COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUÍMICOS, A. C.

Transcripción

1 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-PARTÍCULAS LIPÍDICAS EN RATONES BALB/c KNOCKOUT A IL-4 CON LUPUS INDUCIDO POR FÁRMACOS Badillo Claudia,* España Luis, Alcántara Verónica, Ibáñez Miguel y Baeza Isabel. Laboratorio de Biomembranas de la Escuela Nacional de Ciencia Biológicas del IPN. Prol. de Carpio y Plan de Ayala, Méx., D.F Tel./Fax ext *claus791109@hotmail.com INTRODUCCIÓN. El síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAAF) es un conjunto de enfermedades que se caracterizan por trombosis venosa y arterial, trombocitopenia, pérdida fetal recurrente y producción de anticuerpos antifosfolípidos (Asherson y col., 1996). El SAAF puede ser primario cuando no se identifica ningún otro síntoma o signo diferente a los indicados, o secundario, cuando está asociado con otras enfermedades (autoinmunes, infecciosas o neoplásicas). Los anticuerpos antifosfolípidos descritos en el SAAF son muy heterogéneos, en general pertenecen a tres grupos: 1)Los anti-cardiolipina, que reaccionan con diferentes fosfolípidos además de la cardiolipina, algunos muestran reactividad con un complejo formado por fosfolípidos aniónicos y la proteína plasmática β 2 -glicoproteína I (β 2 -gpi), o incluso con la β 2 -gpi sola (Mc Neil y col., 1990). 2)Los anticoagulantes prolongan el tiempo de coagulación al interferir con las reacciones dependientes de fosfolípidos de la cas-cada de la coagulación (Sugi y col., 1990). 3)Los anti-partículas lipídicas que identifi-can lípidos en asociaciones moleculares diferentes a la bicapa lipídica conocidas como partículas lipídicas (Figura 1). Las partículas lipídicas se encuentran en estado natural en las membranas celulares en forma transitoria, participan en la fusión entre membranas, en uniones intercelulares, en señales de activación del metabolismo celular, en la activación de proteínas membranales, y cuando se hacen permanentes son inmunogénicas. Figura 1. Representación esquemática de una partícula lipídica en una membrana celular. La cual se observa como una micela invertida insertada entre las monocapas de lípidos.

2 De las enfermedades que se integran en el síndrome de anticuerpos antifosfolípidos secundario, el lupus eritematoso sistémico (LES) es de interés en este trabajo, por el modelo murino que se ha desarrollado en nuestro laboratorio. El LES es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y multisistémica que sigue un curso de alternancia de exacerbaciones y remisiones, en la cual se producen lesiones tisulares y citológicas por subgrupos patógenos de auto-anticuerpos. Entre ellos: los anti-nucleares, antiplaquetarios y los anti-eritrocitos, en la actualidad la lista se ha extendido para incluir anticuerpos antifosfolípidos, anti-partículas lipídicas y anti-colágeno del tipo II (Roit y col., 1998; Baeza y col. 2004). En el Laboratorio de Biomembranas de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN se desarrolló un modelo experimental de lupus en ratones (Baeza y col. 2004), tanto en la cepa BALB/c como en la cepa NIH (Figura 2), a través de la administración de fármacos que inducen la formación de partículas lipídicas o de las partículas lipídicas inducidas por estos fármacos en liposomas, o de anticuerpos monoclonales con especificidad a lípidos asociados en partículas lipídicas. Figura 2. Fotografía de ratones NIH que desarrollaron lupus experimental. Son ratones hembra de siete meses de edad que recibieron liposomas que llevan partículas lipídicas inducidas por procainamida. En los tres casos se desarrolló una enfermedad autoinmune parecida al lupus humano, caracterizada por la presencia en el suero de anticuerpos anti-partículas lipídicas y 4 semanas después de anticuerpos anti-cardiolipina, anti-nucleares y anticoagulantes, lesiones faciales en forma de ala de mariposa y glomerulonefritis. Estos resultados han servido para tratar de explicar en el LES la respuesta masiva de autoanticuerpos contra distintos com-ponentes celulares, en esta respuesta la interleucina 4 (IL- 4) participa en forma activa en cuatro funciones 1)La proliferación de linfocitos B. 2)Estimula el cambio de la cadena pesada de las inmunoglobulinas del isotipo IgE al IgG 1 en ratón y a IgG 4 en humanos. 3)Promueve el desarrollo de células Th2 a partir de células T CD4 vírgenes y actúa como factor de crecimiento autocrino para las células Th2 diferenciadas. 4)Antagoniza los

3 efectos de la activación de los macrófagos del IFN-γ e inhibe las rea-cciones de inmunidad celular (Figura 3). Secreción de inmunoglobulinas y cambio de isotipo Reconocimiento del antígeno Proliferación de células B Figura 3. Acciones biológicas de la interleucina 4 (IL-4) (Abbas, 2002). OBJETIVO Determinar el papel de la interleucina 4 en la producción de anticuerpos antipartículas lipídicas y en el desarrollo del lupus murino parecido al LES humano en dos poblaciones de ratones BALB/c, una normal y la otra knockout a interleucina 4. MATERIALES Y MÉTODOS 1) En este trabajo se utilizaron dos tipos de liposomas (Fosfatidilcolina:fosfatidato 2:1 o fosfatidilcolina:fosfatidilserina 4:1) los cuales se prepararon por el método de evaporación en fase inversa de Szoka y Papahadjopoulos (1978)modificado. 2) La formación de partículas lipídicas se realizó al adicionar a las preparaciones de liposomas un inductor de partículas lipídicas (cloropromacina 2 mm o procainamida 24 mm o MnCl 2 5 mm). 3) Las preparaciones liposomales se analizaron por citofluorometría de flujo, con los siguientes parámetros: modo logarítmico, tamaño liposomal relativo E00, umbral mínimo de detección 52 V, complejidad liposomal 401 V y FL1 660 nm. Los datos obtenidos de 10, 000 liposomas se analizaron en el programa Cellquest. 4) La inducción de lupus en ratones BALB/c tipo silvestre y knockout a IL-4 se realizó a través de la administración de los fármacos (cloropromacina 2 mm o procainamida 24 mm) o de partículas lipídicas inducidas por estos fármacos en liposomas o del anticuerpo monoclonal H308 con especificidad a los lípidos asocia dos en partículas lipídicas. 5) La determinación de los anticuerpos anti-partículas lipídicas por citofluorometria se realizó adicionando a los liposomas con partículas lipídicas 100 μl de los sueros (1:50), las muestras se incubaron 1h a 37ºC. A continuación se agregaron 100 μl del segundo anticuerpo conjugado

4 a FITC (1:2000) y se incubó a 37ºC por 1h. Las preparaciones liposomales fueron analiza das como se describió previamente. 6) Los anticuerpos anti-histonas y anti-cardiolipina se determinaron mediante la técnica de ELISA. 7) Los estudios histopatológicos se realizaron a partir de fragmentos de riñón o piel fijados en formaldehído al 10%, que se tiñeron con la técnica de hematoxilina eosina. 8) La detección de los anticuerpos anti-nucleares se realizó empleando la línea celular Hep 2, los sueros de los ratones se emplearon en una dilución 1:80. Las preparaciones se observaron en microscopia de epifluorencencia. RESULTADOS A los seis meses de la inducción del lupus en los ratones no se detectó la presencia de anticuerpos anti-partículas lipídicas, anti-cardiolipina, anti-histonas y anti-nucleares en los sueros de los ratones knockout a IL-4. Además, estos ratones no presentaron alopecia ni lesiones en la piel, por lo que se decidió sacrificarlos y llevar a cabo el estudio histopatológico. En contraste, a este tiempo de inducción del lupus en los ratones BALB/c de la cepa silvestre se detectaron anticuerpos anti-partículas (Figura 4) y se produjeron los primeros cambios en la piel. a a b b Tamaño liposomal c d Número de liposomas c d e e Fluorescencia

5 Figura 4. Determinación de anticuerpos anti-partículas lipídicas por citofluorometría. Liposomas de fosfatidilcolina:fosfatidato (2:1) (a), + cloropromacina (clp) 3 mm (b), + clp 3mM + 2º Ab polivalente anti-ratón FITC (c), + clp 3 mm + H º Ab FITC (d), + clp 3 mm + suero de ratón con lupus + 2º Ab FITC (e). En la piel de ratones BALB/c cepa silvestre con lupus se observó una atrofia muy marcada de la epidermis e infiltración de células mononucleares alrededor de los folículos pilosos, con un ensanchamiento de los folículos y una gran desorganización de las células matricales; además, se obtuvo la banda lúpica de depósitos de inmunocomplejos entre la dermis y la epidermis (Figura 5). En cambio, en los ratones knockout a IL-4, únicamente el grupo que recibió el anticuerpo monoclonal H308 presentó cambios histopatológicos en la piel muy moderados con respecto a los descritos en la cepa silvestre (Figura 6). Figura 5. Cambios histológicos y depósitos de complejos inmunes en la piel de ratones BALB/c de la cepa silvestre con lupus. Micrografías de áreas de la piel de la cara con alopecia (A) y (B), que muestran una atrofia muy marcada de la epidermis e infiltración de células mononucleares alrededor de los folículos pilosos. En (B) se observan eritrocitos y linfocitos alrededor de las células matricales de los folículos (flechas) y un ensanchamiento de los folículos con una gran desorganización de estas células (cabezas de flecha). Micrografías de inmunofluorescencia (C) y (D). (C) es la piel tomada de la misma área que en (A) y (B) en donde se observa la banda lúpica de depósitos de inmunocomplejos. Piel facial de un ratón sano (D). Adicionalmente, en los glomérulos de ratones con lupus (Figura 7) se observó un incremento en el número de células y el depósito de complejos inmunes en los capilares glomerulares y en el mesangio renal. En tanto que en los knockout a IL-4 no se encontraron alteraciones en los glomérulos y no hubo depósito de complejos inmunes (Figura 7).

6 A B Figura 6. Cambios histológicos en la piel de ratones BALB/c knockout a IL-4. Micrografías de la piel de la cara, en (A) y (B) se observa que la atrofia no es tan acentuada como las mostradas en la fígura 5 y hay presencia de un infiltrado inflamatorio moderado en la dermis profunda alrededor de las glándulas cebáceas. Figura 7. Estudio comparativo de los cambios histológicos en glomérulos de ratones BALB/c de las cepas silvestre y knockout a IL-4. En la cepa silvestre el lupus se indujo con partículas lipídicas inducidas por cloropromacina (A) y (B) y en los knockout a IL-4 con el anticuerpo H308 (C) y (D). En (A) el glomérulo presenta un incremento notable en el número de células. La inmunofluorescencia revela el depósito de complejos inmunes en los capilares glomerulares y en mesangio renal (B). En (C) y (D) el glomérulo es normal, no se observa incremento en el número de células y no hay depósitos de complejos inmunes. Conclusiones. La falta de IL-4 es determinante en los ratones knockout a IL-4, que recibieron cloropromacina, procainamida o partículas lipídicas inducidas por estos fármacos, para no desarrollar el lupus. Bibliografía - Abbas, A., Lichtman, A. y Pober, J. (2002). Inmunología Celular y Molecular. 4ª ed. Graw-Hill Interamericana. pp Asherson, R. A., Cervera, R., Piette, J. & Shoenfeld, Y. (1996). The antiphospholipid syndrome: History, definition, classification and differential diagnosis. En: The antiphospholipid syndrome. CRC Press, Boca Raton, New York, Londres Baeza, I y col. (2004). Antibodies to nonbilayer phospholipid arrangements induce a murine autoimmune disease resembling human lupus. Eur. J. Immunol. 34: 1-11.

7 - Mc Neil, H. P., Simpson, R., Chesterman, N. & Krilis, A. (1990). Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation:β 2 - Glicoprotein (apoprotein H). Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 87: Roit, I., Brostoff, J. & Male, D. (1998). Inmunology. 5ª ed. Mosby. New York. pp Sugi, T. & Mc Intyre, J. (1995). Autoantibodies to phophatidylthanolamine (PE) recognize a kininogen-pe complex. Blood. 86: Szoka, F. & Papahadjopoulos, D. (1978). Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse phase evaporation. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. 75,