Compañía. CerTest Biotec es una empresa enfocada en el desarrollo y fabricación de productos de diagnóstico in vitro con aplicaciones humanas.

Transcripción

1

2 Compañía CerTest Biotec es una empresa enfocada en el desarrollo y fabricación de productos de diagnóstico in vitro con aplicaciones humanas. Fundada en 2002, su éxito está asociado con fuerza a tres pilares básicos: recursos humanos, innovación y orientación al cliente. Estas condiciones nos permiten suministrar productos de diagnóstico clínico con un alto grado de calidad, utilizando nuestros clientes. Estamos respaldados por nuestra amplia red de distribuidores en más de 120 países por los 5 continentes. VIASURE Real Time PCR Detection Kits

3 Diagnóstico molecular La tecnología de qpcr -o PCR a tiempo real- se ha convertido en los últimos años en el método diagnóstico reproducibilidad. causantes de enfermedades infecciosas mediante el uso VS - ATV113 código de producto placa tira ó bajo (L) / alto (H) IC VIASURE VIASURE ha sido creado con el propósito de ofrecer, al usuario de Diagnóstico Molecular, kits de PCR a tiempo real para la detección de patógenos de interés. VIASURE ofrece termocicladores de sistema abierto, así como la última tecnología para la estabilización de productos. La gama VIASURE Real Time PCR Detection Kits se basa en la actividad 5 exonucleasa de la Taq DNA polimerasa. Muestra negativa: sin curva de Para llevar a cabo esta reacción, son necesarios dos cebadores y una sonda complementarios a la secuencia a IC cantidad de la secuencia diana presente en la muestra, que puede ser monitorizada con un amplio rango de equipos de PCR a tiempo real. Muestra positiva: curva de y Control Interno (IC). VIASURE Real Time PCR Detection Kit contiene en cada pocillo todos los componentes necesarios en formato estabilizado para realizar el ensayo PCR a tiempo real, lo que permite su envío y almacenamiento a temperatura ambiente. Catálogo General

4 Metodología Determinar y separar el número de reacciones necesarias incluyendo las muestras y los controles. En cada serie de muestras a analizar se deben incluir un control positivo y uno negativo. Retirar el aluminio protector de las placas o tiras. Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 Añadir 15 l de Añadir 5 L de: Colocar las tiras Interpretación solución tampón Muestra de DNA/RNA, en el termociclador de resultados. en cada pocillo ó Control Positivo, e iniciar el protocolo para la rehidratación. ó Control Negativo. Componentes Reactivo / Material Descripción Cantidad 8-well strips 96-well plate Una mezcla de enzimas, cebadores-sondas, tampón, dntps, estabilizadores y Control interno en formato estabilizado Una mezcla de enzimas, cebadores-sondas, tampón, dntps, estabilizadores y Control interno en formato estabilizado 6/12 x tiras de 8 pocillos 1 placa Rehydration Buffer Solución para la reconstitución del producto estabilizado 1 vial x 1,8 ml Positive Control 1 vial Negative Control Control Negativo 1 vial x 1 ml Water RNAse/DNAse free Agua libre de RNAsa/DNAsa 1 vial x 1 ml Tear-off 8-cap strips Tapones ópticos para sellar los pocillos durante el ciclo térmico Shell Frame Grid Adaptador de la placa 1 ó 2 6/12 x tiras de 8 tapones Componentes incluidos en cada VIASURE Real Time PCR Detection Kit. Referencias Referencia VS - XXX106L VS - XXX106H VS - XXX112L VS - XXX112H VS - XXX113L VS - XXX113H Descripción VIASURE (nombre del producto VIASURE (nombre del producto VIASURE (nombre del producto VIASURE (nombre del producto VIASURE (nombre del producto VIASURE (nombre del producto Cambiar XXX por el código de referencia del kit deseado. VIASURE Real Time PCR Detection Kits

5 Ventajas Kits Listos-para-usar. Contienen todos los componentes necesarios para el ensayo. Transporte y almacenamiento a temperatura ambiente. Caducidad: 24 meses -en toda nuestra gama de productos qpcr-. Fácil de usar. Reducción del número de manipulaciones y, por tanto, de la posibilidad de error. etapas tempranas de la infección. Versátil. Es posible analizar desde 1 a 96 muestras por ensayo. Flexible. Adaptable a un amplio rango de termocicladores del mercado. Evaluado y validado según norma ISO y marcado CE. Compatibilidades Fabricante Modelo Qiagen Rotor-Gene Q* Cepheid SmartCycler * Fabricante Modelo Qiagen Rotor-Gene Q* Cepheid SmartCycler * DNA-Technology DTprime Real-time Detection Thermal Cycler DNA-Technology DTprime Real-time Detection Thermal Cycler DNA-Technology DTlite Real-time PCR System DNA-Technology DTlite Real-time PCR System 7500 Fast Real-time PCR System 7300 Real-time PCR System 7500 Fast Dx Real-Time PCR System 7500 Real-Time PCR System QuantStudio TM 12K Flex 96-well Fast 7900 HT Real-Time PCR System QuantStudio TM 6 Flex 96-well Fast QuantStudio TM 7 Flex 96-well Fast ABI PRISM 7000 ABI PRISM 7700 QuantStudio TM 3 Real-Time PCR System QuantStudio TM 12K Flex 96-well QuantStudio TM 5 Real-Time PCR System QuantStudio TM 6 Flex 96-well StepOne Plus TM Real-Time PCR System QuantStudio TM 7 Flex 96-well StepOne TM Real-Time PCR System QuantStudio TM 3 Real-Time PCR System ViiA TM 7 Fast Real-Time PCR System QuantStudio TM 5 Real-Time PCR System CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System Viia TM 7 Real-Time PCR System Mini Opticon TM Real-Time PCR Detection System CFX96 Touch TM Deep Well Real-Time PCR Detection System Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System icycler iq TM Real-Time PCR Detection System Roche LightCycler 96 Real-Time PCR System icycler iq TM 5 Real-Time PCR Detection System Agilent Technologies AriaMx Real-Time PCR System MyiQ TM Real-Time PCR Detection System BIONEER Exicycler TM 96 (Fast block) MyiQ TM 2 Real-Time PCR Detection System Eppendorf Mastercycler TM ep realplex Stratagene / Agilent Technologies Mx3000P TM Real-Time PCR System Listado para kits VIASURE monoplex. con kits multiplex, consultar instrucciones de uso. * El producto se debe reconstituir siguiendo el procedimiento adecuado y transvasar Rotor-Gene, ó SmartCycler. Stratagene / Agilent Technologies Mx3005P TM Real-Time PCR System Analytik Jena Biometra TOptical Analytik Jena Biometra qtower 2.0 Abbott Abbott m2000 RealTime System BIONEER Exicycler TM 96 (Normal block) Catálogo General

6 Protocolo de iniciación PCR a tiempo real VIASURE Real Time PCR Detection Kits

7 El objetivo de este protocolo es facilitar la formación de personal técnico de laboratorio en la realización de pruebas diagnósticas moleculares basadas en la técnica PCR a tiempo real, o qpcr, a partir de muestras clínicas. El uso de los test RNA-DNA VIASURE Extraction Kit y VIASURE Pathogen Real Time PCR Detection Kit, en combinación con los signos y síntomas presentados por los pacientes, permitirá al personal sanitario especializado establecer un diagnóstico clínico. Para desarrollar de manera correcta las actividades mencionadas es necesario adaptar las instalaciones con el equipamiento adecuado y establecer áreas diferenciadas donde se realizarán La unidad de diagnóstico molecular se compone de 4 zonas: Área de extracción de ácidos nucleicos Área Pre-PCR Área Set-up PCR e interpretación de resultados Procesamiento de muestras. Extracción de Reconstituir el número de pocillos necesarios. Añadir control Reconstituir control Añadir DNA/RNA Colocar las tiras en el equipo de PCR a tiempo real. DNA/RNA con kit negativo. extraído de cada Programar el comercial manual o sistema automático (opcional). muestra, añadir control termociclador e iniciar positivo y sellar los pocillos con tapones ópticos. el protocolo. Análisis de resultados con software propio del equipo. Recomendaciones Es importante destacar que la PCR a tiempo real, o qpcr, es una herramienta de diagnóstico afectar gravemente al desarrollo de la prueba. El personal del laboratorio de biología molecular debe contar con una indumentaria exclusiva en cada una de las zonas de trabajo. Es recomendable la desinfección al inicio del proceso y tras el uso de los equipos. Soluciones desinfectantes comerciales. Etanol 70%. Catálogo General

8 1 Área de extracción de ácidos nucleicos Esta primera área tiene como objetivo el procesamiento de muestras potencialmente infecciosas y su posterior zona de riesgo biológico y se recomienda situar todos los equipos en cercanía para minimizar los desplazamientos. El proceso de extracción de DNA/RNA puede ser manual o automático. Siga las instrucciones del proveedor de su kit de extracción, o consúltenos sobre el protocolo de extracción de DNA/RNA en ensayos qpcr. 2 Área Pre-PCR Se recomienda mantener el Área Pre-PCR libre de cualquier tipo de material biológico, para evitar así posibles Equipamiento básico: Material EPI: guantes desechables (sin polvo), bata, mascarilla, gorro. Micropipeta (2-20 μl) (uso exclusivo para la rehidratación de los pocillos y adición del control negativo). Tijeras. Gradillas tubos 0,1-0,2 ml. En esta área utilizaremos el test VIASURE Pathogen Real Time PCR Detection Kit. Separar el número de reacciones/pocillos necesarios (incluyendo las muestras y los dos pocillos reservados para el control positivo y negativo que deben ser siempre incluidos en cada ensayo). En caso necesario, recortar con unas tijeras el número de pocillos requeridos. Retirar el aluminio protector. Reconstituir cada pocillo con 15 μl del tampón de rehidratación (vial azul). Añadir 5 μl del control negativo (vial morado) en el pocillo reservado para control negativo. Tras este proceso trasladaremos los pocillos rehidratados al Área Set-up PCR. VIASURE Real Time PCR Detection Kits

9 3 Área Set-up PCR El Área Set-up PCR es la zona donde se realizan dos procesos independientes: A. Rehidratación del control positivo. B. Adición a los pocillos rehidratados de los ácidos nucleicos y el control positivo. El riesgo biológico no es potencialmente infeccioso para el personal del laboratorio, pero se aconseja mantener esta zona limpia y desinfectada para evitar contaminaciones que comprometan el resultado del test. Aunque es recomendable mantener zonas diferenciadas (Extracción de ácidos nucleicos, Pre-PCR y Setup PCR), esta área podría ser compartida con el Área Pre-PCR manteniendo la precaución de limpiar correctamente la campana entre ambos procesos y diferenciar el uso de pipetas (1ª pipeta, 2-20 μl: uso para el tampón de rehidratación y control negativo; 2ª pipeta, 2-20 μl: uso para ácidos nucleicos y control positivo). Equipamiento básico Material EPI: guantes desechables (sin polvo), bata, mascarilla, gorro. Micropipeta (2-20 μl) (uso exclusivo para la adición de los ácidos nucleicos y el control positivo). Tijeras. Gradillas tubos 0,1-0,2 ml. En esta área utilizaremos el test VIASURE Pathogen Real Time PCR Detection Kit. A. Rehidratación del control positivo. El test VIASURE Pathogen Real Time PCR Detection Kit suministra un control positivo que es necesario rehidratar para su posterior uso en cada ensayo. Debido a que contiene una gran cantidad de copias molde del patógeno, se recomienda abrirlo y manipularlo antes de comenzar el ensayo. Posteriormente, limpiar la zona con soluciones desinfectantes comerciales y/o etanol 70%. Reconstituir el control positivo (vial rojo) con 100 μl de agua libre de RNAsa/DNAsa (vial blanco) y mezclar con la ayuda del vórtex. Separar en alícuotas para minimizar los ciclos de congelación y descongelación. Almacenar a -20ºC tras su re-suspensión. B. Adición a los pocillos rehidratados de los ácidos nucleicos y el control positivo. Añadir 5 μl del DNA/RNA extraído de cada muestra en los pocillos rehidratados (a excepción de los dos pocillos reservados para añadir el control negativo y positivo). Añadir 5 μl del control positivo reconstituido (vial rojo) en el pocillo reservado para control positivo. Separar el número de tapones ópticos necesarios y cerrar los pocillos. En caso necesario, recortar con unas tijeras el número de tapones ópticos requeridos con la precaución de no tocar la parte interna con los guantes. Tras este proceso trasladaremos nuestra placa/ tira, ya cerrada, al equipo de qpcr. Catálogo General

10 4 e interpretación de resultados y sus componentes asociados. Se recomienda situarlo en cercanía al Área Set-up PCR para minimizar los desplazamientos. Equipamiento básico: Equipo PCR a tiempo real. Ordenador. Colocar la tira/placa en el termociclador. Se recomienda colocar el mismo número de tiras/pocillos a ambos lados Programar el termociclador e iniciar el protocolo. En esta área utilizaremos el test VIASURE Pathogen Real Time PCR Detection Kit. PROTOCOLO TÉRMICO DNA PROTOCOLO TÉRMICO RNA Nº ciclos Tiempo Temperatura 1 2 min 95 ºC 10 s 95 ºC s 60 ºC * * Recolección de datos Nº ciclos Tiempo Temperatura 1 15 min 45 ºC 1 2 min 95 ºC 10 s 95 ºC s 60 ºC * Análisis de los resultados con el software propio del equipo Patógeno Control Interno Control negativo Control positivo Interpretación + +/- * - + Patógeno positivo Patógeno negativo Inválido Inválido * La detección del control interno no es necesaria en caso de muestras altamente positivas. Un elevado número de copias del patógeno presentes en la muestra puede conducir a una señal débil o ausente en el control interno. VIASURE Real Time PCR Detection Kits

11 CerTest Biotec, S.L. Pol. Industrial Río Gállego II Calle J, Nº , San Mateo de Gállego, Zaragoza (Spain) VIASURE online Real Time PCR Detection Kits Versión SP 1605