YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS Resultados preliminares

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1 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 1 YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS Resultados preliminares Viguès V. 1, Serrano E 1., Dumas C. 2, Coarer M. 3, Yobregat O. 4, Larignon P. 5 1 ITV France Midi-Pyrénées V Innopôle BP LISLE/TARN virginie.vigues@itvfrance.com 2 Ingeniero en prácticas ENITAB 3 ITV France Nantes 4 SICAREX Sud Ouest 5 ITV France Rhône-Méditerranée Trabajos efectuados en colaboración con Nelly Estrade y Flora Dias (ITV France Midi-Pyrénées) y con el Syndicat Midi-Pyrénées des Producteurs de Plants. INTRODUCCIÓN Las enfermedades de la madera, Yesca y Black Dead Arm (BDA, brazo muerto), dañan la estructura de la vid y provocan, en un plazo más o menos largo, la muerte de la cepa afectada. Desde la eliminación del arsenito de sodio, la exteriorización de los síntomas y la mortalidad de las cepas han ido aumentando de forma regular. El año 2004 fue especialmente determinante en cuanto a exteriorización de la enfermedad. Un sondeo llevada a cabo en Midi-Pyrénées (SERRANO, 2004 comunicación personal) mostró que las parcelas más afectadas tenían por lo general entre 10 y 15 años, pero se observó bastante claramente que las viñas jóvenes también se veían afectadas por la enfermedad: más del 10 % de las parcelas afectadas tenían menos de 10 años. La observación de síntomas incluso en viñas jóvenes, de 4 ó 5 años, planteó el interrogativo de una posible presencia de los hongos en el material vegetal que llega a los viveros o que sale de ellos. Un estudio reciente ha demostrado que si se considera únicamente el nivel de contaminación del material vegetal de base (portainjerto), sólo pocas plantas deberían estar infectadas por Phaeomoniella chlamydospora y Phaeoacremonium aleophilum hongos pioneros de la yesca (LARIGNON et al., 2005). Al mismo tiempo, en Sudáfrica, algunos trabajos mostraron la presencia de Phaeomoniella chlamydospora en todas las etapas de preparación de la planta, incluso en el baño de rehidratación (RETIEF et al., 2005). Estos resultados sugieren una posible contaminación durante las etapas de elaboración de la planta de vid. El programa llevado a cabo en 2005 tenía como objetivo evaluar la incidencia de los hongos asociados a las enfermedades de la madera en las plantas que salen de los viveros y, sobre todo, identificar las etapas del proceso de elaboración de las plantas en las que se pueden verificar contaminaciones, a fin de ofrecer soluciones adecuadas al problema.

2 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 2 METODOLOGÍA Muestreo En este estudio se utilizaron los dos tipos principales de planta de vid disponibles: plantas tradicionales y plantas en maceta. Ocho viveros, que representan más del 80% de las plantas vendidas en Midi-Pyrénées, colaboraron en este estudio proporcionando el material vegetal necesario. La investigación se llevó a cabo utilizando 900 plantas tradicionales y 1000 plantas en maceta. Con el fin de limitar el número de variables, se seleccionó una única variedad (Merlot) y un solo portainjerto (SO4). Aislamiento Las plantas tradicionales y en maceta se prepararon eliminando hojas, raíces, tierra y parafina. Se efectuaron muestreos en 7 puntos de la planta: Injerto (G) Soldadura (S) Portainjerto : 1 cm por debajo de la soldadura (PG1) Parte central del portainjerto (PG2) 5 mm por enzima de la herida de desyemado (Pe) Herida de desyemado (Pe) Parte basal (PG4) En cada punto, se eliminó la corteza y se cortó un trozo de madera con las tijeras de poda. Cada uno de estos trozos se dividió en trocitos de alrededor de 1 mm 3 y se tomaron 5 de ellos al azar. A continuación fueron colocados, bajo campana de flujo laminar, en un medio de cultivo agar malta después de la desinfección en un baño de hipoclorito de calcio (3g/100 ml). El medio de cultivo compuesto por agar (20g/L), extracto de malta (15g/L) y un antibiótico (cloramfenicol, a dosis de 250mg/L) fue esterilizado en autoclave a 121 C durante 20minutos. Una vez sembradas y claramente señalizadas, las placas de petri fueron incubadas a temperatura ambiente (20 C). Un mes más tarde, por lo menos, se efectuó la lectura. Se determinó visualmente la presencia de hongos en cada una de las placas de petri. Se consideró que los puntos de muestreo estaban contaminados por hongos, si estos se habían desarrollado por lo menos en uno de los 5 trocitos de madera. Identificación de las etapas de riesgo durante la elaboración de las plantas en los viveros Se definieron siete etapas de riesgo (tabla I) y se efectuaron muestreos del material vegetal en cada una de estas fases con el fin de proceder al aislamiento e identificación de los diferentes hongos (análisis microbiológicos). Se realizaron también muestreos de agua (aguas de lavado, de remojo ) para el análisis biomolecular.

3 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 3 Etapas Análisis microbiológicos Análisis biomoleculares Muestreo en los pies madre 200 injertos 200 portainjertos Desyemado-corte / Remojado 200 injertos 200 portainjertos / Agua del enjuague de las herramientas Agua de remojado Injertación-parafinado Estratificación en aserrín 200 injertos soldados Agua del enjuague de las herramientas 50 injertos soldados Aserrín de estratificación Rehidratación 60 injertos soldados Agua de rehidratación Venta de la planta 100 injertos soldados / Tabla I : Protocolo de muestreo a lo largo del proceso de fabricación de un injerto soldado Los análisis microbiológicos siguieron el procedimiento descrito precedentemente con la diferencia de que antes de la injertación (muestreo en las cepas madre y remojo), los aislamientos se realizaron en un único punto: a mitad de los injertos y portainjertos. Los 7 puntos descritos anteriormente se aplicaron en el análisis de los injertos soldados. Los análisis biomoleculares consistieron en la detección (o no) de Phaeomoniella chlamydospora (Pch) por PCR (Polymerase Chain Reaction). Se utilizaron los cebadores PCL1/PCL2 (GROENWALD et al., 2000) y PCH1/PCH2 (TEGLI et al., 2000) después de la optimización de las condiciones de extracción y de amplificación (COARER, 2004 comunicación personal). RESULTADOS del SONDEO En general, en el momento de la venta el 11% de las plantas tradicionales y el 7 % de las plantas en maceta eran portadoras de hongos asociados a la yesca. De la misma manera, el 15% de las plantas tradicionales y el 29% de las plantas en maceta eran portadoras de hongos asociados al BDA (Figura 1) % Figura 1 : Porcentaje de plantas contaminadas a la salida de los viveros (plantas tradicionales o en maceta) tradicionales REVISTA INTERNET DE VITICULTURA Y ENOLOGÍA, maceta 2008, Nº 2/1 % de plantas contaminadas por al menos un hongo asociado a la yesca % de plantas contaminadas por al menos un hongo asociado al BDA

4 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 4 Hongos asociados al BDA, Botryosphaeria sp Independientemente del itinerario de fabricación, las plantas eran portadoras de hongos asociados al BDA, es decir los Botryosphaeria. El porcentaje de plantas contaminadas era variable en función del lote estudiado. Varió entre un 6 y un 31 % para las plantas tradicionales y entre un 6,4 y un 70 % para las plantas en maceta (tabla n II). Hongos asociados a la yesca, Phaeomoniella chlamydospora (Pch) y Phaeoacremonium aleophilum (Pal) Entre los hongos asociados a la yesca, el Pch (uno de los hongos pioneros) fue el microorganismo aislado más frecuentemente en las plantas puestas a la venta (tabla n II). El porcentaje de plantas contaminadas por Pch a la salida del vivero fue variable en función del lote estudiado. Estuvo comprendido entre 0 y 28% para las plantas tradicionales y entre 0,7 y 11% para las plantas en maceta. Con respecto a Pal (otro hongo pionero de la yesca), fue aislado con menor frecuencia. Su porcentaje de aislamiento varió entre 1 y 3,5% para las plantas tradicionales y entre 0 y 6,4% para las plantas en maceta. Es importante señalar que los dos hongos pioneros de la yesca (Pal y Pch) rara vez se presentaron simultáneamente en la misma planta: entre 0 y 2% para las plantas tradicionales y entre 0 y 1% para las plantas en maceta. Sin embargo, los dos hongos deben actuar de común acuerdo para llevar a cabo el proceso de degradación de la madera característico de la yesca. Además, hasta ahora ningún estudio ha permitido determinar la relación entre el nivel de contaminación en el vivero y el nivel de exteriorización de las enfermedades de la madera en la parcela. Tradicional Maceta Lotes Pch solo Pal solo Pch y Pal Botryosphaeria simultáneamente sp 1 5% 3,5% 0,5% 6% 2 5% 2,5% 0,5% 13% 3 0% 1,5% 0% 17,5% 4 27,7% 2% 2% 21,8% 5 4% 1% 0% 31% 6 14% 3% 2% 11% 2 11,1% 1,5% 1% 8,6% 3 2,7% 3,7% 0% 19% 7 3,9% 5,9% 0% 6,4% 8 0,7% 0% 0% 70% Tabla II : Porcentaje de plantas contaminadas por los diferentes hongos asociados a las enfermedadesde la madera en función de los lotes Las diferencias observadas entre los lotes estudiados podrían ser debidas o al material vegetal original (a su llegada al vivero), o a los diferentes procesos de fabricación aplicados en los viveros, o bien a los dos. Cabe señalar que los dos lotes de plantas tradicionales que presentaban el mayor número de plantas contaminadas por Pch y el lote de plantas en maceta que presentó numerosas plantas infectadas por Botryosphaeria no habían sido sometidos a ninguna desinfección con criptonol a diferencia de todos los demás lotes.

5 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 5 Como ya había sido descrito en otros trabajos (LARIGNON et al., 2005), Fomitiporia mediterranea, microorganismo responsable de la degradación de la madera característica de la yesca y Eutypa lata, moho responsable de la eutipiosis no fueron aislados a la salida del vivero. Este resultado puede tener dos interpretaciones, o bien estos microorganismos no se encuentran presentes en la planta, o bien el método descrito anteriormente no permite aislarlos. FORMAS DE CONTAMINACIÓN De todas las plantas tradicionales estudiadas, tres cuartas partes presentaron infección en un único punto de muestreo y el 18% en dos puntos simultáneamente. Ninguna planta estuvo completamente contaminada (Figure 2). % sitio 2 sitios 3 sitios 4 sitios 5 sitios 6 sitios 7 sitios P. alta y baja de la planta Parte baja Parte alta Figura 2 : Repartición de las plantas contaminadas según el número puntos analizados en los que se aisló un hongo asociado a la enfermedad de la madera. En los casos en los que la planta presentó contaminación en un único punto de muestreo, alrededor del 70% de los casos, esto ocurrió en la parte superior de la planta (niveles S, G y PG1) y principalmente en la soldadura (43%). Cuando la contaminación se presentó en dos puntos simultáneamente, el 66% de los casos, se trató de puntos situados ambos en la parte alta de la planta (G y S : 24%, G y PG1 : 22%, S y PG1 : 20%). Cuando una planta presentó contaminación en 3 puntos de muestreo simultáneamente, el 87% de los casos, estos fueron G, S y PG1. La misma tendencia se observó con todos los hongos (Figura 3) : Botryospheria se encontró en el 79% de los casos en la parte alta de la planta y sobre todo a nivel de la soldadura (52,4%). Los 2 hongos asociados a la yesca fueron aislados también en la parte alta de la planta en el 70% de los casos. Pch fue localizado más concretamente a nivel del injerto (24%) y del PG1 (25%) y Pal a nivel de PG1 (40,7%). PG2 fue por término medio el nivel menos frecuentemente contaminado (3% por Botryosphaeria, 9% por Pch y 7,4% por Pal). Pal y Botryosphaeria fueron aislados también, aunque en menor medida (10%), en la base de la planta, a nivel de la herida de desyemado.

6 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG % G 90% 80% S 70% 60% PG1 50% PG2 40% 30% PG3 20% 10% Pe 0% Botryosphaeria sp Phaeomoniella chlamydospora Phaeoacremonium aleophilum PG4 Figura 3 : Localización de los diferentes hongos En este estudio se identificaron por tanto dos puertas de entrada (Figura 4) : - la zona de la soldadura que parece ser la preponderante - y la parte baja de la planta (herida del desyemado y parte basal) menos importante. Estos resultados confirman los obtenidos por Larignon (comunicación personal) relativos a la penetración de Pal y de Botryosphaeria por la parte alta de la planta pero ponen en discusión la hipótesis según la cual Pch penetra esencialmente por la base de la planta. Estos diferentes resultados pueden ser debidos a dos motivos: el material vegetal de base y el proceso de fabricación. Greffon 70% PG1 Soudure PG2 Nivel menos afectado PG3 PG4 Pe 25% Figura 4 : Principales puertas de entrada de los hongos asociados a las enfermedades de la madera

7 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 7 PROCESO DE FABRICACIÓN A efectos de la experimentación y con la intención de identificar lo mejor posible las etapas de riesgo, los injertos procedían de una parcela muy afectada por las enfermedades de la madera. Análisis microbiológicos Hongos asociados a la yesca Por lo que respecta a los hongos asociados a la yesca, sólo Pch fue aislado durante el proceso de fabricación. Apareció solamente en el momento de la rehidratación (1,7% de los pies estuvieron afectados) pero su presencia se hizo mucho más significativa durante la venta: un 8%. Por tanto una contaminación parece producirse durante la rehidratación. Hongos asociados al BDA A pesar de la procedencia de los injertos, al inicio del estudio éstos mostraron no estar contaminados por Botryosphaeria. De la misma manera, los Botryosphaeria fueron aislados de forma poco significativa en los portainjertos (de un 0,5 a un 2%). Un mayor porcentaje de aislamiento de estos hongos se produjo durante la injertación: en ese momento un 16,5 % de las plantas eran portadoras de Botryosphaeria. Este porcentaje alcanzó el 33% en el momento de la venta (Figura 5) % G PG G PG 1.7 Punto cero Remojado Injertación Estratificación En aserrín Rehidratación Venta Phaeomoniella chlamydospora Botryosphaeria sp Figura 5 : Evolución del porcentaje de plantas afectadas a lo largo del proceso de fabricación de un injerto soldado No se conoce la causa del mayor número de aislados de Botryosphaeria en el momento de la injertación. Se pueden barajar varias hipótesis: contaminación de las herramientas de injertación por Botryosphaeria, Las contaminaciones durante los remojados se evidencian sólo al momento del análisis siguiente a causa del periodo de latencia (cerca de 40 días) entre la realización de las diferentes operaciones y el análisis microbiológica.

8 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 8 La hipótesis de una contaminación durante la realización del injerto parece poco probable ya que la mayor parte de los Botryosphaeria se encuentran en ese momento a nivel de la herida de desyemado (51,4%) y no a nivel de la soldadura (Figura 6). Lo más lógico es que la contaminación haya tenido lugar por tanto durante el remojado. En ese caso las contaminaciones serían debidas a la presencia del hongo ( en forma de esporas? de micelio?) sobre la superficie de la madera G S % PG1 PG2 PG3 Pe 10 0 Injertación Estratificación en aserrín Rehidratación Venta PG4 Figura 6 : Ubicación de los Botryosphaeria durante el proceso de fabricación A lo largo del proceso de fabricación, la cantidad de plantas contaminadas por Botryosphaeria aumenta y la ubicación de estos hongos se invierte: al inicio presentes mayoritariamente en la base de la planta, mientras que en el momento de la venta se encuentran principalmente en la parte alta de la planta. Una nueva contaminación se produjo, esta vez en la parte alta de la planta, o durante la estratificación o durante la rehidratación. Análisis biomoleculares El análisis PCR, llevado a cabo sólo con Pch, mostró la presencia del hongo en el agua de remojado y en las aguas de estratificación. Ningún Pch fue detectado en el agua de enjuague de la superficie de los injertos. Las herramientas no parecen estar implicadas en el proceso de contaminación por Pch. Este nuevo enfoque pone de manifiesto de nuevo el rol de los diferentes baños en la transmisión de los hongos de una planta a otra. El hongo se encuentra en el material vegetal. En otros estudios se ha demostrado que la superficie del material vegetal sobre la que se encuentra Pch (en forma de esporas, de micelio, o ambos), representa la fuente de inoculo, o una de ellas, que provoca las contaminaciones observadas en los viveros (LARIGNON y COARER, comunicación personal).

9 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 9 CONCLUSIÓN El presente trabajo ha permitido evaluar la incidencia de los hongos asociados a las enfermedades de la madera sobre las plantas que salen del vivero. Los hongos Pch y Botryosphaeria son los microorganismos presentes más frecuentemente de todos aquellos asociados a las enfermedades de la madera. Su presencia es variable en función del origen de las plantas y/o de su proceso de fabricación. Pal fue el menos aislado en las plantas que salen del vivero y los mohos Fomitiporia mediterranea y Eutypa lata no fueron nunca aislados. Se identificaron las vías de penetración. La principal puerta de entrada se encuentra a nivel de la soldadura. Las heridas situadas en la base de la planta pueden actuar también como puertas de entrada de los microorganismos en el injerto soldado. Las etapas en las que se produjeron las contaminaciones fueron parcialmente identificadas. Se trata del remojado y/o de la estratificación y/o de la rehidratación en el caso de la Botryosphaeria. Los baños de hidratación podrían representar también una fase de riesgo en los que podría tener lugar una contaminación del material vegetal por Pch. Para limitar la propagación de algunos hongos en el material vegetal, es necesario proseguir estos estudios con el objetivo de: + identificar con mayor precisión las etapas en las que se pueden producir contaminaciones + buscar la fuente del inóculo en cada una de estas etapas por PCR, en particular de Pch pero también de Pal y de los Botryosphaeria + encontrar métodos de desinfección de la superficie del material vegetal que entra en los viveros, aplicables durante la rehidratación de la madera (cryptonol u otros productos). Esta desinfección podría tener como objetivo las dos zonas «de riesgo» que son la herida de desyemado y la soldadura. Trabajo realizado con el apoyo económico de ONIVINS Midi-Pyrénées y de la Región Midi-Pyrénées

10 VIGUES ET AL., YESCA Y BLACK DEAD ARM EN LOS VIVEROS, PÁG. 10 Para saber más FOURIE P.H., HALLEEN F., Investigation of occurence of Phaeomoniella chlamysdospora in canes of rootstock mother vines. Australasian Plant Pathology, 31, FOURIE P.H., HALLEEN F., Occurence of grapevine trunk disease pathogens in rootstock mother plant in South Africa. Australasian Plant Pathology, 33, GROENEWALD M., BELLSTEDT D.U. et CROUS P.W., A PCR-based method for the detection of Phaeomoniella chlamydospora in grapevines. South African Journal of Science, 96, HALLEEN F., CROUS P.W. et PETRINI O., Fungi associated with healthy grapevine cuttings in nurseries, wqith special reference to pathogens onvolved in the decline of young vines. Australian Plant Pathology, 32, LARIGNON P., Réflexions sur l esca. Phytoma, 576, LARIGNON P., Maladies du bois : aspects pépinières et protection des plaie de tailles. Progrès Agricole et Viticole, Vol , LARIGNON P. BERUD F., DUBOS B., et GIRARDON K Les maladies du bois de la vigne : quelques éléments sur le cycle biologique des champignons qui y sont associés en pépinières. Phytoma (soumis) LARIGNON P. et DUBOS B., Le Black Dead Arm. Maladie nouvelle à ne pas confondre avec l esca. Phytoma, 538, LARIGNON P., DUPONT J. et DUBOS B., L esca de la vigne : quelques éléments sur la biologie de deux des agents associés, Phaeoacremonium aleophilum et de Phaeomoniella chlamydospora, Phytoma, 527, LARIGNON P., PULCHIC R., CERE L., et DUBOS B., Observation of Black Dead Arm in french vineyards. Phytopathology Mediterranea, 40, S336-S342 LEHOCZKY J Necrosis of nurseried grapevine grafts of Botryosphaeria stevensii infection. Acta Phytopathologica Academiae Scientarum hungaricae, 9, RETIEL E., DAMM U. Mc LEODA. et FOURIE P.H., Petri disease : potential inoculum sources in South African grapevine nurseries. 4th International Workshop on grapevine Trunk Diseases janvier 2005, Stellenbosch, Afrique du Sud. RIDGWAY H.J., SLEIGHT B.E. et STEWART A., Molecular evidence for the presence of Phaeomoniella chlamydospora in New Zealand nurseries, and its detection in rootstock mothervines using species-specific PCR. Australasian Plant Pathology. 31, TEGLI S., BERTELLI E. et SURICO G Sequence analysis of ITS ribosomal DNA in five Phaeoacremonium species and development of a PCR-based assy for the detection of P. chlamydosporum and P. aleophilum in grapevine tissue. Phytopathologia Mediterranea, 39,