Técnicas de diagnóstico de la EEB y del Scrapie establecidas por la Organización Internacional de Epizootías

Transcripción

1 Técnicas de diagnóstico de la EEB y del Scrapie establecidas por la Organización Internacional de Epizootías La normativa comunitaria que regula el Programa de Vigilancia de las EETs (Reglamento 999/2001) establece que los animales sospechosos de padecer una EET (vigilancia pasiva) serán objeto de un examen histológico conforme a los métodos y protocolos que figuran en la última versión del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la Oficina Internacional de Epizootías (OIE). En caso de que el resultado del examen histopatológico no sea concluyente, sea negativo o de que el material esté autolítico, los tejidos se someterán a uno de los métodos de diagnóstico alternativos previstos en el citado Manual (inmunocitoquímica, inmunotransferencia u observación de las fibrillas características mediante microscopía electrónica). Asimismo, la normativa establece que cuando el resultado de las pruebas de diagnóstico rápido aplicadas a los animales examinados en el marco del Programa de seguimiento anual (vigilancia activa) no sea concluyente o sea positivo, se aplicarán estas mismas técnicas indicadas en el Manual. Hasta el momento no ha sido posible el aislamiento del agente causal de las EETs mediante técnicas in vitro, por lo que se establece que la base para el diagnóstico de este grupo de enfermedades es la demostración de un cuadro lesional característico común a todas ellas. Se trata de un cambio espongiforme simétrico y bilateral del neuropilo de la sustancia gris y/o una vacuolización del pericarion neuronal (con vacuolas simples o múltiples) localizado siempre en núcleos específicos del SNC (perfil lesional), concretamente a nivel de la médula oblongada y el tronco del encéfalo. Así, el método clásico de confirmación de EETs se basa en la demostración de estas lesiones mediante el examen histopatológico de muestras de tejido fijado. Por otro lado, otra característica común de estas enfermedades, ya mencionada anteriormente, es la acumulación (incluso anterior temporalmente a la vacuolización), principalmente en el SNC, de la PrPsc. Las técnicas capaces de detectar los depósitos de esta proteína, incluidas junto con el examen histopatológico en el Manual como métodos de confirmación de EETs, son: la detección de Scrapie Associated Fibrils (SAF) mediante microscopía electrónica y la detección de la proteína patológica mediante técnicas inmunológicas como la inmunohistoquímica (IHC) y el Western blotting (WB). TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras de los bovinos, ovinos y caprinos sospechosos (por sospecha clínica) de estar infectados por el agente causal de las EETs consistirá en la extracción del encéfalo completo o, en su defecto, de la médula oblongada via foramen magnum. Medidas de seguridad El agente causal de la EEB puede ser transmitido al hombre mediante el consumo de tejido bovino infectado, lo que implica un mayor nivel de protección que con el Scrapie en el que no se ha demostrado dicha transmisión. El tejido de mayor riesgo es el de naturaleza nerviosa (encéfalo, médula espinal, ojo, nervios périféricos y ganglios) junto

2 con, en el caso de ovino y caprino, el tejido linfoide (linfonodos, bazo, timo, tonsilas y placa de Peyer intestinal) y la placenta. La transmisión del prión por vía aerógena no ha sido demostrada, por lo que el riesgo de contaminación por inhalación de partículas infecciosas se considera muy bajo. Sin embargo, es importante protegerse la cara (mascarillas y gafas) para evitar riesgos derivados de fragmentos de hueso o tejido / fluído infectado, especialmente cuando se sierre el cráneo o se manipule el encéfalo. Durante la extracción del encéfalo, el mayor riesgo para el manipulador es el corte por objetos punzantes o cortantes como cuchillos, sierra y agujas, o mediante fragmentos de huesos. Estas lesiones se pueden prevenir mediante el uso de equipos personales de protección como guantes de malla o anticorte. En caso de que ya existan heridas o alteraciones cutáneas en las manos, es necesario cubrir las zonas afectadas mediante apósitos resistentes al agua antes de empezar a trabajar. Con carácter general, al manipular los cadáveres se debe llevar botas de agua, mandil y guantes fáciles de desinfectar con hipoclorito sódico. Respecto a la desinfección, el único método que se ha demostrado efectivo es la exposición del material potencialmente contaminado al hipoclorito sódico (lejía) durante 1 hora. En el caso de objetos que se puedan corroer, se puede utilizar hidróxido sódico 2N durante 1 hora, aunque en este caso la inactivación frente a altos títulos del agente es incompleta. Por otro lado, es importante señalar que la materia orgánica seca en el instrumental contaminado dificulta la completa inactivación del prión, tanto con lejía como con hidróxido sódico, por lo que es necesario mantener húmedo impidiendo que se seque mientras se decontamina. Extracción del encéfalo completo Materiales: - Cuchillo, pinzas, tijeras, serrucho, costotomo (opcional, sirve cualquier instrumento resistente para hacer palanca). - Envases individuales para recogida de muestras: los envases deben ser herméticos e irrompibles y estar perfectamente identificados. 1 bote con formol tamponado al 10%, suficientemente grande como para que la muestra flote libremente en el líquido fijador. * Solución tamponada de formol al 10% (para 10 litros): 1 litro de formaldehído 37-38% comercial (p.e.: PANREAC), 9 litros de agua destilada, 40 gramos de fosfato sódico monohidratado, 65 gramos de fosfato bisódico. También se puede realizar diluyendo 85 gramos cloruro sódico en 9 litros de agua y 1 litro de formaldehído 37-38% comercial. 1 bote para la muestra sin fijar. - Tubo para la recogida de sangre (con EDTA como anticoagulante). Extracción: 1. OVINOS SOSPECHOSOS - Extracción de 10 ml de sangre (EDTA) para el genotipado (Fig 1) - Sacrificio y sangrado del animal (Fig 2). En el caso de que el sacrificio se realice mediante pistola de bala cautiva, el tiro se deberá dar en la zona frontal, evitando siempre la zona posterior de la cabeza.

3 Desarticulación de la cabeza por la articulación atlanto-occipital y separar la cabeza, asegurándose de cortar la médula espinal lo más caudalmente posible (Fig 3-4). Eliminar la piel y los músculos del área occipital del cráneo (Fig 5). Con una sierra, realizar un corte profundo desde la mitad del cóndilo hasta la parte posterior del arco cigomático y repetir en el otro lado (Fig 6). Realizar un tercer corte transversal, por detrás de los arcos cigomáticos, uniendo los dos cortes anteriores (Fig 7) Hacer palanca con el objeto de levantar la parte del cráneo que se ha cortado (Fig 8) y cortar las meninges que queden adheridas al encéfalo, consiguiendo tener así a la vista la parte dorsal del encéfalo (Fig 9). Para realizar los cortes es conveniente fijar la cabeza lo mejor posible. Invertir la cabeza para facilitar que el encéfalo se separe del suelo del cráneo. Con unas tijeras cortar las meninges y los pares craneales hasta que el encéfalo se separe completamente del cráneo (Fig 10-11; se puede facilitar la separación golpeando ligeramente la parte superior de la cabeza contra la superficie de trabajo). Realizar un corte caudal al obex (ventral al cerebelo) separando el encéfalo de la médula espinal y obteniendo así 2 secciones: o Encéfalo (Sección A): inmersión, inmediatamente tras la extracción, en aproximadamente medio litro de formol al 10%. Muestras para el diagnóstico anatomopatológico. o Médula espinal (Sección B): introducir en un contenedor estéril y congelar inmediatamente tras la extracción. Muestras para la tipificación de cepas (si procede). Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4

4 Fig 5 Fig 6 Fig 7 Fig 8 Fig 9 Fig 10 Fig 11 Fig 12

5 Fig 13 Fig BOVINOS SOSPECHOSOS La toma de muestras en el caso de bovinos sospechosos es similar a la descrita para el caso del ovino con las siguientes excepciones: - Puesto que en el bovino todavía no se ha descrito ningún gen asociado a la resistencia o susceptibilidad de la enfermedad, no es necesaria la extracción de sangre para el genotipado. - Ya que los estudios realizados sobre el agente causal de la EEB indican que es una única cepa, no es necesaria la separación del encéfalo de la médula espinal para tipificar. Sin embargo, es conveniente mantener siempre una sección del tejido nervioso (Sección B) congelada por si es necesario hacer otras pruebas diagnósticas diferentes a las histopatológicas. Extracción del tronco del encéfalo vía foramen magnum Esta técnica se aplica para la obtención de muestras en el Programa de vigilancia activa así como cuando la extracción del encéfalo completo no sea posible (vigilancia pasiva), intentando obtener una porción de cerebelo en el caso del ovino y caprino. Equipo: - Tijeras, pinzas, cuchara y envases (Fig 15) Extracción: - Invertir la cabeza y colocarla sobre una superficie plana con el foramen magnum hacia el manipulador (Fig 16). Identificar la médula espinal seccionada y la meninge (duramadre) y, si es necesario, eliminar con tijeras y pinzas los coágulos de sangre. - Sujetar la duramadre con las pinzas y cortarla, junto con los pares craneales. Introducir la cuchara (con la cara convexa hacia abajo) entre la duramadre y la parte ventral del tronco del encéfalo (Fig 17). - Rotar la cuchara haciendo un círculo alrededor de todo el tronco del encéfalo (Fig 18), separándolo y cortando los pedúnculos cerebelosos y los pares craneales. - Sacar la cuchara junto con el tronco del encéfalo (Fig 19), sujetando el extremo caudal de la médula con unas pinzas para ayudar a sacar la muestra en el caso de que sea necesario. - Si la muestra se obtiene en el marco del Programa de vigilancia activa, dividir el tronco del encéfalo longitudinalmente (por el vértice del obex) en 2 secciones iguales (Fig 20-21); mantener una sección sin fijar (para realizar los tests

6 rápidos) y fijar la otra para que, en el caso que sea necesario, se confirme el diagnóstico mediante técnicas histopatológicas. Fig 15 Fig 16 Fig 17 Fig 18 Fig 19 Fig 20 Fig 21

7 DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DEL LA EEB Y DEL SCRAPIE Procesado del tejido Medidas de seguridad: Ni la fijación con formol o glutaraldehído ni el procesado histológico inactivan el agente causal, por lo que tanto el tejido fresco como el fijado, así como su procesado constituyen un riesgo potencial. La exposición durante 1 hora a altas concentraciones de ácido fórmico es el único método eficaz capaz de reducir sustancialmente la infectividad de tejidos fijados en formol manteniendo a su vez la morfología del tejido necesaria para un adecuado examen histológico. Por otro lado, la fijación en formol confiere una gran resistencia a la inactivación del prión mediante el autoclavado, excepto cuando éste se realiza en presencia de, o después de un tratamiento durante 1 hora con, hidróxido sódico 2M. Como norma general, en el laboratorio debe de llevarse en todo momento guantes desechables, doble siempre que se manipule los tejidos. Siempre que sea posible se trabajará en una cabina de bioseguridad sobre una bandeja de plástico, especialmente cuando se maneja tejido fijado sin inactivar (tallado). Fijación y tallado: Se realiza mediante la inmersión de la muestra, inmediatamente tras su extracción, en una solución de formol al 10%; la muestra debe flotar libremente en el líquido fijador, que debe cubrirla totalmente. Para obtener óptimos resultados, la fijación del encéfalo completo debe realizarse durante 7 días, cambiar el líquido fijador y mantenerse otros 7 días más. Transcurridos estos 14 días, el encéfalo se talla en secciones transversales de 3-5 mm, introduciendo en casettes de procesamiento histológico las secciones correspondientes al óbex, médula oblongada a nivel de los pedúnculos cerebelosos y mesencéfalo para el diagnóstico de la EEB o el Scrapie. Las secciones se mantienen así otros 7 días antes de ser procesadas. Por razones prácticas, los tiempos prolongados de fijación no son posibles para el diagnóstico de las EETs en el marco de un Programa de Vigilancia. Así que, para acelerar el proceso, se separa el tronco del encéfalo y se introduce en la solución de formol al 10% durante horas, se tallan las secciones indicadas anteriormente y se introducen en casettes, manteniéndolas otras 24 horas para completar la fijación. Este proceso aún se puede acelerar más aumentando la temperatura e introduciendo agitación. A continuación se incluye un esquema del proceso de fijación y tallado de muestras para el diagnóstico anatomopatológico de la EEB y del Scrapie. - Sumergir la muestra, inmediatamente tras su extracción, en formol tamponado al 10% en un volumen suficiente para que la muestra flote libremente en el líquido fijador durante un mínimo de 24 horas. - Tallar en una cabina de bioseguridad los cortes A, B y C (Fig 25) en un bloque de aproximadamente 2-3 mm de grosor: Corte A: médula oblongada a nivel del óbex (sección prioritaria)

8 Corte B: médula oblongada a nivel de los pedúnculos cerebelares; en el caso del ovino y caprino incluir un corte de cerebelo. Corte C: mesencéfalo a nivel de los colículos rostrales. - Introducir los bloques en cassettes y dejarlos fijar en formol tamponado al 10% otras 24 horas. Fig 25 a A B C Fig 25 b Inactivación del agente causal mediante ácido fórmico: - Introducir los bloques en ácido fórmico 98% durante 1 hora. El ácido fórmico es cáustico, por lo que debe evitarse el contacto con la piel y su inhalación, manejándose siempre dentro de una cabina de extracción. - Lavar los bloques con agua del grifo durante 20 minutos. - Introducir los bloque en formol tamponado al 10%. Procesado histológico: A continuación se muestra, como ejemplo, un protocolo de rutina realizado en inclusor automático al vacío. - Deshidratar e incluir el tejido en parafina. Reactivo Tiempo Temperatura Formol 10% 10 min Ambiente Alcohol 70º 2 h Ambiente Alcohol 70º 2 h Ambiente Alcohol 96º 1 h Ambiente Alcohol 96º 1 h Ambiente Alcohol 100º 1 h Ambiente Alcohol 100º 2 h Ambiente Alcohol 100º 2 h Ambiente Xileno 1 h y 30 min Ambiente Xileno 1 h y 30 min Ambiente Parafina 1 h y 30 min 62º C Parafina 1 h y 30 min 62º C Parafina 1 h y 30 min 62º C

9 - Montar los bloques: dejar los bloques en la parafina de la consola durante un mínimo de 30 min. Abrir los cassettes y colocar el tejido en un molde que contiene un poco de parafina fundida. Dejar solidificar la parafina a temperatura ambiente sobre una placa fría, formándose así un bloque con el tejido en su interior. - Cortar con el microtomo. Desbastar el bloque de parafina mediante cortes de 15 micras hasta que todo el tejido esté representado en el corte. Enfriar los bloques durante aproximadamente 2 horas (sobre cubitos de hielo en la nevera) para facilitar el corte posterior. Realizar cortes de 5 micras. - Depositar las secciones en un baño termostático a aproximadamente 45ºC, de forma que los cortes se estiren y queden flotando. - Recoger las secciones con los portaobjetos tratados con Vectabond. - Secar los portaobjetos a 56ºC durante 30 minutos o a 37ºC durante toda la noche en una estufa. Tinción con hematoxilina-eosina: - Desparafinar y teñir los tejidos mediante la inmersión en los siguientes reactivos: Xilol: 10 minutos Xilol: 10 minutos Alcohol 100º: 5 minutos Alcohol 100º: 5 minutos Alcohol 96º: 5 minutos Alcohol 60º: 5 minutos Agua corriente del grifo: 5 minutos Hematoxilina: 15 minutos Agua corriente del grifo: 5 minutos Eosina: 30 segundos Agua del grifo: 3 inmersiones de 1-2 segundos - Deshidratar y montar los tejidos mediante la inmersión en los siguientes reactivos: Alcohol 60º: 4 inmersiones de 1-2 segundos Alcohol 96º: 4 inmersiones de 1-2 segundos Alcohol 100º: 5 inmersiones de 1-2 segundos Alcohol 100º: 3 inmersiones de 1-2 segundos Xilol: 3 inmersiones de 1-2 segundos Xilol: inmersión durante un mínimo de 1 minuto Montar en DPX Si las muestras no se han inactivado con ácido fórmico antes, se puede realizar antes de la tinción mediante la inmersión en ácido fórmico durante 5 minutos. Neuropatología En 1987 Wells y colaboradores describían por primera vez la EEB como una alteración neurológica esporádica y progresiva que afectaba al ganado bovino adulto y se caracterizaba por una vacuolización de la sustancia gris del SNC. Las lesiones observadas en los 13 animales estudiados las definieron como vacuolas esféricas u ovoides en el neuropilo de la

10 sustancia gris y en el pericarion neuronal y dendritas de ciertos núcleos del tronco del encéfalo, principalmente del núcleo dorsal del nervio vago, la formación reticular, los núcleos vestibulares y el núcleo rojo. La intensidad de la vacuolización neuronal y del neuropilo variaba independientemente de la localización topográfica; sin embargo, la distribución se mantenía constante. Los autores relacionaron la EEB con otras EETs descritas en diversas especies de rumiantes y el hombre, concretamente el Scrapie y el Kuru. Tras los primeros casos descritos de EEB, el número de nuevos animales afectados por la enfermedad en diversas explotaciones distribuidas por todo Reino Unido se incrementó rápidamente, alcanzándose un total de casos confirmados en Noviembre de Los estudios realizados relacionados con el seguimiento de la enfermedad a lo largo de la epidemia permitieron definir la neuropatología de la EEB. La lesión característica de las EETs es la vacuolización de las dendritas en el neuropilo de la sustancia gris (cambio espongiforme) y del pericarion neuronal (una única vacuola o múltiples, bien delimitadas, que pueden dilatar el soma neuronal). Otras lesiones que también se han observado son: degeneración y pérdida neuronal, astrocitosis y amiloidosis. Todas ellas difieren poco entre las especies afectadas de forma natural por una EET, pero la importancia de cada una de ellas y los patrones de distribución varían considerablemente. La EEB presenta un patrón de distribución del cambio espongiforme en el SNC constante, siendo las localizaciones principales: el tracto solitario, el tracto espinal del nervio trigémino, los núcleos vestibulares y la formación reticular de la médula oblongada; la sustancia gris central del mesencéfalo; el área periventricular del hipotálamo; el tálamo y el área septal. También se ha observado vacuolización en el cerebelo, hipocampo, núcleos basales y corteza cerebral, pero con una intensidad mucho menor que en la médula oblongada, mesencefalo y tálamo. Esta distribución constante de las lesiones permitió que durante la epidemia de EEB en Reino Unido el diagnóstico de rutina se realizara mediante el examen histopatológico de una única sección de médula oblongada a nivel del obex, basándose en un estudio que indicaba que permitía la detección de un 99,6% de los casos. A diferencia de la EEB, el patrón de distribución de la vacuolización en el Scrapie es variable. Se han realizado numerosos estudios con el fin de determinar los factores que influyen en dicho patrón, pero hasta el momento no se han identificado. Entre los factores estudiados se encuentran la cepa del agente causal, la raza y el genotipo del animal, la duración clínica de la enfermedad, la edad a la que se infectó el animal, la dosis y la vía de infección. El cambio espongiforme en el caso del Scrapie se ha detectado en las diversas áreas del SNC: médula espinal, médula oblongada, cerebelo, mesencéfalo, tálamo y área frontal. La intensidad de las lesiones es mayor en el núcleo dorsal del nervio vago, la formación reticular y tracto espinal del nervio trigémino en la médula oblongada, el área ventral del vermis del cerebelo, la sustancia negra en el mesencéfalo, núcleos del tálamo, el área del hipotálamo y el núcleo accumbens del área frontal. Cabe destacar un estudio que detecta vacuolización en la corteza cerebral en el 37% de los casos estudiados (N= 222). Criterios para el diagnóstico histopatológico Secciones a examinar / Núcleos diana principales: - Médula oblongada a nivel del obex (Fig 26) Núcleo Dorsal del Vago Tracto solitario

11 Tracto Espinal del Nervio Trigémino Formación Reticular Núcleo de la oliva - Médula oblongada (caudal a los pedúnculos cerebelosos; Fig 27) Núcleos Vestibulares Formación Reticular Tracto Espinal del Nervio Trigémino. - Mesencéfalo (a nivel de los colículos rostrales (Fig 28) Colículos Superiores. Sustancia gris Central Fig 26 Fig 27 Fig 28 Diagnóstico positivo: - Lesiones características: Vacuolización del neuropilo de la sustancia gris en núcleos diana (cambio espongiforme; Fig. 29). Vacuolización del pericarion neuronal en núcleos diana (Fig 30). Distribución: simétrica y bilateral (generalmente). - Observaciones: La vacuolización del neuropilo es más frecuente que la vacuolización neuronal en bovinos. La vacuolización neuronal es más frecuente que la vacuolización del neuropilo en ovinos. La vacuolización neuronal en el núcleo rojo (mesencéfalo) no es por sí misma patológica. - Otras lesiones que pueden observarse en la EEB y en el Scrapie son la astrocitosis, principalmente en las zonas en las que se observa la vacuolización, degeneración neuronal, pérdida neuronal y, en el caso del Scrapie, placas de amiloide. No se observa ninguna lesión macroscópica, ni cambios inflamatorios específicos, ni alteraciones degenerativas primarias en la sustancia blanca. Diagnóstico negativo: - Ausencia de vacuolización en núcleos diana (Fig 31-32) Diagnóstico no concluyente: - Remisión de muestras inadecuadas. Sección no representativa de los núcleos diana. Autolisis (Fig 33) Congelación (Fig 34)

12 - Vacuolización insuficiente del neuropilo de la sustancia gris o de las neuronas. Procesos patológicos que cursan con degeneración espongiforme del SNC (procesos metabólicos, tóxicos...). Fig 29 Fig 30 Fig 31 Fig 32 Fig 33 Fig 34

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14 Diagnóstico diferencial: causas de vacuolización del SNC Los términos vacuolización, espongiosis, cambio espongiforme o microcavitación tienen el mismo significado y se refieren a una alteración del SNC, causada por agentes patológicos o no patológicos. El término encefaloaptía espongiforme describe cualquier patología del encéfalo en la que la espongiosis o vacuolización es la lesión predominante, pudiendo afectar, tanto a la sustancia gris como a la sustancia blanca. Así, las enfermedades priónicas son el prototipo de cambio espongiforme en la sustancia gris. 1. Vacuolización no patológica En bovinos se ha observado frecuentemente una vacuolización en neuronas, principalmente en el núcleo rojo y en el núcleo del nervio oculomotor, sin que se haya detectado ninguna significación patológica. 2. Artefactos La autolisis puede dar lugar a una vacuolización, tanto en la sustancia gris como blanca, aunque generalmente es más evidente en esta última. Cuando la autolisis está muy avanzada se pueden observar, incluso macroscópicamente burbujas de gas debido a la putrefacción. La congelación y descogelación de los tejidos producen cristales de hielo que rompen las células dando lugar a grandes y numerosas vacuolas alargadas u ovoides, generalmente con una distribución regular y lineal en el tejido. Un procesado histológico inadecuado, como la fijación inadecuada, una rápida deshidratación o la utilización de parafina excesivamente caliente, puede causar artefactos en el SNC dando lugar a alteraciones similares a un cambio espongiforme. A diferencia de las EETs en que la espongiosis se localiza en áreas específicas del encéfalo, la vacuolización originada por los artefactos suele ser uniforme y afecta en mayor medida al neuropilo que al soma neuronal. En el caso de la autolisis la vacuolización puede ser más intensa en las zonas más profundas del encéfalo, ya que la solución fijadora tarda más en alcanzarlas. Las vacuolas producidas en el pericarion neuronal por artefactos no están bien definidas, ni rodeadas completamente por el citoplasma de la neurona. Asimismo, no es frecuente observar diversas vacuolas que confluyan en una misma neurona. 3. Vacuolización patológica Existe una gran diversidad de causas que pueden producir un cambio espongiforme en el SNC, las cuales se pueden clasificar según los agentes causales en: - Agentes infecciosos: rabia, EEB o Scrapie. - Alteraciones metabólicas: incluye alteraciones como la encefalopatía hepática, la encefalopatía renal o encefalopatías asociadas a la dieta (falta de tiamina o cobre). - Tóxicos como el amonio, antibióticos o antihelmínticos. - Enfermedades congénitas o hereditarias como la citrulinemia o mucopolisacaridosis.

15 MÉTODOS IN VITRO DE DETECCIÓN DE PRIONES La presencia de PrPsc en tejidos humanos o animales se puede detectar mediante diversas técnicas, principalmente la inmunohistoquímica o la inmunotransferencia. Como se ha indicado anteriormente, la OIE reconoce dichas técnicas, junto con la detección de SAF, como métodos de confirmación de las EETs en los casos en que el examen histopatológico no sea concluyente, sea negativo o de que el material esté autolítico. Estos métodos de diagnóstico adquieren especial relevancia cuando el material no presenta las condiciones adecuadas para un examen histológico (material autolítico o congelado), en el caso de que se trate de un animal en estado preclínico de la enfermedad (ya que el acúmulo de la PrPsc en el SNC es anterior a las lesiones) y para el diagnóstico in vivo de la enfermedad de Scrapie a partir de biopsias de tejido linfoide (técnicas inmunohistoquímicas). Detección de la PrPsc mediante inmunohistoquímica (IHQ) A diferencia de la técnica de WB o los tests rápidos, la IHQ permite observar la localización topográfica y celular de la PrPsc, así como su relación con las lesiones histológicas. El depósito de PrPsc se puede detectar tanto asociado al cambio espongiforme como en áreas del SNC donde no se han observado lesiones. La sensibilidad y la especificidad de la técnica dependen en gran medida de la metodología y del anticuerpo utilizado, no existiendo hasta la fecha ningún protocolo estandarizado o anticuerpo recomendado para la detección de esta proteína. Dentro de cualquier ensayo IHQ, los pasos fundamentales a incluir en la técnica son los siguientes: - Cortes de 4-5 micras de tejidos incluidos en parafina (ver procesado histológico de los tejidos), desparafinado y rehidratado. - Desenmascarado de epítopos. - Inactivación de la peroxidasa endógena. - Incubación con el anticuerpo monoclonal específico para PrP. - Amplificación de la señal. - Visualización de la reacción antígeno -anticuerpo. - Examen mediante microscopía óptica. Diferentes pretratamientos son utilizados para el desenmascarado de epítopos, siendo los más empleados la inmersión en ácido fórmico, la digestión con la proteinasa K y el autoclavado hidratado o en buffer citrato, generalmente combinados varios de ellos en función del anticuerpo y el tejido utilizados. Respecto a los anticuerpos, existe una gran variedad en el mercado (algunos no son comerciales). La mayoría de ellos se obtienen frente a péptidos sintéticos correspondientes a diversas secuencias aminoacídicas de la PrP, por lo que no diferencian entre la PrPsc y la PrPc (por ello la necesidad de pretratamientos con el fin de obtener una adecuada inmunoreacción). Los anticuerpos más utilizados para el diagnóstico de las EETs son el L42 (R-Biopharm), F99 y F89 (USDA Pullman), R145 (Veterinary Agency laboratorios, Weybridge), SAF 84 (SPI bio) y 6H4 (Prionics).

16 Criterios para el diagnóstico mediante técnicas inmunohistoquímicas: DIAGNÓSTICO POSITIVO El diagnóstico se basa en la observación de los acúmulos de la proteína siguiendo un patrón característico de tinción que podría clasificarse según su localización: - Tinción neuronal (Fig 35-36) - Tinción axonal (Fig 37) - Tinción del neuropilo (Fig 38) - Tinción glial (Fig 39) - Tinción perivascular (Fig 40) - Tinción subependimal (Fig 41) - Placas de amiloide (Fig 42) Al igual que las lesiones histológicas, se han observado diversos patrones de acumulación de la PrPsc, en función de su morfología y distribución neuroanatómica, siendo en el caso de la EEB bastante homogéneo, pero presentando una gran variabilidad en el Scrapie. Por otro lado, en ovinos y caprinos se pude detectar la PrPsc en diversos tejidos, principalmente en el SLR, donde la tinción se restringe al interior de los folículos (Fig 43), pudiéndose localizar los depósitos de PrPsc básicamente en macrófagos (Fig 43 A) y en células dendriticas foliculares (Fig 43 B). Finalmente, en determinadas muestras se observa una inmunotinción inespecífica que no sigue el patrón característico de la PrPsc. Esta señal puede deberse a diferentes razones, entre ellas: - Procesamiento inadecuado - Autolisis de la muestra - Efecto borde - Reacción cruzada del anticuerpo con otros antígenos DIAGNÓSTICO NEGATIVO Ausencia de inmunotinción específica en la muestra analizada (Fig 44).

17 Fig 35 Fig 36 Fig 37 Fig 38 Fig 39 Fig 40

18 Fig 41 Fig 42 Fig 43 Fig 44 Fig 45 Fig 46

19 Detección de la PrPsc mediante inmunotransferencia (WB) Se basa en la detección de la isoforma patológica purificada por su peso molecular y afinidad por un anticuerpo específico. Puesto que la proteína PrPc es una glicoproteína con dos posiciones de glicosilación, PrP debe poseer diferentes patrones electroforéticos (glicoformas) según esté no glicosilada, monoglicosilada o diglicosilada, lo que permite la diferenciación de estos patrones mediante WB. Brevemente, el método consiste en el análisis de la PrPsc mediante electroforesis en gel de poliacrilamida seguida de WB tras la aplicación de una serie de tratamientos de extracción y purificación. A pesar de que en un principio se trataba de una técnica validada para muestras (en fresco y sin tratar) procedentes del SNC y con altas concentraciones de proteína patológica, su fiabilidad ha sido demostrada también a partir de tejidos de otra naturaleza y con menores concentraciones de PrPsc. Demostración de SAF por microscopía electrónica La demostración de SAFs, marcador ultraestructural específico de las EETs, no se ve alterada por el deterioro del tejido. Sin embargo, debido a que su sensibilidad ha sido cuestionada por algunos autores, las técnicas de IHC y WB han cobrado mayor relevancia en los últimos años. Consiste básicamente en la observación de las fibrillas mediante microscopio electrónico tras un tratamiento de la muestra (preferiblemente en fresco y sin tratar) con detergente y una digestión con proteinasa K. Tras este tratamiento, la PrPsc que permanece en la muestra puede ser visualizada como SAF, ya que se ha demostrado que las fibrillas están compuestas por agregados de la isoforma (parcialmente resistente a la proteinasa) de una proteína de membrana que ha resultado ser finalmente PrP. En base a los criterios morfológicos usados para su identificación se definieron dos tipos de SAFs en función del diámetro y de la disposición que adoptaban, aunque se llegó a aceptar tal variabilidad en la forma de interactuar entre ellas que se llegaron a observar numerosas formas intermedias. MÉTODOS IN VIVO DE DETECCIÓN DE PRIONES Los priones también pueden ser detectados in vivo mediante bioensayos en animales de laboratorio. Aunque estos ensayos no tienen utilidad práctica, permiten detectar la infectividad de diversos tejidos e incluso determinar la dosis infectiva. Inicialmente, los bioensayos se realizaron en determinadas estirpes originales de ratones, lo que limitaba el uso práctico de estas técnicas debido a la existencia de la barrera entre especies y a los largos períodos de incubación. Además, la determinación de la dosis infectiva está condicionada por el hospedador. De hecho, estudios referentes a la infectividad de la EEB valorada en bovinos han demostrado que trabajos previos que cuantificaban los títulos de prión de la EEB mediante bioensayos con ratones RIII subestimaban dichos títulos hasta en un factor Actualmente se están desarrollando líneas de ratones transgénicos con altos niveles de expresión del gen que codifica para la proteína prión humana o bovina eliminando así el efecto barrera y reduciendo considerablemente el tiempo de incubación. Concretamente, una estirpe de ratones transgénicos (BoPrP) que expresan múltiples copias del gen bovino PRNP son 10 veces más sensibles a la infección por EEB que los propios bovinos y veces más que los ratones no transgénicos. Estas herramientas permitirán detectar y cuantificar adecuadamente los priones en diversos órganos de animales afectados por una EET.

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