RD-100i OSNA La nueva generación de análisis de ganglios centinela en cáncer de mama
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- Raúl Ramírez Roldán
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1 RD-1i OSNA La nueva generación de análisis de ganglios centinela en cáncer de mama
2 RD-1i OSNA La nueva generación de análisis de ganglios centinela en cáncer de mama La biopsia de ganglios centinela se ha establecido rápidamente como el procedimiento quirúrgico de referencia para el estudio de metástasis en pacientes con cáncer de mama en fase temprana con ganglios clínicamente negativos. El análisis intraoperatorio convencional de ganglio centinela hasta ahora se realizaba mediante corte por congelación o impronta citológica con tinción rápida en hematoxilina y eosina (H&E). Estos métodos histopatológicos, debido a que de forma intraoperatoria únicamente permiten examinar una pequeña proporción del ganglio centinela, tienen una baja sensibilidad. A consecuencia de ello, existe un riesgo considerable de obtener falsos negativos, resultados negativos en el análisis intraoperatorio que son identificados como positivos en el estudio postoperatorio, haciendo que sea necesaria una segunda intervención quirúrgica para realizar el vaciamiento axilar. El análisis OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification, amplificación de ácidos nucleicos en un solo paso) constituye un nuevo enfoque diagnóstico que ya está ampliamente establecido y que, por primera vez, permite analizar la totalidad del ganglio linfático de manera intraoperatoria. De esta forma es posible tomar una decisión clínica definitiva sin necesidad de realizar un segundo procedimiento quirúrgico o un análisis histopatológico confirmatorio.
3 Tecnología avanzada OSNA es un ensayo de diagnóstico molecular automatizado que utiliza la tecnología RT-LAMP* como método de amplificación de ácidos nucleicos para detectar a nivel de ARNm el grado de expresión del gen que codifica para la citoqueratina 19 (CK19). La CK19 es un marcador de células epiteliales que en condiciones normales no se expresa en el tejido linfático. La presencia de ARNm de CK19 se corresponde con el tamaño de los focos metastásicos presentes en el ganglio centinela. La evaluación del resultado de la paciente se basa en una curva estándar realizada con anterioridad donde se utilizan tres calibradores con diferentes concentraciones conocidas de ARNm de CK19. Selección del marcador Durante el desarrollo del método OSNA, Sysmex seleccionó 45 marcadores de ARNm candidatos, a partir de una base de datos pública de expresión de genes humanos. Los criterios de selección fueron detectar una elevada expresión en tejidos de la glándula mamaria en combinación con una expresión mínima o ausente en tejido sano de los ganglios linfáticos. En un segundo paso se llevó a cabo una evaluación adicional de los siete marcadores candidatos más prometedores, caracterizados por una expresión elevada del ARNm en ganglios linfáticos positivos para metástasis y por una expresión mínima en ganglios linfáticos negativos. Dicha evaluación se realizó utilizando un número mayor de ganglios linfáticos (Figura 2). Este análisis identificó el marcador CK19 como el más adecuado, al mostrar niveles altos de expresión en ganglios linfáticos metastásicos y niveles bajos de expresión en ganglios linfáticos no metastásicos, por lo que ofrece tanto el potencial de una elevada sensibilidad como la capacidad para discriminar entre ganglios linfáticos metastásicos y no metastásicos. El índice de expresión de estos marcadores se evaluó utilizando ganglios linfáticos positivos y negativos desde el punto de vista histopatológico (Figura 1a y 1b). Ensayo de 45 potenciales genes marcadores CK19 FOXA1 SPDEF CEA MGB1 TACSTD2 MUC1 FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (dominio SAM objetivo que contiene el factor de transcripción ETS), CEA, TACSTD2 (transductor de señal de calcio asociado a tumor 2), MGB1 (mamaglobina1), MUC1 (mucina1) Figura 2 Expresión de marcadores de ARNm en ganglios linfáticos histopatológicamente positivos y negativos * RT-LAMP = Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification; bajo licencia Eiken Chemical CO., Ltd Figura 1a Ratio de expresiones de ARN entre ganglios linfáticos histopatológicamente positivos y negativos Figura 1b Expresión de cada marcador de ARNm en ganglios linfáticos histopatológicamente positivos
4 Tecnología RT-LAMP La innovadora tecnología de amplificación RT-LAMP es un procedimiento isotérmico rápido que ofrece diversas ventajas respecto a los métodos de PCR convencionales. La reacción de amplificación tiene lugar en 16 minutos sin necesidad de purificar previamente el ARN. Las condiciones para la preparación de las muestras y el diseño especial de los primers garantizan una elevada especificidad y evitan obtener resultados falsos positivos. El proceso se monitoriza en tiempo real en el sistema automatizado de amplificación y detección RD-1i. Los resultados están disponibles en aproximadamente 3 45 minutos después de la llegada de la muestra, dependiendo del número de ganglios analizados (Figura 3). La tecnología RT-LAMP utiliza seis primers distintos, específicamente diseñados para evitar la amplificación de pseudogenes de la CK19 o de sus productos de transcripción, así como para acelerar la reacción del ensayo. Primer LAMP B1 B2 5 3 Target RNA 3 5 cdna Figura 3 Control de la reacción en tiempo real F2 F1 Todos los reactivos están listos para usar. Los colorantes azules o los coloides radioisotópicos utilizados para la identificación de los ganglios centinela no interfieren en la reacción de OSNA. L1 3 5 L2 Procedimiento isotérmico a 65 C Reacción de alta velocidad (16 min) F1: Primer directo 1 F2: Primer directo 2 B1: Primer inverso 1 B2: Primer inverso 2 L1: Primer bucle 1 L2: Primer bucle 2 o : Dominio ADN o : Dominio ADN complementario No es necesaria la purificación previa de ARN Sin amplificación no deseada de ADN genómico Alta especificidad debido a la utilización de 6 primers La amplificación no deseada del ADN genómico se evita debido a la precipitación del ADN a ph bajo (3,5) durante la preparación de las muestras y a la temperatura de reacción isotérmica de 65 C.
5 Estudios de validación clínica y resultados El método OSNA ha sido evaluado en diversos estudios multicéntricos en distintos países [1 5]. En todos estos estudios OSNA se comparó con un examen histopatológico muy extenso. Los ganglios linfáticos se dividieron en 4 secciones de un grosor de 1 ó 2 mm. Se asignaron secciones alternas para el ensayo OSNA y para el análisis histológico de múltiples niveles en cortes permanentes. Los cortes se tomaron de 5 niveles con segmentos intermedios de 1, 2 ó 25 µm. En resumen, el análisis de ganglios linfáticos generó los siguientes datos de rendimiento: Índice de concordancia 96,5% Sensibilidad 95,6% Especificidad 96,7% Como parte del estudio multicéntrico japonés se pudo demostrar que la especificidad del método OSNA en pacientes pn (144 ganglios linfáticos analizados) era del 1% (Tabla 1). OSNA n = 144 (++) (+) ( ) Examen patológico positivo negativo macro micro 144 Especificidad: 1% (95% C.I.:.935 ~.993) Table 1 El análisis de 144 ganglios linfáticos de 6 pacientes pn determinó una especificidad del 1% El número de copias de ARNm de CK19 en los ganglios linfáticos negativos, objeto de análisis en este estudio de especificidad, fue considerablemente menor que el valor de corte para el ensayo OSNA. Este hecho es una sólida indicación de que prácticamente puede excluirse el riesgo de obtener falsos positivos (Figura 4). Figura 4 Distribución del número de copias de ARNm de CK19 en 144 ganglios linfáticos de 6 pacientes pn Los resultados de todas las evaluaciones clínicas muestran que el ARNm de la CK19 es un marcador molecular excelente para la detección de las metástasis de ganglios linfáticos en el cáncer de mama. En conclusión, el ensayo OSNA puede aplicarse como herramienta diagnóstica para la detección rápida de metástasis en biopsias de ganglio centinela en pacientes con cáncer de mama. Cumple totalmente con la Directiva de productos sanitarios para diagnóstico in vitro (IVD) y, por consiguiente, está plenamente aprobado para uso diagnóstico en toda la Unión Europea. Referencias de publicaciones [1] Tsujimoto M et al. 27 Clin Cancer Res 13(16). 487 One-Step Nucleic Acid Amplification for Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Patients. [2] Visser M et al. 28 Int. J. Cancer: Intra-operative rapid diagnostic method based on CK19 mrna expression for the detection of lymph node metastases in breast cancer. [3] Schem C et al. 29 Virchows Arch (454.23) One Step Nucleic Acid Amplification a molecular method for the detection of lymph node metastases in breast cancer patients; results of the German study group. [4] Tamaki Y et al. 29 Clin Can Res 15: Molecular detection of lymph node metastases in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step nucleic acid amplification assay. [5] Snook KL et al. 21 Br J Surg, (epub ahead of print) Multicentre evaluation of intraoperative molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma.
6 RD-1i Instrumento Método Parámetro Tecnología Detección Parámetros mostrados Rendimiento Intervalo tisular por muestra Volumen de la muestra Reactivos Almacenamiento de datos Control de calidad Interfaces Dimensiones del analizador anchura x altura x profundidad [mm] Peso del analizador Sistema detector de amplificación génica RD-1i OSNA (Amplificación de ácidos nucleicos en un solo paso) ARNm de CK19 RT-LAMP (Transcripción inversa amplificación isotérmica mediada por bucle) cambio de la luz transmitida debido a la precipitación de pirofosfato de magnesio dependiendo del grado de la reacción CK19 Q (resultado cualitativo de la CK19) CK19 (tiempo de amplificación de la CK19) CK19 C (concentración del ARNm de la CK19) 4 muestras por análisis 5 6 mg 2 µl reactivo homogeneizador LYNORHAG reactivo de amplificación LYNOAMP BC todos los reactivos están listos para usar 2. muestras control positivo y negativo 18 puntos de datos por archivo conexión para el ordenador anfitrión (RS232, LAN) conexión para impresora (USB) 596 x 548 x kg aproximadamente SNCS opcional con el «Sysmex Service Agent» (Agente de Servicio Sysmex) y acceso remoto. El diseño y especificaciones pueden modificarse debido a mejoras del producto. Sysmex Europe GmbH Bornbarch 1, Norderstedt, Alemania Phone Fax Sysmex España S.L. Frederic Mompou, 4B Planta 2, 896 Sant Just Desvern, España Phone Fax ZE296.ES.N.3/11
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