RT - kit plus síntesis de ADNc con random primer

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1 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCIPIO DE LA PRUEBA pág. 2 PRESENTACIÓN DEL KIT pág. 2 MATERIAL PROVISTO EN EL KIT pág. 2 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL KIT pág. 2 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 3 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 3 MUESTRAS Y CONTROLES pág. 5 PROCEDIMIENTO pág. 5 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO pág. 7 CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES pág. 8 BIBLIOGRAFÍA pág. 9 PROBLEMAS Y SOLUCIONES pág. 10 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 11 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sitio WEB: C El producto es un sistema de transcripción inversa para la síntesis de ADNc del ARN extraído de muestras celulares y no celulares. El producto se utiliza en la síntesis de ADNc para la búsqueda y el dosaje de virus humanos con genoma de ARN y para la búsqueda y el dosaje de ARN mensajeros humanos. Los ADNc sintetizados con este producto se pueden utilizar en los test diagnósticos basados en reacciones de amplificación de los ácidos nucleicos con enzimas ADN polimerasas (por ejemplo ADN polimerasas termoestables). PRINCIPIO DE LA PRUEBA El procedimiento prevé la realización con un termostato programable (thermal cycler) de una reacción de transcripción inversa que utiliza oligonucleótidos hexámeros de secuencia casual (random primer) para producir la polimerización y el ADN polimerasas ARN dependiente del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV). La reacción de transcripción inversa produce ADNc de las diferentes moléculas de ARN presentes en el ARN extraído de las muestras examinadas. El inhibidor ARNsa STOP en la mezcla de reacción, permite prevenir la degradación del ARN extraído causado por ARNsa eventualmente presentes. PRESENTACIÓN DEL KIT El producto provee los siguientes componentes: - las mezclas de reacción RT - MIX para la transcripción inversa, previamente dosificadas en 50 probetas «monotest» listas para su uso. Cada probeta contiene 10 µl de solución. - La encima transcriptasa inversa MMLV-RT, dosificada en una probeta que contiene 70 µl. - el inhibidor de las ARNsa ARNsa STOP, dosificado en una probeta que contiene 35 µl. - el Agua Ultrapura, para biología molecular, dosificada en dos probetas que contienen 1900 µl cada una. El producto permite efectuar 50 reacciones de transcripción inversa, controles positivos y negativos incluidos. MATERIAL PROVISTO EN EL KIT Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado oligonucleótidos hexámeros, TRIS base, TRIS clorhidrato, Mezcla de retrotranscripción Cloruro de potasio, Cloruro de magnesio, RT - MIX 50 x 10 µl en probetas de 0,2 o 0,5 ml Desoxirribonucleótidos trifosfatados, - Ditiotreitol, Triton X-100, Albúmina Sérica Bovina acetilada MMLV-RT 200 U / µl U RNasi STOP 40 U / µl U U de transcriptasa inversa, tapón con aplicación AZUL U de inhibidor de las ARNsa, tapón con aplicación AMARILLA 1 x 70 µl 1 x 35 µl enzima MMLV-RT, TRIS base, TRIS clorhidrato, Cloruro de Sodio, Ditiotreitol, Sodio EDTA, NP-40, Glicerol inhibidor ARNsa STOP, TRIS base, TRIS clorhidrato, Cloruro de potasio, Ditiotreitol, Sodio EDTA, Glicerol Agua Ultrapura Agua para biología molecular 2 x 1900 µl - - MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL KIT - Campana de flujo laminar. - Guantes sin polvo descartables de látex o similares. - Mezclador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas y tips estériles con filtro para aerosol o de dispensación positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Agua bidestilada estéril. - Termostato programable (thermal - cycler). - - SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 1/11 SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 2/11

2 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS Los reactivos para la extracción del ARN de las muestras a analizar, para el control positivo de extracción, para la amplificación del ADNc y la detección del ADN amplificado no están incluidos en este kit. Para realizar estas fases analíticas se aconseja la utilización de los siguientes productos accesorios producidos por ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAgen» (código EXTG01), kit de extracción de los ácidos nucleicos de muestras no celulares; el kit permite efectuar 50 extracciones; «EXTRAzol» (código EXTR01), kit de extracción del ARN de muestras celulares; el kit permite efectuar 50 extracciones; «CPE-RNA - Internal Control» (código CTRRNA, o incluido en el «RECK» código RK100), control positivo de extracción de ARN genómico del fago MS2 para sistemas de extracción del ARN de muestras no celulares; el producto permite efectuar 50 reacciones. Este kit es para uso exclusivo in vitro. Advertencias y precauciones generales ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si pudiesen transmitir agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni aerosol. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121C dura nte una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales usados para realizar la prueba como si fuesen agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni aerosol. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material combustible monouso debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos o la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el kit antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el kit durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del kit. Utilizar sólo los reactivos presentes en el kit y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de kits de otros fabricantes. Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos, requieren personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de amplificación. Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / detección de los productos de amplificación. Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de productos de amplificación. Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / detección de productos de amplificación al área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos deben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los componentes Las RT-MIX para la transcripción inversa son desechables y por lo tanto deben ser utilizadas una sola vez en reacciones de transcripción inversa. Las RT-MIX para la transcripción inversa no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S No respirar los gases/ humos/ vapores/ aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. La MMLV-RT no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S No respirar los gases/ humos/ vapores/ aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. la ARNsa STOP no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S No respirar los gases/ humos/ vapores/ aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 3/11 SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 4/11

3 Muestras MUESTRAS Y CONTROLES Este producto se debe utilizar con ARN extraído de muestras biológicas celulares y no celulares. El volumen del ARN extraído para agregar a la reacción de transcripción inversa es de 10 µl. En caso de utilizar una muestra de volumen inferior a 10 µl, llevar la muestra a 10 µl agregando Agua ultrapura. La cantidad de ARN extraído agregado a la reacción de transcripción inversa no debe superar 1 µg, para evitar aparición de productos inespecíficos y posibles fenómenos de inhibición en la siguiente reacción de amplificación de los ácidos nucleicos. En caso de congelar los RNA extraídos, se recomienda preparar varias alícuotas de muestras para no someterlas a repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamientos. Cuando se utilizan ARN extraídos congelados, descongelar las muestras inmediatamente antes de iniciar la extracción para evitar eventuales fenómenos de degradación de los ácidos nucleicos. Sustancias interferentes El ARN extraído de la muestra no debe contener heparina, hemoglobina, dextrano o Ficoll, para evitar fenómenos de inhibición y la aparición de frecuentes resultados no válidos. No se dispone de datos referidos a eventuales fenómenos de inhibición por parte de fármacos antibióticos, antivirales, quimioterápicos o inmunosupresores. Controles de transcripción inversa Es absolutamente necesario convalidar cada una de las sesiones de transcripción inversa preparando una reacción de control negativo y una reacción de control positivo. Para el control negativo utilizar agua bidestilada estéril (no provista en el kit) agregándola a la reacción en lugar del ARN extraído de la muestra o el control negativo de extracción. Para el control positivo utilizar un ARN extraído de una muestra positiva ya testada. Programación del ciclo térmico PROCEDIMIENTO Antes de iniciar la sesión es necesario: - controlar que el bloqueo térmico del termostato programable (thermal - cycler) sea compatible con el formato de las probetas «monotest» provistas en el kit (probetas de 0,2 o 0,5 ml); - programar en el thermal - cycler los parámetros apropiados del ciclo térmico descriptos en la tabla siguiente. Ciclo térmico de la transcripción inversa Número de ciclos Temperaturas Tiempos Hibridación de los primer 25 C 10 min. Transcripción inversa 37 C 45 min. Desnaturalización última 95 C 5 min. Preparación de la transcripción inversa (A realizarse en el área de extracción / preparación de la reacción de amplificación) Antes de iniciar la sesión es necesario: - extraer y descongelar las probetas con las muestras a analizar. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer y descongelar las probetas «monotest» de RT - MIX necesarias para la sesión. Agitar delicadamente las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido, identificar reconocibles con un marcador permanente y mantenerlas en hielo; SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 5/11 - extraer la probeta de la transcriptasa inversa MMLV-RT 200 U / µl (tapón con aplicación AZUL) y la probeta del inhibidor de las ARNsa RNasi STOP 40 U / µl (tapón con aplicación AMARILLA), centrifugarlas durante 5 segundos para obtener el contenido en el fondo y mantenerlas en hielo. Nota: La transcriptasa inversa MMLV-RT y el inhibidor de las ARNsa RNasi STOP son muy sensibles al calor. Para evitar que estos reactivos pierdan la actividad, se aconseja mantenerlos fuera del congelador sólo el tiempo necesario para preparar las diluciones. - diluir juntos como se describe en la siguiente tabla, la transcriptasa inversa MMLV-RT (a 40 U / µl) y el inhibidor de las ARNsa RNasi STOP (a 4 U / µl) con Agua Ultrapura. Preparar un volumen de enzimas diluidas suficiente para todas las reacciones previstas (controles incluidos) más una, para contar con un margen de seguridad. Las enzimas deluidas no se pueden conservar. Nota: La transcriptasa inversa MMLV-RT y el inhibidor de las ARNsa RNasi STOP diluidos son muy sensibles al calor. Para evitar que estos reactivos pierdan la actividad, se aconseja mantenerlos fuera del hielo sólo el tiempo necesario para la dispensación. Número de reacciones MMLV-RT RNasi STOP Agua Ultrapura Volumen total 4 4 µl 2,0 µl 14,0 µl 20 µl 5 5 µl 2,5 µl 17,5 µl 25 µl 6 6 µl 3,0 µl 21,0 µl 30 µl 7 7 µl 3,5 µl 24,5 µl 35 µl 8 8 µl 4,0 µl 28,0 µl 40 µl 9 9 µl 4,5 µl 31,5 µl 45 µl µl 5,0 µl 35,0 µl 50 µl µl 5,5 µl 38,5 µl 55 µl µl 6,0 µl 42,0 µl 60 µl µl 6,5 µl 45,5 µl 65 µl µl 7,0 µl 49,0 µl 70 µl µl 7,5 µl 52,5 µl 75 µl µl 8,0 µl 56,0 µl 80 µl µl 8,5 µl 59,5 µl 85 µl µl 9,0 µl 63,0 µl 90 µl µl 9,5µL 66,5 µl 95 µl µl 10,0 µl 70,0 µl 100 µl 1. Agregar a cada probeta «monotest» 5 µl de MMLV-RT y ARNsa STOP diluidos (en total 200 U de MMLV-RT y 20 U ARNsa STOP). 2. Agregar a cada probeta «monotest» 10 µl de ARN extraído y mezclar bien RT-MIX, enzimas diluidas y muestra pipeteando tres veces el volumen de 10 µl. Proceder de igual manera con el control negativo y con el control positivo. 3. Transferir las probetas «monotest» en el thermal - cycler y comenzar el ciclo térmico de la transcripción inversa. Productos utilizados después de la transcripción inversa serie «AMPLIFICACIÓN NESTED» serie «AMPLIFICACIÓN REAL TIME» serie «AMPLIFICACIÓN REAL TIME DUPLEX» serie «REAL TIME PCR DUPLEX MONO-REACTIVA» Modalidad de uso del producto de extracción Utilizar directamente el producto de reacción. Agregar 40 µl de Agua ultrapura al producto de reacción y llevarlo a 65 µl finales. Nota: El producto de reacción puede conservarse a -20 Cº por un período máximo de un mes. Nota: El producto de reacción tiene la capacidad de contaminar las pruebas siguientes. Aislar o eliminar adecuadamente el producto residual de reacción y los desechos producidos en las siguientes manipulaciones. SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 6/11

4 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES Utilizar este producto con ARN extraído de muestras biológicas celulares y no celulares. No utilizar con este producto el ARN extraído de muestras heparinizadas: la heparina inhibe la reacción de amplificación de los ácidos nucleicos y produce resultados no válidos. No utilizar con este producto ARN extraído contaminado con Ficoll, dextrano o hemoglobina: estas sustancias inhiben la reacción de amplificación de los ácidos nucleicos y pueden causar resultados no válidos. No se dispone de datos referidos a eventuales fenómenos de inhibición por parte de fármacos antibióticos, antivirales, quimioterápicos o inmunosupresores. Los resultados obtenidos con este producto dependen de la correcta recolección, transporte, conservación y preparación de las muestras; para evitar resultados erróneos es necesario prestar una particular atención a estas fases y seguir atentamente las instrucciones provistas con los productos para la extracción de los ácidos nucleicos. Este producto requiere personal instruido para la manipulación de muestras biológicas capaces de transmitir infecciones y de preparados químicos clasificados como peligrosos, para evitar accidentes con consecuencias potencialmente graves para el usuario u otras personas. Este producto requiere indumentaria y áreas de trabajo adecuadas para la manipulación de muestras biológicas capaces de transmitir infecciones y de preparados químicos clasificados como peligrosos, para evitar accidentes con consecuencias potencialmente graves para el usuario u otras personas. Este producto requiere personal instruido para los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos para evitar resultados incorrectos en las fases siguientes de los análisis realizados en los ácidos nucleicos con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Este producto requiere áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación para evitar resultados falsos positivos en las fases siguientes de los análisis realizados en los ácidos nucleicos con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Este producto requiere el uso de indumentaria de trabajo y equipos destinados a la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación, para evitar resultados falsos positivos en las fases siguientes de los análisis realizados en los ácidos nucleicos con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Eficiencia de transcripción inversa: test con ARN del fago MS2 La eficiencia de transcripción inversa de este producto permite obtener una cantidad de ADNc promedio igual al 50% del ARN extraído agregado a la reacción de transcripción inversa. La eficiencia de transcripción inversa ha sido testeada utilizando como material de referencia una preparación de ARN genómico purificado del fago MS2, cuya concentración inicial ha sido determinada espectrofotométricamente. El RNA del fago MS2 ha sido diluido con un título de 100 y 10 copias para 10 µl en ARN total de levadura con una concentración de 1 µg para 10 µl. Cada dilución se ha empleado en 10 repeticiones para realizar la transcripción inversa y 5 µl del ADNc producido se han empleado en amplificación real time con los productos ELITechGroup S.p.A. y sus accesorios. Los resultados obtenidos son coherentes con una eficiencia de transcripción inversa de por lo menos el 50% y se resumen en la siguiente tabla: Copias de ARN del fago MS2 presentes en la reacción de transcripción inversa Copias esperadas (eficiencia 50%) de ADNc del fago MS2 en la reacción de amplificación real time Resultado obtenido positivos / repeticiones / /10 Las muestras de ADNc obtenidas a partir de 10 copias ARN del fago MS2 en la reacción de transcripción inversa, presentan un título inferior al límite de detección del sistema de amplificación real time que produce resultados positivos de modo casual. La eficiencia de transcripción inversa ha sido testeada utilizando como material de referencia una preparación de ARN genómico purificado del fago MS2, cuya concentración inicial ha sido determinada espectrofotométricamente. Una cantidad de copias de ARN del fago MS2 ha sido agregada a 6 muestras de di 300 µl de plasma recolectado en EDTA. Cada muestra fue utilizada para realizar la extracción, transcripción inversa y amplificación real time, con los productos ELITechGroup S.p.A. y sus accesorios. La prueba se repitió con tres lotes diferentes de este producto. Los resultados obtenidos son coherentes con una eficiencia de transcripción inversa promedio del 50% y se resumen en la siguiente tabla: Copias de ARN del fago MS2 esperadas en la reacción de transcripción inversa Copias de ADNc del fago MS2 esperadas (eficiencia 50%) en la reacción de amplificación real time Cuantidad promedio de ADNc de fago MS2 obtenida en la reacción de amplificación real time Eficiencia de transcripción inversa: test con ARN total positivo para Philadelphia P210 La eficiencia de transcripción inversa ha sido testeada utilizando como material de referencia una dilución 1: de ARN total positivo para la translocación t(9:22) Philadelphia P210 (de células K562) en ARN total normal. La muestra fue utilizada en 6 repeticiones para realizar todo el procedimiento de análisis, transcripción inversa y amplificación real time, con los productos ELITechGroup S.p.A. y los accesorios. Los resultados finales se presentan en la siguiente tabla. Muestra ARN positivo P210 (1:10.000) Positivas / Repeticiones Amplificación P210 promedio de la cantidad Amplificación ABL promedio de la cantidad Relación % P210 / ABL 6 / ,027% Todas las repeticiones se han identificado correctamente. Los resultados cuantitativos se expresan como valor de la cantidad del ADNc de P210 y del ADNc de ABL en la reacción y como relación en porcentaje. Este resultado demuestra la elevada eficiencia de transcripción inversa del producto. SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 7/11 SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 8/11

5 Eficiencia de transcripción inversa: test con material de referencia certificado La eficiencia de transcripción inversa ha sido testeada utilizando como material de referencia certificado un panel de diluciones de Enterovirus (Coxackievirus A9) de tres concentraciones diferentes (Qnostics EV Mini Panel, Qnostics Ltd, Escocia, Reino Unido). Cada muestra del panel ha sido reconstituida para obtener un título 1,5 veces inferior al previsto por el fabricante y acercarse a la concentración límite. Cada muestra del panel fue utilizada en 3 repeticiones para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción, transcripción inversa y amplificación real time, con los productos ELITechGroup S.p.A. y sus accesorios. Los resultados finales se presentan en la siguiente tabla. Muestra Título viral Intervalo de Ct esperado Positivas / Repeticiones Promedio de los Ct obtenidos ENT06D Alto / 3 30 ENT06C Medio / 3 33 ENT06B Bajo / 3 39 Todas las muestras se han identificado correctamente. Los resultados cuantitativos, expresados como valor de Ct (Cycle threshold) entran en el intervalo definido por Qnostics, no obstante la dilución de las muestras 1,5 veces mayor. Este resultado demuestra la elevada eficiencia de transcripción inversa del producto. Nota: Los datos y los resultados completos de las pruebas realizadas para evaluar las características de las presentaciones del producto con las matrices y los equipos están señaladas en la Sección 7 del Fascículo Técnico del Producto "", FTP BRK200. BIBLIOGRAFÍA J. A. Garson et al. (1990) Lancet 336: PROBLEMAS Y SOLUCIONES Falsos positivos con el producto de transcripción inversa Causas posibles Error durante la dispensación del ARN. Contaminación de los reactivos preparados para la sesión. Contaminación del agua ultrapur para la dilución de las enzimas. Contaminación de los stock de enzimas. Contaminación del área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Falsos negativos con el producto de transcripción inversa Causas posibles Enzimas demasiado diluidas o error durante la dispensación de las enzimas. Pérdida de actividad de las enzimas Error durante la dispensación del ARN extraído. Degradación del ácido nucleico extraído. Material demasiado diluido. Soluciones Abrir una probeta a la vez, evitar esparcir el contenido de la probeta, cambiar siempre de tip. Seguir atentamente la dilución y la dispensación de las enzimas, cambiar siempre de tip. Utilizar una nueva alícuota de agua ultrapura. Utilizar nuevas alícuotas de enzimas. Limpiar superficies y instrumentos con detergentes acuosos, lavar batas, sustituir probetas y tips en uso. Soluciones Volver a controlar los cálculos de dilución, seguir atentamente la dispensación de la enzima y mezclar de manera adecuada. Mantener en hielo la probeta con la dilución de las enzimas, utilizar nuevas alícuotas de enzimas Seguir atentamente la dispensación del ARN extraído. Utilizar plástico sin ADNsa y ARNsa, cambiar la alícuota en uso de etanol absoluto, reactivo de lavado, agua ultrapura. Extraer una nueva alícuota de muestra y disolver el depósito de ácidos nucleicos en un volumen menor de agua ultrapura. Error de programación del ciclo térmico. Controlar el ciclo térmico programado en el thermal - cycler. Error durante la dispensación del producto de transcripción inversa. Productos inespecíficos en las reacciones de amplificación de los ADNc Extraer y distribuir prestando atención el producto de transcripción inversa en la reacción de amplificación. Causas posibles Soluciones Evaluar la concentración del ARN extraído, no superar una Exceso de ARN extraído en la reacción. concentración de 40 ng / µl (1 µg de ARN en total) en la reacción de transcripción inversa. Exceso de ADNc o de reactivos de No excederse con la cantidad de producto de la reacción de transcripción inversa en la reacción de transcripción inversa que se transfiere a la reacción de amplificación. amplificación. SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 9/11 SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 10/11

6 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS Número de catálogo. Límite superior de temperatura. Código de lote. Utilizar antes del último día del mes. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. CONT Contenido. Atención, consultar las instrucciones de uso. Fabricante. SCH mbrk200_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 11/11