UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR LIC. EN CIENCIAS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE BIOLOGÍA CELULAR PRÁCTICA SOBRE RESPIRACIÓN AEROBIA

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1 UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR LIC. EN CIENCIAS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE BIOLOGÍA CELULAR PRÁCTICA SOBRE RESPIRACIÓN AEROBIA LIC. GUSTAVO J. ROENES GALÉ Docente adscrito al Dpto. de Ciencias Naturales UPC. MSc. Rolando Hernández Lazo. Docente Asociado al Dpto de Ciencias Naturales UPC. Fecha de realización: Objetivo General: OBJETIVOS: Comprender el fundamento bioquímico de la respiración aerobia a través de procesos recreados en el laboratorio. Objetivos Específicos: Para el Estudiante: elabore por lo menos cinco objetivos específicos relativos al desarrollo de la práctica. Tenga en cuenta los parámetros sugeridos para la redacción, clasificación y contexto de los mismos

2 5. INTRODUCCIÓN Para el estudiante: Elabore la introducción de la práctica de laboratorio siguiendo los parámetros sugeridos. Recuerde que en la introducción se debe describir qué se va a hacer, cómo se va a hacer y por qué se va a hacer. FUNDAMENTO TEÓRICO Las células llevan a cabo diversos procesos para mantener su funcionamiento normal, muchos de los cuales requieren energía. La respiración celular es una serie de reacciones mediante las cuales la célula degrada moléculas orgánicas y produce energía. Todas las células vivas llevan a cabo respiración celular para obtener la energía necesaria para sus funciones. Usualmente se usa glucosa como materia prima, la cual se metaboliza a bióxido de carbono y agua, produciéndose energía que se almacena como ATP (trifosfato de adenosina). La molécula de ATP está formada por adenina, ribosa y tres grupos fosfatos con enlaces ricos en energía. Cuando la molécula se hidroliza, el fosfato terminal se separa para formar ADP (difosfato de adenosina) y se libera energía. El ATP es la fuente de energía que se usa como combustible para llevar a cabo el metabolismo celular.

3 La respiración celular se divide en pasos y sigue distintas rutas en presencia o ausencia de oxígeno. En presencia de oxígeno sucede respiración aeróbica y en ausencia de oxígeno sucede respiración anaeróbica. Ambos procesos comienzan con la glucólisis. 1. Glucólisis: La definiremos como el conjunto de reacciones que degradan la glucosa (C ) transformándola en 6 dos moléculas de ácido pirúvico (PYR) (C ). Estas reacciones se realizan en el citoplasma de la 3 célula. Es un proceso anaerobio, que no necesita oxígeno, y en el que por cada molécula de glucosa (GLU) se obtienen ATP y NADH+H +. Reactivos (puede aparecer con el nombre de sustrato): Glucosa + ATP + 4ADP + Pi + NAD + Productos: ácido pirúvico + ADP + 4 ATP + NADH + H + + H O Figura Nº 1: Esquema general de la glucólisis Características y significado biológico de la glucólisis: - Se realiza tanto en procariotas como en eucariotas. - En los eucariotas se realiza en el citoplasma. - Se trata de una degradación parcial de la glucosa.

4 - Es un proceso anaerobio que permite la obtención de energía a partir de los compuestos orgánicos en ausencia de oxígeno. - La cantidad de energía obtenida por mol de glucosa es escasa ( ATP). - La glucolisis fue, probablemente, uno de los primeros mecanismos para la obtención de energía a partir de sustancias orgánicas en la primitiva atmósfera sin oxígeno de la Tierra. Vías del catabolismo del ácido pirúvico: Para evitar que la glucolisis se detenga por un exceso de ácido pirúvico (PYR) y NADH+H + o por falta de NAD +, se necesitan otras vías que eliminen los productos obtenidos y recuperen los substratos imprescindibles. Esto va a poder realizarse de dos maneras: Respiración aerobia: Cuando hay oxígeno, el pirúvico es degradado completamente obteniéndose dióxido de carbono (CO ). El NADH+H + y otras coenzimas reductoras obtenidas son oxidadas y los electrones transportados hacia el oxígeno (O ), recuperándose el NAD + y obteniéndose H O. Este proceso se realiza en los eucariotas en las mitocondrias. Fermentación: Cuando no hay oxígeno el ácido pirúvico se transforma de diferentes maneras sin degradarse por completo a CO y H O. Este proceso tiene como objetivo la recuperación del NAD +. En los eucariotas se realiza en el citoplasma.

5 Figura Nº : Destino del producto obtenido en el proceso glucolítico I. Primera etapa: la activación del piruvato (o ácido pirúvico) En condiciones aeróbicas el ácido pirúvico (PYR) obtenido en la glucolisis y en otros procesos catabólicos atraviesa la membrana de la mitocondria y en la matriz mitocondrial va a sufrir un proceso químico que tiene dos procesos: Descarboxilación. El ácido pirúvico (PYR) va a perder el grupo CO correspondiente al primer carbono, el carbono que tiene la función ácido. Oxidación. Al perderse el primer carbono, el segundo pasa de tener un grupo cetona a tener un grupo aldehído. Este grupo se oxidará a grupo ácido (ácido acético) por acción del NAD +. En el proceso interviene una sustancia, la coenzima-a (HS-CoA) que se unirá al ácido acético para dar acetil-coenzima A (ACA). En consecuencia, se van a formar nuevas moléculas de NADH+H + por cada molécula de glucosa (GLU) y, al mismo tiempo, se originan las primeras moléculas de CO.

6 Figura Nº 3: Transformación del ácido pirúvico en acetilcoencima A II. Segunda etapa: el ciclo de Krebs Krebs (1938), denominó ciclo del ácido cítrico, y hoy se conoce también como ciclo de Krebs, a la ruta metabólica a través de la cual el ácido acético unido a la coenzima-a va a completar su oxidación en la matriz mitocondrial. Este ciclo, no sólo va a ser la última etapa de la degradación de los azucares, otros compuestos orgánicos (los ácidos grasos y determinados aminoácidos) van a ser también degradados a acetil- CoA (ACA) e integrados en el ciclo de Krebs. El ciclo de Krebs es, por lo tanto, la vía fundamental para la degradación de la mayoría de los compuestos orgánicos y para la obtención coenzimas reductoras. Es la vía más importante para el catabolismo de las sustancias orgánicas. Funcionamiento del ciclo de Krebs: El ciclo de Krebs, como todo proceso cíclico, no tiene más principio o fin que el que nosotros queramos ponerle. Es alimentado continuamente en substratos y continuamente genera productos. Las sustancias intermediarias se recuperan para ser de nuevo integradas en él. Como una rueda girando sin fin, sólo se detendrá si faltan los substratos o si, por exceso de productos, se inhiben las enzimas que participan en él. Balance energético del ciclo de Krebs Balance de un ciclo: Acetil-CoA + 3 NAD + + FAD CO + 3NADH + FADH + ATP Balance para una molécula de glucosa:

7 1 glucosa + 38 ADP + 38 P i 6 CO + 38 ATP de los NADH son formados en el citoplasma durante la glicólisis. Para ser transportados a la matriz mitocondrial para ser posteriormente oxidado por la cadena transportadora de electrones, tienen que pasar por medio de transporte activo al interior de la mitocondria, Esto "cuesta" 1 ATP per NADH. Por lo tanto el balance final resulta en 36 ATP por glucosa en cierto tipo de células, como por ejemplo las musculares, y no de 38 ATP. Figura 4: esquema general del ciclo de Krebs III. Tercera etapa: la cadena de transporte electrónico (C.T.E.) Consiste en un transporte de electrones desde las coenzimas reducidas, NADH+H + o FADH, hasta el oxígeno. Este transporte se realiza en la membrana de las crestas mitocondriales. Es en este proceso donde se obtendrá la mayor parte de la energía contenida en la glucosa y otros compuestos orgánicos, que será almacenada en forma de ATP. Al mismo tiempo se recuperarán las coenzimas transportadoras de electrones en su forma oxidada, lo que permitirá la oxidación de nuevas moléculas de glucosa y de otras sustancias orgánicas. Como producto de desecho se obtendrá agua.

8 Figura Nº 5: Mecanismo de la cadena respiratoria: oxidación de del NADH y síntesis de ATP. Los electrones serán cedidos finalmente al oxígeno que junto con dos protones del medio darán una molécula de H O: H + + 1/O + e - H O Uno de los objetivos principales de la respiración: fosforilación oxidativa La fosforilación oxidativa es la síntesis de ATP impulsada por la transferencia de electrones hacia el O. Éste es el proceso de transfusión de energía más importante, junto con la fotofosforilación, ya que son los procesos que sintetizan la mayor cantidad de ATP en los organismos aeróbicos. Se caracteriza por: 1. Los protones son transferidos a través de la membrana, desde la matriz al espacio intermembrana, como resultado del transporte de electrones que se originan cuando el NADH cede un hidrógeno. La continuada producción de esos protones crea un gradiente de protones.. La ATP sintetasa es un gran complejo proteico con canales para protones que permiten la re-entrada de los mismos. 3. La síntesis de ATP se produce como resultado de la corriente de protones fluyendo a través de la membrana: ADP + P i ATP DESARROLLO METODOLÓGICO 1. Producción de bióxido de carbono en el proceso respiratorio. En este ejercicio se demostrará la capacidad que tienen los sistemas vivos de producir bióxido de carbono (CO ) en las reacciones respiratorias que se dan en presencia de oxígeno. Para ello se deberá usar un indicador de ph como el Azul de Bromotimol, con el fin de detectar los cambios de ph que le ocurre al agua de cada tratamiento cuando se deposita el contenido de una exhalación en el medio líquido.

9 1.1. Materiales, insumos y reactivos por grupo de trabajo Vasos de precipitado de 500 ml Pitillos plásticos Cronómetro Solución acuosa de azul de Bromotimol Solución de NaOH 0,5 M Agua destilada 1.. Procedimiento 1. Rotule tres vasos de precipitado de 500 ml y agrégueles agua destilada a la mitad. Adicione unas cinco gotas de Azul de Bromotimol y agite hasta obtener una coloración homogénea de azul muy claro o preferiblemente verde, en cada uno de ellos. Si la coloración no es la indicada, basifique el medio adicionando dos gotas de solución de NaOH 0,5 M a cada vaso, hasta que obtenga la coloración deseada.. Tome la frecuencia respiratoria de uno de tus compañeros de grupo, estando en reposo, y anote el resultado en la tabla Nº 1. Haga que exhale el contenido de una respiración mediante un pitillo, en el vaso de precipitado Nº Pida al mismo compañero que camine fuera del laboratorio durante un minuto y vuelva a medir su frecuencia respiratoria. Anote los resultados en la tabla Nº 1 y haga que nuevamente exhale el contenido de su respiración en el vaso Nº. 4. Pida al mismo compañero, que ahora haga ejercicio intenso, esto es, correr o subir y bajar las escaleras de manera rápida por un tiempo de cinco minutos. Tome su frecuencia respiratoria y anote el resultado nuevamente en la tabla Nº 1. Haga que exhale el contenido de su respiración en el vaso Nº Compare sus observaciones y anote los resultados obtenidos de manera clara en la tabla número 1.

10 1.4. Análisis de resultados Para el estudiante: Realice una discusión de los resultados obtenidos a partir de la explicación de los hechos observados, teniendo en cuenta los elementos conceptuales del marco teórico de la guía o haciendo uso de bibliografía especializada.

11 . Respiración celular v/s fotosíntesis en plantas: En el siguiente ejercicio se comparará el proceso de respiración y la fotosíntesis que ocurre en plantas acuáticas que viven en agua dulce. El CO que producen estos organismos durante la respiración celular se convierte en un ácido (ácido carbónico), cuya concentración se medirá por medio de una titulación 1 usando un indicador de ph (fenolftaleína). Con este indicador se observará el punto de cambio en ph, donde se obtiene el equilibrio entre ph ácido y básico. Este cambio en ph sucede al añadirle una solución básica de NaOH a la muestra ácida, y se observa por un cambio en color; de esta forma se podrá calcular la producción de CO para los organismos experimentales. Se estudiará una planta acuática para determinar si lleva a cabo respiración celular en la oscuridad y en presencia de luz..1. Materiales, insumos y reactivos por grupo de trabajo Vasos de precipitado de 150 ml Vasos de precipitado de 100 ml Papel de aluminio Fenoftaleína Solución de NaOH 0.5 M (para diluir 1:100) Bureta para titular Pipetas graduadas de 5 y 10 ml Pipeteador para pipetas pequeñas Elodea fresca Lámpara reflectora.. Procedimiento 1. Determine el volumen que se añadió al producirse ácido carbónico en el agua para cada organismo a utilizarse (Elodea) y anote la información en la Tabla. Para determinar el volumen siga estos pasos: a. Añada el organismo a un vaso (beacker) pequeño con 50 ml de agua b. Haga una marca donde queda el menisco. c. Remueva el organismo. d. Con una pipeta llena añada agua hasta llegar a la marca. e. La diferencia de lectura en la pipeta indicará el volumen del organismo. f. Repita para el otro organismo.. Rotule 3 vasos (150 ml) del 1 al 3 y añádale a cada uno: 1) 100 ml de agua + 5 cm de Elodea fresca ) 100 ml de agua + 5 cm de Elodea fresca 3) 100 ml de agua 3. Tape la boca del vaso número 1 y 3 con papel de aluminio y el vaso se cubrirá por completo para mantener la Elodea en oscuridad. 4. Coloque el vaso 1 cerca de una bombilla. 5. Después de 30 minutos, remueva los organismos de los vasos de precipitado 6. Transfiera 5 ml de la solución del vaso 1 a un vaso pequeño. 7. Añada cuatro gotas de fenolftaleína y mezcle. 8. Llene la bureta de titulación con la solución de M de NaOH. 9. Mueva el vaso en círculos y añada gotas de la solución de NaOH hasta obtener un color rosado persistente. 10. Anote en la Tabla 8. la cantidad de NaOH que utilizó para la titulación. 11. Repita el proceso con los demás vasos. 1. Calcule la producción de CO para cada vaso mediante esta ecuación: 1 Titulación: El proceso por el cual una solución se le añade a otra solución de manera que reaccione bajo unas condiciones específicas para que el volumen añadido pueda ser medido con precisión. La titulación se asocia comúnmente con reacciones de ácido-base, pero se puede usar en otros tipos de reacciones.

12 13. Coloque los resultados en la Tabla. *Se obtiene al titular el agua del vaso 3 Tabla Nº.5. Análisis de resultados. Para el estudiante: Discuta los resultados obtenidos de la experiencia realizada teniendo en cuenta los elementos conceptuales que se pueden aplicar a la explicación de dichos resultados.

13 CUESTIONARIO 1. En la experiencia número dos, por qué no es igual la producción de CO en cada caso?. Por qué la planta lleva a cabo fotosíntesis y también respiración celular? 3. Compare los resultados de Elodea en la oscuridad y en la luz. Cuál tiene una mayor tasa de respiración celular? Por qué? BIBLIOGRAFÍA 1. Denniston, Topping and Caret (004). General, Organic, and 3. Biochemistry, 4ta Ed. Mc Graw Hill. New York. USA 4. Boyer, B (1999). Concepts in Biochemistry, Brooks/Cole Publishing Solomon, Berg & Martin (004). Biology, 7th Ed. Brooks Cole Publ Respiration.html OTRAS FUENTES BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS

14 PARÁMETROS DE EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO 1. Para el Estudiante: NOMBRE DE LOS ESTUDIANTES DEL GRUPO ITEM DE EVALUACIÓN Usa atuendo requerido para estar en el laboratorio Llega puntual al laboratorio Es proactivo y dedicado en su quehacer práctico Mantiene el orden y la disciplina en el laboratorio Intercambia opiniones con sus compañeros de manera respetuosa y cordial Usa atuendo requerido para estar en el laboratorio Llega puntual al laboratorio Es proactivo y dedicado en su quehacer práctico Mantiene el orden y la disciplina en el laboratorio Intercambia opiniones con sus compañeros de manera respetuosa y cordial Usa atuendo requerido para estar en el laboratorio Llega puntual al laboratorio Es proactivo y dedicado en su quehacer práctico Mantiene el orden y la disciplina en el laboratorio Intercambia opiniones con sus compañeros de manera respetuosa y cordial Usa atuendo requerido para estar en el laboratorio Llega puntual al laboratorio Es proactivo y dedicado en su quehacer práctico Mantiene el orden y la disciplina en el laboratorio Intercambia opiniones con sus compañeros de manera respetuosa y cordial Usa atuendo requerido para estar en el laboratorio Llega puntual al laboratorio Es proactivo y dedicado en su quehacer práctico Mantiene el orden y la disciplina en el laboratorio Intercambia opiniones con sus compañeros de manera respetuosa y cordial Usa atuendo requerido para estar en el laboratorio Llega puntual al laboratorio Es proactivo y dedicado en su quehacer práctico Mantiene el orden y la disciplina en el laboratorio Intercambia opiniones con sus compañeros de manera respetuosa y cordial VALOR

15 . Para el grupo: ITEM DE EVALUACIÓN Elaboran los objetivos de la práctica de manera correcta y contextualizada de acuerdo a los parámetros establecidos. Redactan la introducción de la guía con base en los principios establecidos en la metodología de la investigación. Describen sus resultados de manera clara mediante un discurso contextualizado y coherente a partir de hechos reales observados. Demuestran una actitud científica mediante los análisis construidos a partir de una hipótesis acertada y el uso de elementos conceptuales teóricos, con el fin de explicar los hechos observados. Elaboran su pre-informe y organizan sus materiales de trabajo, previamente antes de ingresar al laboratorio. VALOR