ELECTROPHORESIS 4 detección electroforética de ADN

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1 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCIPIO DEL MÉTODO pág. 2 DESCRIPCIÓN DEL KIT pág. 2 MATERIAL PROVISTO EN EL KIT pág. 2 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL KIT pág. 3 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 3 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 3 MUESTRAS Y CONTROLES pág. 4 PROCEDIMIENTO pág. 5 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO pág. 10 CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES pág. 10 BIBLIOGRAFÍA pág. 11 PROBLEMAS Y SOLUCIONES pág. 11 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 12 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sitio WEB: +2 C +8 C El producto es un sistema de detección e identificación del ADN mediante separación electroforética en gel de agar de los productos de las pruebas cualitativas de amplificación de los ácidos nucleicos de la serie «Oligomix Alert kit» de ELITechGroup S.p.A. El producto se utiliza para la detección de los resultados de las pruebas cualitativas de amplificación de los ácidos nucleicos para la detección de un ADN blanco en el ADN extraído de muestras biológicas o en el ADNc obtenido de ARN extraído de muestras biológicas. PRINCIPIO DEL MÉTODO El procedimiento de detección electroforética prevé la preparación de los productos de la reacción de amplificación y su carga en los pocillos del gel de agar sumergido en el tampón de electroforesis en la cubeta electroforética. Al aplicar una corriente continua a la cubeta electroforética el ADN presente en cada pocillo migra hacia el electrodo positivo e incorpora el bromuro de etidio, un fluoróforo presente en el gel de agar. El retículo molecular del gel de agar permite la separación de las moléculas de ADN de dimensiones más pequeñas, es decir con un número de pares de bases (bp) menor, que migran más rápidamente, de las de mayores dimensiones, es decir con un número de pares de bases mayor, que migran más lentamente. El ADN puede visualizarse por medio de la exposición de gel a una radiación ultravioleta y aparece como una traza anaranjada con la forma del pocillo (banda). La presencia del producto específico de una indica la presencia del ADN blanco en la muestra de partida. DESCRIPCIÓN DEL KIT El kit provee el Gel Listo 8 pocillos, en cubeta y listo para usar, el Tampón de Electroforesis 50x, para reconstituir agregando agua bidestilada estéril, el Tampón de Carga 6x, para la preparación de los productos de la, el Marker HaeIII, como referencia de peso molecular y una solución diluida de Bromuro de Etidio, para la recoloración del gel cuando sea necesario. El kit permite efectuar 64 detecciones, pesos moleculares de referencia y controles incluidos. MATERIAL PROVISTO EN EL KIT Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado Gel Listo 8 pocillos gel de agar con 8 pocillos en tampón TAE 1x con bromuro de etidio Tampón de Electroforesis 50x tampón TAE 50x, para diluir 50 veces con agua Tampón de Carga 6x Marker HaeIII tampón de carga, para diluir 6 veces en la muestra pesos moleculares de referencia, listos para su uso 8 1 x 50 ml 1 x 0,5 ml 1 x 0,1 ml Agar, TRIS base, TRIS acetato, EDTA, 0,05% Bromuro de etidio TRIS base, TRIS acetato, EDTA Glicerol, TRIS base, TRIS clorhidrato, EDTA, Azul de Bromofenol, Xilencianol FF Plásmido, Glicerol, TRIS base, TRIS clorhidrato, EDTA, Azul de Bromoferol, Xilencianol FF SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 1/12 SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 2/12

2 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL KIT Campana de flujo laminar Guantes descartables de látex o similares Microcentrífuga de mesa ( RPM). Micropipetas y tips estériles con filtro para aerosol o de dispensación positiva (220 µl, 550 µl). Agua bidestilada estéril. Probetas estériles de microcentrífuga de 1,5 ml. Cubeta electroforética. Alimentador de corriente continua (de 50 V a 150 V). Transiluminador UV (de 320 nm a 380 nm). Aparato fotográfico o sistema de adquisición de imagen para registrar los resultados. Bromuro de etidio 0,05%. OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS Los reactivos para la amplificación del ADN o del ADNc obtenido de las muestras a analizar, para el control positivo de amplificación y para el control interno de idoneidad no están incluidos en este kit. Para realizar estas fases analíticas se aconseja la utilización de los siguientes kits de accesorios producidos por ELITechGroup S.p.A.: serie «Oligomix Alert kit», kit de amplificación del ADN o del ADNc obtenido de las muestras; serie «Positive Control», control positivo de amplificación de ADN plasmídico; «DECK» (código DK100), control interno de idoneidad que utiliza el gen humano de la beta globina como blanco; el producto permite efectuar 100 reacciones; «RECK» (código RK100), control interno de idoneidad que utiliza el ARN genómico del fago MS2 como blanco; el producto permite efectuar 100 reacciones. Este kit es para uso exclusivo in vitro. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Advertencias y precauciones generales Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si fuesen agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni pulverizar. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121 Cº durante una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales usados para realizar la prueba como si fuesen agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni pulverizar. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material de uso único combustible debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos / la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el kit antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el kit durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del kit. Utilizar sólo los reactivos presentes en el kit y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de kits de otros fabricantes. Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la trascripción inversa, la amplificación y la revelación de ácidos nucleicos, requieren de personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / revelación de los productos de Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción / preparación de las reacciones de Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / revelación de productos de Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / revelación de productos de amplificación al área de extracción/ preparación de las reacciones de Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de desplazamiento positivo o usar tips con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNse y ARNse, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos seben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de desplazamiento positivo o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNse y ARNse, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los componentes. El Gel Listo 8 pocillos es desechable y por lo tanto debe utilizarse sólo una vez en la sesión de detección. El Gel Listo 8 pocillos debe conservarse alejado de fuentes de luz. Para el Gel Listo 8 pocillos se deben tener en cuenta las siguientes precauciones (S): S 2324/25. No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos y la piel. Muestras Para el Tampón de Electroforesis 50x se deben tener en cuenta las siguientes precauciones (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. Para el Tampón de Carga 6x se deben tener en cuenta las siguientes precauciones (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. Para el Marker HaeIII se deben tener en cuenta las siguientes precauciones (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. MUESTRAS Y CONTROLES El material a utilizar con este kit debe estar constituido por ADN producto de una reacción de El ADN producto de la debe tener dimensiones de 1000 bp a 50 bp para poder ser identificado con este kit. SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 3/12 SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 4/12

3 Controles de detección Es absolutamente necesario confirmar cada una de las sesiones de detección haciendo que el Marker HaeIII, utilizado como control positivo de detección, migre hacia el gel de agar. Es absolutamente necesario confirmar la especificidad del producto de la de una muestra comparando su migración al gel de agar con la migración del Marker HaeIII, utilizado como referencia de peso molecular, y con la migración del producto de la del control positivo de PROCEDIMIENTO Preparación del Tampón de Electroforesis 1x Antes de comenzar la fase de detección, preparar el volumen de Tampón de Electroforesis 1x necesario para la sesión de detección electroforética según las siguientes instrucciones. Diluir 50 veces el Tampón de Electroforesis 50x en agua bidestilada estéril de manera de obtener el Tampón de Electroforesis 1x. Por ejemplo, transferir 10 ml de Tampón de Electroforesis 50x en un recipiente estéril de 500 ml que contenga 490 ml de agua bidestilada estéril. El Tampón de Electroforesis 1x puede conservarse a temperatura ambiente por un máximo de tres meses. Preparación de la sesión de detección Para cada muestra se requiere la utilización de un pocillo. Se pueden efectuar 64 detecciones, pesos moleculares de referencia y controles incluidos. El número mínimo de detecciones por sesión es equivalente a 4, pesos moleculares de referencia y controles incluidos. Antes de iniciar la sesión es necesario: controlar, tomando como referencia la documentación del equipo, las características del Alimentador de corriente continua y las normas para su utilización por parte del operador en condiciones de seguridad; controlar, tomando como referencia la documentación del equipo, las características del Transiluminador UV y las normas para su utilización por parte del operador en condiciones de seguridad; establecer la posición de los pesos moleculares de referencia, de los controles y de las muestras en los pocillos del gel y anotarla cuidadosamente en un Plan de trabajo. El Plan de trabajo deberá seguirse con atención durante la transferencia de las muestras a los pocillos y servirá para una correcta interpretación de los resultados. Preparación del aparato electroforético 1. Controlar que el Alimentador esté apagado y que los electrodos estén desconectados de la cubeta electroforética. 2. Extraer una bandeja de plástico que contenga un Gel Listo 8 pocillos y quitar la protección de las dos cintas adhesivas colocadas debajo de la bandeja. 3. Quitar la cubierta que sella la parte superior de la bandeja con el Gel Listo 8 pocillos (Atención: el Gel Listo 8 pocillos contiene Bromuro de Etidio). 4. Colocar la bandeja con el Gel Listo 8 pocillos en la cubeta electroforética vacía, fijándola con las cintas adhesivas de manera que los pocillos se encuentren en la parte de la cubeta electroforética que tiene el electrodo negativo (negro). Nota bene: Para una separación electroforética óptima es indispensable que la bandeja con el Gel Listo 8 pocillos esté colocada en posición perfectamente paralela al eje largo de la cubeta electroforética. 5. Llenar la cámara electroforética con el Tampón de Electroforesis 1x de manera tal que su nivel supere por aproximadamente 5 mm los bordes de la bandeja con el Gel Listo 8 pocillos de modo de permitir el paso de la corriente eléctrica al gel. SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 5/12 Preparación de la muestra Nota bene: Cuando en la se han utilizado los controles internos de idoneidad «DECK» o «RECK» las muestras deben transferirse directamente a los pocillos del gel sin agregado del Tampón de Carga 6x. Por lo tanto, seguir el procedimiento que se describe a continuación, a partir del punto Extraer una probeta para microcentrífuga de 1,5 ml (no provista en el kit) por cada una de las muestras a analizar, incluidos los controles de amplificación, y una para los pesos moleculares de referencia y marcarlas de manera reconocible con un rotulador indeleble. 7. Transferir en las probetas para microcentrífuga de 1,5 ml para las muestras a analizar, incluidos los controles de amplificación, 3 µl del Tampón de Carga 6x. 8. Extraer 15 µl del Producto de amplificación y transferirlos en la probeta para microcentrífuga de 1,5 ml con el Tampón de Carga 6x. Mezclar bien pipeteando tres veces el volumen de 15 µl en el Tampón de Carga 6x. Repetir esta operación para cada muestra, incluidos los controles de 9. Transferir en la probeta para microcentrífuga de 1,5 ml para los pesos moleculares de referencia 10 µl del Marker HaeIII. Realización de la separación electroforética 10. Controlar que el Alimentador esté apagado y que los electrodos estén desconectados de la cubeta electroforética. 11. Transferir 18 µl de cada muestra preparada (o directamente de la amplificada cuando se utiliza el «DECK» o el «RECK») en un pocillo de Gel Listo 8 pocillos, como fue señalado previamente en el Plan de trabajo. Nota bene: Transferir cuidadosamente la muestra preparada dentro de los pocillos de manera que se deposite sobre el fondo del pocillo y que no desborde en los pocillos contiguos. 12. Transferir 10 µl de Marker HaeIII en el pocillo, como fue señalado previamente en el Plan de trabajo. 13. Cerrar la cubeta electroforética con la tapa de seguridad correspondiente y conectar los electrodos: electrodo negativo (negro) en la parte del gel con los pocillos; electrodo positivo (rojo) en la parte opuesta al gel hacia la que tendrá lugar la migración del ADN. Nota bene: Durante estas operaciones prestar atención a no mover bruscamente la cubeta electroforética, lo que puede provocar que se derramen las muestras de los pocillos. 14. Regular en el Alimentador la diferencia de potencial de manera que el campo eléctrico resulte de 6 8 V / cm. Por ejemplo, si los electrodos de la cubeta electroforética distan aproximadamente 15 cm se aconseja aplicar una diferencia de potencial de V. 15. Encender el Alimentador y controlar que los colorantes del Tampón de Carga 6x migren hacia al electrodo positivo (rojo) (Atención: en el aparato electroforético circula corriente eléctrica). 16. Dirigir la separación electroforética hasta que el frente de migración del colorante azul del Tampón de Carga 6x haya alcanzado aproximadamente un tercio del largo del Gel Listo 8 pocillos; generalmente son suficientes aproximadamente minutos (Atención: en el aparato electroforético circula corriente eléctrica). 17. Apagar el Alimentador, esperar 10 segundos, luego desconectar los electrodos y quitar la tapa de la cubeta electroforética. Nota bene: El Tampón de Electroforesis 1x puede utilizarse para un máximo de cuatro sesiones distintas de detección electroforética durante dos días, conservándolo en la cubeta electroforética cerrada. Nota bene: El producto de la tiene la capacidad de contaminar las pruebas siguientes. Aislar el producto residual de la, los geles ya utilizados, el Tampón de Electroforesis 1x usado y los demás residuos producidos en la detección electroforética. SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 6/12

4 Detección del ADN 18. Dentro de los 30 minutos siguientes al final de la separación electroforética extraer la bandeja con el Gel Listo 8 pocillos de la cubeta electroforética, luego extraer con cuidadosamente el gel de la bandeja de plástico y transferirlo al Transiluminador UV apagado (Atención: el Gel Listo 8 pocillos contiene Bromuro de Etidio). Nota bene: El producto de la tiene la capacidad de contaminar las pruebas siguientes. Evitar contaminar el ambiente con el Tampón de Electroforesis 1x. 19. Encender el Transiluminador UV para visualizar en el gel la separación electroforética del ADN y registrar los resultados con un aparato fotográfico o con un sistema de adquisición de imagen (Atención: las radiaciones ultravioletas son peligrosas para la piel y los ojos: evitar la exposición directa o indirecta de los ojos y la piel a la radiación ultravioleta). Nota bene: El Gel Listo 8 pocillos contiene bromuro de etidio, por lo tanto generalmente no es necesario procedimiento de coloración alguno para evidenciar el ADN. En caso de que la señal fluorescente fuera poco visible, se la puede intensificar como se describe a continuación: a) en una cubeta destinada a tal fin agregar a 100 ml de Tampón de Electroforesis 1x un volumen de 50 µl Bromuro de etidio (no provista en el kit) y mezclar bien; b) sumergir durante 30 minutos el gel sin la bandeja de plástico en el Tampón de Electroforesis 1x y, si fuera posible, mantenerlo en agitación lenta en un plano basculante; c) transferir el gel al Transiluminador UV y continuar el procedimiento desde el punto 19. Interpretación de los resultados La separación electroforética del Marker HaeIII se utiliza para confirmar la sesión de detección como se describe en la siguiente tabla: Marker HaeIII Bandas visibles Detección CORRECTA Si las bandas del Marker HaeIII no están visibles, ha ocurrido un problema durante la fase de detección (problema de transferencia al gel, de migración o de fluorescencia) que puede provocar resultados falsos negativos. La sesión de detección no es válida y debe repetirse. La separación electroforética correspondiente a una muestra en análisis se utiliza para evaluar la presencia y estimar las dimensiones y, en consecuencia, la especificidad del producto de una reacción de Este kit tiene capacidad para detectar una cantidad mínima de ADN producto de la reacción de amplificación de al menos 5 ng (límite de detección del producto, ver apartado sobre las Características de las prestaciones en las páginas 10). Los resultados correspondientes a cada muestra son utilizados para la búsqueda del ADN producto de la, como se describe en la siguiente tabla: Es absolutamente necesario confirmar la especificidad del producto de la comparando su migración al gel con la migración de los pesos moleculares de referencia del Marker HaeIII y con la migración del producto de la del control positivo. Este kit tiene capacidad para disolver moléculas de ADN producto de la de dimensiones de 1000 bp a 50 bp (intervalo de separación del producto, ver apartado sobre las Características de las prestaciones en las páginas 10). Los resultados correspondientes a cada muestra son utilizados para la búsqueda del ADN producto de la, como se describe en la siguiente tabla: Migración del ADN producto de la Correcta respecto del Marker y del Control Positivo Incorrecta respecto del Marker y del Control Positivo ADN producto de la ESPECÍFICO NO ESPECÍFICO La presencia del producto específico de la indica la presencia del ADN blanco en la muestra de partida, como se describe en la siguiente tabla: ADN producido por la Resultado de la detección electroforética Resultado de la prueba ADN blanco en la muestra de partida PRESENTE y ESPECÍFICO positivo positivo PRESENTE PRESENTE pero NO ESPECÍFICO negativo negativo NO DETECTADO NO DETECTADO negativo negativo NO DETECTADO La eventual presencia de productos no específicos de la no tiene significado alguno, ya que se refiere a la detección del ADN blanco en la muestra de partida. El significado de la presencia del ADN blanco en la muestra de partida se describe en los Manuales de instrucciones para la utilización de los productos de la serie «Oligomix Alert kit». Muestra Banda visible Banda no visible ADN producido por la PRESENTE NO DETECTADO Si el resultado de la separación electroforética de una muestra es No Detectado no se puede excluir que el ADN producto de la esté presente en cantidad inferior al límite de detección del producto (ver apartado sobre las Características de las prestaciones en las páginas 10). En este caso el resultado sería un falso negativo. SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 7/12 SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 8/12

5 A título de ejemplo, se presenta a continuación una figura esquemática que representa la separación electroforética de una sesión de detección de los productos de la de 5 muestras. En este ejemplo el producto de la para el parámetro de interés tiene dimensiones de 110 bp y el producto de la del control interno de idoneidad «DECK» o «RECK» tiene dimensiones de aproximadamente 600 bp. Pocillos Pesos Moleculare s Control positivo Control negativo Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra bp * * * * 459/434 bp 600 bp* 600 bp* 600 bp* 600 bp* 321/317 bp 293 bp 267 bp 250 bp 174 bp 142 bp 102 bp 110 bp 110 bp 110 bp 110 bp 80 bp * Al utilizar los sistemas «DECK» o «RECK», las muestras negativas para el producto de la reacción de amplificación para el parámetro de interés presentan, en caso de ser aptas, el producto de amplificación del control interno de idoneidad. Además, con «DECK» o «RECK», también las muestras positivas para el producto de amplificación para el parámetro de interés pueden presentar el producto de amplificación del control interno de idoneidad. Leyenda de la figura: Pesos Moleculares, el Marker HaeIII presenta bandas de dimensiones de 587 bp a 80 bp. Control positivo de amplificación, está presente el producto específico de amplificación para el parámetro de interés de dimensiones de 110 bp. Control negativo de amplificación, no está presente ningún producto de Muestras 1 y 2, muestras positivas, están presentes el producto específico de amplificación para el parámetro de interés y el producto específico de amplificación del control interno de idoneidad. Muestra 3, muestra en la cual no se ha detectado el producto específico de amplificación para el parámetro de interés y está presente sólo el producto específico de amplificación del control interno de Muestra idoneidad. 4, muestra positiva, está presente el producto específico de amplificación para el parámetro de interés (el producto específico de amplificación del control interno de idoneidad en este caso está ausente). Muestra 5, muestra en la cual no se ha detectado el producto específico de amplificación para el parámetro de interés (está presente un producto no específico de amplificación) y está presente el producto específico de amplificación del control interno de idoneidad. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Utilizar con este producto sólo el ADN producto de reacciones de amplificación de los ácidos nucleicos. Los resultados obtenidos con este producto dependen de la correcta recolección, transporte, conservación, preparación, extracción y amplificación de las muestras; por lo tanto para evitar resultados incorrectos es necesario tener una particular precaución durante estas fases y seguir atentamente las instrucciones provistas. Este producto requiere personal capacitado para la manipulación de preparados químicos con el fin de evitar accidentes con consecuencias para el usuario u otras personas. Este producto requiere indumentaria y áreas de trabajo adecuadas para la manipulación de preparados químicos con el fin de evitar accidentes con consecuencias para el usuario u otras personas. Este producto requiere personal capacitado para los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos con el fin de evitar resultados falsos positivos en los análisis posteriores con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Este producto requiere áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación con el fin de evitar resultados falsos positivos en los análisis posteriores con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Este producto requiere el uso de indumentaria de trabajo e instrumentos destinados a la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación con el fin de evitar resultados falsos positivos en los análisis posteriores con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Un resultado negativo obtenido con este producto indica que el ADN producto de la reacción de amplificación no ha sido detectado en la separación electroforética, pero no se puede excluir que el ADN esté presente en cantidad inferior al límite de detección del producto (ver apartado sobre las Características de las prestaciones en las páginas 10); en este caso el resultado sería un falso negativo. Como para cualquier otro dispositivo de diagnóstico, existe un riesgo latente de obtener resultados falsos negativos con este producto. Dicho riesgo latente no puede ser eliminado ni reducido totalmente. Este riesgo latente en situaciones particulares, puede contribuir a decisiones equivocadas también con consecuencias graves para el paciente. Sensibilidad analítica: límite de detección CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES La sensibilidad analítica de este sistema de detección, como límite de detección, permite constatar la presencia de aproximadamente 5 ng de ADN en el producto de la reacción de La sensibilidad analítica ha sido verificada utilizando como material de referencia calibrado ADN plasmídico cuya concentración inicial ha sido medida espectrofotométricamente. El ADN plasmídico ha sido asimilado con la enzima de restricción HinfI que da origen a diversos fragmentos entre los cuales uno de dimensiones de 247 bp que representa el 7,7% del ADN inicial y un fragmento de dimensiones de 75 bp que representa el 2,3% del ADN inicial. Una muestra con una concentración de 100 ng de ADN plasmídico en 10 µl ha sido utilizado en 2 repeticiones en distintas sesiones para realizar el procedimiento de detección. En todas las repeticiones de la muestra resultaron visibles, el fragmento de dimensiones de 247 bp, presente en una cantidad de 7,7 ng, y el fragmento de dimensiones de 75 bp, presente en una cantidad de 2,3 ng. SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 9/12 SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 10/12

6 Sensibilidad analítica: intervalo de separación La sensibilidad analítica de este sistema de detección, como intervalo de separación, permite disolver moléculas de ADN de dimensiones de 1000 bp a 50 bp en el producto de la reacción de La sensibilidad analítica ha sido verificada utilizando como material de referencia calibrado ADN plasmídico cuya concentración inicial ha sido medida espectrofotométricamente. El ADN plasmídico ha sido asimilado con la enzima de restricción HinfI que da origen a diversos fragmentos cuyas dimensiones se enumeran a continuación: 1380 bp, 517 bp, 459 bp, 387 bp, 247 bp, 75 bp, 65 bp, 46 bp, 22 bp. Una muestra con una concentración de 1 µg de ADN plasmídico en 10 µl ha sido utilizado en 2 repeticiones en distintas sesiones para realizar el procedimiento de detección. En todas las repeticiones de la muestra resultaron disueltos e identificables los fragmentos de dimensiones de 1380 bp a 46 bp. SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS Número de catálogo. Límites de temperatura. Código de lote. Nota bene: Los datos y resultados completos de las pruebas realizadas para evaluar las características de las prestaciones del producto están señalados en la Sección 7 del Fascículo Técnico del Producto "ELECTROPHORESIS", FTP EPH. Utilizar antes del último día del mes. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. BIBLIOGRAFÍA T. Maniatis et al. (1987) Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor, NY: chapter 6 Señal muy débil o ausente con el Marker Causas posibles Error en la colocación del gel en la cubeta electroforética. Error en la colocación de los electrodos en la cubeta electroforética o en el Alimentador. Error en la colocación del Marker en el gel. PROBLEMAS Y SOLUCIONES Soluciones Los pocillos deben encontrarse en la parte de la cubeta electroforética con el electrodo negativo (negro). Conectar los electrodos de manera correcta. Transferir cuidadosamente el Marker dentro de los pocillos de manera que se deposite sobre el fondo del pocillo. Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. Atención, consultar las instrucciones de uso. Mantener alejado de fuentes de luz. Fabricante. Degradación del Marker. Utilizar una nueva alícuota de Marker. Error de programación del Alimentador. Error en la dilución del Tampón de Electroforesis. Separación electroforética demasiado larga. Bandeja presente en el Transiluminador UV. Degradación del bromuro de etidio del gel. Controlar la diferencia de potencial programada en el Alimentador. Controlar la dilución del Tampón de Electroforesis. Interrumpir la migración cuando el colorante azul del Tampón de Carga haya alcanzado un tercio del largo del gel. Quitar el gel de la bandeja de plástico antes de transferirlo al Transiluminador UV. Volver a colorear el gel como se describe en la sección Procedimiento. La adquisición de este producto permite al comprador utilizarlo para la detección de secuencias de ácidos nucleicos amplificadas con el fin de proveer servicios de diagnóstico humano in vitro. Este derecho es otorgado sólo si el producto provisto es utilizado junto a un producto con licencia para el "Positive Control" y para la amplificación de ELITechGroup S.p.A. Por medio de la adquisición no se otorga ningún derecho general u otra licencia de tipo diferente de este derecho de uso específico. SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 11/12 SCH m_es 28/05/13 Revisión 03 Pág. 12/12