EDUCACIÓN CONTINUADA. EN EL LABORATORIO CLÍNICO Ed Cont Lab Clín; 14: CANCER COLORRECTAL. MUTACIONES EN KRAS Y EGFR
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- María Nieves Ángeles Caballero Espejo
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1 EDUCACIÓN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLÍNICO Ed Cont Lab Clín; 14: CANCER COLORRECTAL. MUTACIONES EN KRAS Y EGFR Esther Ocaña Pérez F.E.A. Inmunología Manuela Gassó Campos Directora de UGC de Laboratorios y Alergología Complejo Hospitalario de Jaén INTRODUCCIÓN Se entiende por cáncer colorrectal (CCR) la formación maligna que se inicia en la mucosa del recto o del colon y que se presenta histológicamente como un adenocarcinoma. Se desarrolla a partir de la formación de pólipos benignos adenomatosos o displasias. Este desarrollo anormal de pólipos crece y sus células sufren una alteración en su forma, lo que las lleva a convertirse en células cancerígenas. A su vez, estas células son transportadas hasta el recto, y por el sistema sanguíneo hasta todo el cuerpo, provocando una invasión de otros órganos con estas células cancerosas mediante un proceso que conocemos como metástasis. Estos pólipos pueden estar presentes incluso 10 años antes de desarrollarse la malignificación. Los síntomas más comunes de este tipo de cáncer es el sangrado rectal, cambios persistentes en los hábitos intestinales y anemia. En tumores avanzados se produce pérdida de peso, nauseas y anorexia y dolor abdominal. Los síntomas precoces pueden ser poco severos y frecuentemente no bien definidos, llegando en algunos pacientes a aparecer únicamente cuando el cáncer está en una fase avanzada. La cuarta parte de los pacientes son diagnosticados cuando ya han desarrollado metástasis, y un 50 % más de los pacientes la desarrollarán en la progresión del cáncer. La supervivencia a cinco años la logran sólo unos pocos pacientes. ETIOLOGIA En el desarrollo del cáncer colorrectal están involucrados una gran cantidad de factores genéticos y ambientales. La dieta con un elevado contenido en grasa saturada (de origen animal) y un bajo contenido en fibra, parece tener una gran importancia en el desarrollo de esta patología.. Factores genéticos que van a predisponer al desarrollo del cáncer. Se calcula que de un 5 % a un 10 % de los cánceres colorrectales tienen un origen hereditario. Es más frecuente en las familias
2 con tendencia a presentar pólipos de colon u obesidad. Los parientes en primer grado de un paciente con cáncer de colon presentan un riesgo incrementado para sufrirlo, por lo que deberían realizarse pruebas diagnósticas, principalmente a partir de los 50 años de edad. Las radiaciones ionizantes son uno de los factores causales más reconocidos. La radiación produce cambios en el ADN, como roturas o trasposiciones cromosómicas en las que los cabos rotos de dos cromosomas pueden intercambiarse. La radiación actúa como un iniciador de la carcinogénesis, induciendo alteraciones que progresan hasta convertirse en cáncer después de un periodo de latencia de varios años. Infecciones y inflamaciones intestinales previas como enfermedades inflamatorias intestinales previas: los enfermos con colitis ulcerosa con una evolución de 7-10 años presentan un riesgo aumentado de cáncer colorrectal. Además, hay algunas patologías que pudieran estar relacionadas con un riesgo incrementado para el cáncer colorrectal como pueden ser la enfermedad de Crohn. Productos químicos: El proceso por el que los productos químicos producen cáncer ha sido ampliamente estudiado. Algunos actúan como iniciadores. Sólo se requiere una única exposición, pero el cáncer no aparece hasta pasado un largo periodo de latencia y tras la exposición a otro agente denominado promotor. Los iniciadores producen cambios irreversibles en el ADN. Los promotores no producen alteraciones en el ADN pero sí un incremento de su síntesis y una estimulación de la expresión de los genes. Su acción sólo tiene efecto cuando ha actuado previamente un iniciador, y cuando actúan de forma repetida. EPIDEMIOLOGÍA El cáncer colorrectal es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado en el mundo. El número de casos nuevos se puede estimar en casos anuales, y es la segunda causa de mortalidad por cáncer en Europa y América del Norte. En España, al igual que en Europa, el cáncer colorrectal se sitúa como la segunda causa de mortalidad por cáncer tras el de pulmón. La incidencia de la enfermedad está experimentando un incremento en los últimos 30 años, estimado en un 3 % anual siendo más importante en el caso de los varones. En EEUU se ha observado en los últimos años una reducción de la mortalidad por este tipo de cáncer, pero esa tendencia no se ha observado en nuestro país. El cáncer colorrectal no es frecuente en personas menores de 40 años. Aproximadamente el 41 % de los individuos diagnosticados son mayores de 75 años y el 52 % de las muertes a causa de este cáncer tienen lugar en este grupo de edad. Las dos terceras partes de los individuos desarrollan el tumor en el colon y el resto en el recto. El cáncer de colon presenta la misma prevalencia en hombres que en mujeres, siendo el cáncer rectal más frecuente en los varones. 33
3 MANEJO DEL CÁNCER COLORRECTAL La cirugía es la mejor alternativa terapéutica en pacientes en fase I y II. La reserción radical es apropiada en la mayoría de los pacientes, mientras que en torno al % de los que tienen cáncer colorrectal primario se asocia a metástasis. A pesar de la cirugía curativa, estos pacientes tienen una probabilidad elevada de recaída o desarrollo de otros tipos de cáncer. Diversos estudios clínicos han demostrado un beneficio adicional de la utilización de quimioterapia junto a la cirugía frente a la cirugía sola en la III fase de la enfermedad, permitiendo que un 60 % de los pacientes tengan una supervivencia de 5 años libres de enfermedad. La radioterapia también es frecuentemente considerada tratamiento adyuvante en el cáncer colorrectal. Alrededor del 50 % de los pacientes con CCR metastático (CCRm), tratados con los tratamientos estándar de primera línea desarrollarán una progresión de la enfermedad en un periodo de siete a nueve meses. La media de supervivencia desde el diagnóstico de cáncer colorrectal avanzado es de 6-9 meses. El tratamiento en la fase IV se lleva a cabo con 5 Fluorouracilo/Leucovorin, oxaliplatino e irinotecán en diferentes combinaciones. A pesar del progreso médico y farmacológico, el cáncer metastático colorrectal sigue siendo incurable en casi todos los casos. La tasa de supervivencia a cinco años, no supera el 5 %, por lo que el tratamiento actual para el cáncer avanzado colorrectal es principalmente paliativo, incluyendo además de los tratamientos de quimioterapia, radioterapia o cirugía, el control sintomático y ayuda psicosocial. El objetivo es mejorar la calidad y cantidad de vida restante mientras se controlan los síntomas de la enfermedad. Los pacientes con cáncer colorrectal pueden experimentar una gran variedad de síntomas físicos y psicológicos que reducen la calidad de vida del paciente. La necesidad de un tratamiento mejorado es evidente. CETUXIMAB Cetuximab es un fármaco comercializado en España como Erbitux por el laboratorio Merck. Es un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico cuya diana es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Su mecanismo de acción es mediante la unión selectiva a este receptor, que posee una actividad Tirosin-quinasa y que es estimulado por algunos factores de crecimiento. Este receptor está sobreexpresado en varios tipos de tumores celulares, incluyendo el % de los cánceres colorrectales, estando involucrado en las fases avanzadas de la enfermedad. La sobreexpresión del EGFR está relacionada con un pobre pronóstico para la enfermedad, reduciéndose la supervivencia y siendo más frecuentes las metástasis. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) está también relacionado con la proliferación de células tumorales, la inhibición de la apoptosis y otros procesos requeridos en la progresión del cáncer. Cetuximab presenta una gran afinidad por el EGFR, superior incluso a la del EGF, por lo que compite con dicho ligando al ocupar el receptor. 34
4 Por otro mecanismo de acción Cetuximab induce la internalización del receptor dando lugar a un efecto de down-regulation que permite reducir el número de receptores disponibles y dirige a las células efectoras inmunitarias citotóxicas hacia las células tumorales que expresan EGFR (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo), limitando el progreso de la enfermedad. Los datos obtenidos de los estudios de Cetuximab marcan el camino para pacientes con CCR metastásico, al proporcionar nuevas opciones de tratamiento. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN EGFR El EGFR es capaz de transmitir una gran variedad de señales que pueden generar respuestas celulares tan dispares como pueden ser mitogénesis, supervivencia celular, diferenciación, prevención o inducción de apoptosis e incluso migración celular (Figura 1 (a y b)). Esta variedad de respuestas ante un mismo estímulo puede depender del tipo celular y más genéricamente de las diversas condiciones fisiológicas a las cuales estén sometidas las células. Figura 1 (a y b). La unión del EGFR a su receptor activa una cascada de señales intracelulares que promueve la proliferación y supervivencia celular, así como la activacion de angiogénesis lo cual contribuye a la aparición de metástasis. Virchows Arch (2008) 453:
5 Cuando el ligando extracelular se une al EGFR se produce la dimerización de éste, lo que da lugar a la activación de su tirosina quinasa y la transfosforilación de los residuos de tirosina de su extremo C-terminal. Los residuos de fosfotirosina del receptor activado son reconocidos por proteínas que poseen dominios SH2 o dominios PTB (phosphotyrosin binding). Estas proteínas pueden ser de dos tipos: proteínas adaptadoras que pueden reclutar a otras proteínas transductoras, o bien factores o enzimas directamente transductores/as que tras unirse al receptor son fosforilados por éste, pasando de un estado inactivo a otro activo. Por lo tanto, mediante estos reclutamientos o fosforilaciones se producen cambios conformacionales o cambios en la localización intracelular de estas proteínas señalizadoras, siendo así capaces éstas de transmitir sus mensajes a otros componentes de las diversas rutas intracelulares de transducción de señales. VÍA DE SEÑALIZACIÓN MAPKS La ruta de señalización mejor conocida en diversos organismos e iniciada por el EGFR activado es la vía de las Mapks (Mitogen-activated protein kinases, o proteín cinasas activadas por mitógenos). Ésta se inicia por la proteína adaptadora Grb2 que posee un domino SH2, que interacciona con los residuos de fosfotirosina del receptor, y dos dominios SH3, que interacciona con factores intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEFs) tales como Sos1/2. Así, tras la formación del complejo Grb2/Sos, éste se trasloca a la membrana plasmática estimulando el intercambio de nucleótidos en Ras, transformando Ras-GDP (forma inactiva) en Ras-GTP (forma activa). El Ras activo es capaz de interaccionar y activar a las serina/treonina quinasas Raf-1, A-Raf y B- Raf (o más genéricamente denominadas MAPKKKs, por mitogen-activated protein kinase kinase kinases). Estas últimas a su vez fosforilan a las tirosina/treonina quinasas duales MEK1/2, y éstas finalmente fosforilan a las serina/treonina quinasas ERK1/2 (por extracellular-regulated kinases 1 y 2, también denominadas MAPKs). (Figura 2). Una vez que las ERK1/2 son activadas, éstas pueden fosforilar a diferentes proteínas dianas localizadas en la membrana plasmática y en el citoplasma, dando lugar a la activación de otras vías de señalización o traslocarse al núcleo y fosforilar diversos factores de transcripción como son, entre otros, c-myc, c-jun, c-fos, Elk-1 y p62tcf, produciendo así la activación o la represión transcripcional de determinados genes. 36
6 Figura 2. Vías de señalización del EFGR. Scaltriti and Baselga, 2006 EL DESCUBRIMIENTO DEL KRAS COMO BIOMARCADOR Si bien la familia de oncogenes RAS ha estado implicada en la biología del cáncer humano durante más de 20 años, es ahora cuando se dispone de datos convincentes que trasladan la investigación preclínica a la práctica clínica. Se ha demostrado clínicamente que el gen KRAS, miembro de la familia RAS, desempeña un papel clave en la vía de señalización del EGFR. La estimulación de este receptor causa la activación de moléculas (RAS) que unen el GTP, lo cual activa en forma simultánea varias cascadas intracelulares que median la proliferación y progresión en el ciclo celular, contribuyendo a la progresión del tumor mediante la modulación de eventos como la proliferación, adhesión y angiogénesis. La indemnidad de esta vía sería un blanco para lograr tratamientos eficaces. Mutaciones en las vías KRAS, NRAS, BRAF, PI3K, LKB y otras separarían tumores con mejor o peor pronóstico desde el punto de vista biológico y de respuesta clínica. Las mutaciones en el gen KRAS, que se encuentran aproximadamente en el 40 % de los canceres colorrectal metastasico (CCRm), inducen la activación de forma constitutiva de la proteína KRAS, 37
7 que provoca una señalización continua con independencia de si el propio EGFR se ha activado o inhibido terapéuticamente. Sin embargo, la actividad de KRAS no mutado (wild type) está estrechamente regulada y no induce una señalización continua que promueva la progresión del cáncer. MECANISMO DE ACCIÓN DEL GEN KRAS Tras la unión del ligando, la activación del EGFR provoca la transmisión de una señal intracelular a través de múltiples proteínas, entre ellas el gen KRAS. Esta señalización promueve la proliferación de las células cancerosas y la aparición de metástasis, activando la progresión del tumor. (Figura 3a). Las terapias anti-egfr actúan bloqueando la activación del EGFR. En presencia de KRAS no mutado, provoca la inhibición de la señalización, inhibiendo la progresión del cáncer (Figura 3b). Sin embargo, el gen KRAS mutado interfiere en la eficacia de las terapias anti-egfr, dando lugar a una proteína KRAS mutada que se mantiene activa de forma constitutiva, transmitiendo señales aún cuando el EGFR esté inhibido. (Figura 3c). Figura 3 a. Normalmente la activación del EGFR promueve la progresión del cáncer. Figura 3 b. En presencia de KRAS no mutado, las terapias anti- EGFR inhiben la progresión del cáncer bloqueando la activación del EGFR Figura 3 c. Sin embargo, KRAS mutado interfiere en la eficacia de las terapias anti-egfr, ya que promueve una señalización continua y la progresión del tumor. 38
8 Por lo tanto, el test de determinación del estado de la mutación del gen KRAS, mejora la selección de los pacientes, definiendo que pacientes se beneficiarán con tratamientos nóveles. La detección de la mutación del gen KRAS puede ayudar a predecir los resultados terapéuticos en el CCRm. (Figura 4). Figura 4. Mecanismo de acción de Cetuximab Si bien la familia de oncogenes RAS ha estado implicada en la biología del cáncer humano durante más de 20 años, es ahora cuando se dispone de datos convincentes que trasladan la investigación preclínica a la práctica clínica. Se ha demostrado clínicamente que el gen KRAS, miembro de la familia RAS, desempeña un papel clave en la vía de señalización del EGFR Esta selección de pacientes permitirá: 1) Aumentar al máximo las tasas de respuesta, el control de la enfermedad y la supervivencia libre de progresión. 2) Evitar efectos secundarios innecesarios en pacientes que no se beneficiarían del tratamiento. 3) Redirigir a los pacientes con KRAS mutado a terapias alternativas. 4) Evitar gastos desmesurados. 39
9 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MUTACIONES EN KRAS El análisis de mutaciones en el gen KRAS incluye cuatro pasos: 1) Selección de pacientes susceptibles de análisis. 2) Selección del área tumoral de interés. 3) Extracción de ADN. 4) Análisis de las mutaciones. La mayoría de las mutaciones detectadas hasta el momento en el gen KRAS ocurren en el codón 12 o 13 del gen, aunque también se ha detectado algunas mutaciones en el codón 61. Actualmente, no existe una técnica gold-standard para la determinación de mutaciones en KRAS. Los métodos de detección de mutaciones en el gen KRAS se resume en la Tabla 1. Tabla 1. Métodos usados para la determinación de Genotipos de KRAS- 40
10 Muchos de estos métodos, son elaborados en los laboratorios pero no están disponibles comercialmente para su uso diagnóstico. Actualmente, están disponibles dos kits comerciales, con marcado CE para la determinación de dichas mutaciones: DxS Diagnostic Innovations, [Manchester, UK]) y ViennaLab Diagnostic GmbH. A pesar de existir varios estudios en los que se realiza estudios comparativos de los diferentes métodos, no se ha llegado a ningún consenso en cuanto al mejor método de análisis, por lo que no existe estandarización al respecto, aunque en el tercer Congreso Internacional de Anatomía Patológica celebrado en Barcelona en 2008 se propusieron algunas recomendaciones que se resumen en el siguiente trabajo KRAS mutation testing for predicting response to anti-egfr therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program. Virchows Arch (2008) 453: Test de mutación TheraScreen K-RAS (DxS Diagnostic Innovations, Manchester, UK). Fue el primero en disponer de la validación clínica del Marcado CE para el diagnóstico de mutaciones de tumores específicos en pacientes con cáncer colorrectal. El test detecta siete mutaciones en los codones 12 y 13 del oncogen K-RAS. El ensayo de PCR en tiempo real basado en la tecnología Scorpions de DxS permite detectar las siete mutaciones del gen K-RAS en ADN genómico normal. Este método es altamente selectivo. Siempre que se disponga de suficientes copias de ADN, existe la posibilidad de detectar aproximadamente un 1% de mutaciones en el ADN genómico normal. (Figura 5). 1. Extracción de ADN de tejido incluido en parafina 2. Preparación de la reacción de PCR 3. Amplificación (PCR tiempo real) 4. Análisis de resultados (evaluación de Ct) e interpretación Figura 5. Test de mutación TheraScreen K-RAS (DxS Diagnostic Innovations, Manchester, UK). 41
11 Los ensayos en tiempo real de Scorpions utilizan el número de ciclos de PCR necesarios para detectar una señal de fluorescencia superior a la señal de referencia como medida de las moléculas diana presentes al comienzo de la reacción. El punto en el que se detecta una señal superior a la lectura de fluorescencia de referencia se denomina ciclo umbral (Ct). 2. Test de mutación ViennaLab Diagnostic GmbH. El ensayo K-ras StripAssay para la identificación de mutaciones K-ras está basado en ensayos de PCR e hibridación reversa. Los alelos mutados son detectables cuando están presentes en al menos un 1% con respeto al gen K-ras wild-type. El procedimiento incluye tres pasos: (1) aislamiento del ADN, (2) amplificación PCR utilizando primers marcados con biotina, (3) hibridación de los productos de amplificación en tiras que contienen sondas de oligonucleótido alelo específico fijadas en líneas paralelas. (Figura 6). Figura 6. Determinación de mutaciones del gen KRAS mediante PCR e hibridación alelo específica (ViennaLab Diagnostic GMBH). 42
12 BIBLIOGRAFIA Baselga J. The EGFR as a target for anticancer therapy focus on cetuximab. Eur J Cancer. 2001;37(suppl ):S16-S22. Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Oncogenic activation of the RAS/ RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res. 2007;67(6): Burt RW, Bishop DT, Lynch HT, et al. Risk and surveillance of individuals with heritable factors for colorectal cancer. WHO Collaborating Centre for the Prevention of Colorectal Cancer. Bull World Health Organ 1990;68(5): Chau I, Cunningham D. Adjuvant chemotherapy in colon cancer: state of the art. ASCO educational book, 38th annual meeting. 2002: Conlin A, Smith G, Carey FA, Wolf CR, Steele RJC. The prognostic significance of K-ras, p53, and APC mutations in colorectal carcinoma. Gut. 2005;54(9): Cunningham D, Findlay M. The chemotherapy of colon cancer cannot be ignored. Eur J Cancer 1993; 29A: Esteller M, González S, Risques RA, et al. K-ras and p16 aberrations confer poor prognosis in human colorectal cancer. J Clin Oncol. 2001;19(2): J.J. Viñes, E. Ardanaz, A. Arrazola, I. Gaminde.Epidemiología poblacional de cáncer colorrectal: revisión de la causalidad. Ann Sis San Navarra 2003;26(1): Khambata-Ford S, Garrett CR, Meropol NJ, et al. Expression of epiregulin and amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol. 2007;25(22): Lièvre A, Bachet J-B, Le Corre D, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66(8): London Cancer New Drugs Group. Cetuximab in metastatic colorectal cancer. APC/DTC Briefing. June Disponible en nhs.uk/documents/cetuximab_ june2005.pdf?id=
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