EFECTOS DE LA INOCULACIÓN CON BACTERIAS LÁCTICAS SELECCIONADAS SOBRE LA PRODUCCIÓN DE FENOLES VOLÁTILES POR BRETTANOMYCES

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1 EFECTOS DE LA INOCULACIÓN CON BACTERIAS LÁCTICAS SELECCIONADAS SOBRE LA PRODUCCIÓN DE FENOLES VOLÁTILES POR BRETTANOMYCES Vincent GERBAUX 1, Carole BRIFFOX 1, Ann Dumont 2, Sibylle KRIEGER 3, Carlos Suarez 4, Jose María Heras 4 1 Institut Français de la Vigne et du Vin (IFV) France, 6 rue du 16e Chasseurs, Beaune, Francia 2 Lallemand, 1620, rue Préfontaine, Montréal QC Canadá H1W 2N8 3 Lallemand S.A., 19 rue des Briquetiers, Blagnac CEDEX, Francia 4 Lallemand España-Portugal., Zurbano 71, Madrid, España Agradecimientos Los autores quieren expresar su agradecimiento al Dr. Richard Morenzoni por la revisión de este documento, así como a Lallemand (Montreal, Canadá) y al Bureau Interprofessionnel des Vins de Bourgogne (Beaune, Francia) por su apoyo a esta investigación. 1. Introducción El control de la fermentación maloláctica (FML) mediante inoculación de bacterias malolácticas seleccionadas ayuda a preservar la calidad de los vinos, ya que previene el desarrollo de las levaduras indeseables del género Brettanomyces. Gracias a las mejoras en el proceso de FML, el enólogo consigue una rápida estabilización del vino, lo que reduce el tiempo disponible para el crecimiento de Brettanomyces. A nivel experimental se vio que los vinos elaborados con una adecuada inoculación de bacterias malolácticas contenían pocos fenoles volátiles o bien éstos no estaban presentes. Por el contrario, en los vinos que no habían sido inoculados con bacterias malolácticas, la FML no siempre arrancó y en general estos vinos contenían fenoles volátiles. Estos resultados fueron obtenidos en ensayos de laboratorio llevados a cabo con vinos inoculados con Brettanomyces, así como en ensayos en bodega con vinos que contenían poblaciones indígenas de Brettanomyces. Una parte de los resultados han sido publicados por Gerbaux et al. en El análisis sensorial confirmó una pérdida de calidad a causa de la contaminación por Brettanomyces. La inoculación de los vinos tintos con bacterias malolácticas representa por tanto una interesante herramienta para reducir el riesgo de aparición de fenoles volátiles en los vinos. 2. Materiales y Métodos 2.1 PROTOCOLOS DE VINIFICACIÓN Los vinos utilizados en estos ensayos fueron elaborados con uvas Pinot Noir de la denominación Bourgogne Hautes Côtes de Beaune en una bodega experimental de Francia, así como en una bodega industrial. Para las pruebas de laboratorio se utilizaron tres depósitos de vinos Pinot Noir procedentes de diferentes viñedos y vinificados en la bodega experimental. En esta bodega experimental, las maceraciones se llevaron a cabo en depósitos de acero inoxidable de 250 litros a temperatura controlada. Se eligió este tamaño de depósito ya que proporciona una geometría del sombrero que es fundamental a la hora de reproducir los vinos tintos elaborados en fermentadores de tamaño comercial. La fermentación alcohólica se hizo iniciar con la adición de las levaduras enológicas seleccionadas Lalvin RC212 (Lallemand, Montreal, Canadá) a una dosis de 20 g/hl, y durante la fermentación se efectuaron regularmente bazuqueos. Al inicio la temperatura de fermentación fue mantenida a 20 C, pero luego alcanzó los 32 C para permitir que concluyese la fermentación. Con el fin de aumentar la extracción de polifenoles y para estabilizar mejor el color, los vinos fueron calentados a 42 C durante 24 horas justo antes del trasiego (Gerbaux et al. 2003). La duración total de la fermentación fue de 10 días; a continuación se efectuó el prensado mediante una prensa hidráulica vertical. El vino de lágrima y el primer prensado se mezclaron y a continuación se efectuó el desfangado que duró tres días. Los vinos experimentales obtenidos se decantaron en botellas de vidrio de 20 litros. 1

2 Una vez concluida la fermentación alcohólica, estos vinos se conservaron a 4 C, y se les identificó como PN1. Los vinos de la misma variedad elaborados en una bodega industrial fueron utilizados para una experimentación a mayor escala. Una vez concluida la fermentación alcohólica, estos vinos fueron identificados como PN2 y PN3. Los análisis químicos de los vinos producidos se muestran en la Tabla CULTIVOS DE BRETTANOMYCES En las pruebas efectuadas en laboratorio se utilizaron las cepas LO2B4, LO2C1, LO2A1 y LO3D1 de Brettanomyces bruxellensis. Estas cepas fueron aisladas en Francia por el IFV France, Unidad de Beaune, a partir de vinos Pinot Noir y fueron caracterizadas genéticamente mediante electroforesis en gel de campo pulsado. Antes de ser utilizadas, estas levaduras se cultivaron en un medio (YPD) de extracto líquido de levadura / peptona /dextrosa (10 g/l extracto de levadura, 20 g/l peptona y 20 g/l glucosa, ph 4,8). Cuando los cultivos alcanzaron el final de su fase de crecimiento exponencial, fueron utilizados para inocular los vinos experimentales a dosis de 1 x 102 o 1 x 104 ufc/ml. Las poblaciones viables de Brettanomyces fueron cultivadas en placas sobre medio de cultivo sólido constituido por 20 g/l glucosa, 10 g/l extracto de levadura, 20 g/l peptona, 100 mg/l ácido p-cumárico, 100 mg/l ácido ferúlico y 20 g/l de agar, a ph 4,8. El desarrollo de bacterias lácticas y levaduras en este medio fue impedido mediante la adición de 100 mg/l de cloranfenicol y 50 mg/l of cicloheximida. El conteo de las colonias presentes se efectuó tras cinco-seis días de incubación a 28 C. 2.3 BACTERIAS LÁCTICAS Las bacterias lácticas, disponibles en el mercado, utilizadas para realizar la fermentación maloláctica fueron bacterias Oenococcus oeni y fueron etiquetadas como Lalvin 31 y FML Expertise S. Todas las cepas fueron proporcionadas por Lallemand en Montreal, Canadá y fueron rehidratadas durante 15 minutos en agua a 20 C antes de ser utilizadas. Las poblaciones de bacterias lácticas viables se determinaron mediante siembra en placas sobre medio MRS solidificado según el método descrito por Nault et al El desarrollo de levaduras en este medio fue impedido mediante la adición de 50 mg/l de natamicina (Gist Brocades, Holanda). Las colonias presentes fueron contadas al cabo de seis-diez días de incubación a 28 C. 2.4 ANÁLISIS QUÍMICOS Se efectuó el análisis por cromatografía de gases de las muestras de vino, estabilizadas mediante la adición de 100 mg/l de SO2, para determinar los fenoles volátiles 4-etil fenol y 4-etil guaiacol. El seguimiento de la FML se efectuó mediante análisis enzimático del ácido L-málico (SCIL Diagnostics, Viernheim, Alemania). Se realizó un análisis sensorial con un panel de científicos y enólogos de Borgoña y las estadísticas fueron elaboradas utilizando el software para la generación, adquisición y tratamiento de las sesiones FIZZ (Biosystèmes, Couternon, Francia). 2

3 2.5 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES Los ensayos 1 y 2 fueron llevados a cabo utilizando PN1, un vino Pinot Noir elaborado en la bodega experimental. El ensayo 3 fue efectuado utilizando PN2, y el ensayo 4 fue realizado utilizando PN3, que eran vinos Pinot Noir elaborados en una bodega industrial. 2.6 ENSAYOS EFECTUADOS EN LABORATORIO ENSAYO 1: INOCULACIÓN DE BRETTANOMYCES Y DE BACTERIAS MALOLÁCTICAS Estas series de ensayos de laboratorio se efectuaron en matraces de 250 ml. Las bacterias malolácticas Lalvin 31 y FML Expertise S fueron inoculadas en el vino a dosis de 2 x 106 ufc/ml y las cepas de Brettanomyces bruxellensis L02B4, L02C1, L03A1 y L03D1 fueron inoculadas en el mosto a dosis de 1 x 102 o bien de 1 x 104 ufc/ml. La inoculación de Brettanomyces fue llevada a cabo siete días antes de la inoculación de las bacterias malolácticas o bien siete días después de la inoculación de bacterias malolácticas. Todos los matraces fueron incubados a 18 C y comparados con un testigo no inoculado. Los resultados se muestran en las Figuras 1A, 1B y 1C ENSAYO 2: EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE FENOLES VOLÁTILES POR BRETTANOMYCES ANTES Y DESPUÉS DE LA INOCULACIÓN DE BACTERIAS MALOLÁCTICAS Estas series de ensayos de laboratorio analizan el efecto de la temperatura y del ph. El ph de las muestras de vino se corrigió para conseguir dos niveles de ph diferentes 3,3 y 3,6 y a continuación se dividieron por igual en matraces de 250 ml. Para cada ph, la mitad de los matraces fueron incubados a 14 C y la otra mitad a 18 C. Para cada combinación de ph/temperatura, había testigos que no habían sido inoculados con bacterias lácticas, y pruebas que fueron inoculadas con Lalvin 31 y FML Expertise S, a dosis de 2 x 106 ufc/ml. Brettanomyces bruxellensis L02B4 se inoculó en el mosto a una dosis de 102 ufc/ml seis días antes de la inoculación de bacterias o bien ocho días después de la inoculación de bacterias. Los resultados se muestran en la Tabla ENSAYOS REALIZADOS EN LA BODEGA COMERCIAL ENSAYOS 3 Y 4: PRUEBAS EN BODEGAS INDUSTRIALES; CONTROL DE FENOLES VOLÁTILES POR INOCULACIÓN CON BACTERIAS MALOLÁCTICAS. Los vinos se dividieron en botellas de vidrio de 20 L y no se efectuó ninguna inoculación de Brettanomyces. Sin embargo, se contó con la presencia de una flora indígena de esta levadura para contaminar los vinos producidos a nivel comercial. El ensayo 3 estudió dos temperaturas de bodega diferentes, C y C, y dos cepas bacterianas, Lalvin 31 y FML Expertise S, inoculadas a dosis de 2 x 10 6 ufc/ml con las dos temperaturas. Los resultados se muestran en la Tabla 3. El ensayo 4 fue llevado a cabo en la bodega a C, a ph 3,36 y 3,60. Se preparó un testigo no inoculado y tres lotes inoculados con Lalvin 31 y FML Expertise S a dosis de 2 x 10 6 ufc/ml. Los resultados se muestran en la Tabla Resultados 3.1 ENSAYO 1: INOCULACIÓN DE BRETTANOMYCES Y BACTERIAS MALOLÁCTICAS. Los efectos de la inoculación con Brettanomyces y con bacterias malolácticas se muestran en las Figuras 1A, 1B y 1C. Todos los vinos inoculados con cultivos iniciadores de BML acabaron la fermentación pero la evolución de la FML dependió de la cepa de bacterias utilizada, con algunas cepas que eran más propicias a una FML rápida que otras. Cuando se efectuó el análisis, la FML había empezado y estaba algo avanzada en los lotes inoculados con Lalvin 31, y había concluido en los lotes inoculados con FML Expertise S. Por experiencia se sabe que Lalvin 31 no es tan rápido en el Pinot Noir como FML Expertise S, pero las FML ligeramente más lentas son una característica buscada en los vinos Pinot Noir. En las otras pruebas, las diferencias de velocidad de la FML no parecieron tan evidentes. Hay que destacar que la adición de Brettanomyces tuvo un efecto muy limitado sobre la FML, como demuestra la relativamente alta cantidad de células de bacterias malolácticas viables presentes en el vino. Por el contrario, los vinos inoculados con bacterias malolácticas contenían un número relativamente bajo de células viables de Brettanomyces. En 3

4 general, la inoculación de Brettanomyces a dosis de 1 x 104 ufc/ml siete días antes de la inoculación de las bacterias Lalvin 31, tendió a retrasar, pero no a impedir, la FML. El testigo no inoculado no inició ni completó la FML, y en consecuencia, la biomasa bacteriana fue nula. 4

5 3.2 ENSAYO 2: INOCULACIÓN EN LABORATORIO DE BACTERIAS MALOLÁCTICAS Y PRODUCCIÓN DE FENOLES VOLÁTILES POR BRETTANOMYCES A DIFERENTES PH Y TEMPERATURAS. Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 2. En todos los casos en los que no se inocularon bacterias malolácticas y se desarrollaron Brettanomyces en el vino, los niveles de 4-etil fenol y 4-etil guaiacol fueron excesivos. La inoculación con cultivos iniciadores de bacterias lácticas y el crecimiento de bacterias malolácticas previno completamente o inhibió fuertemente la producción de fenoles volátiles. A 14 C y ph 3,3, se produjeron fenoles volátiles en vinos inoculados con bacterias ML y Brettanomyces, pero no a los niveles observados cuando no se adicionaron bacterias malolácticas. A 18 C y ph 3,6, no se produjeron fenoles volátiles en los vinos en los que se habían adicionado bacterias lácticas. Estas dos condiciones parecen representar los dos extremos de la influencia ejercida y son más probablemente atribuibles a las condiciones de crecimiento preferidas por las bacterias lácticas, es decir, las bacterias crecen mejor a unos niveles de ph más elevados y a temperaturas más altas. Estas condiciones son más propicias al crecimiento bacteriano, lo que significa que pueden limitar el crecimiento de Brettanomyces y al mismo tiempo la formación de fenoles volátiles. 5

6 Tabla 2. Fenoles volátiles (µg/l) 4-etil fenol (EP) y 4-etil guaiacol (EG) producidos (ensayo 2, vino PN1) 3.3 ENSAYO 3: PRUEBAS IDUSTRIALES; EFETOS DE DOS DIFERENTES TEMPERATURAS DE BODEGA Los resultados de este ensayo efectuado en una bodega industrial se muestran en la Tabla 3. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de laboratorio. En todos los casos, los vinos inoculados con bacterias malolácticas acabaron la FML en un tiempo adecuado. En los vinos producidos a temperaturas más elevadas, la FML fue más rápida que en los vinos a bajas temperaturas. Al igual que en el ensayo 2, los vinos producidos a temperaturas más elevadas, que son más propicios al crecimiento bacteriano, contenían niveles de fenoles volátiles más bajos que los producidos a temperaturas más bajas. La calidad general de los vinos producidos con inoculación de bacterias no se vio afectada por las dos temperaturas de bodega utilizadas, pero en todos los casos, la calidad general fue considerada mejor en los vinos que habían sido inoculados con bacterias ML y que por lo tanto contenían bajos niveles de fenoles volátiles. 6

7 3.4 ENSAYO 4: PRUEBAS INDUSTRIALES; EFECTOS DE DOS NIVELES DE PH DIFERENTES Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 4. Al igual que en el ensayo anterior, estos resultados confirman también los obtenidos en laboratorio. Como se ha visto anteriormente, niveles de ph más bajos tienden a ralentizar el crecimiento de las bacterias malolácticas, dando lugar a FML más largas. En todos los casos, en los lotes inoculados no se detectaron células de Brettanomyces o éstas eran excesivamente pocas, presentando una buena correlación con la sorprendente ausencia de fenoles volátiles. El crecimiento y proliferación de bacterias malolácticas aparentemente impidió la formación de 4-etil fenol y 4-etil guaiacol. 4. Discusión. Gerbaux et al. (2000) mostraron que aproximadamente el 50% de los vinos Pinot Noir de Borgoña, antes de empezar la FML, contienen cantidades variables de Brettanomyces. Por lo tanto, es conveniente limitar la exposición de los vinos a Brettanomyces. Parece que existe una relación entre las bacterias malolácticas y Brettanomyces en el sentido de que el crecimiento de las bacterias parece inhibir el excesivo crecimiento de Brettanomyces y la consiguiente producción de fenoles volátiles, compuestos que afectan negativamente a la calidad del vino. Las condiciones físicas que favorecen unas FML seguras niveles de ph y temperatura elevados fomentan el crecimiento de las bacterias y esto, a su vez, inhibe la proliferación sin restricciones de Brettanomyces. En todos los casos en los que los fenoles volátiles estaban presentes en bajas 7

8 concentraciones o eran inexistentes, la calidad del vino se consideró superior a la de los vinos en los que los fenoles volátiles se encontraban presentes. Los ensayos efectuados a escala comercial confirmaron los resultados obtenidos en laboratorio. En estos ensayos, la presencia natural de levaduras Brettanomyces fue inhibida en la misma medida que las levaduras inoculadas en el vino elaborado en condiciones de laboratorio. En este caso también las bacterias malolácticas inhibieron la producción de cantidades indeseables de fenoles volátiles. 5. Conclusión. Las bacterias malolácticas comerciales pueden ser utilizadas para la inoculación de vinos con el fin de asegurar unas fermentaciones malolácticas adecuadas. También pueden ser utilizadas como herramientas para prevenir la formación de fenoles volátiles indeseables como 4-etil fenol y 4-etil guaiacol. La eliminación o la drástica reducción de estos compuestos da lugar a vinos de calidad superior. Con una buena programación de las fermentaciones alcohólica y maloláctica, se podría conseguir efectuar la fermentación maloláctica inmediatamente después de la fermentación alcohólica. Si se evita el intervalo de tiempo entre el final de la FA y el inicio de la FML, se podría evitar también la presencia de Brettanomyces, ya que el vino se estabilizaría antes. Se puede decir que Brettanomyces es un microorganismo oportunista, que crece sólo cuando no hay otros microbios que le hacen la competencia. Referencias Gerbaux, V., S. Jeudy, and C. Monamy Étude des phénols volatils dans les vins de Pinot noir en Bourgogne. Bull. OIV : Gerbaux, V., C. Briffox, and B. Vincent Optimisation de la macération finale à chaud, intérêt d un enzymage et d une macération sous chapeau immergé pour la vinification du Pinot noir. Rev. Fr Oenol. 201: Gerbaux, V., C. Briffox, A. Dumont, and S. Krieger Influence of inoculation with malolactic bacteria on volatile phenols in wines. Am. J. Enol. Vitic. 60(2): Nault, I., V. Gerbaux, J. P. Larpent, and Y. Vayssier Influence of pre-culture conditions on the ability of Leuconostoc oenos to conduct malolactic fermentation in wine. Am. J. Enol. Vitic. 46(3):