Uso de Herramientas Informáticas en el Análisis de la Degradación de un Efluente Lácteo con Levaduras del Género Rhodotorula

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1 Uso de Herramientas Informáticas en el Análisis de la Degradación de un Efluente Lácteo con Levaduras del Género Rhodotorula Silvia A. Moyano 1, Alejandra M. Liboa 1, María E. Guerín 1, José M. Peralta 2, Miguel A. Rosa 2, Graciela N. Marín 1 (1) Laboratorio de Química y Microbiología. (2) Grupo GISIQ, Universidad Tecnológica Nacional, Facultad Regional Villa María, Av. Universidad 450, Villa María, Córdoba (Argentina) (silmoyano@hotmail.com) RESUMEN El objetivo de este trabajo fue determinar la velocidad de crecimiento y el desarrollo de la levadura Rhodotorula sp. en un efluente de origen lácteo, utilizando herramientas informáticas específicas tales como OriginPro 7.5 y Aquasim v 2.1b. Rhodotorula mucilaginosa demostró la capacidad de degradar materias grasas en efluentes de restaurantes y de biodiesel. Un inoculo de esta levadura se mezcló con 3 litros de un efluente lácteo en un reactor con agitación y aireación constante, durante 5 días. El recuento de las levaduras en el efluente se realizó utilizando la técnica de la ICMSF- International Commission on Microbiological Specifications for Foods, para la determinación de hongos y levaduras. El programa convencional OriginPro 7.5 resultó más apropiado para analizar los datos experimentales del ensayo de crecimiento de Rhodotorula sp. en efluente lácteo que el software específico Aquasim 2.1b, para el periodo de crecimiento de la levadura como para la degradación de materia orgánica. Se concluye que es importante el uso de herramientas informáticas para llevar a cabo este tipo de análisis y la evaluación del comportamiento de sistemas naturales INTRODUCCIÓN Las herramientas informáticas, como softwares específicos para cálculos matemáticos son útiles para predecir el comportamiento de fenómenos biológicos que ocurren en la naturaleza como es el caso de la degradación de materia orgánica de efluentes industriales (Reichert, 1998). Las levaduras, para su crecimiento necesitan fuentes de carbono orgánico y nitrógeno mineral u orgánico. El carbono se puede suministrar en forma de azucares, aldehídos, sales de algunos ácidos orgánicos, glicerina o etanol y, ocasionalmente, en otra forma dependiendo del tipo de levadura. Todas ellas son capaces de utilizar nitrógeno en forma de amonio. Estas características hacen que puedan desarrollarse en medios ricos en materia orgánica como es el caso de gran parte de los efluentes industriales. La biodegradabilidad de efluentes ricos en materias grasas fue estudiada por varios autores, reportándose trabajos en aguas residuales de restaurantes (Fujii et al., 2003) y de producción de biodiesel (Suehara et al, 2005; PFA, UDEA., 2001), utilizando levaduras pertenecientes al género Rhodotorula. Estos microorganismos crecen rápidamente formando colonias suaves, mucosas, de color rosado y/o anaranjado cremoso o rugoso debido a su riqueza en carotenoides, lo cual facilita su identificación (figura 1) (Bonaly y Malenge, 2002.; Akzu y Tugban Eden, 2005). El objetivo de este trabajo fue determinar la velocidad de crecimiento y el desarrollo de la levadura Rhodotorula sp. en un efluente de origen lácteo, utilizando herramientas informáticas como

2 OriginPro 7.5 y Aquasim v2.1b (Reichert, 1998), un programa específico para la simulación e identificación de sistemas acuáticos. MATERIALES Y MÉTODOS. Aislamiento de la levadura el género Rhodotorula. Fig. 1: Cepas aisladas de Rhodotorula sp. Se efectuó a partir de muestras de efluente de una industria mantequera y una productora de queso. Ambas se procesaron realizando un recuento de hongos y levaduras (ICMSF, 1982; Subcommittee on microbiological criteria, 1985) con 4 diluciones, utilizando Agar de Glucosa, Extracto de levaduras, Cloramfenicol. Las placas se incubaron aproximadamente a 25 ± 2 ºC, durante 72 horas. Para la caracterización de las levaduras desarrolladas se tuvo en cuenta la clasificación propuesta por (Pitt et al. 1997; Carrillo, 2003; Pemán, 2007). Los resultados obtenidos fueron 4 colonias típicas en dilución 10-4 de cada muestra. Inóculo de Rhodotorula sp. Para la preparación del inóculo se tomó de la superficie una colonia típica de levadura y se sembró en 200 ml de caldo para levaduras (8 g glucosa, 0.8 g extracto de levadura, 0.08 g fosfato monopotásico, 0.08 g sulfato magnésico y agua destilada c.s.p. 200 ml). Luego se incubó a 30 ± 2 ºC durante 72 horas. Biodigestor Se volcó el inoculo de la levadura en 3 litros de un efluente lácteo en un reactor de 4 litros provisto de agitación de aproximadamente 219 Hp y aireación constante, durante 5 días. Análisis microbiológicos El recuento de las levaduras Rhodotorula sp en las muestras de efluente lácteo se realizó con la técnica propuesta por la ICMSF; como medio selectivo para la determinación de hongos y levaduras se utilizó Agar de glucosa, Extracto de levaduras, Cloramfenicol. Las placas inoculadas con el efluente se incubaron durante horas a C. (ICMSF, 1982). Determinación del DQO del efluente lácteo.

3 Log. ufc/g Método colorimétrico a reflujo cerrado D..Standard Methods for examination of water & wastewater. (2005). Análisis estadísticos de los datos: Para analizar los datos obtenidos se utilizó los softwares OrginPro 7.5 y AQUASIM 2.1. El programa AQUASIM fue diseñado para la identificación y la simulación de sistemas acuáticos en el laboratorio, en plantas técnicas y en la naturaleza (Reichert, 1998). RESULTADOS Los resultados obtenidos del crecimiento de la Rhodotorula sp durante 5 días después de la inoculación en el efluente lácteo, fueron analizados de manera comparativa con los programas antes mencionados. Utilizando OriginPro 7.5 se logró el mejor ajuste con una curva polinómica de quinto orden y un coeficiente de correlación r = 0,925 (ecuación 1) donde el mayor crecimiento se observa a las 34 horas de producida la incubación (figura 2). Y = X X X X X 5 (1) Datos experimentales) Datos calculados con OriginPro Tiempo (Horas) Fig.2: Crecimiento de la Rhodotorula sp en el biodigestor en una muestra de efluente lácteo. Utilizando el programa Aquasim v2.1b y asumiendo una cinética del tipo de Monod para la zona de crecimiento, la cual ocurre durante 44 horas de incubación, se logró un ajuste aceptable de los datos experimentales. Los parámetros calculados por el programa se presentan en la tabla 1, mientras que en la figura 3 se muestran los resultados de la simulación. Tabla 1: Modelo y parámetros calculados por Aquasim v2.1b para la zona de crecimiento de Rhodotorula sp.

4 Aquasim v2.1b (Cinética de Monod) r max1* C 1 /(K 1 + C 1 ) Referencias C 1ini. Concentración inicial del sustrato 1 K 1 : velocidad de crecimiento del sustrato 1 r max1 : velocidad máx de crecimiento del sustrato 1 Parámetros calculados por el programa C 1ini. 17,62 (mg/l) K 1 : 39,20 (mg/l) r max1 : 36,65 (1/h) Cuando los datos de la zona de crecimiento de la curva experimental se ensayaron con el programa OriginPro 7.5 se logró un coeficiente de correlación de 0,998 con una curva polinómica de tercer orden (ecuación 2). Y = X X X 3 (2) En la tabla 2 se muestran de manera comparativa los resultados experimentales con los datos calculados a partir de la ecuación polinómica de tercer orden (OriginPro 7.5) y los obtenidos con Aquasim 2.1b utilizando el modelo de Monod, en la zona de crecimiento de la Rhodotorula sp. durante la experiencia realizada. Tabla 2: Datos experimentales y calculados por el OriginPro 7.5 y Aquasim v2.1b para la zona de crecimiento de Rhodotorula sp. Tiempo (horas) Datos experimentales 5,51 6,45 9,53 11,66 10,94 Valores calculados con el OriginPro 7.5 (Polinómica de tercer orden) 5,08 6,71 9,21 11,88 10,82 Valores calculados con Aquasim v2.1b 4,89 7,41 8,98 11,05 11,56 Se puede observar que para los tiempos correspondientes a los resultados experimentales, los valores calculados por el programa OriginPro 7.5 se correlacionan mejor que los obtenidos con Aquasim 2.1b y además la máxima concentración de Rhodotorula sp., calculada con aquel, se produce aproximadamente a las 38 horas, en concordancia a lo observado durante la experiencia.

5 log ufc/g Datos experimentales OriginPro 7.5 AQUASIM 2.1b Tiempo (horas) Fig. 3: Datos experimentales y calculados por OriginPro 7.5 y Aquasim v2.1b para la zona de crecimiento de Rhodotorula sp. Para determinar la degradación de la materia orgánica del efluente lácteo se realizó la determinación de la Demanda Química de Oxígeno (DQO) tomando muestras diarias durante el ensayo. El mejor ajuste de los resultados experimentales utilizando OriginPro 7.5, se logró mediante un modelo lineal (ecuación 3) con un coeficiente de correlación r = Y = X (3) Asimismo, se utilizó un modelo cinético de primer orden para el tratamiento de los datos experimentales con el software Aquasim v 2.1b. Los parámetros calculados en este caso se muestran en la Tabla 3. Tabla 3 Modelo y parámetros calculados por el Aquasim v2.1b para la DQO de la Rhodotorula sp. en la experiencia realizada con efluente lácteo. Aquasim v2.1b (Cinética de 1 er orden) k 1 + C 1ini. Referencias C 1ini. Concentración inicial del sustrato 1 k 1 : velocidad de reacción específica. Parámetros calculados por el programa C 1ini. 9,253 (mg/l) K 1 :1,028 (1/h) En la tabla 4 y figura Nº 4 se muestran de manera comparativa los resultados experimentales de la DQO con los datos calculados con OriginPro 7.5 y los obtenidos con Aquasim v2.1b utilizando el modelo cinético de primer orden.

6 Log ufc/g Tabla 4: Datos experimentales y calculados por el OriginPro 7.5 y Aquasim v 2.1b para la zona de crecimiento de la Rhodotorula sp. en la experiencia realizada en efluente lácteo. Días DQO (mg/l) Datos experimentales DQO (mg/l) OriginPro DQO (mg/l) Aquasim v2.1b Datos experimentales OriginPro 7.5 AQUASIM 2.1b Tiempo (días) Fig.4: Datos experimentales y calculados por el OriginPro 7.5 y Aquasim v2.1b para la DQO de Rhodotorula sp. Como puede observarse (fig Nº 4, tabla 4) el programa OriginPro 7.5 otorga también un ajuste mejor que con Aquasim v2.1b, para interpretar la degradación de la materia orgánica del efluente durante la experiencia realizada con la aplicación de un cultivo de Rhodotorula sp. CONCLUSIONES: Del análisis y discusión de los resultados obtenidos se pueden enunciar las siguientes conclusiones: Las levaduras del género Rhodotorula sp. procedentes de un efluente lácteo y sometidas a aireación en un reactor biológico se desarrollan en el mismo y permiten predecir su capacidad para degradar la materia orgánica presente. El programa convencional OriginPro 7.5 resultó más apropiado para analizar los datos experimentales del ensayo de crecimiento de Rhodotorula sp. en efluente lácteo que el software específico Aquasim v2.1b, tanto para el periodo de desarrollo de la levadura como para la degradación de materia orgánica

7 Se destaca en términos generales, la importancia del uso de herramientas informáticas para llevar a cabo este tipo de análisis y evaluar el comportamiento de sistemas naturales REFERENCIAS Akzu, Z; Tugban Eden; A. Carotenoids production by the Yeast Rhodotorula mucilaginosa.use of Agriculral wastes as a Carbon Sources. Turkey.Journal of process Biochemistry..Vol.40 (9). (2005) Bonaly R. Malenge, J.P. The Biosyntesis of cyclic carotenoides in Rhodotorula mucilaginosa and Rhodotorula aurnatiaca. France. Journal of biochimica et biophysica acta (bba) lipids and lipid metabolism. vol.164 (2). (2002) Carrillo, L. Los Hongos de los Alimentos y Forrajes. Argentina. Universidad Nacional de Salta. Cap. 9. pág (2003) Fujii, E, Tunematsu, T; Kaminoto,Y; Kohda, J; Suehara, K; Nakano, Y; Yano,T. Microbial Treatment of Oil Contained Wastewater Discharged from Industrial Kitchen. Forestry and Fisheries Research Information Technology Center The Agriculture. Japan: Journal of Food Engineering. Vol 4. p (2003) ICMSF Técnicas de Análisis microbiológico. Microbiología de los Alimentos. -. Ed. Acribia, (1982) Pemán, J., Martín-Mazuelos, E. Rubio Calvo, M.C. Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Cap 11: " Identificación de Levaduras". 2ª. Bilbao: Revista Iberoamericana de Micología.(2007). PFA, UDEA. Tecnologías avanzadas de oxidaciones aplicadas a la descontaminación de los efluentes líquidos asociados a la producción actual de biodiesel de Colombia.Colombia. Universidad de Antioquia. Ministerio de Agricultura y Desarrollo rural. Proyecto de investigación 188. (2001). Pitt, J.I. y Hocking, A.D. Fungi and Food Spoilage. 2da ed. London Blackie Academic & Professional. Cap. 4. (1997). Reichert P.; Aquasim 2.0. User Manual. Computer Program for the Identification and Simulation of Aquatic Systems; 2-10, Swiss Federal Institute for Environmental Science and Technology (EAWAG), Dübendorf, Suiza (1998). Subcommittee on microbiological criteria. An evaluation of the role of microbiological criteria for foods and food ingredients.committee on Food Protection, Natl. Research Council, National Academy Press. 256 Washington, D.C (1985) Suehara, K, Kamamoto, Y; Fuji,E; Kohda;J; Nakano, Y; Yano,T. Biological Treatment of Wastewater Discharged from Biodiesel Fuel Production Plant with Alkali-Catalyzed Transesterification. The Society for Biotechnology. Japan. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol. 100, No. 4, (2005).