WNV ELITe MGB Kit. Reactivos para la transcripción inversa del ARN y para Amplificación Tiempo Real de cdna RTS100PLD

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1 Reactivos para la transcripción inversa del ARN y para Amplificación Tiempo Real de cdna ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCIPIO DE LA PRUEBA pág. 2 PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO pág. 3 MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 4 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 4 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 4 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 5 MUESTRAS Y CONTROLES pág. 6 PROCEDIMIENTO pág. 7 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO pág. 14 CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES pág. 15 BIBLIOGRAFÍA pág. 22 PROBLEMAS Y SOLUCIONES pág. 22 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 23 AVISO AL COMPRADOR: LICENCIA LIMITADA pág. 24 HOJA DE TRABAJO pág. 25 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sitio WEB: C El producto forma parte de una prueba de amplificación de los ácidos nucleicos para la detección y la cuantificación del ARN del flavivirus humano West Nile Virus (Linaje WNV 1a, incluyendo cepas Mediterráneo y Linaje 2) en muestras de ARN extraído de sangre entera recolectada en EDTA, líquido cefalorraquídeo, orina recolectada sin conservantes. El producto se utiliza en el diagnóstico y seguimiento de la infección de West Nile Virus, junto con los datos clínicos del paciente y los resultados de otras pruebas de laboratorio. El producto no debe ser utilizado para la detección de sangre o de tejidos u órganos para transfusiones o donaciones de órganos. PRINCIPIO DE LA PRUEBA La prueba prevé la realización de una reacción de transcripción inversa y amplificación tiempo real en microplaca con un termociclador programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia (termociclador para amplificación Tiempo Real). En cada pocillo se lleva a cabo una reacción de transcripción inversa y amplificación específica para una región del gen NS5 de WNV, que codifica para una proteína no estructural, y para una región del ARN genómico del fago MS2 (Control Interno de inhibición) utilizando directamente el ARN extraído de las muestras de prueba. La sonda con tecnología ELITe MGB específica para WNV, marcada con el fluoróforo FAM, se activa cuando hibrida con el producto específico de la reacción de amplificación para WNV. La sonda con tecnología ELITe MGB específica para el Control Interno, marcada con el fluoróforo AP525 (equivalente a VIC), se activa cuando hibrida con el producto de la reacción de amplificación para el Control Interno. La emisión de la fluorescencia aumenta con el aumento de los productos específicos de la reacción de amplificación y es medida y registrada por el aparato. La elaboración de los datos permite detectar la presencia y el título de ARN a partir de WNV en la muestra de partida. Al final de la sesión se puede realizar el análisis de la curva de disociación (melting curve) e identificar la (melting temperature) temperatura de disociación para confirmar la presencia del target correcto o identificar la presencia de mutaciones. La evaluación de la prueba ha sido realizada con equipos 7300 Real Time PCR System y 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument. En la siguiente figura se resume el mecanismo de activación y emisión de la fluorescencia de la sonda con tecnología ELITe MGB. Notar que la sonda no se hidroliza durante el ciclo de amplificación y por lo tanto se puede utilizar para el análisis de la curva de disociación cebador 5 3 Q R 3 5 Molde de ADN 3 5 sonda ELITe MGB 5 3 ADN polimerasa R 5 Fluorescencia desnaturalización Q 3 5 hibridación / detección Q R 5 extensión 3 ELITe MGB y el logotipo ELITe MGB están registrados como marcas comerciales en la Unión Europea SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 1/25 SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 2/25

2 PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS El producto provee los siguientes componentes: WNV PreMIX Una mezcla de reacción completa para la transcripción inversa y la amplificación tiempo real en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas (con el tapón de inserción BLANCO). Cada probeta contiene 270 µl de solución, suficiente para 50 reacciones. Los oligonucleótidos primers y la sonda para WNV (estabilizada por el grupo MGB, marcada con el fluoróforo FAM e inactivada por el apagador no fluorescente) son específicos para una región del gen NS5 de WNV. Los oligonucleótidos primers y la sonda para el Control Interno, (estabilizada por el grupo MGB, marcada con el fluoróforo AP525, equivalente a VIC, y con inactividad determinada por un apagador no fluorescente), son específicos para una región del ARN genómico del fago MS2. La mezcla de reacción provee también el fluoróforo AP593 (usado en el lugar del ROX o del Cy5 como referencia pasiva para la normalización de la fluorescencia. PCR MasterMix Una mezcla de reacción completa para la transcripción inversa y la amplificación tiempo real en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas (con el tapón NEUTRAL sin inserto). Cada probeta contiene 820 µl de solución, suficiente para 50 reacciones. La mezcla de reacción provee el sistema tampón, el cloruro de magnesio, los nucleótidos trifosfatos y la enzima Taq ADN polimerasa de activación térmica (hot start). RT EnzymeMix Una mezcla de reacción completa para la transcripción inversa en una solución estabilizadora, previamente dosificada en dos probetas (con el tapón NEGRO). Cada probeta contiene 20 µl de solución, suficiente para 50 reacciones. La mezcla de reacción provee las enzimas para la transcripción inversa. El producto permite efectuar 100 determinaciones, estándar y controles incluidos. MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO Componente Descripción Cantidad Clasificación y etiquetado WNV PreMIX PCR MasterMix RT EnzyMix mezcla de oligonucleótidos primers y sonda tapón BLANCO mezcla de reacción completa para la transcripción inversa y la amplificación real time tapón NEUTRAL enzimas para la transcripción inversa tapón NEGRO 2 x 270 µl - 2 x 820 µl - 2 x 20 µl - MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO - Campana de flujo laminar. - Guantes sin polvo descartables de látex o similares. - Mezclador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas y puntas estériles con filtro para aerosol o de dispensación positiva (2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Micropipetas para biología molecular de polipropileno de 1,5 ml. - Agua grado biología molecular. - Termociclador programable con sistema óptico de detección de la fluorescencia 7300 Real Time PCR System o 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument calibrado según las indicaciones del fabricante. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 3/25 Los reactivos para la extracción del ARN de las muestras a analizar, las microplacas para la amplificación y los ADN estándar de cantidad conocida no están incluidos en este producto. Para la extracción automática del ARN de las muestras a analizar, se aconseja utilizar el producto genérico «ELITe STAR 200 Extraction Kit» (ELITechGroup S.p.A., código INT011EX), kit de extracción de los ácidos nucleicos de muestras biológicas, con el instrumento «ELITE STAR» (ELITechGroup S.p.A., código INT010). En caso que sea previsto el uso de un equipo 7300 Real-Time PCR System, se aconseja utilizar el producto genérico «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas con pocillos de 0,2 ml y láminas adhesivas para la amplificación tiempo real. En caso que sea previsto el uso de un equipo 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, se aconseja utilizar el producto genérico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas con pocillos de 0,1 ml y láminas adhesivas para la amplificación tiempo real. Como control positivo de extracción y control de inhibición se requiere el empleo de producto genérico «CPE - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTRCPE), control positivo de extracción de ADN y ARN plasmídico. Si se requiere la detección y cuantificación del ARN de WNV se aconseja usar el producto «WNV ELITe Standard» (código STD100PLD), cuatro diluciones de ADN plasmídico en cantidad conocida para obtener las curvas estándar. MUESTRAS Y CONTROLES Este producto debe ser utilizado con el ARN extraído de las siguientes muestras clínicas: sangre entera recolectada en EDTA, líquico cefalorraquídeo (líquido), orina recolectada sin conservantes. Este producto debe ser utilizado agregando directamente el ARN extraído (hasta 300 ng) a la reacción de transcripción inversa y amplificación real time (metódico one step). Sangre entera recolectada en EDTA Las muestras de sangre entera destinadas a la extracción de los ácido nucleicos deben ser recolectadas en EDTA según las indicaciones del laboratorio, transportadas a +2º / +8 Cº y conservadas a +2º / +8 Cº por un máximo de tres días, de lo contrario deben ser congeladas y conservadas a -20 Cº por un máximo de treinta días o bien a -70Cº por tiempos más prolongados. Se aconseja subdividir en diferentes alícuotas las muestras que deben conservase conservarlas congeladas para no someterlas a repetidos ciclos de congelación / descongelación. Líquido cefalorraquídeo Las muestras de líquido cefalorraquídeo destinadas a la extracción de los ácidos nucleicos deben ser recolectadas según las indicaciones del laboratorio evitando la contaminación con la sangre del paciente, transportadas a +2 / +8 Cº y conservadas a +2 / +8 Cº por un máximo de cuatro horas, de lo contrario deben congelarse y conservarse a -20 Cº por un máximo de treinta días o bien a -70 Cº por tiempos más prolongados. Se aconseja dividir en diferentes alícuotas las muestras para conservarlas congeladas y no someterlas a repetidos ciclos de congelación / descongelación. Orina recolectada sin conservantes Las muestras de orina destinadas a la extracción de los ácidos nucleicos deben ser recolectadas en recipientes sin conservantes según las indicaciones del laboratorio, transportadas a temperatura ambiente (+ 18 / +25Cº) y conservadas a temperatura ambiente (+ 18 / + 25Cº) por un máximo de cuatro horas, de lo contrario deben congelarse y conservarse a -20Cº por un máximo de treinta días o bien a -70Cº por tiempos más prolongados. La congelación de las muestras de orina frecuentemente causa la formación de precipitados que pueden interferir en las fases siguientes del método: para la extracción utilizar sólo el sobrenadante. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 4/25

3 Nota: cuando se realiza la extracción de ARN de muestras de sangre entera recolectada en EDTA, líquico cefalorraquídeo (líquido), orina recolectada sin conservantes usando con el kit «ELITe STAR 200 Extraction Kit» y el instrumento «ELITe STAR» (ELITE STAR System), con versión de software (o versiones posteriores equivalentes), utilizar el protocolo de extracción "UUNI_E100S200_ELI", que emplea 200 µl de muestra y eluye el ARN extraído en 100 µl. Las muestras en las probetas primarias pueden cargarse directamente en el «ELITE STAR». Es necesario siempre un volumen mínimo de µl para cada muestra según la clase de tubo utilizado. Agregar 200 µl de CPE en los tubos de Proteinase-Carrier, como se indica en el manual del kit de extracción. Para conocer detalles sobre el procedimiento de extracción, seguir atentamente las indicaciones del Manual de instrucciones de uso del kit. Sustancias interferentes El ARN extraído de la muestra de partida no debe contener heparina, hemoglobina, etanol o 2- propanol, para evitar fenómenos de inhibición y la aparición de frecuentes resultados no válidos. Cantitades de ARN mayor que 300 ng por reacción pueden inhibir la reacción de la transcripción inversa y la amplificación tiempo real. Cantitades elevadas de ADN genómico humano en el ARN extraído de la muestra pueden inhibir la reacción de la transcripción inversa y la amplificación tiempo real. No son disponibles datos referidos a eventuales fenómenos de inhibición por parte de fármacos antibióticos, antivirales, quimioterápicos o inmunosupresores. Controles de amplificación Es absolutamente necesario convalidar cada una de las sesiones de amplificación preparando una reacción de control negativo y una reacción de control positivo. Para el control negativo utilizar agua bidestilada estéril (no provista en el producto) agregándola a la reacción en lugar del ARN obtenido de la muestra. Para el control positivo utilizar el producto «WNV ELITe Standard». Controles de calidad Se aconseja confirmar todo el procedimiento de análisis de cada una de las sesiones, extracción, transcripción inversa y amplificación, utilizando una muestra negativa y una muestra positiva ya testadas o del material de referencia calibrado. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Este producto es para uso exclusivo in vitro. Advertencias y precauciones generales Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si pudiesen transmitir agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni aerosol. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121C durante una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales utilizados para realizar la prueba como si fuesen potencialmente infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni aerosol. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material combustible monouso debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 5/25 Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos / la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el producto antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el producto durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del producto. Utilizar sólo los reactivos presentes en el producto y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de productos de otros fabricantes. Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos, requieren personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de amplificación. Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / detección de los productos de amplificación. Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de productos de amplificación. Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / detección de productos de amplificación al área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar puntas con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos deben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los componentes WNV PreMix La WNV PreMix debe ser conservada en lugar oscuro a -20C. La WNV PreMix puede ser congelado y descongelado por un máximo de cinco veces. Otros ciclos de congelación / descongelación pueden provocar una pérdida de las prestaciones del producto. La WNV PreMix no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. PCR MasterMix La PCR MasterMix debe ser conservada en lugar oscuro a -20C. La PCR MasterMix puede ser congelado y descongelado por un máximo de cinco veces. Otros ciclos de congelación / descongelación pueden provocar una pérdida de las prestaciones del producto. La PCR MasterMix no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S 23-24/25. No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos y la piel. RT EnzymeMix L'RT EnzymeMix debe ser conservada a -20C. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 6/25

4 L'RT EnzymeMix no debe ser expuesto a temperaturas superiores a -20C durante más de 10 minutos. L' RT EnzymeMix no presenta frases de riesgo (R) y presenta los siguientes consejos de prudencia (S): S 23-24/25. No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Evitar el contacto con los ojos y la piel. PROCEDIMIENTO Programación de la sesión de amplificación real time (A realizarse en el área de amplificación / visualización de los productos de amplificación) Si se utiliza un equipo 7300 Real-Time PCR System: Antes de iniciar la sesión, tomando como referencia la documentación del equipo, es necesario: - encender el thermal cycler para real time, encender el computador de control, iniciar el software destinado y abrir una sesión "absolute quantification"; - programar (Detector Manager) el "detector" para la sonda para WNV con el "reporter" = "FAM" y el "quencher" = "none" (no fluorescente) y denominarlo WNV ; - programar (Detector Manager) el "detector" para la sonda para MS2 con el "reporter" = "VIC" y el "quencher" = "none" (no fluorescente) y denominarlo IC ; - para cada pocillo en uso de la microplaca, programar (Well Inspector) los "detector" (tipo de fluorescencia a medir), el "passive reference" = "ROX" (se usa AP593 en lugar del ROX, normalización de la fluorescencia medida) y el tipo de reacción (muestra, control negativo de amplificación, control positivo de amplificación o estándar con la correspondiente cantidad conocida). Completar el Plan de trabajo adjunto al final de este manual de instrucciones de uso transcribiendo estas informaciones o bien imprimir la organización de la microplaca. El Plan de trabajo deberá seguirse con atención durante la transferencia de la mezcla de reacción y de las muestras a los pocillos. Nota: para la determinación del título del ADNc en la muestra de partida es necesario preparar una serie de reacciones con los Q - PCR Standard (10 5 copias, 10 4 copias, 10 3 copias, 10 2 copias) para obtener las Curvas estándar. Con referencia a la documentación del instrumento, programar en el software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile), los parámetros del ciclo térmico: - agregar, en la fase de amplificación (Add Step), el paso de extensión a 72ºC; Nota: la adquisición de la fluorescencia (Instruments > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) debe permanecer programada en el paso de hibridación a 60ºC. - modificar los tiempos, como se indica en la siguiente tabla Ciclo térmico ; - programar un número de 45 ciclos; - programar el valor de volumen para la simulación software de la transferencia térmica en la reacción ("Sample volume") a 30 µl; - opcional: agregar la fase de disociación (Add Dissociation Stage) y programar la temperatura en un rango de 40C a 80C. Ciclo térmico Fase Temperaturas Tiempos Descontaminación 50C 20 min. Desnaturalización inicial 94C 5 min. Amplificación y detección (45 ciclos) Disociación(opcional) 94C 10 seg. 60Cº (adquisición de la fluorescencia) 30 seg. 72C 20 seg. 95C 15 seg. 40C 30 seg. 80C 15 seg. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 7/25 Si se utiliza un equipo 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Antes de iniciar la sesión, tomando como referencia la documentación del equipo, es necesario: - encender el thermal cycler para real time, encender el computador de control, iniciar el software destinado y abrir una sesión "absolute quantification" y y programar Run mode: Fast 7500 ; - programar (Detector Manager) el "detector" para la sonda para WNV con el "reporter" = "FAM" y el "quencher" = "none" (no fluorescente) y denominarlo WNV ; - programar (Detector Manager) el "detector" para la sonda para MS2 con el "reporter" = "VIC" y el "quencher" = "none" (no fluorescente) y denominarlo IC ; - para cada pocillo en uso de la microplaca, programar (Well Inspector) los "detector" (tipo de fluorescencia a medir), el "passive reference" = "CY5" (se usa AP593 en lugar del Cy5, normalización de la fluorescencia medida) y el tipo de reacción (muestra, control negativo de amplificación, control positivo de amplificación o estándar con la correspondiente cantidad conocida). Completar el Plan de trabajo adjunto al final de este manual de instrucciones de uso transcribiendo estas informaciones o bien imprimir la organización de la microplaca. El Plan de trabajo deberá seguirse con atención durante la transferencia de la mezcla de reacción y de las muestras a los pocillos. Nota: para la determinación del título del ARN en la muestra de partida es necesario preparar una serie de reacciones con los Q - PCR Standard (10 5 copias, 10 4 copias, 10 3 copias, 10 2 copias) para obtener las Curvas estándar. Con referencia a la documentación del instrumento, programar en el software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile), los parámetros del ciclo térmico: - agregar, en la fase de amplificación (Add Step), el paso de extensión a 72ºC; Nota: la adquisición de la fluorescencia (Instruments > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) debe permanecer programada en el paso de hibridación a 60ºC. - modificar los tiempos, como se indica en la siguiente tabla Ciclo térmico ; - programar un número de 45 ciclos; - programar el valor de volumen para la simulación software de la transferencia térmica en la reacción ("Sample volume") a 30 µl; - opcional: agregar la fase de disociación (Add Dissociation Stage) y programar la temperatura en un rango de 40C a 80C. Ciclo térmico Fase Temperaturas Tiempos Descontaminación 50C 20 min. Desnaturalización inicial 94C 5 min. Amplificación y detección (45 ciclos) Disociación(opcional) 94C 10 seg. 60Cº (adquisición de la fluorescencia) 30 seg. 72C 20 seg. 95C 15 seg. 40C 1 min. 40C 15 seg. 60C 15 seg. Preparación de la amplificación (A realizarse en el área de extracción / preparación de la reacción de amplificación) Antes de iniciar la sesión es necesario: - extraer y descongelar a temperatura ambiente (+18/25C ) las probetas con las muestras a analizar. Agitar las probetas con vortex 5 segundos, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer y descongelar a temperatura ambiente (+18/25C ) 30 minutos las probetas de WNV PreMix (tapón BLANCO) necesarias para la sesión teniendo presente que el contenido de cada una es suficiente para preparar 50 reacciones. Agitar las probetas con vortex por 10 segundos 3 veces, SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 8/25

5 centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer y descongelar a temperatura ambiente (+18/25C ) 30 minutos las probetas de PCR MasterMix (tapón NEUTRAL) necesarias para la sesión teniendo presente que el contenido de cada una es suficiente para preparar 50 reacciones. Agitar las probetas con vortex por 10 segundos 3 veces, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer en el momento de uso las probetas de RT EnzymeMix (tapón NEGRO) necesarias para la sesión teniendo presente que el contenido de cada una es suficiente para preparar 50 reacciones. Centrifugar las probetas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; Nota: L'RT EnzymeMix no debe ser expuesto a temperaturas superiores a -20C durante más de 10 minutos. - extraer y descongelar a temperatura ambiente (+18/25C ) 30 minutos las probetas de WNV Q-PCR Standard. Agitar con vortex 10 segundos las probetas, centrifugarlas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo; - extraer la Amplification microplate que será utilizada en la sesión, prestando atención de manejarla con guantes sin polvo y de no dañar los pocillos. - extraer l'amplification Sealing Sheet que será utilizada en la sesión, prestando atención de manejarla con guantes sin polvo y de no dañarlo. - extraer dos microtubos de polipropileno por biología molecular de 1,5 ml (no incluidos en el kit): uno para la mezcla de la reacción completa WNV Q - PCR Mix y marcarlos de forma reconocible con un marcador permanente; - preparan las dos mezclas completas de la reacción WNV Q - PCR Mix de acuerdo con el número de muestras a analizar como se describe en la tabla presentada a continuación. Nota: los volúmenes indicados en la tabla son suficientes para la preparación de las reacciones de transcripción inversa y amplificación real time requeridos para las muestras a analizar, el control negativo de amplificación, cuatro Q - PCR Standard, más un margen de seguridad adecuado. Número de muestras PreMix PCR MasterMix RT EnzymeMix 1 5 µl 15 µl 0,3 µl N N x 5 µl N x 15 µl N x 0,3 µl 4. Transferir, depositándolos cuidadosamente en la mezcla de reacción, 10 µl de WNV Q - PCR Standard 10 2 en el correspondiente pocillo de la Amplification microplate como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. Mezclar enérgicamente la standard pipeteando WNV Q - PCR Standard 10 2 tres veces en la mezcla de reacción. Proceder del igual manera con los los otros WNV Q - PCR Standard 10 3, 10 4, Sellar cuidadosamente la Amplification microplate con la Amplification Sealing Sheet. 6. Transferir la Amplification microplate en el thermal cycler para real time ubicado en el área de amplificación / detección de los productos de amplificación e iniciar el ciclo térmico de amplificación, guardando la programación de la sesión con una identificación unívoca y reconocible (por ej. año-mesdía- BCR-MS2-EGSpA ). Nota: Al finalizar el ciclo térmico, se debe quitar la Amplification microplate con los productos de reacción del equipo y se debe eliminar para no generar contaminaciones ambientales. Nunca levantar la Amplification Sealing Sheet de la Amplification microplate para evitar que se derramen los productos de reacción. La siguiente figura muestra un resumen de cómo configurar las reacciones de amplificación para el análisis cuantitativo de 12 muestras. 1) agregar 20 µl de Q-PCR Mix 2) agregar 10 µl de ARN extraído - Prepare la mezcla de reacción completa WNV Q - PCR Mix transferir en el tubo dedicó los volúmenes calculados de los tres componentes. - Agitar con vortex 10 segundos a baja velocidad por tres veces, centrifugar las probetas durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerlas en hielo. Nota: Las mezclas de reacción preparadas deben ser usados en un plazo de 30 minutos. Las mezclas de reacción preparadas no se pueden conservar. Preparar las reacciones como se describe a continuación. 1. Transferir, depositándolos cuidadosamente en el fondo sin crear burbujas, 20 µl de mezcla de reacción WNV Q - PCR Mix en los pocillos de la Amplification microplate como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. 2. Transferir, depositándolos cuidadosamente en la mezcla de reacción, 10 µl de ARN extraído de la primera muestra en el correspondiente pocillo de la Amplification microplate como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. Mezclar enérgicamente la muestra pipeteando tres veces el ARN extraído en la mezcla de reacción. Prestar atención a no crear burbujas. Proceder de igual manera con los otros ARN extraídos. 3. Transferir, depositándolos cuidadosamente en la mezcla de reacción, 10 µl de Agua para Biología Molecular (no provista en el producto) en el correspondiente pocillo de la Amplification microplate de la Amplification microplate como fue establecido previamente en el Plan de trabajo. Mezclar bien el control negativo pipeteando tres veces Agua bidestilada estéril en la mezcla de reacción. Prestar atención a no crear burbujas. 3) agregar 10 µl de Control Negativo 4) agregar 10 µl de Q-PCR Standard SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 9/25 SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 10/25

6 Análisis dos resultados Los valores registrados de la fluorescencia emitida por la sonda específica para WNV (detector FAM "WNV ) y por la sonda específica para el Control Interno (detector VIC "IC") en las reacciones de amplificación deben ser analizados con el software del equipo. Antes de efectuar el análisis, tomando como referencia la documentación del equipo, es necesario: - programar manualmente el intervalo de cálculo del Nivel de fluorescencia de fondo (Baseline) desde el ciclo 6 al ciclo 15*; *Nota: En caso de una muestra positiva con alto título de WNV, la fluorescencia FAM de la sonda específica para WNV puede comenzar a crecer antes del 15º ciclo. En este caso el intervalo de cálculo del Nivel de fluorescencia de fondo debe ser establecido desde el ciclo 6 al ciclo en el cual la fluorescencia FAM comienza a crecer. Si se utiliza un equipo 7300 Real-Time PCR System: - programar manualmente el Umbral (Threshold) para el detector FAM "WNV" en 0,1; - programar manualmente el Umbral (Threshold) para el detector VIC "CI" en 0,05. Si se utiliza un equipo 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - programar manualmente el Umbral (Threshold) para el detector FAM "WNV" en 0,1; - programar manualmente el Umbral (Threshold) para el detector VIC "CI" en 0,1. Los valores de fluorescencia emitidos por las sondas específicas en las reacciones de amplificación y el valor Umbral de fluorescencia permiten determinar el Ciclo Umbral (Threshold cycle, Ct), el ciclo en el cual se ha alcanzado el valor Umbral de fluorescencia. Curva estándar Los valores de Ct para WNV en las reacciones de amplificación de los cuatro Q - PCR Standard se utilizan para calcular la Curva estándar (Results > Standard Curve) de la sesión de amplificación y para confirmar la amplificación y la detección como se describe en la siguiente tabla: Reacción WNV - Q - PCR Standard 10 5 detector FAM "WNV" Resultado de la prueba Amplificación / Detección Ct 25 POSITIVO CORRECTA Curva estándar detector FAM "WNV" Intervalo de aceptación Amplificación / Detección Coeficiente de correlación (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTA Si el resultado de las reacciones de amplificación del Q - PCR Standard 10 5 es Ct > 25 o Ct No determinado (Undetermined), o si el valor del Coeficiente de correlación (R2) no está contenido dentro de los límites, no ha sido detectada correctamente la presencia de ADN blanco. Se han verificado problemas en la fase de amplificación o en la de detección (preparación incorrecta de la mezcla de reacción, dispensación incorrecta de la mezcla de reacción o de los estándar, degradación de la sonda o de los estándar, programación incorrecta de la posición de los estándar, programación incorrecta del ciclo térmico, ver "Problemas y soluciones") que pueden provocar resultados incorrectos. La sesión no es válida y se debe repetir a partir de la fase de amplificación. Control negativo En las reacciones WNV de amplificación del Control negativo, los valores de Ct de las sondas específicas para WNV (Results > Report) se utiliza para confirmar la amplificación y la detección como se describe en la tabla siguiente: Reacción Control negativo WNV (FAM "WNV") Resultado de la prueba Amplificación Ct No determinado NEGATIVO CORRECTA SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 11/25 Si el resultado de las reacciones de amplificación del Control negativo es distinto de Ct No determinado (Undetermined) para WNV, ha sido detectada la presencia de ARN blanco. Se han verificado problemas en la fase de amplificación (contaminación, ver "Problemas y soluciones") que pueden causar resultados incorrectos y falsos positivos. La sesión no es válida y se debe repetir a partir de la fase de amplificación. En las reacciones WNV de amplificación de cada muestra, los valores de Ct para WNV son utilizados para detectar y cuantificar la presencia de ARN blanco, mientras que los valores de Ct para el Control Interno son utilizados para validar la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección. Nota: Verificar con el software del equipo (Results, Amplification plot, delta Rn vs Cycle) que el Ct sea determinado por un aumento rápido y regular de los valores de fluorescencia y no por fenómenos de pico o aumento de la señal de fondo (fondo irregular o alto). Este producto tiene la capacidad de detectar una cantidad mínima de 450 a 200 copias de WNV ARN por mililitro, correspondientes a los genomas Equivalentes por ml (Límite de detección del producto, véanse las Características de las prestaciones). Los resultados como Ct de las reacciones de amplificación de cada muestra (Results > Report) son utilizados como se describe en la siguiente tabla: detector FAM "WNV" Ct No determinado Ct Determinado Reacción muestra detector VIC "IC" Ct > 35 o Ct No determinado Idoneidad de la muestra Resultado de la prueba ARN de WNV no idónea no válido - Ct 35 idónea válido, negativo Ct > 35 o Ct No determinado NO DETECTADO idónea válido, positivo DETECTADO Ct 35 idónea válido, positivo DETECTADO Si el resultado de la reacción de amplificación de una muestra es Ct No determinado para WNV y Ct > 35 o Ct No determinado para el Control Interno, no ha sido posible detectar de manera eficiente el ARN del Control Interno. En este caso, se han verificado problemas durante la fase de retrotranscripción y amplificación o durante la fase de extracción (degradación del ARN del Control Interno, perdidas del ARN durante la extracción o presencia de inhibidores en la extracción, véanse Problemas y soluciones) que pueden provocar resultados incorrectos y falsos negativos. La muestra no es apta, la prueba no es válida y debe repetirse a partir de la extracción de una nueva muestra. Si el resultado de la reacción de amplificación de una muestra es Ct No determinado para WNV y Ct 35 para el Control Interno, el ARN de WNV no ha sido detectado en el ARN extraído de la muestra, pero no se puede excluir que el ARN de WNV esté presente con un título inferior al límite de detección del producto (véanse Características de las prestaciones). En este caso el resultado sería un falso negativo. Los resultados obtenidos con esta prueba deben ser interpretados considerando todos los datos clínicos y los resultados de los otros exámenes de laboratorio correspondientes al paciente. Nota: Cuando en la reacción de amplificación correspondiente a una muestra ha sido detectada la presencia de ARN de WNV, la amplificación del Control Interno puede dar como resultado un Ct > 35 o Ct No determinado. En efecto, la reacción de amplificación de baja eficiencia del Control Interno puede ser anulada por competición de la reacción de amplificación de alta eficiencia de WNV. En este caso, la muestra es apta de todas maneras y el resultado positivo de la prueba es válido. Los valores de Ct para WNV en las reacciones de amplificación de cada muestra y la Curva estándar (Standard Curve) (Results > Standard Curve) de la sesión de amplificación son utilizados para calcular la Cantidad (Quantity) de ARN blanco presente en las reacciones de amplificación correspondientes a las muestras. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 12/25

7 Este producto se probó con muestras en la concentración desde a 316 copias de WNV ARN por mililitro, correspondientes a los genomas Equivalentes por ml (Intervalo lineal de medición del producto, véanse las Características de las prestaciones). Los resultados (Cantidad) de cada muestra (Results > Report) son utilizados para calcular los genomas Equivalentes (geq) de CMV presentes en la muestra de partida (Nc) según esta fórmula: Ve x Cantidad Nc (geq / ml) = Vc x Va x Ep Donde: Vc es el volumen de la muestra usado en la extracción en relación con la unidad de medida requerida; Ep es la eficiencia del procedimiento, extracción y amplificación, expresada en decimales; Ve es el volumen total obtenido de la extracción expresado en µl; Va es el volumen del producto de extracción usado en la reacción de amplificación expresado en µl; Cantidad es el resultado de la reacción de amplificación correspondiente a la muestra expresado en geq por reacción. Cuando se utilizan muestras de sangre entera recolectada en EDTA y el sistema de extracción «ELITe STAR» y se desea obtener el resultado expresado en geq / ml, la fórmula es: Fórmula simplificada para sangre entera y «ELITe STAR» Nc (geq / ml) = 66,7 x Cantidad Cuando se utilizan muestras de líquido cefalorraquídeo o orina y el sistema de extracción «ELITe STAR» y se desea obtener el resultado expresado en geq / ml, la fórmula es: Fórmula simplificada para líquido cefalorraquídeo o orina y «ELITe STAR» Nc (geq / ml) = 50 x Cantidad LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Utilizar con este producto sólo el ARN extraído de las siguientes muestras clínicas: sangre entera recolectada en EDTA, líquido cefalorraquídeo, orina. No utilizar con este producto ARN extraído de muestras heparinizadas: la heparina inhibe las reacciones de trascripción inversa y de amplificación de los ácidos nucleicos y causa resultados no válidos. No utilizar con este producto ARN contaminado con hemoglobina, etanol o 2-propanol: estas sustancias pueden inhibir las reacciones de transcripción inversa y de amplificación de los ácidos nucleicos y pueden provocar resultados no válidos. Cantitades de ARN mayor que 300 ng por reacción pueden inhibir la reacción de la transcripción inversa y la amplificación tiempo real de los ácidos nucleicos. No utilizar con este producto ARN extraído con cantitades elevadas de ADN genómico humano que pueden inhibir la reacción de la transcripción inversa y la amplificación real time de los ácidos nucleicos y pueden provocar resultados no válidos. No hay datos disponibles referidos a las prestaciones de este producto con el ARN extraído de las siguientes muestras clínicas: plasma recolectado en EDTA. No son disponibles datos referidos a eventuales fenómenos de inhibición por parte de fármacos antibióticos, antivirales, quimioterápicos o inmunosupresores. Los resultados obtenidos con este producto dependen de la correcta recolección, transporte, conservación y preparación de las muestras; para evitar resultados erróneos es necesario tener una particular atención a estas fases y seguir atentamente las instrucciones provistas con los productos para la extracción de los ácidos nucleicos. La metodología de amplificación anidads de los ácidos nucleicos utilizada en este producto, debido a su alta sensibilidad analítica, está sujeta a contaminación por parte de muestras clínicas positivas para WNV, de los controles positivos y de los mismos productos de la reacción de amplificación. Las contaminaciones llevan a resultados falsos positivos. Las modalidades de realización del producto son capaces de reducir las contaminaciones; sin embargo, estos fenómenos pueden evitarse sólo con una buena práctica de las técnicas de laboratorio y siguiendo atentamente las instrucciones provistas en este manual. Este producto requiere personal instruido para la manipulación de muestras biológicas capaces de transmitir infecciones y de preparados químicos clasificados como peligrosos, para evitar accidentes con consecuencias potencialmente graves para el usuario u otras personas. Este producto requiere indumentaria y áreas de trabajo adecuadas para la manipulación de muestras biológicas capaces de transmitir infecciones y de preparados químicos clasificados como peligrosos, para evitar accidentes con consecuencias potencialmente graves para el usuario u otras personas. Este producto requiere personal instruido para los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos para evitar resultados incorrectos. Este producto requiere áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación para evitar resultados falsos positivos. Este producto requiere el uso de indumentaria de trabajo e instrumentos destinados a la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de los productos de amplificación para evitar resultados falsos positivos. Un resultado negativo obtenido con este producto indica que los ARN WNV no han sido detectados en el producto de la transcripción inversa obtenido del ARN extraído de la muestra, pero no se puede excluir que los ARN WNV estén presentes con un título inferior al límite de detección del producto (límite de detección del producto, ver apartado sobre las Características de las prestaciones ); en este caso el resultado sería un falso negativo. Un resultado no válido obtenido con este producto indica que no fue posible detectar de manera eficiente el ARN del Control Interno; en este caso el análisis de la muestra debe ser repetido de la extracción con posibles retrasos en la obtención del resultado. Cualquier polimorfismos en regiones del genoma del paciente en el que se hibridan oligonucleótidos primers y la sonda del producto pueden afectar la detección y cuantificación del ARN de WNV. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 13/25 SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 14/25

8 Como para cualquier otro dispositivo de diagnóstico, los resultados obtenidos con este producto deben ser interpretados considerando todos los datos clínicos y otros exámenes de laboratorio correspondientes al paciente. Como para cualquier otro dispositivo de diagnóstico, existe un riesgo latente de obtener resultados no válidos, falsos positivos y falsos negativos con este producto. Dicho riesgo latente no puede ser eliminado ni reducido totalmente. Este riesgo latente en situaciones particulares, puede contribuir a decisiones equivocadas también con consecuencias potencialmente graves para el paciente. Límite de detección CARACTERÍSTICAS DE LAS PRESTACIONES El límite de detección de la prueba se determinó utilizando un panel de diluciones de WNV con sangre entera recolectada en EDTA. El panel consiste en sangre entera negativo por ARN de WNV positivizado con material de referencia calibrado y certificado QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) del (cepa NY99). El panel consiste en concentración de 562 copias / ml a 10 copias / ml. Cada muestra del panel fue utilizado en 24 repeticiónes para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. El análisis estadístico se realizó con la regresión Probit. El límite de detección se definió como la concentración a la que la probabilidad de obtener un resultado positivo es del 95%. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Límite de detección 95% positividad Límite de detección en Sangre entera con «ELITe STAR» Intervalo de confianza del 95% Límite superior 447 copias / ml 310 copias / ml 798 copias / ml El límite de detección de la prueba se determinó utilizando un panel de diluciones de WNV con orina recolectada sin conservantes. Los paneles consisten en Orina negativa por ARN de WNV positivizada con material de referencia calibrado y certificado QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) del (cepa NY99) y linaje 2 (cepa Heja). Los paneles consisten en concentración de 316 copias / ml a 10 copias / ml. Cada muestra del panel fue utilizado en 24 repeticiónes para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. El análisis estadístico se realizó con la regresión Probit. El límite de detección se definió como la concentración a la que la probabilidad de obtener un resultado positivo es del 95%. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Límite de detección 95% positividad Límite de detección 95% positividad Límite de detección en Orina con «ELITe STAR» Intervalo de confianza del 95% Límite superior 318 copias / ml 228 copias / ml 554 copias / ml Límite de detección WNV linaje 2 en Orina con «ELITe STAR» Intervalo de confianza del 95% Límite superior 282 copias / ml 188 copias / ml 545 copias / ml El límite de detección de la prueba se determinó utilizando un panel de diluciones de WNV con líquido cefalorraquídeo. El panel consiste en líquido cefalorraquídeo negativo por ARN de WNV positivizado con material de referencia calibrado y certificado QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) del (cepa NY99). El panel consiste en concentración de 316 copias / ml a 10 copias / ml. Cada muestra del panel fue utilizado en 24 repeticiónes para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. El análisis estadístico se realizó con la regresión Probit. El límite de detección se definió como la concentración a la que la probabilidad de obtener un resultado positivo es del 95%. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 15/25 Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Límite de detección 95% positividad Intervalo lineal de medición Límite de detección en Sangre entera con «ELITe STAR» Intervalo de confianza del 95% Límite superior 201 copias / ml 145 copias / ml 345 copias / ml El intervalo lineal de medición de la prueba de WNV con ARN total se determinó utilizando tres paneles de diluciones de WNV en sangre entera, orina y líquido cefalorraquídeo. Los paneles consisten en matrices negativas para WNV ARN positivizadas con material de referencia calibrados y certificados QCMD 2010 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) del (cepa NY99) y el linaje 2 (cepa Heja). Los paneles consisten en concentración de copias / ml a 316 copias / ml. Cada muestra del panel fue utilizado en 9 repeticiónes para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. El análisis de los datos obtenidos, realizadas por regresión lineal, demostrando que la prueba tiene una respuesta lineal para todos los puntos del panel (cuadrado del coeficiente de correlación superior a 0,99). Los resultados finales se resumen en las siguientes tablas. Intervalo lineal de medición en Sangre entera con «ELITe STAR» Límite superior (testado) 447 copias / ml copias / ml Intervalo lineal de medición en Orina con «ELITe STAR» Límite superior (testado) 318 copias / ml copias / ml Intervalo lineal de medición WNV linaje 2 en Orina con «ELITe STAR» Límite superior (testado) 316 copias / ml copias / ml Intervalo lineal de medición en Líquido cefalorraquídeo con «ELITe STAR» Límite superior (testado) 316 copias / ml copias / ml Nota: En el caso de la sangre entera recolectada en EDTA y orina positivizado con como el límite inferior de la medición lineal se ha impuesto sobre el valor del límite de detección. Precisión y Exactitud La precisión de la prueba, como variabilidad de los resultados obtenidos en una misma sesión de amplificación con 9 repeticiones de una muestra, ha permitido obtener un Coeficiente de Variación porcentual (CV %) de los valores de Ct y como la desviación estándar (DE) de los resultados expresados en log copias / ml para las concentraciones de WNV en el rango de medición lineal de copias / ml a 316 copias / ml. Los resultados se resumen en las siguientes tablas. en Sangre entera Precisión: CV% del Ct en Orina WNV linaje 2 en Orina en líquido cefalorraquídeo 6,0 Log copias / ml 0,43 1,16 0,81 0,98 5,0 Log copias / ml 0,30 1,25 0,73 0,50 4,0 Log copias / ml 0,68 1,09 1,02 0,71 3,0 Log copias / ml 0,76 2,18 1,23 0,56 2,5 Log copias / ml 0,97 2,82 2,71 1,01 SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 16/25

9 en Sangre entera Precisión: DE del Log copias / ml en Orina WNV linaje 2 en Orina en líquido cefalorraquídeo 6,0 Log copias / ml 0,15 0,09 0,06 0,07 5,0 Log copias / ml 0,10 0,11 0,06 0,04 4,0 Log copias / ml 0,23 0,11 0,10 0,07 3,0 Log copias / ml 0,26 0,24 0,13 0,06 2,5 Log copias / ml 0,33 0,32 0,31 0,11 La exactitud de la prueba, como diferencia entre el promedio de los resultados obtenidos en una misma sesión de amplificación con 9 repeticiones de una muestra y el valor teórico de la concentración de la muestra, se evaluó como una desviación del valor teórico del valor medio medido expresado en Log copias / ml para las concentraciones de WNV en el intervalo de medición lineal de copias / ml a 316 copias / ml. Los resultados se resumen en las siguientes tablas. Exactitud: desviación della Cuantificación (Log copias / ml) del valor teórico en Sangre entera en Orina WNV linaje 2 en Orina en líquido cefalorraquídeo 6,0 Log copias / ml 0,30 0,43 0,08 0,50 5,0 Log copias / ml 0,47 0,41 0,04 0,42 4,0 Log copias / ml 0,28 0,36 0,02 0,37 3,0 Log copias / ml 0,48 0,32 0,06 0,49 2,5 Log copias / ml 0,29 0,08 0,03 0,58 La precisión y la exactitud han sido determinadas utilizando los datos obtenidos en las pruebas para el estudio del intervalo de medición lineal. Reproducibilidad con panel por proficiency test La reproducibilidad de los resultados de la prueba en comparación con los resultados obtenidos por otros métodos en otros laboratorios se ha verificado mediante el panel por proficiency test QCMD 2013 West Nile Virus (RNA) EQA (Qnostics Ltd, Reino Unido). Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Panel por Proficiency Test con «ELITe STAR» Muestra Patógeno, matriz Resultado esperado Positivas / Repeticiones Promedio Ct WNV13-01 WNV NY99, linaje 1a Frecuentemente detectado 2 / 2 8,28 WNV13-02 WNV NY99, linaje 1a Frecuentemente detectado 2 / 2 7,17 WNV13-03 WNV NY99, linaje 1a Frecuentemente detectado 2 / 2 5,92 WNV13-04 WNV NY99, linaje 1a Frecuentemente detectado 2 / 2 5,99 WNV13-05 WNV NY99, linaje 1a Detectado 2 / 2 4,97 WNV13-06 WNV NY99, linaje 1a Detectado 2 / 2 3,95 WNV13-07 WNV NY99, linaje 2 Frecuentemente detectado 2 / 2 8,12 WNV13-08 WNV NY99, linaje 2 Frecuentemente detectado 2 / 2 7,10 WNV13-09 WNV NY99, linaje 2 Frecuentemente detectado 2 / 2 7,60 WNV13-10 flavivirus non-wnv Negativo 0 / 2 - WNV13-11 flavivirus non-wnv Negativo 0 / 2 - WNV13-12 VTM Negativo Negativo 0 / 2 - Todas las muestras han sido detectadas correctamente. La muestra WNV13-10 que contiene virus de la Encefalitis japonesa, el Dengue virus 1, el Dengue virus 2, el Dengue virus 4 y la muestra WNV13-11 que contiene virus 17D contra la Fiebre Amarilla, el Dengue virus 3, el Dengue virus 4, el virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas, son resultados negativos. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 17/25 Eficiencia de la detección y cuantificación en distintos genotipos La eficiencia de la detección y cuantificación en distintos genotipos ha sido evaluada confrontando las secuencias con bases de datos nucleotídicas. El análisis de las regiones elegidas para la hibridación de los oligonucleótidos primers y de la sonda fluorescente sobre la alineación de las secuencias disponibles en la base de datos del gen NS5 de WNV, linaje 1a y linaje 2 ha demostrado su conservación y la ausencia de mutaciones significativas. La eficiencia de la detección y cuantificación en distintos genotipos ha sido evaluada utilizando una construcción plásmidica que contiene la región amplificada de cepa mediterránea Ita09. La construcción plasmídica que contiene la región amplificada de cepa mediterránea Ita09 (ENA accession number GU011992) se cuantificó mediante la lectura de espectrofotómetro y ha sido diluido en las concentraciones de , , 1.000, 100 y 10 copias por reacción. Cada muestra ha sido utilizada en triplicado con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Eficiencia de detección y cuantificación con cepa Ita09 Concentración teórica Promedio de los resultados Positivas / Repeticiones Log copias / reacción Log copias / reacción 5,00 3 / 3 5,11 4,00 3 / 3 3,98 3,00 3 / 3 2,94 2,00 3 / 3 2,06 La eficiencia de la detección y cuantificación de diferentes genotipos fué verificada mediante el análisis de material de referencia positivo certificad para y linaje 2 de Istituto Superiore di Sanità (ISS, Italia). Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Eficiencia de detección y cuantificación con material de certificado ISS Concentración teórica Positivas / Promedio de los resultados Log copias / reacción Repeticiones Log copias / reacción WNV ARN ISS0213 (linaje 1a) 3,176 SI 3,371 WNV ARN ISS0411 (linaje 2) 3,000 3,698 SI 3,764 Marcadores potencialmente interferentes La ausencia de reactividad cruzada con otros marcadores potencialmente interferentes, ha sido evaluada confrontando las secuencias con bases de datos nucleotídicas. El análisis de la alineación de las secuencias de los oligonucleótidos cebadores y de la sonda fluorescente con las secuencias disponibles en la base de datos de organismos distintos de WNV, incluyendo otros flavivirus del complejo antigénico de la encefalitis japonesa, incluyendo el virus Usutu, ha demostrado su especificidad y la ausencia de homologías significativas. La ausencia de reactividad cruzada con otros marcadores potencialmente interferentes, ha sido evaluada utilizando el panel por proficiency test QCMD 2013 West Nile Virus (RNA) EQA Programme. Los resultados obtenidos con el panel aparecen bajo la "Reproducibilidad con panel de profiency test". En particular, la muestra WNV13-10 que contiene virus de la encefalitis japonesa, el Dengue virus 1, el Dengue virus 2, el Dengue virus 4 y la muestra WNV13-11 que contiene el virus 17D de la Fiebre Amarilla, el Dengue virus 3, el Dengue virus 4, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, fueron negativos. La ausencia de reactividad cruzada con otros marcadores potencialmente interferentes, ha sido evaluada utilizando el material de referencia desde el panel de proficiency (Qnostics Ltd, Reino Unido) para CMV (QCMD 2012 Human Cytomegalovirus (DNA) EQA Programme), para EBV (CMD 2008 Epstein-Barr virus (DNA) EQA Programme), por HSV1 y HSV2 (QCMD 2008 Herpes Simplex Virus (DNA) EQA Programme) y para VZV (QCMD 2012 Varicella Zoster Virus (DNA) EQA Programme). Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Todas las muestras han sido confirmados negativos. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 18/25

10 Sustancias interferentes El posible efecto sobre la prueba de sustancias interferentes se evaluó mediante el análisis del panel de "AcroMetrix Inhibition Panel" (Life Technologies Inc.) con muestras que contienen potencial de interferir sustancias endógenas, resultante de hemólisis, ictericia y lipemia, y exógeno, anticoagulantes EDTA y heparina. Las muestras del panel fueron positivizada con material de referencia QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd,, Reino Unido) a una concentración de 3 x Límite de detección. Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Todas las muestras han sido confirmados positivas, pero la muestra con heparina se inhibe (Ct del WNV y Control Interno retrasó significativamente). Ausencia de contaminación cruzada La ausencia de contaminación cruzada, ha sido verificada analizando los resultados de tres sesiones, en las cuales muestras positivas para el ARN de WNV han sido alternadas con muestras negativas para el ARN de WNV. Ninguna muestra negativa para el ARN di WNV ha resultado positiva. Una muestra de sangre entera negativa para el ARN de WNV se utilizó como una muestra negativa y, después de la adición de material de referencia QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) con un título de copias / ml, come una muestra positiva. Tres series de 6 muestras positivas alternando con 6 muestras negativas se emplearon para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Sangre entera positiva para el ARN de WNV Sangre entera negativa para el ARN de WNV Tasa global de error del sistema La tasa global de error del sistema que arroja resultados falsos negativos, ha sido verificada realizando el análisis de un panel de muestras positivizadas para el ARN de WNV con bajo título y ha resultado negativo. Una muestra de sangre entera negativa para el ARN de WNV ha sido positivizada con el material de referencia QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) con un título de copias / ml. La muestra se utilizó en 60 repeticiones para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Sangre entera positivizada para el ARN de WNV Reproducibilidad entre lotes La reproducibilidad entre lotes de la prueba fue de verificación mediante el análisis de la correlación y la variabilidad de los resultados obtenidos con el material de referencia y tres lotes diferentes del producto. La prueba presenta valores de Ct con un CV% inferiores a 4%. Una muestra de sangre entera recolectada en EDTA negativa para el ARN de WNV y el material de referencia QCMD 2012 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) se utilizaron para preparar el siguiente panel de 12 muestras: - 3 muestras positivizada a copias / ml (3 x Límite de detección); - 3 muestras positivizada a 450 copias / ml (1 x Límite de detección); - 3 muestras positivizada a 225 copias / ml (0,5 x Límite de detección); - 3 muestras negativas para el WNV. El panel ha sido utilizado por los tres diferentes operadores en asociación con el sistema de extracción «ELITe STAR». Las muestras extraídas fueron transcritas inversa y amplificadas, utilizando 3 lotes de productos ELITechGroup S.p.A,. en días diferentes y en diferentes instrumentos de amplificación real time. Los resultados se presentan en la siguiente tabla. Positivas / Promedio Promedio DE CV% Repeticiones Ct WNV Ct CI DE CV% 3x Límite de detección 9 / 9 35,25 0,81 2,29 31,28 0,87 2,78 1x Límite de detección 9 / 9 36,22 1,43 3,95 31,13 0,55 1,78 0,5x Límite de detección 9 / 7 37,79 1,15 3,04 30,91 0,27 0,88 Negativas 0 / ,88 0,39 1,27 Sensibilidad diagnóstica: confirmación de muestras positivas La sensibilidad diagnóstica de la prueba, como confirmación de muestras clínicas positivas, ha sido evaluada utilizando muestras de sangre entera, orina y líquido cefalorraquídeo positivizadas para el ARN de WNV, dada la dificultad de encontrar un número significativo de muestras clínicas positivas. La sensibilidad de diagnóstico total es igual a 96,5%. La prueba de sangre entera recolectada en EDTA ha sido evaluada utilizando 30 muestras de diferentes pacientes. Las muestras se positivizada en una primera serie con el ARN de y en una segunda serie con el linaje 2 de QCMD 2010 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) a un título de 500 copias / ml. A la prueba con el WNV linaje 2 se añadieron otras 10 muestras de sangre entera recolectada en EDTA positivizada a un título de 500 copias / ml. Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. ARN de sangre recolectada en EDTA positivizada para ARN de sangre recolectada en EDTA positivizada para WNV linaje Total Cinco muestras fueron confirmadas negativas con los productos ELITechGroup S.p.A. probablemente debido a la concentración cerca del valor límite de detección (447 copias / ml). Una muestra es resultado no válido debido a un inhibidor no identificado y no se incluyeron en el cálculo de la sensibilidad diagnóstica. En esta prueba la sensibilidad de diagnóstico con sangre entera es igual a 92,7%. La prueba de orina recolectada sin conservantes ha sido evaluada utilizando 30 muestras de diferentes pacientes. Las muestras se positivizada en una primera serie con el ARN de y en una segunda serie con el linaje 2 de QCMD 2010 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) a un título de 500 copias / ml. Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Orina positivizada para Orina positivizada para WNV linaje Total Una muestra ha dado un resultado negativo válido con los productos ELITechGroup S.p.A. debido probablemente a la concentración cerca del valor límite de detección (318 copias / ml). En esta prueba la sensibilidad de diagnóstico con orina es igual a 98,3%. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 19/25 SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 20/25

11 La prueba de líquido cefalorraquídeo ha sido evaluada utilizando 20 muestras de diferentes pacientes. Las muestras se positivizada en una primera serie con el ARN de y en una segunda serie con el linaje 2 de QCMD 2010 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Reino Unido) a un título de 500 copias / ml. Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Líquido cefalorraquídeo positivizada para Líquido cefalorraquídeo positivizada para WNV linaje Total En esta prueba la sensibilidad de diagnóstico con líquido cefalorraquídeo es igual a 100%. Especificidad diagnóstica: confirmación de muestras negativas La especificidad de diagnóstico de la prueba, como confirmación de muestras clínicas negativas, ha sido evaluada realizando el análisis de sangre entera, orina y líquido cefalorraquídeo negativas para el ARN de WNV. La especificidad diagnóstica total es igual a 100%. La prueba de sangre entera recolectada en EDTA ha sido evaluada utilizando 30 muestras de diferentes pacientes. Las muestras testado negativo para el ARN WNV con un producto real time de amplificación "hecho en casa". Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Sangre entera negativa para ARN de WNV Seis muestras fueron "no válido" debido a un inhibidor identificado y no se incluyeron en el cálculo de la especificidad de diagnóstico. En esta prueba la especificidad de diagnóstico con sangre entera es igual a 100%. La prueba de orina recolectada sin conservantes ha sido evaluada utilizando 30 muestras de diferentes pacientes. Las muestras testado negativo para el ARN WNV con un producto real time de amplificación "hecho en casa". Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Orina negativa para ARN de WNV Tre muestras fueron "no válido" debido a un inhibidor identificado y no se incluyeron en el cálculo de la especificidad de diagnóstico. En esta prueba la especificidad de diagnóstico con sangre entera es igual a 100%. La prueba de líquido cefalorraquídeo ha sido evaluada utilizando 20 muestras de diferentes pacientes. Las muestras testado negativo para el ARN WNV con un producto real time de amplificación "hecho en casa". Cada muestra del panel se utiliza para realizar todo el procedimiento de análisis, extracción y transcripción inversa y amplificación con los productos ELITechGroup S.p.A. Los resultados finales se resumen en la siguiente tabla. Orina negativa para ARN de WNV En esta prueba la especificidad de diagnóstico con sangre entera es igual a 100%. Nota: Los datos y los resultados completos de las pruebas realizadas para evaluar las características de las prestaciones del producto están señaladas en la Sección 7 del Fascículo Técnico del Producto "WNV ELITe MGB Kit", FTP. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 21/25 BIBLIOGRAFÍA F. J. May et al. (2011) J. Virol. March vol. 85: E. M. Botha (2008) Emerging Infectious Disease vol. 14: T. Bakonyi (2006) Emerging Infectious Disease vol. 12: J. H. Scherret (2001) Emerging Infectious Disease vol. 7: E. A. Lukhtanov et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35: e30 PROBLEMAS Y SOLUCIONES ADN blanco no detectado en la reacción dos Q - PCR Standard o Coeficiente de correlación de la Curva estándar no válido Causas posibles Soluciones Controlar los volúmenes de mezcla de reacción Error en la preparación de la mezcla de dispensados durante la preparación de la mezcla complete reacción. de reacción. Dispensar cuidadosamente los reactivos en la microplaca siguiendo el plan de trabajo. Error en la dispensación de la microplaca. Controlar los volúmenes de mezcla de reacción dispensados. Controlar los volúmenes dos estándar dispensados. Degradación de la sonda. Utilizar una nueva alícuota de PreMix. Degradación de la PCR MasterMix. Utilizar una nueva alícuota de PCR MasterMix. Degradación del estándar. Utilizar una nueva alícuota de estándar. Controlar la posición de las reacciones del estándar Error en la programación del equipo. programada en el equipo. Controlar el ciclo térmico programado en el equipo. ARN / ADN blanco detectado en la reacción de Control negativo Causas posibles Soluciones Evitar esparcir el contenido de las probetas de las muestras. Error en la dispensación de la microplaca. Cambiar siempre el tip entre una muestra y la otra. Dispensar cuidadosamente muestras, control negativo y estándar en la microplaca siguiendo el plan de trabajo. Controlar la posición de muestras, control negativo y Error durante la programación del equipo. estándar programada en el equipo. Microplaca mal cerrada. Cerrar con cuidado la microplaca. Contaminación del agua bidestilada estéril. Utilizar una nueva alícuota de agua estéril. Contaminación de la mezcla complete de Utilizar una nueva alícuota de la mezcla complete de amplificación. amplificación. Contaminación del área de extracción / Limpiar superficies e instrumentos con detergentes preparación de las reacciones de acuosos, lavar batas, sustituir probetas y tips en uso. amplificación. ARN blanco no detectado en la reacción de las muestras Causas posibles Error en la preparación de la mezcla de reacción. Degradación de la RT EnzymeMix. Problemas de almacenamiento de los reactivos. Problemas durante la fase de extracción. Soluciones Controlar los volúmenes de los reactivos dispensados durante la preparación de la mezcla de reacción. Controlar la RT EnzymeMix se añadió a la mezcla de reacción. Utilizar una nueva alícuota de RT EnzymeMix. Controlar la RT EnzymeMix no sido expuesta a temperaturas superiores a -20C durante tiempos más largos de 10 minutos. Controlar que la mezcla de reacción completa no se deja expuesto a temperaturas ambientales durante tiempos más largos de 30 minutos. Compruebe la calidad y la concentración de ARN extraído. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 22/25

12 Presencia de fluorescencia de fondo irregular o elevada en las reacciones Causas posibles Soluciones Mezclar cuidadosamente, pipeteando tres veces, Error en la dispensación de la muestra. muestras, control negativo y estándar en la mezcla de reacción. Evitar crear burbujas. Programar el intervalo de cálculo de "baseline" en una zona de ciclos en la cual la fluorescencia de fondo ya se encuentre estabilizada (controlar los registros "Results", "Component") y que la fluorescencia de la señal no haya Error en la programación de la "baseline". comenzado a crecer todavía, por ejemplo del ciclo 6 al ciclo 15. Programar el cálculo automático de la "baseline" seleccionando la opción "Auto Baseline". CONT Atención, consultar las instrucciones de uso. Contenido. Mantener alejado de la luz solar. Fabricante. Presencia de curva de disociación anómala Causas posibles Ausencia de un pico definido. Pico definido pero diferente del de otras muestras y de los estándares. Número de catálogo. Límite superior de temperatura. Soluciones Controlar que el Ct del detector FAM sea inferior a 30. Cantidades elevadas de producto de amplificación presentes al finalizar la reacción pueden interferir en el análisis de la curva de disociación. Repetir la amplificación de la muestra para confirmar la presencia de un ADN blanco con una posible mutación. Para confirmar la presencia de una mutación, se debería secuenciar el ADN blanco presente en la muestra. SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS AVISO AL COMPRADOR: LICENCIA LIMITADA Los reactivos de detección ELITe MGB están cubiertos por una o más patentes U.S. número 5,801,155; 6,127,121; 6,312,894; 6,426,408; 6,485,906; 6,492,346; 6,660,845; 6,699,975; 6,727,356; 6,790,945; 6,949,367; 6,972,328; 7,045,610; 7,319,022; 7,368,549; 7,381,818; 7,556,923; 7,662,942; 7,671,218; 7,715,989; 7,723,078; 7,759,126; 7,767,834; 7,794,945; 7,897,736, 8,008,522, 8,067,177, RE 38,416 y de las patentes EP , , , , y , así como de solicitud de patentes que están actualmente pendientes. La compra de este producto incluye una licencia limitada, no transferible y no exclusiva (sin derecho a revender, volver a empaquetar, o sublicenciar) sobre la base de las patentes U.S. número 6,030,787; 5,723,591 y 5,876,930 y las correspondientes patentes extranjeras, unicamente para usar este producto en un análisis en el que la detección de una secuencia de un ácido nucleico no incluya el corte de una sonda de ácido nucleico, con exclusión de cualquier otro propósito. Ninguna otra licencia en virtud de estas patentes o cualquier otra patente es concedida, expresamente, implícitamente o en forma excepcional. Esta licencia limitada permite a la persona o entidad legal a la cual se proporcionó este producto, de usar el producto y los datos generados por el uso del producto, sólo para el diagnóstico humano. Ni ELITechGroup S.p.A., ni sus licenciadores conceden cualquier otra licencia, explícita o implícita para cualquier otro propósito. Código de lote. Utilizar antes del último día del mes. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. TRI Reagent es una marca registrada de Molecular Research Center, Inc. Ficoll es una marca registrada de GE Healthcare Bio-Sciences AB. SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 23/25 SCH m _es 27/02/15 Revisión 00 Pág. 24/25