CARACTERIZACIÓN DEL MODELO EXPERIMENTAL DE LUPUS INDUCIDO EN RATONES BALB/c "KNOCKOUT" PARA INTERLEUCINA 4 INFORME FINAL

Transcripción

1 CARACTERIZACIÓN DEL MODELO EXPERIMENTAL DE LUPUS INDUCIDO EN RATONES BALB/c "KNOCKOUT" PARA INTERLEUCINA 4 INFORME FINAL Dra. MARÍA ISABEL BAEZA RAMÍREZ 1. RESUMEN. En el Laboratorio de Biomembranas de la ENCB se ha desarrollado un modelo del lupus humano en ratones BALB/c y NIH, en los que se presenta incluso lesiones faciales en forma de ala de mariposa como en el lupus humano. En el desarrollo de esta patología participan anticuerpos, de IgM y/o de IgG, contra lípidos en asociaciones moleculares diferentes a la bicapa o partículas lipídicas. Adicionalmente se desarrolló esta enfermedad parecida al lupus en ratones BALB/c que no producen interleucina 4, porque carecen de este gen o ratones knockout a IL4, para obtener información respecto al mecanismo por el cual se producen los anticuerpos en contra de los lípidos asociados en partículas lipídicas; ya que la interleucina 4 producida por las células T modula ampliamente el sistema inmunológico. Efectivamente, en los ratones knockout a IL4 se desarrolló un cuadro de lupus muy leve en comparación con el que se ha desarrollado en la cepa silvestre BALB/c. Por lo que en este trabajo, se llevó a cabo la caracterización de la enfermedad en los ratones BALB/c knockout a IL4 por su perfil de anticuerpos, de citocinas y por la inmunohistopatología de piel y de riñones. 2. INTRODUCCIÓN. Las partículas lipídicas son estructuras formadas en membranas celulares y liposomales por fosfolípidos en una asociación molecular diferente a la bicapa 1-5. Estos fosfolípidos son de forma molecular cónica como la fosfatidiletanolamina (PE), la cardiolipina (CL), el fosfatidato (PA) y la fosfatidilserina (PS). Las partículas lipídicas son transitorias, su formación es inducida por variaciones en la temperatura y en el ph, por fármacos que inducen lupus en el humano, como la cloropromacina y la procainamida, por antibióticos, péptidos no-polares y por cationes divalentes 1-5. Participan en la fusión entre membranas, en uniones entre células, en activación de proteínas membranales, en señales de activación del metabolismo celular 5-10 y son esenciales para la viabilidad de Escherichia coli 11,12. Las partículas lipídicas estabilizadas son inmunogénicas, ya que se han obtenido anticuerpos policlonales y monoclonales, como el H308, con especificidad por dichas estructuras 3, 13, 14. Con base en esta información, nuestro grupo ha propuesto, que la exposición anormal de partículas lipídicas en las membranas celulares puede inducir la formación de autoanticuerpos que pueden participar en el desarrollo de algunas enfermedades del síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAAF) 3. El SAAF se caracteriza por trombosis, tromocitopenia, pérdida fetal recurrente y por la presencia de anticuerpos antifosfolípidos. Puede ser primario (SAAFP), cuando los pacientes no presentan alguna otra enfermedad, o secundario (SAAFS), cuando está asociado con enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso generalizado (LEG) y enfermedades parecidas al lupus, o enfermedades inducidas por algunos fármacos o con algunas enfermedades infecciosas y neoplásicas 15, 16. Los anticuerpos antifosfolípidos son una población muy heterogénea de autoanticuerpos, en general son anti-cl (acl) y anticoagulantes (LA) 15. Los acl reaccionan con CL y con otros lípidos aniónicos como PA, PS y fosfatidilglicerol. Algunos muestran reactividad con un complejo formado por lípidos aniónicos y la proteína plasmática β 2 -glicoproteína I (β 2 -gpi), o incluso con la β 2 -gpi sola, en lugar de con fosfolípidos

2 Los anticuerpos anticoagulantes prolongan el tiempo de la coagulación al interferir con las reacciones dependientes de fosfolípidos de la cascada de la coagulación. Anticuerpos anticoagulantes diferentes a los acl también se han detectado en el SAAF. Entre ellos están los anticuerpos que reconocen a PE asociada con cininógenos y LA que reconocen a PS en asociación con protrombina, proteína C, proteína S o con anexina V 15, 17, 20. Por otra parte el anticuerpo monoclonal H308, es un anticuerpo antifosfolípidos que tiene una reactividad diferente a los anticuerpos que se han descrito en el SAFF. La reactividad de este anticuerpo monoclonal purificado se caracterizó con partículas lipídicas formadas por los lípidos CL, PS, y PA, e inducidas por calcio, manganeso, o con los fármacos cloropromacina o procainamida. Este anticuerpo mostró especificidad con asociaciones moleculares tridimensionales, protuberancias de 35 a 55 Å, y falta de reactividad con superficies lisas de bicapa de los mismos lípidos 3, 14. La reactividad del anticuerpo monoclonal H308 purificado con partículas lipídicas no se modificó en presencia de β 2 -glicoproteína. El anticuerpo H308 también reconoció partículas lipídicas en células neoplásicas, en las que produjo daño membranal en presencia de complemento. Anticuerpos con una reactividad similar a la del H308 se detectaron en el suero de pacientes con SAAF, lo que sugiere la presencia y la exposición anormal de lípidos asociados en partículas lipídicas en las membranas celulares de estos pacientes. Para determinar la participación de los anticuerpos anti-partículas en el desarrollo de algunas enfermedades del SAAF y con base en la propiedad de la cloropromacina y la procainamida de inducir partículas lipídicas, nuestro grupo propuso, que en el lupus humano inducido por estos fármacos, las protuberancias lipídicas son estabilizadas en las membranas celulares por la cloropromacina y la procainamida, lo que produce una exposición anormal de las mismas, que conduce a la producción de anticuerpos anti-partículas lipídicas. Para probar esta hipótesis, los fármacos se administraron a ratones BALB/c hembras, tanto solos, como en la formación de protuberancias lipídicas. En el primer caso, se espera que los fármacos indujeran y estabilizaran partículas en las membranas celulares de los ratones; mientras que en el segundo, las partículas ya fueron suministradas en los liposomas. Como se esperaba, con los dos tratamientos los ratones produjeron anticuerpos con reactividad a estas estructuras lipídicas, similar a la del anticuerpo H308. Después de la detección de estos anticuerpos, se produjeron anticuerpos anti-nucleares, anticoagulantes y acl. Estos ratones presentaron alopecia moderada, piloerección, lesiones faciales en forma de ala de mariposa, depósitos de complejos inmunes, lesiones histopatológicas en diferentes órganos y en general una baja fecundidad. La patología que se presenta en los ratones tiene características tanto del SAAF primario, como de un SAAF secundario a lupus eritematoso sistémico humano 14. En cambio, en los ratones knockout a IL4 se desarrolló un cuadro de lupus muy leve en comparación con el que se ha desarrollado en la cepa silvestre BALB/c. 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. Con base en los resultados obtenidos en el modelo experimental, la hipótesis de esta línea de investigación es, que los anticuerpos anti-partículas lipídicas pueden participar en el desarrollo de procesos patológicos, debido a que están dirigidos contra lípidos asociados en partículas lipídicas que se encuentran en la superficie de las membranas celulares. Por lo que al ocurrir la reacción inmunológica de los anticuerpos con los lípidos asociados en partículas lipídicas, se puede producir un daño en la membrana celular, como el demostrado en esta línea de investigación, lo que causaría la exposición de antígenos intracelulares y la consecuente producción de anticuerpos anti-fosfatidilserina, anti-cardiolipina, anticoagulantes, anti-nucleares y anti-dna. Estos anticuerpos pueden participar en la formación de depósitos de complejos inmunes en diferentes órganos, así como producir daños celulares en los mismos, que pueden contribuir junto con diferentes factores genéticos, en el desarrollo de algunas de las enfermedades que integran el SAAF humano, en forma similar a como se ha demostrado en el modelo experimental de lupus en ratones. 2

3 Debido a que el sistema inmunológico está totalmente involucrado en el desarrollo del lupus murino, como era de esperarse en los ratones knockout a IL4 se desarrolló un cuadro de lupus muy leve en comparación con el que se ha desarrollado en la cepa silvestre BALB/c. La IL4 participa fundamentalmente en las siguientes funciones: en la proliferación de los linfocitos B, es la principal citocina que estimula el cambio de la cadena pesada de las inmunoglobulinas al isotipo IgE y al IgG 1 en ratones y a IgG 4 en humanos; estimula el desarrollo de células Th2 a partir de células T CD4 + vírgenes y actúa como factor de crecimiento autocrino para las células Th2 diferenciadas; además, antagoniza los efectos de activación de los macrófagos del IFN-γ e inhibe las reacciones de inmunidad celular. En este trabajo se llevó a cabo la caracterización del lupus desarrollado en los ratones BALB/c knockout a IL4 por su perfil de anticuerpos, de citocinas y por la inmunohistopatología de piel y de riñones. 4. OBJETIVO. Caracterizar el lupus desarrollado en los ratones BALB/c knockout a IL4 por su perfil de anticuerpos, de citocinas y por la inmunohistopatología de piel y de riñones. 5. METAS. 1) Obtención de liposomas e inducción de la formación de partículas lipídicas con procainamida. 2) Caracterización de los liposomas por citofluorometría. 3) Inducción de lupus en los ratones: Administrar a ratones BALB/c "knockout" a IL4 hembras de 2 meses de edad liposomas que llevan partículas inducidas por procainamida. Como control negativo se estudió un grupo (C ) de ratones BALB/c "knockout" a IL4 hembras de 2 meses de edad al que se le administró solución salina. Como control positivo se estudió un grupo de ratones BALB/c hembras de 2 meses de edad al que se le administró el H308. 4) Administrar a ratones BALB/c "knockout" a IL4 hembras de 2 meses de edad procainamida. 5) Determinar el perfil de autoanticuerpos (anti-partículas, anticardiolipina y antinucleares) y de citocinas en los 4 grupos de ratones. 6)Determinar depósitos de complejos inmunes en piel y en riñones en los 4 grupos de ratones. 6. METODOLOGÍA, RESULTADOS y DISCUSIÓN. A. Obtención de liposomas. Los liposomas, microvesículas de 400 nm de diámetro, se emplearon como antígenos lipídicos para administrarlos a los ratones y para detectar anticuerpos anti-partículas lipídicas. Los liposomas se formaron por el método de Szoka y Papahadjopoulos (1978) 21 con las siguientes formulaciones lipídicas: PC:PS (4:1) En donde: PC.- fosfatidilcolina de yema de huevo PS.- fosfatidilserina de Se emplearon 10 µmoles de lípidos en cloroformo, que se colocaron en un tubo de 13 x 100mm, adaptado a un rotavapor-m, Brinkmman Instruments, en donde se llevó a cabo la evaporación del cloroformo a presión reducida y a 37ºC. Posteriormente los lípidos se disolvieron en 1.2 ml de eter dietílico y se les agregaron 330 µl del regulador de TS a ph 7.0, esta mezcla se agitó en un vortex 3

4 y en un sonicador de baño (Super-Mixer 1290, LabLine), durante 3 ciclos de 5 seg, con intervalos de 30 seg. Finalmente el eter dietílico se evaporó y se obtuvo la suspensión de liposomas. Las microvesículas que se obtuvieron fueron unilamelares de acuerdo con sus espectros de NMR de 31 P. B. Formación de las partículas lipídicas en los liposomas. La formación de estas estructuras lipídicas se llevó a cabo por incubación con procainamida a una concentración de 8 mm, durante 30 min, a 37ºC (Baeza et al., 1994) 6, con lo que se obtuvieron las siguientes preparaciones de liposomas: Liposomas con los lípidos asociados en bicapa : PC:PS (4:1) Liposomas con los lípidos asociados en partículas lipídicas: PC:PS (4:1) + procainamida Estas preparaciones fueron analizadas por sus espectros de NMR de 31 P. C. Caracterización de los liposomas por resonancia magnética nuclear (NMR) de 31 P. Se empleó el método descrito por Jones et al. (1992) modificado por Baeza et al. (1994) 6, para determinar la organización de los lípidos en bicapa o en partículas lipídicas en los liposomas. Se usaron 70 µmoles de cada preparación liposomal para este estudio, los espectros se obtuvieron en el espectrofotómetro JEOL FX90Q. Los liposomas de PC:PS (4:1), presentaron espectros de NMR de 31 P con señales angostas y con un máximo cercano a 0.0 ppm, que corresponden a liposomas con un tamaño promedio de 400 nm (Baeza et al., 1994) 6. Al incubar los liposomas que tienen el lípido cónico fosfatidilserina con procainamida, se obtuvieron espectros con señales más angostas, que presentaron un desplazamiento hacia campos magnéticos más bajos. Que indica el movimiento molecular isotrópico característico de los lípidos en las asociaciones moleculares diferentes a la bicapa o partículas lipídicas (Baeza et al., 1994; Aguilar et al., 1999) 3, 6. Con estos modelos membranales puede tenerse, sin cambiar la composición de lípidos, las dos asociaciones moleculares lipídicas que se han descrito en las membranas celulares (Cullis y Hope, 1991; Baeza et al., 2004; Aguilar et al., 1999) 2, 3, 14. Los liposomas de fosfatidilcolina: fosfatidilserina pueden presentar los lípidos asociados en bicapa o en partículas lipídicas. Estas observaciones apoyan la conclusión de que las asociaciones de lípidos en partículas lipídicas se forman solamente por lípidos de forma molecular cónica como fosfatidilserina, cardiolipina y fosfatidato D. Determinación de la especificidad del anticuerpo monoclonal H308-FITC a partículas lipídicas. La reacción del anticuerpo H308-FITC con partículas lipídicas inducidas por procainamida 8 mm en liposomas de PC:PS (4:1) se determinó por citofluorometría. En esta técnica se emplearon liposomas (0.3 µmoles/100 µl de regulador) que contienen partículas lipídicas como antígenos, los cuales se incubaron con el anticuerpo H308-FITC, diluído 1:100, durante 1 h a 37ºC; a continuación los liposomas se lavaron con solución reguladora de ph. Posteriormente los liposomas se resuspendieron en solución FACS Flow y se analizaron por citometría de flujo en el citómetro FACScalibur (Beckton Dickinson), equipado con rayo de argón de 488 nm 3, 13. 4

5 La reacción positiva del anticuerpo H308-FITC con las partículas lipídicas inducidas por procainamida, produjo liposomas con una fluorescencia 60 veces mayor que la de aquellos que se incubaron con un anticuerpo monoclonal inespecífico TsmAb-FITC. La diferencia en la reacción inmune del anticuerpo antipartículas lipídicas, con respecto al anticuerpo inespecífico se confirma en las gráficas de fluorescencia y de granularidad que se obtuvieron. E. Inducción de lupus parecido al humano en ratones BALB/c "knock out" a IL4. Se hicieron 2 grupos de ratones BALB/c "knockout" a IL4 a los que se les trató de inducir el cuadro parecido al lupus humano con procainamida o con liposomas que llevan partículas lipídicas inducidas por procainamida. Como control negativo se estudió un grupo de 7 ratones hembras BALB/c "knockout" a IL4 que recibió solución salina por vía intraperitoneal, semanalmente, durante 4 meses. Como control positivo se estudió un grupo de 7 ratones BALB/c hembras "knockout" a IL4 que recibió el anticuerpo H308, estudios previos han mostrado que los ratones BALB/c desarrollan la patología parecida al lupus humano con este tratamiento: Grupo A. Ratones BALB/c "knockout" a IL4 hembras, de 2 meses de edad, 7 por grupo, se les administraron liposomas que llevan partículas lipídicas por vía intraesplénica, 2 veces con intervalo de 2 semanas. Posteriormente los liposomas se administraron por vía intraperitoneal semanalmente durante 4 meses. Grupo B. Ratones BALB/c "knockout" a IL4 hembras de 2 meses de edad, 7 por grupo, se les administró por vía intraperitoneal solución salina estéril, cada semana durante 4 meses. Grupos C. Ratones BALB/c hembras de 2 meses de edad, 7 por grupo, se les administró por vía intraperitoneal el anticuerpo monoclonal H308 contra lípidos en partículas lipídicas, cada semana durante 4 meses. Grupo D. Ratones BALB/c "knockout" a IL4 hembras, de 2 meses de edad, 7 por grupo, se les administró procainamida por vía intramuscular cada semana durante 4 meses. F. Determinación de anticuerpos anti-partículas lipídicas en los 4 grupos de ratones estudiados. Los anticuerpos anti-partículas lipídicas se analizaron en el suero de los 4 grupos de ratones por la metodología descrita para el anticuerpo monoclonal H308, incluso como control positivo se usó la reactividad de este anticuerpo con liposomas que llevan partículas lipídicas. Se emplearon liposomas (0.3 µmoles/100 µl de regulador) que contienen partículas lipídicas como antígenos, los cuales se incubaron con los sueros de los ratones en dilución 1:250, durante 1 h a 37ºC; a continuación los liposomas se lavaron con solución reguladora de ph. Posteriormente los liposomas se resuspendieron en solución FACS Flow y se analizaron por citometría de flujo en el citómetro FACScalibur (Beckton Dickinson), equipado con rayo de argón de 488 nm 3,13. No se detectaron anticuerpos anti-partículas lipídicas en los 2 grupos de ratones BALB/c "knock out" a IL4 que recibieron los diferentes tratamientos, ni en el grupo de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibió únicamente solución salina (Tabla 1). Estos anticuerpos si fueron detectados en el grupo (C) de ratones BALB/c que fueron tratados con el anticuerpo H308 (Tabla 1). G. Determinación de anticuerpos anti-cardiolipina por ELISA en los 4 grupos de ratones estudiados. 5

6 Se empleó el método que se aplica en los laboratorios clínicos (Loizou et al., 1985) 23. El lípido cardiolipina (4 µg/100 µl de etanol) como antígeno, se adicionó a los pozos de las placas de ELISA, se evaporó el etanol, y la placa se bloqueó con solución de gelatina al 0.4% en regulador de Trissalina. Posteriormente se adicionaron a cada pozo los sueros de humanos o de los ratones, diluidos 1:100, y se incubó 1 h a 37ºC. A continuación se lavaron 5 veces y se incubaron con anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulinas de ratón conjugados a peroxidasa durante 1h a 37ºC. Se volvió a lavar y después de que se agregó el sustrato de la enzima, se midió la absorbencia del producto a 492 nm en un lector de ELISA (Labsystems Multiskan MS). Como controles, se emplearon sueros de los ratones antes de que se les aplicaran los diferentes tratamientos. Los resultados se expresan en unidades arbitrarias (UA) y se consideran valores positivos cuando son 1.9 UA, como se ha establecido en humanos. No se detectaron anticuerpos anti-cardiolipina en los 2 grupos de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibieron los diferentes tratamientos, ni en el grupo de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibió únicamente solución salina (Tabla 1). Estos anticuerpos si fueron detectados en el grupo (C) de ratones BALB/c que fueron tratados con el anticuerpo H308 (Tabla 1). H. Determinación de anticuerpos anti-nucleares en los 4 grupos de ratones estudiados.la detección de estos anticuerpos se llevó a cabo por inmunofluorescencia indirecta (Molden et al., 1984) 25. Un cultivo de células Hep-G2 se incubó con el suero de los ratones durante 1 h a 37ºC. Posteriormente los cultivos se lavaron y se incubaron con anticuerpos de cabra antiinmunoglobulinas de ratón conjugados a FITC, 1 h a 37ºC. La inmunofluorescencia de los cultivos celulares se analizó en un microscopio óptico Zeiss equipado con un sistema de epifluorescencia. Los resultados positivos se indican con la dilución de suero que da una inmunofluorescencia muy clara en la zona nuclear. No se detectaron anticuerpos anti-nucleares en los 2 grupos de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibieron los diferentes tratamientos, ni en el grupo de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibió únicamente solución salina (Tabla 1). Estos anticuerpos si fueron detectados en el grupo (C) de ratones BALB/c que fueron tratados con el anticuerpo H308 (Tabla 1). I. Determinación por ELISA de las citocinas IL4, IL12 e INF-γ. Para esta determinación las inmunoplacas fueron sensibilizadas con la diluciones adecuadas de las citocinas (1:250 para IL4 e IL12, y 1:2000 para INF-γ). Los sueros de ratón se usaron en dilución [1:4] o se usaron muestras para la curva tipo en diluciones seriadas, con factor de dilución 1:2. Se usó el segundo anticuerpo conjugado a avidina y después de incubar una hora a 37 C, las preparaciones se leyeron a 450 nm antes de 30 minutos. Los valores obtenidos para las tres citocinas en los 2 grupos de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibieron los diferentes tratamientos, así como en el grupo de ratones "knockout" a IL4 que recibió únicamente solución salina, se encontraron por debajo del límite de la curva de calibración: < 62.5 pg para IL12, < 31.3 pg para INF-γ, < 7.83 pg para IL4 J. Determinación de depósitos de complejos inmunes en piel y en riñones en los 4 grupos de ratones estudiados. Se determinaron cambios histopatológicos y complejos inmunes en todos los grupos de ratones. Se tomaron muestras de los órganos para su estudio histopatológico y otras muestras se conservaron congeladas para su tratamiento por inmunofluorescencia, estas muestras se 6

7 incubaron con un anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado isotiocianato de fluoresceína (Naciff et al., 1996) 27. Se detectaron escasos depósitos de complejos inmunes en piel pero no en riñones en los 2 grupos de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibieron procainamida o liposomas que llevan partículas lipídicas inducidas por este fármaco. Los complejos inmunes no se detectaron en el grupo de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que recibió únicamente solución salina (Tabla 1), pero si fueron detectados en el grupo (C) de ratones BALB/c que fueron tratados con el anticuerpo H308. Tabla 1. Presencia de anticuerpos anti-partículas lipídicas, anti-cardiolipina y anti-nucleares en los sueros de los ratones que fueron sometidos a los diferentes tratamientos. Ratones BALB/c "knockout" a IL4 Grupo: A Tratamiento administrado Liposomas con part. lipídicas inducidas por procainamida Anticuerpos antipart. lipídicas Valor de D) Anticuerpos anticardiolipina (UA) Anticuerpos anti-nucleares 0.07 ± ± B Solución salina 0.10 ± ± C Anticuerpo H ± ± 0.5 1:600 D Procainamida 0.14 ± ± D. Es la diferencia en escala logarítmica en la reactividad entre las poblaciones de liposomas que fueron expuestos a los sueros de los ratones después de los tratamientos, comparados con la reactividad de los sueros de los ratones antes de recibir los tratamientos. Valores de D 0.5, a p< 0.001, son valores positivos e indican la presencia de anticuerpos antipartículas lipídicas. Los anticuerpos anti-cardiolipina se expresan en unidades arbitrarias (UA) y se consideran valores positivos cuando son 1.9 UA, como se ha establecido en humanos. Los anticuerpos anti-nucleares dan una zona fluorescente alrededor del núcleo, los resultados positivos se indican por la dilución del suero que da esta fluorescencia, (-) indica resultados negativos. En la piel de los ratones BALB/c del grupo C se observó una atrofia muy marcada de la epidermis, con una fuerte infiltración de eritrocitos y leucocitos en la dermis. Entre la dermis y la epidermis ocurre el depósito de complejos inmunes que se revelan como una banda fluorescente entre ambos, en forma similar a como se ha descrito en el humano, a esta banda se le conoce como banda lúpica. En los riñones se presenta una proliferación celular en los glomérulos, con depósitos de complejos inmunes en la membrana basal y en la matriz del mesangio glomerular. Los cambios histopatológicos en la piel de los "knockout" a IL4 fueron muy discretos en comparación de los descritos en los ratanes de la cepa silvestre. Adicionalmente, en los 3 grupos de ratones BALB/c "knockout" a IL4 que se estudiaron en este Proyecto no se desarrollaron lesiones faciales como se ha descrito en los ratones BALB/c. 7. CONCLUSIONES. La falta de producción de anticuerpos anti-partículas lipídicas, anti-cardiolipina y anti-nucleares, en los ratones BALB/c "knockout" a IL4 sometidos a los diferentes tratamientos para inducir una enfermedad parecida al lupus humano; así como la detección de cantidades muy bajas de las citocinas IL4, IL12 e INF-γ y la presencia muy discreta de lesiones en la piel y la ausencia de éstas en los riñones, adicionada también de una presencia muy discreta de depósitos de complejos inmunes solamente en la piel, permite concluir que en estos ratones knockout para interleucina 4, se desarrolló esta enfermedad autoinmune en forma muy leve con respecto a los ratones BALB/c de la cepa silvestre, debido precisamente a que carecen o presentan concentraciones muy bajas de interleucina 4, así como de INF-γ. 7

8 Como se ha descrito en esta línea de investigación, el cuadro parecido al lupus humano que se ha desarrollado y caracterizado, por nuestro grupo, en ratones BALB/c, por la administración de fármacos que inducen partículas lipídicas en membrana celulares, como la cloropromacina y la procainamida, o por la administración de liposomas que llevan partículas lipídicas inducidas por estos fármacos, así como por la transferencia pasiva del suero de ratones enfermos a ratones singénicos sanos, se desarrolla por los anticuerpos producidos en contra de los lípidos asociados en partículas lipídicas, estos anticuerpos son de los isotipos IgM e IgG 14,28,29. Adicionalmente, los hallazgos obtenidos en este Proyecto indican que el desarrollo muy leve del lupus en los ratones BALB/c que carecen de interleucina 4, descarta la participación de las células B-1 en la producción de los anticuerpos anti-partículas lipídicas e involucra a las células B convencionales o células B-2 en la producción de dichos anticuerpos, ya que las células B-2 requieren de la interleucina 4 producida por las células T para el cambio en la producción de anticuerpos IgM a los anticuerpos de IgG. Asimismo, estos hallazgos indican la importancia de los anticuerpos anti-partículas lipídicas del isotipo IgG en el desarrollo del lupus murino parecido al humano. 8. IMPACTO EN EL SECTOR PRODUCTIVO DE BIENES Y SERVICIOS. BENEFICIO SOCIAL O EDUCATIVO. Los resultados de este Proyecto apoyan fuertemente la línea de investigación de este tipo de enfermedades autoinmunes, que ha permitido presentar una solicitud de patente que fue aprobada en agosto de 2004 en la Oficina de Patentes de EUA: Baeza, I., Aguilar, L., Wong, C. Ibáñez, M. & Lara, M. Patente US 6,777,193 B1. (2004). Methods for diagnostic and/or treatment of antiphospholipids antibodies-related diseases and devices. Así como la patente que fue aprobada por el Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial en 2005: Baeza, I., Aguilar, L., Wong, C. Ibáñez, M. & Lara, M. Patente México No (2005). Métodos para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con anticuerpos antifosfolípidos y dispositivos utilizados. También se tiene en proceso en la Oficina de Patentes de EUA la patente divisional: Solicitud de Patente Divisional US 10/866,163: Methods for diagnostic and/or treatment of antiphospholipids antibodies-related diseases and devices. Estas patentes son sobre un método de diagnóstico temprano de enfermedades relacionadas con el Síndrome de Anticuerpos Antifosfolípidos, basado en la detección de los anticuerpos antipartículas lipídicas en el suero de pacientes que presuntamente tienen alguna de las patologías de este Síndrome. 7. REFERENCIAS. 1. Baeza, I., Ibañez, M., Santiago, J.C., Argüello, C., Wong, C. & Oró, J. (1990) J. Mol. Evol. 31: Cullis, P. R., Tilcock, C P. & Hope, M. J. (1991) In : Membrane Fusion. (Wilschut, J. & Hoekstra, D., Eds.), pp , Marcel Dekker, New York. 3. Aguilar, L., Ortega, G., Campos, B., Fonseca, R., Ibáñez, M., Wong, C., Kaetzel, M., Farfán, N., Naciff, J., Dedman, J. R. & Baeza, I. (1999). J. Biol. Chem. 274: De Kruijff, B., Killiani, A., Rietveld, A. G. & Kusters, R. (1997) In: Lipid Polymorphism and Membrane Properties (Epand, R. Ed) Academic Press, California, London. 8

9 5. Baeza, I., Aguilar, L., Ibáñez, M. & Wong, C (1998) Mensaje Bioquímico, Vol.XXII: Baeza, I., Wong, C., Mondragón, R., González, S., Ibáñez, M., Farfán, N. & Argüello, C. (1994) J. Mol. Evol. 39: Wegener, J. & Galla, H-J. (1996) Chem. Phys. Lipids 81: van den Brink-van der Laan E. et al. Biochemistry 40: (2001). 9. van der Wel P. C. et al. Biochemistry 39: (2000). 10. Ibáñez, M., Gariglio, P., Chávez, P., Santiago, R., Wong, C. & Baeza, I. (1996) Biochem. Cell Biol. 74: Morein, S., Anderson, A., Rilfors, L. & Lindblom, G. (1996) J. Biol. Chem. 271: Morein, S., Koeppe, R. E., Lindblom, G., De Kruijff, B. & Killian, J. A (2000) Biophys J. 78: Baeza, I., Aguilar, L., Alvarado, F., Soto, C., Escobar, A., Mondragón, R., González, S., Ibáñez, M. & Wong, C. (1995) Biochem. Cell Biol. 73: Baeza, I., Leyva, E., Campos, B., Lara, M., Ibáñez, M., Farfán, N., Orozco, H., Flores-Romo, L., Hernández-Pando, R., and Wong, C. (2004) Eur. J. Immunol. 34: Asherson, R. A., Cervera, R., Piette, J. & Shoenfeld, Y. (1996a) In:The antiphospholipid syndrome (Asherson, R. A., Cervera, R., Piette, J. & Shoenfeld, Y., Eds.) pp. 3-12, CRC Press, Boca Raton, New York, London, Tokyo. 16. Hughes, G. R. Hughes syndrome: antiphospholipid syndrome. J. R. Coll Physicians Lond 32: (1998). 17. Rausch, J. & Janoff, A. S. Lupus 5: (1996). 18. McNeil, H. P., Simpson, R. J., Chesterman, C. N. & Krilis, S. A. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: (1990). 19. Greco, T. P., Amos, M. D., Conti-Kelly, A. M., Naranjo, J. D. & Ijdo, J. W. Lupus 9:33-41 (2000). 20. Sugi, T. & McIntyre, J. A. (1995) Blood 86: Szoka, F. & Papahadjopoulos, D. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: Rauch, J., Tannenbaurm, M., Neville, C. & Fortin, P.R. (1998) Thromb. Haemost. 80: Loizou, S., McCrea, J. D., Rudge, A. C., Reynolds, R., Boyle, C. C. & Harris, E. N. (1985) Clin. Exp. Immunol. 62: Cawkwell, R. D. (1978) Thromb. Haemostasis 39: Molden, D. P., Nakamura, R. M. & Tan, E. M. (1984) J. Clin. Pathol. 82: Shoenfel, Y. & Ziporen, L. (1998) Lupus 7:S158-S Naciff, J. M., Behbehani, M. M., Kaetzel, M. A. & Dedman, J. R. (1996) Am. J. Physiol. 271: C2004-C Campos, B., Chames, M., Lantry, J. M., Bill, J. P., Eis, A., Brockman, D., Neil, J., Tischner, E., Barton, J., Wong, C., Schwemberger, S., Cornelius, J., Myatt, L., Baeza, I., & Hnat, M. (2006). Placenta 27: Baeza, I., Ibáñez, M. & Wong, C. (2006) Biomembranas y fenómenos de transporte. En: Bioquímica. Juan José Hicks Ed. McGraw-Hill Interamericana. México, Sidney, Toronto. pp