TOXICIDAD DE TRES CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis EN LARVAS DE

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1 TOXICIDAD DE TRES CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis EN LARVAS DE Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE) Juan Reyes Delgado-Gamboa 1, Rafael Pérez-Pacheco 1, Jaime Ruíz-Vega 1, Carlos Alejandro Granados-Echegoyén 1, Jorge Eugenio Ibarra-Rendón 2, Verónica González-Negrete 3. 1 Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Oaxaca. IPN. Calle Hornos Santa Cruz Xoxocotlán. C.P Oaxaca. México. jdelgadog0801@alumno.ipn.mx; rperezp@ipn.mx; jruizv@yahoo.com; cgranadose1100@alumno.ipn.mx. 2 Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Unidad Irapuato, 36500, Irapuato, Guanajuato, México. jibarra@ira.cinvestav.mx. 3 Universidad de Guanajuato, Campus Irapuato- Salamanca División de Ciencias de la Vida. Ex Hacienda El Copal km. 9 carretera Irapuato-León; C.P ; Irapuato, Guanajuato. v.gonzaleznegrete@ugto.mx. RESUMEN. Los mosquitos son vectores de agentes causales de enfermedades como paludismo y dengue. Una alternativa al uso de insecticidas químicos es el empleo de agentes biológicos, principalmente insecticidas microbianos. En el presente trabajo se evaluó la toxicidad de tres cepas de B. thuringiensis endémicas de Oaxaca, México, contra Aedes aegypti. Su efecto se cuantificó mediante bioensayos. Se realizó un diseño completamente al azar, utilizando como unidad experimental vasos plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20 larvas del cuarto instar temprano A. aegypti. Se utilizó el complejo espora-cristal, evaluando de 6 a 8 dosis., se realizaron 5 repeticiones con un testigo cada una. La mortalidad se determinó a las 24 h bajo condiciones de 70 de humedad relativa y temperatura media de 28±2 C. Se obtuvieron dos cepas altamente tóxicas a A. aegypti, cuyas CL 50 fueron y 13.2 ng/ml, respectivamente, similares a la Bti control (CL 50 de 9.43 ng/ml) usada como estándar. Palabras clave: Bacillus thuringiensis, toxicidad, bioensayo, resistencia, espora-cristal. ABSTRACT. Mosquitoes are vectors of causal agents of diseases such as malaria and dengue. An alternative to chemical insecticides is the use of biological agents, mainly microbial insecticides. In the present study was designed the toxicity of three native B. thuringiensis strains of Oaxaca, Mexico, against Aedes aegypti. The effect was quantified by bioassay. Performed a randomized design, using as an experimental unit with 100 ml plastic cups dechlorinated water and 20 early in fourth instar Aedes aegypti. Using the spore-crystal complex, six to eight doses were evaluated, five replicates were performed and each with one included one blank treatment. Mortality was determined after 24 hours under conditions of 70 relative humidity and mean temperature of 28±2 C. Two highly toxic strains against of Aedes aegypti, were obtained which presented an LC 50 of and ng/ml respectively, similar to the blank Bti (9.43 ng/ml). Keys words: Bacillus thuringiensis, toxicity, bioassay, isolates, spore-crystal. Introducción Los mosquitos constituyen un grupo de insectos de gran importancia desde el punto de vista médico epidemiológico, debido a que muchas de sus especies además de provocar molestias al hombre y a los animales, son vectores de agentes causales de enfermedades como paludismo (malaria) y dengue (Samanidou-Voyadjoglou et al., 2007). El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos en las áreas tropicales y subtropicales del mundo, donde vive una tercera parte de la población humana (Guzman y Kouri, 2002). El uso de insecticidas químicos de alta acción residual y toxicidad a amplio espectro de organismos han ocasionado serios problemas de contaminación y resistencia de los organismos plaga (Van Frankenhuyzen, 1993). Como una alternativa al uso de insecticidas químicos para el control de mosquitos es necesario el empleo de diversos agentes biológicos (Rodríguez et al., 2001) incluyendo principalmente insecticidas microbianos (Wirth et al., 2005). Bacillus thuringiensis Berliner es la bacteria entomopatógena más conocida, estudiada y utilizada como agente de control microbiano. Más del 90 del mercado de bioinsecticidas 212

2 incluye productos a base de esta bacteria (Glare y O Callaghan 2000). Los principales productos están basados en los serovares kurstaki, israelensis, aizawai, morrisoni, alesti, galleriae, darmstadiensis, dendrolimus y sotto (Glare y O Callaghan, 2000). Desde el descubrimiento e identificación de B. thuringiensis, el interés en esta bacteria ha sido cada vez mayor, en el intento de encontrar nuevas toxinas con actividad biológica diferente (Khyami-Horani et al., 2003). Se estima que actualmente existen más de 100,000 aislados distribuidos en colecciones de todo el mundo (Hammond, 2007). Hasta 1976 se conocía que B. thuringiensis sólo era tóxico contra larvas de lepidópteros, sin embargo, Goldberg y Margalit (1977), aislaron una cepa en el desierto del Negev (Israel). Este aislado representaba un nuevo serotipo (H-14) y se le denominó B. thuringiensis svar. israelensis (de Barjac, 1978). Bti muestra una elevada actividad insecticida sobre larvas de dípteros, en particular de mosquitos (Culicidae) y jejenes (Simuliidae); entre los mosquitos, es activo sobre los tres géneros más importantes: Aedes, Anopheles y Culex, en orden de susceptibilidad (Ibarra et al., 2003). Los productos-bt basados en esta subespecie han logrado un gran éxito y son el principal insecticida microbiano utilizado en el control de vectores de enfermedades, especialmente en países en desarrollo. Existen diversos formulados comerciales, los más utilizados son VectoBac, Bactimos y Teknac (Federici et al., 2005). Aunque el espectro insecticida de Bti abarca principalmente especies de dípteros, algunos insectos de otros órdenes, como lepidópteros y coleópteros, también han mostrado cierto grado de susceptibilidad. El éxito experimentado con la cepa Bti estimuló en todo el mundo el desarrollo de programas de búsqueda de nuevas bacterias y cepas de B. thuringiensis con propiedades mosquitocidas. Hasta la fecha, se han descubierto numerosos aislados activos, aunque su efectividad nunca ha superado la de Bti (Federici et al., 2005). El objetivo de este trabajo fue evaluar la toxicidad de tres cepas nativas de Oaxaca de B. thuringiensis contra Aedes aegypti (L.). Materiales y Método Aislamiento de cepas. Las cepas S4(17), S18(60) y S19(65) forman parte del aislamiento, selección y caracterización de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, en el que se procesaron 71 muestras de suelo, estiércoles y telarañas. Las muestras fueron tamizadas en malla #40. Posteriormente se incorporó 1 g de muestra en tubos de ensayo con 10 ml de agua destilada estéril. Los tubos fueron sometidos a pasteurización mediante baño María a 65 C durante 30 min y enfriados inmediatamente después en hielo. De la suspensión se extrajeron alícuotas de 10 µl, con el que serían plaqueadas cajas Petri con agar nutritivo. Estas se incubaron a 28 C durante 24 h, lo cual permitió el desarrollo de colonias aisladas, que fueron seleccionadas por la apariencia propia de B. thuringiensis: forma irregular y aplanada, márgenes recortados irregularmente, aspecto farinoso y opaco. Estas colonias se inocularon en pequeñas gotas de agar nutritivo (a manera de microcultivos), las cuales fueron incubadas a 28 C durante 48 h en bolsas de plástico (para evitar desecación), hasta obtener la esporulación de la cepa. Las telarañas se colocaron directamente en tubos Eppendorf, se les adicionó 1 ml de agua destilada estéril con sol. Tween 80 al Posteriormente se procedió de la misma manera que con las muestras de suelo. La identificación de las colonias cristalíferas se efectuó al miscroscopio óptico de contraste de fases (1000 X). Aquellas cepas que mostraron la formación de cristales (cuerpos parasporales típicos de B. thuringiensis) fueron resembradas y cultivadas bajo las mismas 213

3 condiciones durante 4-5 días, hasta obtener autolisis. Posteriormente, cada cepa completamente autolizada fue suspendida en 1000 µl de agua destilada estéril dentro de pequeños viales, donde se introdujeron tiras estériles de papel filtro para absorver la suspensión bacteriana y se sometieron a congelación y liofilización para después almacenarse a -20 C. Bioensayo Preparación del Complejo Espora-Cristal. Para la selección toxicológica de las cepas aisladas, se realizó una serie de bioensayos con larvas de A. aegypti, díptero de susceptibilidad conocida a B. thuringiensis svar. israelensis. Se obtuvieron polvos liofilizados del complejo espora-cristal, con la finalidad de contar con un peso seco constante para cada bioensayo de cada una de las cepas. Las cepas cristalíferas se sembraron en matraces de 500 ml con leche peptonizada y se incubaron a 28 C a 250 rpm (Revoluciones por minuto). Después de la autolisis (5 días), se suspendió el cultivo de los matraces en 10 ml de agua destilada estéril y se sometió a tres centrifugaciones sucesivas con la finalidad de eliminar las posibles exotoxinas excretadas, así como los desechos celulares. El precipitado obtenido se congeló y liofilizó. El polvo seco obtenido se utilizó para los bioensayos. Pruebas de Toxicidad. La metodología del bioensayo fue diseñada con la finalidad de determinar la concentración que provoca un 50 de mortalidad en la población (CL 50 ), y así determinar el grado de actividad del agente microbiano. Dichas pruebas toxicológicas se llevaron a cabo sobre larvas del cuarto instar temprano de A. aegypti, alimentadas con levadura en polvo, bajo condiciones de insectario (28± 2ºC, 70 ± 5 de humedad relativa y fotoperiodo de 16:8 h luz: oscuridad). El bioensayo se preparó utilizando vasos plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20 larvas. En un primer nivel de selección se probaron todas las cepas, poniendo una cantidad indeterminada del complejo espora-cristal. Sólo las cepas que provocaron una mortalidad de 100 se sometieron a una segunda etapa de selección, partiendo de una solución madre de 10 mg del complejo espora cristal por ml, donde se probaron niveles de concentración entre 5.04 y ng/ml. Se realizó un diseño completamente al azar, utilizando como unidad experimental vasos plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20 larvas del cuarto instar temprano. Se realizaron 5 repeticiones con un control positivo empleando Bti. Las cepas S4(17), S18(60) y S19(65) mostraron gran actividad insecticida, por lo que se les probó en diversos bioensayos de 6 y 8 niveles de concentración. El nivel de toxicidad fue comparado con la CL 50 obtenida para la cepa estándar de B. thuringiensis israelensis (de Barjac, 1978), producida y probada bajo las condiciones antes mencionadas. La mortalidad se determinó a las 24 h, considerando larva muerta a aquélla que al ser hundida en el agua, no regresa a la superficie con sus movimientos normales característicos o bien no presentan movimiento alguno. Posteriormente se realizó un análisis Próbit para determinar la concentración letal media (CL 50 ). Resultados y Discusión En el cuadro 1 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa control Bti, en el cual se observa que con una concentración de 30 y 21 ng/ml se registraron los más altos niveles de 214

4 mortalidad que fueron de 100 y 80 respectivamente, el cálculo de la CL 50 con un valor de ng/ml, así como la CL95 con un valor de ng/ml. Cuadro 1. Porcentaje de mortalidad, CL 50 y CL 95 del complejo espora-cristal de la cepa control Bti en larvas del cuarto instar de A. aegypti. Tratamiento Concentración Mortalidad CL50 CL En el cuadro 2 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S4(17), en el cual se observa que con una concentración de ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de 92.5, una CL 50 con un valor de ng/ml y una CL 95 de ng/ml. Cuadro 2. Porcentaje de mortalidad, CL 50 y CL 95 del complejo espora-cristal de la cepa S4(17) en larvas del cuarto instar de A. aegypti. Concentración Mortalidad Tratamiento En el cuadro 3 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S18(60), en el cual se observa que con una concentración de 30 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de 95.92, una CL 50 con un valor de ng/ml y una CL 95 de ng/ml. Cuadro 3. Porcentaje de mortalidad, CL 50 y CL 95 del complejo espora-cristal de la cepa S18(60) en larvas del cuarto instar de A. aegypti. Concentración Mortalidad Tratamiento CL50 CL50 (ng/m) CL CL95 (ng/m)

5 En el cuadro 4 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S19(65), en el cual se observa que con una concentración de 30 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de 97.5, una CL 50 con un valor de ng/ml y una CL 95 de ng/ml. Cuadro 4. Porcentaje de mortalidad, CL 50 y CL 95 del complejo espora-cristal de la cepa S19(65) en larvas del cuarto instar de A. aegypti. Tratamiento Concentración Mortalidad CL50 CL95 (ng/m) Se observa que las CL 50 de las cepas S18(60) y S19(65) con un valor de 13.2 y ng/ml respectivamente, son similares a la CL 50 de la cepa Bti (control) con un valor de 9.43 ng/ml. En las mismas cepas las CL 95 tuvieron el mismo comportamiento, por lo tanto estos resultados nos indican que las cepas S18(60) y S19(65) tienen alto potencial mosquitocida, siendo similar a la cepa Bti (control) usada como estándar y con mejor potencial a la cepa Bti analizada por Wirth et al., (2004), quienes reportan una CL 50 de 22.3 ng/ml para el complejo espora cristal. De igual manera Federici et al., (2003), reporta un rango de concentración letal 50 (CL 50 ) de ng/ml sobre larvas de cuarto estadio de muchas especies de mosquitos. Conclusiones Se obtuvieron dos cepas altamente tóxicas a A. aegypti, cuyas CL 50 fueron y 13.2 ng/ml respectivamente similares a la Bti control (CL 50 de 9.43 ng/ml) usada como estándar. Este trabajo abre una nueva vía para el control biológico de A. aegypti, el cual es un vector de importancia médica-veterinaria, para el cual se está implementando una estrategia de control que combina diversos métodos, entre los cuales se podría integrar la vía que explora esta investigación, ya que B. thuringiensis por su elevada actividad larvicida, especificidad e inocuidad sobre organismos no blanco, complejo de tóxinas, la hace una alternativa de gran potencial en el control de insectos vectores de enfermedades. El contar con cepas nativas permite conservar o alterar lo menos posible la biodiversidad existente, en lugar de usar especies exóticas aisladas de nichos ecológicos diferentes. Más aún, el uso de especies nativas es frecuentemente más eficaz que el correspondiente a especies exóticas, cuando los especímenes han sido aplicados en igualdad de circunstancias. Es importante continuar con la caracterización biológica de cepas nativas de B. thuringiensis para disponer de mayores alternativas de control biológico de insectos plaga y vectores de agentes causales de enfermedades. 216

6 Literatura citada De Barjac, H., nouvelle variété de Bacillus thuringiensis très toxique pour les moustiques: B. thuringiensis var. israelensis sérotype H-14. Comptes Rendus Académie Sciences 286, Federici, B.A., Insecticidal bacteria: an overwhelming success for invertebrate pathology. J. Invertebr. Pathol. 89, Glare, TR; O Callaghan, M Bacillus thuringiensis. Biology, ecology and safety. Reino Unido, Wiley and sons. 350 p. Goldberg, L. J., Margalit, J A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti, and Culex pipiens. Mosquito News 37: Guzman, G., Kouri, G., Dengue: an update. Lancet Infect. Dis. 2, Hammond, B Food safety of proteins in agricultural biotechnology. CRC Press, Boca Raton (EEUU). pp. 51. Ibarra, J.E., Del Rincón, M.C., Orduz, S., Noriega, D., Benintende, G., Monnerat, R., Regis, L., de Oliveira, C.M., Lanz, H., Rodríguez, M.H., Sánchez, J., Peña, G., Bravo, A., Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity against different mosquito species. Appl. Environ. Microbiol. 69, Khyami-Horani, H., Hajaij, M. y Charles, J. F Characterization of Bacillus thuringiensis ser. jordanica (serotype H71), a novel serovariety isolated in Jordan. Curr Microbiol 47(1): Rodríguez M. M., Bisset J., de Fernández DM., Lauzan L., Soca A. (2001).Detection of insecticide resistence I Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Cuba y Venezuela. Journal of Medical Entomology Samanidou-Voyadjoglou A., Roussis V., Petrakis P. V. (2007). Control biológico de poblaciones de mosquitos: aspectos aplicados de control de plagas mediante enemigos naturales. Van Frankenhuyzen K (1993) The challenge of Bacillus thuringiensis. In: Entwistle PF, Cory JS, Bailey MJ, Higgs SR (eds) Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice. Wiley, Chichester, pp Wirth M. C., Jiannino JA., Federici B. A., Walton W. E. (2005). Evolution of resistence toward Bacillus sphaericus or a mixture of B. sphaericus+cry 1A from Bacillus thurigensis, in the mosquito, Culex quinquiefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology