PROTOCOLO PARA LA TOMA DE MUESTRAS Y ESTIMACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Gadiel Alarcón

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Lidia Venegas Casado
hace 6 años
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1 PROTOCOLO PARA LA TOMA DE MUESTRAS Y ESTIMACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Gadiel Alarcón 1.- Toma de muestra y almacenamiento Para la recolección de muestras de agua de mar, normalmente se utiliza una botella oceanográfica Niskin desde la profundidad seleccionada. Muchas veces se utiliza un balde plástico para tomar muestras superficiales, el cual debe estar libre de contaminantes (e.g. detergente) que pudiesen interferir en los análisis y resultados posteriores. Materiales necesarios: Bidones plásticos oscurecidos. No pintarlos, de preferencia forrar cada bidón con plástico negro. Guantes de látex libres de polvo Sistema de filtración, compuesto de: Bomba de aspiración Trampas de agua (2) Manifold Vasos de vidrio Soportes Rejillas Pinzas de soporte Pinzas para filtros Probeta de 100, 250 ó 500 ml, de acuerdo al volumen que se quiera filtrar. Filtros de fibra de vidrio de 0.7 μm de poro y 25 mm de diámetro (e.g. GF75). Papel de aluminio. Marcador indeleble. Nitrógeno líquido Pasos a seguir Si se va a filtrar inmediatamente, tener el sistema de filtración preparado y verificar el voltaje necesario para el sistema de filtración funcione adecuadamente. Usar guantes de látex libres de polvo, con el fin de evitar que aceites naturales de la piel contaminen la muestra. Utilizar bidones plásticos oscurecidos, para evitar el impacto de la luz solar. Verificar que los bidones estén limpios. Si no es así, lavarlos con agua destilada acidificada (~3%) y luego enjaguarlos abundantemente. Tomar la muestra desde la misma botella que se toma agua para otros análisis (e.g. nutrientes, fitoplancton). Enjuagar el recipiente al menos 3 veces con la muestra de agua. Dejar los bidones en oscuridad y en lugar fresco (de preferencia en frío) hasta que se filtre. Filtrar de preferencia en triplicado. No utilizar una presión de aspiración mayor a 10 cm de Hg. Poner cada filtro sobre el soporte, verificar que no queden espacios para evitar el escurrimiento de la muestra. Aforar el volumen a filtrar en forma adecuada en cada réplica, ya que el análisis es muy sensible a las variaciones de volumen entre muestras. Anotar el volumen filtrado.

2 Una vez que estén todos los vasos con agua de mar, poner en marcha la bomba de aspiración. No dejar los filtros secos por mucho tiempo, ya que puede arrastar los pigmentos al desecho. Enjuagar con agua de mar filtrada el interior del vaso de filtración, antes de sacar el filtro y cada vez que se cambie de nivel de muestreo. Con las pinzas, tomar un borde del filtro y doblar por la mitad. Disponer de un sobre de papel de aluminio abierto, poner allí todas las réplicas dobladas. Cerrar el sobre e identificar adecuadamente con un marcador. Poner inmediatamente en nitrógeno líquido, hasta su análisis en laboratorio Fraccionado En todas las fracciones el filtro que se guarda, corresponde al filtro de fibra de vidrio de 25 mm de diámetro y 0.7 μm de poro. Las fracciones requeridas serán: Total Se mide el volumen requerido de agua de mar y se filtra directamente sobre este filtro, tal como se indicó en el punto 1.1. Picoplancton Corresponde a la fracción entre 0.2 y 2 μm y que para efectos de este muestreo, se realiza entre 0.7 y 3 μm. Para ello se debe pre-filtrar utilizando un filtro de 3 μm y recolectar el agua de mar en un matraz erlenmeyer. Luego se mide el volumen requerido en una probeta y se filtra por 0.7 μm. Una vez echo esto se procede como se indicó anteriormente en el punto 1.1. Nanoplancton Corresponde a la fracción entre 2.0 y 20 μm y que para efectos de este muestreo, se realiza entre 0.7 μm y 20 μm. Para ello se debe pre-filtrar utilizando una maya Nytex de 20 μm y recolectar el agua de mar en un matraz erlenmeyer, o bien medir el volumen requerido en una probeta y filtrar directamente sobre el vaso de filtración. Una vez echo esto se procede como se indicó anteriormente en el punto 1.1. Recuerde SIEMPRE ENJUAGAR ENTRE MUESTRAS.

3 2.- Análisis de muestras Una vez que se han recolectado las muestras, se lleva a cabo la extracción de pigmentos y el análisis por fluorometría. Se deben realizar todos los procedimientos contemplados en esta etapa, en una pieza oscura y que tenga buena ventilación (o extractor de aire), ya que los pigmentos son fotosensibles y la acetona es muy volátil (explosiva), por lo que se debe evitar su acumulación. Materiales: Fluorómetro. Cubetas de 13 mm Acetona 90% Pañuelos de papel (u otro equivalente, que no deje residuos). Guantes de látex libres de polvo. Recipiente para desechos de acetona. Agua destilada para lavado de viales de vidrio. Dispensador para acetona. Viales de vidrio de 20 ml. Congelador a 20 ºC. Pinzas para filtros. Acido clorhídrico (HCl) al 10%. Gotario. Recomendaciones: Descongelar la muestra. Numerar los viales. Agregar 10 ml de acetona al 90% a cada vial. Poner cada filtro en un vial, previamente marcado. Anotar inmediatamente la muestra asociada a cada vial Después de que las muestras han sido sacadas del frío, se procede a poner cada filtro individualmente en un vial de vidrio que contiene los 10 ml de acetona al 90%, se pone la tapa del vial y se cierra rigurosamente para evitar derramar la acetona y cambiar la concentración final de pigmentos. Luego se agita suavemente con el fin de homogeneizar el contenido, se guarda ordenadamente (de acuerdo a la enumeración que se asigne) y se deja en un congelador a 20 ºC por 24 horas aproximadamente. En el fluorómetro: una vez que las muestras han sido dejadas extrayendo por aproximadamente hrs, se dejan en la misma sala del fluorómetro por otras 2-3 hrs, con el fin de que cada muestra tenga la misma temperatura (homogeneizar nuevamente). La Fluorescencia es dependiente de la Temperatura Finalizado este tiempo se procede a leer la fluorescencia. Para ello, se debe leer un blanco utilizando sólo acetona al 90%. Registrado este valor, se bota la acetona en un recipiente dispuesto para residuos. Ahora, se comienza con la lectura de cada muestra, para ello se debe:

4 Sebar la cubeta con ~1 ml de muestra y botar. Sebar la cubeta otra vez y botar. Llenar la cubeta hasta aproximadamente un 70% de su capacidad con muestra. Poner la cubeta en el fluorómetro, cuidando de no derramar dentro del compartimiento. Anotar la lectura de fluorescencia que aparece en la pantalla. Esta lectura puede derivar un poco, hasta centrarse en un valor promedio (que puede ser estimado por el analista). Sacar la cubeta y agregar 4-5 gotas de HCl al 10%. Agitar vigorosamente (utilizar de preferencia un vortex). En proceso previo debe pasar al menos 1 minuto para que los pigmentos sean completamente degradados. Poner la cubeta en el compartimiento del fluorómetro nuevamente y registrar la segunda lectura. Botar lo que queda de la muestra en el recipiente de residuos. Enjuagar 2 veces la cubeta con 1-2 ml de acetona al 90%. Se vuelve al comienzo. Utilizar guantes para evitar manchar la cubeta de lectura

5 3.- Estimación de concentraciones En esta etapa se obtendrá la concentración en mg m -3 (μg L -1 ) de clorofila-a y feopigmentos contenidos en las muestras recolectadas. Esto se puede hacer en cualquier tipo de planilla electrónica. La fórmulas generales están dadas por: mg Cl-a m -3 = DF * (Fla Fld)* (v / V) mg Feopigmentos m -3 = DF * ([Fld*DF ] Fla) * (v / V) donde, DF Fla Fld v V DF = constante obtenida de la calibración. = Fluorescencia obtenida en la primera lectura. = Fluorescencia obtenida después de acidificar (segunda lectura). = volumen de acetona utilizada para la extracción. = volumen de agua filtrada en litros. Por ejemplo, si se filtraron 150 ml, este valor debe ser anotado como 0,150. = constante obtenida de la calibración. Finalmente, no olvidar que a cada lectura se le debe restar el blanco para el cálculo de clorofila-a y fopigmentos.

6 Esquema de armado de sistema de filtración Trampa Agua Sistema Aspiración Matraz Kitasato Manifold de 3 posiciones Llave de paso Envase Vidrio Fig.1. Esquema de armado sistema filtración Gadiel Alarcón

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