los valores de intensidad de cada columna y se representa en la proyección bidimensional como representante de toda la columna.

34 Series: Proyecciones Proyección de valor medio

35 Series: Proyecciones Proyección transparente También influyen todos los valores de intensidad, pero se valoran de forma diferente. Los valores de las imágenes inferiores del lote tienen menor influencia que los de las imágenes superiores. Por ello, en esta proyección se calcula la media ponderada de todos los valores de intensidad de cada columna.

36 Series: Proyecciones Proyección transparente

37 Series: Proyecciones Máxima Media Transparente

38 Imágenes digitales Desde un punto de vista físico una imagen puede considerarse como un objeto plano cuya intensidad luminosa y color puede variar de un punto a otro. Si se trata de imágenes monocromas (blanco y negro), se pueden representar como una función continua f(x,y) donde (x,y) son sus coordenadas y el valor de f es proporcional a la intensidad luminosa (nivel de gris) en ese punto.

39 Imágenes digitales Para obtener una imagen que pueda ser tratada por el ordenador es preciso someter la función f(x,y) a un proceso de discretización tanto coordenadas como en la intensidad. A este proceso se le denomina digitalización. en las

40 Imágenes digitales La digitalización consiste en la descomposición de la imagen en una matriz de M x M puntos donde cada uno tiene un valor proporcional a su nivel de gris. Dado que este valor puede ser cualquiera dentro de un rango continuo, es preciso dividir dicho rango en una serie de intervalos, de forma que el nivel de gris de cada punto sea asignado a uno de los valores que representa dicho intervalo.

41 Imágenes digitales Los sistemas de proceso digital de imágenes suelen ser capaces de discriminar 256 niveles de gris. y f(x,y) x

42 Imágenes digitales Cada elemento en que se divide la imagen recibe el nombre de "pixel" (picture element). El número de niveles de gris y las dimensiones de la matriz (numero de filas por nº de columnas) condicionan la capacidad de resolución de la imagen digital.

43 Imágenes digitales 512 x x x x x x 16

44 Imágenes digitales Zoom: En la microscopía confocal la ampliación de una imagen se determina, por una parte, mediante el objetivo y, por otra, mediante el zoom electrónico. El objetivo genera una imagen intermedia cuya ampliación depende del factor de ampliación del objetivo. El zoom adicional. electrónico permite esa ampliación

45 Imágenes digitales Zoom: Con el factor de zoom 1 se explora el tamaño de barrido máximo con un determinado número de puntos. Si se ajusta el factor a 2, con el mismo número de puntos en el campo de barrido se explora la mitad de la longitud lateral del campo máximo de barrido (1/4 del campo de barrido original).

46 Imágenes digitales Zoom: Zoom = 1 Zoom = 2

47 Imágenes digitales Zoom: También se obtiene una gran ampliación y, de esta forma, también una mejor resolución de la imagen, ya que se explora un campo de menor tamaño con la misma frecuencia, lo que proporciona una mayor densidad de información.

48 Imágenes digitales Zoom: Es posible ajustar factores de zoom entre 1 y 32. No obstante, el zoom electrónico no permite una ampliación ilimitada. El límite se alcanza con la distancia óptica más pequeña aún resoluble determinada mediante el poder resolutivo del objetivo.

49 Imágenes digitales Zoom: Esta distancia óptica aún resoluble se visualiza, de acuerdo con el teorema de Nyquist, sin pérdida de información cuando se explora con 2 ó 3 puntos de trama.

50 Imágenes digitales Zoom: Si se sobrepasa la frecuencia de exploración debido a un factor de zoom relativamente alto y un formato de barrido determinado, no tiene sentido una ampliación mayor ya que no pueden apreciarse más detalles ópticos, ampliación vacía.

51 Imágenes digitales Zoom: Con el formato de barrido se selecciona también la trama utilizada para la captura de la imagen. Junto con la apertura numérica del objetivo y la longitud de onda de excitación, el formato de barrido determina, además del zoom electrónico, resolución espacial de los datos capturados. la

52 Imágenes digitales Teorema de Nyquist: Resolución lateral = 0,61λ / A.N. Si se utiliza una longitud de onda de 488 nm y un objetivo con una apertura numérica de 1,4 Resolución lateral = 0,61 x 488 / 1,4 = 212 nm La distancia entre los puntos de trama estará entre 212 / 2 = 106 nm y 212 / 3 = 71 nm

53 Imágenes digitales Teorema de Nyquist: 212 / 2 = 106 nm y 212 / 3 = 71 nm Si se selecciona un formato de barrido de 1024 x 1024 con un objetivo cuya máximo tamaño de campo de barrido es de 150 µm, la distancia de los puntos de trama será 150 / 1024 = 0,146 µm = 146 nm Este formato no recogería toda la información disponible.

54 Imágenes digitales µm 1024 La distancia de los puntos de trama será 150 / 1024 = 0,146 µm = 146 nm

55 Imágenes digitales Teorema de Nyquist: Habría que incrementar el formato, por ejemplo a 2048 x 2048 para alcanzar la distancia necesaria entre 106 y 71 nm 150 / 2048 = 0,073 µm = 73 nm

56 Imágenes digitales µm 2048 La distancia de los puntos de trama será 150 / 2048 = 0,073 µm = 73 nm

57 Imágenes digitales Teorema de Nyquist: O bien reducir el tamaño del campo de barrido con la ayuda del zoom electrónico, por ejemplo zoom=2 150 / 2 = / 1024 = 0,073 µm = 73 nm

58 Imágenes digitales 1024 Zoom = 2 75 µm 1024 La distancia de los puntos de trama será 75 / 1024 = 0,073 µm = 73 nm

59 Imágenes digitales Teorema de Nyquist: Si se utiliza un zoom mayor, por ejemplo 3, sólo se estaría aumentando en vacío porque no se estaría barriendo entre la distancia 106 y 71 nm 150 / 3 = / 1024 = 0,049 µm = 49 nm

60 Imágenes digitales Factores de zoom (marcados en rojo) con los que el preparado se explora sin pérdida de información

61 Imágenes digitales Formato: Existen una serie de formatos de imágenes que son legibles por la mayoría de los equipos de análisis de imagen y por los programas de manipulación de imágenes más conocidos.

62 Imágenes digitales Formato TIFF: Tagged Image File Format. Es probablemente el formato de imagen más universal. Soporta imágenes de 24-bits por pixel, pudiendo ser comprimidas o no. El formato comprimido utiliza algoritmos de compresión sin pérdida de información con relación al fichero original. GIF: Graphics Interchange Format. Es un formato comprimido muy utilizado para guardar iconos, gráficos e imágenes con pocos colores o en niveles de gris. Sólo soporta imágenes de 8-bits por píxel (256 colores). Se utiliza para intercambio por internet.

63 Imágenes digitales Formato PCX: Es un formato del sistema operativo DOS. Soporta imágenes de hasta 24-bits y no está comprimido. PSD: Photoshop Document. Son ficheros utilizados sólo por Adobe Photoshop pero conservan todas las capas y canales de la imagen para una edición posterior. EPS: Encapsulated PostScript. Ficheros leídos por impresoras Postscript.

64 Imágenes digitales Formato BMP: Bit Mapped. Son los mapas de bits estándares utilizados en el entorno de Microsoft Windows. Soporta imágenes de 24-bits sin comprimir por lo que su tamaño suele ser grande. PICT: Considerado el formato estándar de imágenes para Macintosh. Soporta 24-bits por píxel.

65 Imágenes digitales Formato JPEG: Joint Photographic Experts Group. Es el formato comprimido más popular, compatible con gran número de plataformas, muy usado para páginas web o . Los datos son comprimidos para eliminar información no detectable por el ojo humano. La eficiencia de la compresión es excelente pudiendo llegar a 1/20 ó 1/30 del original. La compresión es lossy, al descomprimirlos esa información se ha perdido. Soporta imágenes en color real de 24-bits por píxel.