Evaluación de los métodos fenolcloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo

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1 Artículo de reflexión doi: Evaluación de los métodos fenolcloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo Alveiro Antonio Alvis-Arango*, Bacter. 1, Luz Eliana Giraldo-Vásquez, MsC. 2 1 Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, Regional Noroccidente, Medellín, Antioquia, Colombia Institución Universitaria Tecnológico de Antioquia, Facultad de Ciencias Forenses y de la Salud, Medellín, 2 Antioquia, Colombia Recibido: 8 de julio del 2015 Aprobado: 28 de septiembre del 2015 *Autor de correspondencia: Alveiro Antonio Alvis-Arango. Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, Medellín, Antioquia, Colombia. Calle 64B n , Torre 5, Int Teléfonos: Correo electrónico: alanalvis@ medicinalegal.gov.co Cómo citar este artículo: Alvis-Arango AA, Giraldo-Vásquez LE. Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo. Colomb. Forense 2015; 2(1): doi: cf.v3i Resumen. Propósito: encontrar factores para seleccionar métodos de extracción de material genético como el fenol-cloroformo y las columnas de sílice, a fin de utilizarlos en el análisis genético, en el marco de las políticas del Gobierno de Colombia de la Ley de Justicia y Paz. Descripción: se hizo un estudio descriptivo aplicando los dos principales métodos de extracción de adn óseo; se analizaron muestras problema que inicialmente no arrojaron resultados reproducibles y verificables. Punto de vista: según los resultados obtenidos, se halló que el tiempo de digestión para las muestras óseas sometidas a extracción de adn por el método de columnas de sílice mejora cuando se hace a las dos horas. Conclusiones: el adn extraído por el método de columnas de sílice es mejor en la recuperación, pero debe ser analizado lo más pronto posible; de lo contrario, el material se degrada si se conserva refrigerado. Este fenómeno no ocurre en extracciones con fenol-cloroformo. Palabras clave: adn, genética forense, identificación de métodos, tejido óseo. BY NC ND p-issn e-issn

2 Artículo de reflexión doi: Evaluation of phenol-chloroform and silica columns methods for dna extraction from bone tissue Abstract. Purpose: To find factors for selecting genetic material extraction methods such as phenol-chloroform and silica columns in order to use them in genetic analysis, in the framework of the policies of the Justice and Peace Act issued by the Government of Colombia. Description: A descriptive study was conducted using two main methods for dna extraction from bone tissue; test samples that initially did not yield reproducible and verifiable results were analyzed. Point of view: According to the results, it was found that the digestion time for bone samples subjected to dna extraction by the silica columns method improves when performed within two hours. Conclusions: dna extracted by the silica columns method is better for recovery, but must be analyzed as soon as possible; otherwise, the material deteriorates when stored refrigerated. This phenomenon does not occur in extractions with phenol-chloroform. Keywords: dna, forensic genetics, method identification, bone tissue. Avaliação dos métodos fenol- clorofórmio e colunas de sílica para extração de dna a partir de tecido ósseo Resumo. Propósito: encontrar fatores para selecionar métodos de extração de material genético como o fenol-clorofórmio e as colunas de sílica a fim de utilizá-los na análise genética, no âmbito das políticas do Governo da Colômbia da Lei de Justiça e Paz. Descrição: fezse um estudo descritivo que aplicou os dois principais métodos de extração de dna ósseo; analisaram-se amostras-problema que inicialmente não deram resultados reproduzíveis e verificáveis. Ponto de vista: segundo os resultados obtidos, constatou-se que o tempo de digestão para as amostras ósseas submetidas à extração de dna pelo método de colunas de sílica melhora quando se faz às duas horas. Conclusões: o dna extraído pelo método de colunas de sílica é melhor na recuperação, mas deve ser analisado o mais breve possível; do contrário, o material se degrada se for conservado refrigerado. Esse fenômeno não ocorre em extrações com fenol-clorofórmio. Palavras-chave: dna, genética forense, identificação de métodos, tecido ósseo. BY NC ND

3 Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo 71 Introducción El conflicto armado en Colombia ha tenido como consecuencia la desaparición de muchísimas personas. La Fiscalía General de la Nación reportó casos de cadáveres en condición de no identificados en cementerios municipales, según un censo nacional informado por una cuarta parte de las seccionales del país [1]. La identificación de un cadáver en condición de no identificado (cni) se convierte en una misión humanitaria y social [2, 3]; es así como se considera importante saber dónde se encuentran los restos, recibir la confirmación de la muerte y hacer el duelo en las condiciones que se crean necesarias, atendiendo a los principios de dignidad y de respeto por las creencias culturales y religiosas. Desde el punto de vista jurídico, el fallecimiento de una persona tiene implicaciones legales, especialmente en Colombia donde es un hecho el proceso de reparación a las víctimas como una estrategia del Estado para compensar a las familias y a las comunidades. Los procesos de identificación de una persona en condición de no identificado tienen varios grados de complejidad. Cuando se trata de cadáveres bien conservados o frescos, se cuenta con herramientas que permiten hacer identificaciones con óptimos criterios de oportunidad. Estos recursos van desde la información fisonómica (peso, talla, edad, características físicas, cicatrices, tatuajes), pasando por la documentación personal encontrada en el cadáver, hasta la identificación necrodactilar, principal método empleado en identificaciones fehacientes [4, 5, 6]. Los fenómenos que se presentan cuando un organismo fallece generan procesos de degradación y destrucción de todas sus biomoléculas (incluido el adn), los cuales serán iniciados por las propias enzimas del organismo (autolisis), luego por la invasión de bacterias, hongos, insectos o animales de rapiña, y finalmente, por procesos químicos, principalmente hidrólisis (fragmentación del adn) y oxidación (modificación del adn), que completarán la degradación del material genético [7]. En cuerpos en avanzado estado de descomposición o esqueletados, se debe recurrir al análisis del perfil genético del cadáver y a su comparación con los perfiles de presuntos familiares. Esto hace necesario disponer de métodos científicos, viables y rápidos, que apoyen el proceso de identificación. Sin embargo, la obtención de perfiles genéticos a partir de estructuras óseas está limitado por el tipo de muestra, las condiciones del enterramiento y las características del medio ambiente en el que están depositadas [8], aspectos que pueden lentificar o acelerar la degradación (temperatura, humedad, ph o la presencia de ciertos compuestos en el suelo que interfieren con la reacción en cadena de la polimerasa) [9]. Debido a la variabilidad en la preservación de las muestras ingresadas a los laboratorios de genética forense, suele optarse por diversas estrategias para la extracción del material genético, como el fenol-cloroformo y la extracción con columnas de sílice. El interés del presente trabajo es revisar los pasos en la extracción que puedan afectar los resultados y optimizar la calidad del adn recuperado de las muestras a partir del uso de fenol-cloroformo y columnas de sílice, actualmente utilizados de rutina. Así mismo, se pretende hacer ajustes que aumenten los estándares de calidad y maximización de recursos que se traduzcan en disminución de tiempos de respuesta de los informes periciales para este tipo de casos. Materiales y métodos Tipo de estudio: descriptivo Selección de muestras: se tomaron 34 muestras a conveniencia de restos óseos que previamente habían sido analizados y habían sido limpiados de tejidos e impurezas. Se aplicó el método de extracción de fenol-cloroformo a 8 muestras ya procesadas por el método de columnas de sílice, con resultados óptimos para adn. Para el método de columnas de sílice, se utilizaron 12 muestras con resultado positivo de adn y 14 muestras con resultado inicial negativo de adn. Todas estas muestras permanecieron bajo reserva por un año. Cantidad de la muestra para extracción: se utilizaron cantidades de 1 y 2 g de pulverizado de hueso para ambas extracciones. Extracción orgánica de adn a partir de tejido óseo (método de fenol-cloroformo): la digestión es un proceso común en los métodos de extracción de adn que serán analizados: consiste en decalcificar la muestra utilizando un agente quelante (edta), puesto que las sales minerales pueden interferir en procesos posteriores. Para este proceso, se utiliza

4 72 Artículo de reflexión Colombia Forence / Volumen 2, Número 1 / enero-diciembre 2015 proteinasa k (enzima proteolítica que lisa las proteínas de la membrana celular), con lo que se libera el adn al medio acuoso [10, 11, 12]. A las muestras pulverizadas se les hicieron tres lavados con edta 0,5 m; se cubre el pulverizado, se agita manualmente y luego se lleva a centrífuga refrigerada (4 C) por cinco minutos a 3000 rpm. Luego de cada lavado, se descartó el sobrenadante. Al pellet final se le adicionaron 8 ml de edta 0,5 m; 500 μl de proteinasa k y 80 μl de Tween 20. Se incubaron las muestras a 56 C con agitación, y se hicieron revisiones de la digestión a las dos y a las doce horas. Después de la digestión [10, 13, 14], el adn se purificó con solventes orgánicos para que los ácidos nucleicos insolubles en fenol y solubles en cloroformo se separaran en dos fases: la superior acuosa, donde están presentes los ácidos nucleicos, y la fase del fondo con fenol y cloroformo y las demás moléculas, como proteínas y grasas, que inhiben la amplificación de los ácidos nucleicos [15]. Luego de este proceso, el adn extraído se concentró en columnas de purificación [9]. Extracción de adn a partir de hueso utilizando columnas de sílice: para la decalcificación y digestión del pulverizado de hueso, se adicionaron 15 ml de buffer de desmineralización (edta 0,5 m/ n-laurilsarcosinato de sodio 1%) y 1 ml de proteinasa k; se homogenizó e incubó a 56 C en horno de agitación (evaluando la digestión de las muestras a las dos y a las doce horas). El método se fundamenta en la utilización de columnas de sílice. El adn se asocia con el hidrocloruro de guanidina presente en el buffer de unión (pb), lo que facilitó la unión altamente específica entre las partículas de sílice presentes en la membrana de la columna y el material genético, mientras que los contaminantes pasan por medio de esta. Para la ultrafiltración, la purificación, el lavado y la elución, se siguieron los procedimientos sugeridos en los kits comerciales [9] y los procedimientos estandarizados de trabajo [16]. Se ajustó el ph de la solución reguladora pb como lo indica el fabricante. La recuperación de adn se hizo con buffer de elución (eb) como lo indica el procedimiento, y adicional a esto se modificó utilizando agua Milli-q como lo indican los protocolos internacionales. Amplificación, cuantificación y secuenciación Amplificación vía pcr (Reacción en Cadena de la Polimerasa): el procedimiento de pcr [17, 18] permitió la amplificación in vitro de regiones específicas de adn por medio de pcr, que consta de tres etapas fundamentales: denaturación del adn, anillaje de los Fluoroprimers y la extensión por medio de la Taq (Thermus aquaticus) adn polimerasa. Cada etapa se llevó a cabo a temperaturas específicas establecidas en los programas de termociclaje. La amplificación simultánea de los loci str fue posible mediante el uso de primers específicos para estos sistemas con pcr múltiplex, empleando Identifiler, Yfiler y Power Plex hs y esx [19, 20]. Cuantificación: se llevó a cabo mediante la reacción en cadena de polimerasa [pcr], en tiempo real, empleando el kit Plexor, que es específico de adn humano [21]. Secuenciación: se llevó a cabo utilizando el analizador genético Genetic Analyzer abi 3130 [22]. El análisis de los electroferogramas se hizo por medio del software GeneMapper, siguiendo las instrucciones de la guía de operación para el analizador [22]. Verificación de la calidad e integridad del adn en el tiempo: se hizo cuantificación de adn mediante el Kit Plexor al momento de la extracción a cada uno de los extractos obtenidos en los ensayos anteriores. Para esto, se almacenaron las submuestras a -20 o C y a 4 o C por un periodo de 8, 15 y 30 días, y posteriormente fueron cuantificadas. Resultados y discusión La extracción en las muestras óseas sigue siendo un proceso trascendental en la obtención de material genético de buena calidad. El alto porcentaje de fracasos se debe a inhibidores que podrían eliminarse en este paso; si bien se pueden hacer intentos intermedios en otras fases del proceso, no deja de ser una gran preocupación de los Laboratorios de Genética que se desempeñan con este tipo de muestras. En el caso de las muestras analizadas, la cantidad de adn recuperado en las que tenían buenas

5 Evaluación de los métodos fenol-cloroformo y columnas de sílice para extracción de adn a partir de tejido óseo 73 condiciones de conservación y preservación no implicó pérdida sustancial de material genético, y su recuperación se logró con un gramo de muestra ósea pulverizada para los dos métodos de extracción evaluados. La cantidad de muestra influyó en los resultados y en la obtención de adn. Todas aquellas que no arrojaron resultados iniciales con un gramo de pulverizado de resto óseo y que se reprocesaron nuevamente con dos gramos mostraron resultados de adn en el 90% de los casos. La digestión mostró mejores resultados acortando el tiempo. En el método de extracción por columnas de sílice, se pudo evidenciar que la muestra pierde cantidad y calidad de material genético después de las dos horas de digestión, lo cual impide obtener un perfil genético, o que presenta picos inespecíficos que dificultan la interpretación debido a la deficiencia en la calidad del adn. Esto puede asociarse a rupturas por acción del calor prolongado y a la exposición a agentes quelantes. Ajustar el ph en el proceso de adición del buffer pe por el método de extracción con columnas de sílice evidencia un cambio en las muestras con el indicador de ph, sin adición del acetato de sodio necesario para ajustar el ph. Esto permite concluir que lo más adecuado es utilizar buffer preparado recientemente o garantizar que el ph sea adecuado, aspecto que está contemplado en las instrucciones del fabricante. Se pudo evaluar la trazabilidad de una muestra guardada en condiciones de refrigeración, y se encontró que a los 15 días la pérdida del adn autosómico fue de un 99% y la del cromosoma y fue de un 90%; al día 30 no se logra detectar por la cuantificación adn suficiente para análisis. Revisando los procedimientos, se confirmó que el extracto de adn se debe guardar en congelacion a -20 ºC [9] (figura 1). Es importante considerar los problemas de degradación posterior a la extracción, situación que no contribuye a la obtención de resultados completos y reproducibles, lo cual causa un incremento en los reprocesos y aumenta el tiempo de respuesta de los casos dentro de los laboratorios. La recuperación final del adn utilizando buffer eb arroja buenos resultados, aunque el adn obtenido se pierde en el proceso de conservación y puede hacer perder su estabilidad. Se hizo un ensayo utilizando agua Milli-q y se obtuvieron mejores efectos. Someter a más agentes al proceso de la muestra dentro de la extracción y complementado con el tiempo de almacenamiento puede afectar. Optimizar un poco empleando agentes más neutros como el agua, se puede llegar a traducir en análisis positivos a futuro. 5,52 Autosomico Cromosoma Y 0,801 0,546 0,0292 0,0814 0,0853 Dia 1 Dia 15 Dia 30 Figura. Cuantificación de adn autosómico y cromosoma y días 1, 15 y 30 Fuente: elaboración propia Aunque el número de muestras no fue representativo durante el presente estudio por los costos que se generan dado el tipo de análisis, los resultados muestran una tendencia que se puede considerar para futuras investigaciones que permitirán llegar a mayores conclusiones frente a los procesos de extracción. Referencias [1] Semana.com. Documentan más de casos de cadáveres sin identificar en Colombia. Revista Semana [internet] nov 10. Disponible en: [2] Vallejo G, Alonso A. La identificación genética en grandes catástrofes: avances científicos y normativos en España. Rev Esp Med Legal. 2009;35: [3] Crespillo M, Bañón R, Valverde JL. Aprendizaje y reflexiones de la identificación de cadáveres mediante marcadores genéticos monoparentales (adn mitocondrial, cromosoma y). A propósito de un caso. Rev Esp Med Legal. 2011;37: [4] Barrio-Caballero PA. Revisión de métodos de extracción de adn a partir de restos óseos en el laboratorio forense. Rev Esp Med Legal. 2013;39(2): [5] Instituto Nacional de Justicia. Mass fatality incidents: a guide for human forensic identification. Washington: Departamento de Justicia de Estados

6 74 Artículo de reflexión Colombia Forence / Volumen 2, Número 1 / enero-diciembre 2015 Unidos; Disponible en: gov/pdffiles1/nij/ pdf [6] Giannelli PC, Imwinkelried EJ, Peterson JL. Reference guide on forensic identification expertise. En: Federal Judicial Center, editor. Reference manual on scientific evidence. 3. a ed. Washington: National Academies Press; p [7] Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of dna. Nature. 1993;362: [8] Fernández E. Polimorfismos de dna mitocondrial en poblaciones antiguas de la Cuenca del Mediterráneo [tesis doctoral]. [Barcelona]: Universidad de Barcelona; [9] Qiagen. qiaquick pcr purification kit for purification of pcr products, 100 bp to 10 kb. Hilden: Qiagen; [10] Hänni C, Brousseau T, Laudet V, Stehelin D. Isopropanol precipitation removes pcr inhibitors from ancient bone extracts. Nucleic Acids Res. 1995;23(5): [11] Rogan PK, Salvo JJ. Study of nucleic acids isolated from ancient remains. Yearb Phys Anthropol. 1990;33: [12] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory guide. 2. a ed. Salem: Cold Spring Harbor Laboratory Press; [13] Hagelberg E, Clegg JB. Isolation and characterization of dna from archaeological bone. Proc R Soc Lond B Biol Sci.1991;244: [14] Yang DY, Eng B, Waye JS, Dudar JC, Saunders SR. Improved dna extraction from ancient bones using silica-based spin columns. Am J Phys Anthropol. 1998;105: [15] Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses (inmlcf). Procedimiento estandarizado de trabajo. Extracción orgánica de adn a partir de tejido óseo y diente. Bogotá: inmlcf; [16] Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses inmlcf. Procedimiento estandarizado de trabajo. Extracción de adn a partir de hueso usando columnas de sílice. Bogotá: inmlcf; [17] Pääbo S, Higuchi R, Wilson AC. Ancient dna and the polymerase chain reaction. J Biol Chem. 1989;264: [18] Higuchi R. Dr Russ problem corner. Ancient dna Newsletter. 1992;1:6-8. [19] Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses (inmlcf). Procedimiento estandarizado de trabajo. Amplificación mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (pcr) múltiplex de los marcadores genéticos tipo str y amelogenina incluidos en los kits PowerPlex esx-17, esx-16, esi-17 y esi-16 y su análisis. Bogotá: inmlcf; [20] Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses (inmlcf). Procedimiento estandarizado de trabajo. Amplificación mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (pcr) múltiplex de los marcadores genéticos tipo str y amelogenina incluidos en el kit: PowerPlex16 hs System y su análisis. Bogotá: inmlcf; [21] Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses (inmlcf). Procedimiento estandarizado de trabajo. Cuantificación de adn humano mediante pcr en tiempo real. Bogotá: inmlcf; [22] Applied Biosystems, Curso de hid en el equipo 3130.