Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha ISSN: Asociación Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, S.C.

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1 Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha ISSN: Asociación Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, S.C. México Cob Calan, Nubia Noemí; Tello Cetina, Jorge; Escamilla Sanches, José; Vargas y Vargas, Lourdes; Tamayo Cortez, Jorge ACTIVIDAD DE LA POLIFENOLOXIDASA EN EL GEL DE SÁBILA (Aloe vera Mill) Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, vol. 11, núm. 2, diciembre, 21, pp Asociación Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, S.C. Hermosillo, México Disponible en: Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 ACTIVIDAD DE LA POLIFENOLOXIDASA EN EL GEL DE SÁBILA (Aloe vera Mill) Nubia Noemí Cob Calan 2, Jorge Tello Cetina 1, José Escamilla Sanches 1, Lourdes Vargas y Vargas 1 y Jorge Tamayo Cortez Instituto Tecnológico de Mérida, División de Estudios de Posgrado e Investigación, Av. Tecnológico, Km 5 Carr. Mérida Progreso S/N, C.P , Mérida, Yucatán, México. tamayin@hotmail.com. 2. Instituto Tecnológico Superior de Calkiní en el Estado de Campeche, Av. Ah Canul S/N por carretera federal, C.P. 249, Calkiní, Campeche, Yucatán. nubia_c2@hotmail.com. Palabras clave: enzima, polifenoloxidasa, pirogalol, pirocatecol. RESUMEN Las enzimas polifenoloxidasas (PPO) fueron extraídas del gel de sábila (Aloe barbadensis Mill), por la adición de polivinil pirrolidona (PVPP). Su posterior caracterización y la determinación de su actividad en el extracto crudo se presume que cuenta con actividad difenolasa ya que presentó actividad sobre los sustratos difenólicos: Pirocatecol, Pirogalol y Catequina. Se estudio el efecto del ph (3 a 8), temperatura (1 a 7ºC) e inhibidores a varias concentraciones, sobre la actividad de PPO. También se determino los valores de Km y Vmax. Las condiciones óptimas de ph y temperatura para cada sustrato empleado fueron Pirocatecol 7 y 5 o C, Pirogalol 7.5 y 2 o C, Catequina 6.5 y 2 o C respectivamente. La mayor actividad se presentó en Pirocatecol.2 M con U. de act/ml.min y la menor actividad se presentó con pirogalol a partir de.2 M con 2.13 U. de act/ml.min. Aunque el Pirogalol se evaluó a una concentración de saturación, 1 veces menor que el Pirocatecol. Los valores aparentes Km y Vmax en los sustratos que mostraron actividad fueron los siguientes: Pirocatecol Kmap.4613 y Vmaxap.552 U. de act/ml.min, Pirogalol Kmap.3 M y Vmaxap.4347 U. de act/ml.min, (+) Catequina Kmap.4 M y Vmaxap 8 U. de act/ml.min. Presentando mayor afinidad por el sustrato pirogalol y menor afinidad por pirocatecol. Mientras que para los inhibidores, cisteina, ácido aspártico y ácido ascórbico, fueron efectivos cuando se evalúo la actividad de PPO sobre los sustratos: Pirocatecol y Pirogalol, pero mostró un bajo efecto inhibidor en Catequina, por que los tres se comportaron como activadores de la PPO. POLYPHENYLOXIDASE ACTIVITY IN THE GEL OF SABILA (Aloe vera MILL). Key words: enzyme, polyphenoloxidase, pyrogallol, pyrocatechol. ABSTRACT The enzymes polyphenol oxidases (PPO) were extracted from the aloe vera gel (Aloe barbadensis Mill) by the addition of polyvinyl pyrrolidone (PVP). Its further characterization and determination of its activity in the crude extract is presumed to have difenolasa activity since activity on the substrates presented diphenolic: pyrocatechol, pyrogallol and catechin. The effect of ph (3 to 8), temperature (1 to 7ºC) and inhibitors at different concentrations, on the activity of PPO. Also determined the values of Km and Vmax. The optimum conditions of ph and temperature for each substrate used were pyrocatechol 7 and 5 o C, pyrogallol 7.5 and 2 o C, catechin 6.5 and 2 o C respectively. The increased activity occurred in pyrocatechol.2 M with U. act/ml.min and lower activity with pyrogallol was presented from.2 with 2.13 U. act/ml.min. Although pyrogallol was evaluated at a saturation concentration, 1 times smaller than the pyrocatechol. The apparent Km and Vmax values in the substrates that showed activity were: pyrocatechol kmap.4613 and Vmaxap.552 U. act/ml.min, pyrogallol kmap.3 M Vmaxap.4347 act/ml.min, (+) catechin Vmaxap 4 and Vmaxap 8 U. act/ml.min. Introducing a higher affinity for the substrate pyrogallol and pyrocatechol lower affinity. While for the inhibitors, cysteine, aspartic acid and ascorbic acid were effective in evaluating the activity of PPO on the substrates: pyrocatechol and pyrogallol, but showed a low inhibitory effect of catechin, for the three behaved as activators PPO. Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):

3 INTRODUCCIÓN La polifenoloxidasa (E.C ) es una enzima oxidoreductasa de gran importancia en productos vegetales no solo por el papel que juega en los productos agrícolas cosechados sino también por su participación en otros procesos tales como la síntesis de lignina y su papel en aspectos fitopatológicos relacionados con resistencia a enfermedades. Uno de los principales problemas de muchos productos agrícolas después de cosechados o durante el procesamiento industrial es la formación o desarrollo de un oscurecimiento de los tejidos, el cual confiere un aspecto indeseable para el consumidor. El gel de aloe vera puede sufrir modificaciones cuando se extrae y está sujeto a cambios de color por oxidación y a descomposición y alteraciones, debido a que puede sufrir contaminación microbiana. En este trabajo se evalúan, en extractos crudos de gel de sábila recién cortada, la caracterización cinética de la enzima polifenoloxidasa del gel de sábila con el fin de obtener conocimientos básicos para una mejor comprensión del papel que juega en el deterioro del gel después o durante su posible procesamiento industrial. MATERIALES Y METODOS Material vegetal La hojas de sábila Aloe barbadensis Miller, fueron adquiridos de la plantación de don Evelio Sánchez, ubicada en Umán, Yucatán a 15 km de la ciudad de Mérida. Para la extracción de la enzima y su posterior caracterización cinética parcial se utilizaron hojas recién cortadas y completamente sanas. Extracción de la enzima Las enzimas fueron extraídas de las hojas recién cortadas de sábila empleando el método modificado de Oktay et al., 1995, por la adición de PVPP, el cuál consiste en la homogenización durante un minuto utilizando una licuadora: de 5 g (peso fresco) de gel de sábila, con 1 ml de buffer de fosfatos.1m, ph 7, a 4 C, 5 g de PVPP, se filtró a través de ocho capas de gasa, luego se centrifugó a 4 rpm, 4 oc durante 2 minutos, se recuperó el sobrenadante al cual se le denominó extracto crudo (EC) el cual fue utilizado para la medida de la actividad enzimática. Las medidas siempre se efectuaron con extractos frescos puesto que la actividad puede verse afectada durante el almacenamiento refrigerado o congelado del extracto. Determinación de la actividad de la PPO Se utilizó el método de Aranda (24) utilizando pirocatecol, pirogalol y catequina como sustrato. La determinación de la actividad polifenol oxidasa se llevó acabo mediante una determinación espectrofotométrica, por la acumulación del producto, O quinonas, que presentan una banda de absorción aproximadamente a 42 nm. En un tubo de ensayo se colocaron 2.8 ml del sustrato correspondiente (disolución de sustrato en búfer de PO 4.2 M) y.2 ml del extracto enzimático, la mezcla se incubó en un baño a 3 C, con agitación de 2 rpm, por 3 min. Durante este tiempo se realizaron lecturas cada 5 min. El tiempo cero fue la lectura tomada en el momento inmediato de agregar la enzima al sustrato, cabe mencionar que se realizaron tres réplicas. Una unidad enzimática se definió como el cambio en.1 unidades de absorbancia x ml x min. Caracterización cinética de PPO Efecto del ph. Se realizó un estudio del efecto del ph sobre la actividad de la enzima utilizando el método de Aranda (24), modificando las 222 Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):

4 unidades de ph del buffer de fosfato de sodio.2 M, en un rango de ph Efecto de la temperatura. Se determinó el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima utilizando el método de Aranda (24), modificando la temperatura entre 2 a 65ºC con intervalos de 1ºC. Efecto de la concentración de sustrato. Aplicando el método de Lineweaver Burk (1934), las constantes aparentes de Michaelis (Km) y velocidad máxima (Vmax) fueron determinadas en el extracto crudo del gel de sábila; empleando tres sustratos (Pirogalol, pirocatecol y catequina) y cinco concentraciones. Efecto de inhibidores. Para la determinación de la inhibición se empleo el sistema de ensayo de Aranda (24). El sistema de reacción comprendía 2.8 ml de extracto crudo y 81.2 ml de una solución que contenía: 81.2 ml del sustrato en buffer de fosfatos.2 M y 18.8 ml de inhibidor (a diversas concentraciones, como lo indica la tabla 1. Tabla 1. Concentración de inhibidores para evaluar su efecto en la actividad de la PPO en el gel de sábila Inhibidor Concentración(M) Concentración(g) Ácido ascórbico Acido aspártico Cisteína RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para los efectos evaluados ph, Temperatura y concentración de sustrato, el estudio mostró un efecto altamente significativo. Para los tres sustratos en estudio se encontró que a las condiciones de ensayo las actividades no disminuían durante el tiempo de reacción. Efecto del ph. En la figura 1 se observa que los valores del ph donde se presenta la máxima actividad es entre 6 a 7, para (+) Catequina, entre 6.5 a 7.5 para pirocatecol y en 7.5 para pirogalol. Para las medidas del efecto de temperatura se eligió un ph de 6.5, para (+) catequina, de 7 para pirocatecol y de 7.5 para pirogalol. Vo U. de act. /ml.min Vo U. de act./ml.min Vo U. de act. /ml.min ph b a ph c ph Figura 1. Efecto del ph y del sustrato sobre la actividad de la PPO en sábila (+) catequina(a), pirocatecol ( b) y pirogalol (c). Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):

5 De los tres sustratos en estudio (+) Catequina es menos tolerante a valores de ph, pero mantiene su actividad más que pirocatecol y pirogalol. El valor de ph para la actividad máxima de (+) catequina, pirocatecol y pirogalol encontrado en este trabajo confirman lo mencionado con Palmer (1963) y Whitaker (1972); señalando que el ph de la polifenol oxidasa varía en un amplio rango dependiendo de la fuente y el sustrato utilizado. Y esto se pudo observar con el sistema de ensayo evaluado. Efecto de la temperatura. En la figura 2 se representa el efecto de la temperatura sobre la actividad de (+) Catequina, pirocatecol y pirogalol. La actividad de (+) Catequina es alta en un intervalo de temperaturas entre 1 a 3 ºC con un máximo en su actividad a 2 ºC, la de pirocatecol es alta entre 4 a 6 ºC con actividad máxima en 5 ºc, y la de pirogalol es alta entre 1 a 3 ºC con un máximo en su actividad a 2 ºC. Lo que sí es notorio es que en todos los casos la actividad decae paulatinamente tras alcanzar el máximo. En pirocatecol PPO presentó desnaturalización de tal manera que a 65ºC ya no presentó actividad. En un estudio realizado con PPO en pitaya amarilla se obtuvo un comportamiento similar al que se presentó la PPO de sábila en pirocatecol. Cabe mencionar que se logró un valor máximo de actividad en pitaya de 45ºC, empleando como sustrato L DOPA. Los valores de temperatura en los que se obtuvo la máxima actividad fueron usados para la medida del efecto de la concentración del sustrato. Efecto de la concentración de sustrato. Cuando se evalúa el efecto de la concentración de pirocatecol sobre la actividad de PPO se obtiene mayor actividad en Pirocatecol con.2 M con U. de act/ml.min y la menor actividad se presentó con pirogalol a partir de.2 M con 2.13 U. de act/ml.min. Aunque el Pirogalol se evaluó a una concentración de saturación, 1 veces menor que el Pirocatecol. b a c Figura 2. Efecto de la temperatura y del sustrato sobre la actividad de la PPO en sábila, (+) catequina (A), pirocatecol (B) y pirogalol (C). Con los valores de actividad enzimática de (+) Catequina, pirocatecol y pirogalol en función de la concentración de sustrato se constituyeron gráficas de acuerdo con el modelo de Lineweaber Burk y se calcularon los valores aparentes de Km y Vmax (Figuras 3, 4 y 5). Al evaluar el efecto de la concentración 224 Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):

6 de (+) Catequina sobre la actividad de PPO se encontró un valor de Kmap.4 M. Para evaluar el efecto de la concentración de pirogalol sobre la actividad de PPO se encontró un valor de Pirogalol Kmap.3 M. De otro lado, para pirocatecol se encontró un valor de Kmap De acuerdo con el modelo de Lineweaver Burk los valores de Vmax para (+) Catequina, pirogalol y piricatecol son respectivamente (U. de act/ml.min) 8 para (+) Catequina,.4347 para pirogalol y.552 para pirocatecol. Si estas velocidades se evalúan de manera visual a través de la representación de Michaelis Menten se obtienen valores dispares, sin embargo este método es poco efectivo por cuanto no se visualiza claramente el máximo de velocidad. En general, en la literatura se encuentran valores de Km y Vmax hallados de acuerdo con el método de Lineweaver Burk, si bien en ciertos casos reportan los hallados por los dos métodos con resultados dispares.,35,3,25 y = 5E-5x +,129 R 2 =,9983 concentración de sustrato establecidos en los experimentos anteriores. Además se empleo un sistema control donde no se adicionó el inhibidor correspondiente. Figura 4. Cuantificación de Km y Vmax de la PPO del gel de sábila mediante Lineweaver Burk para el Pirogalol y =,9132x + 1,9794 R 2 =,783, ,15-2,1, ,5 Figura 3. Cuantificación de Km y Vmax de PPO del gel de sábila mediante Lineweaver Burk para la (+) catequina. Efecto de la adición de agentes inhibidores en la actividad de la PPO. Se evaluó el efecto de la adición de tres compuestos reportados como inhibidores de la actividad de PPO (Ríos, 24 y Aranda, 24); sobre la actividad de la PPO en sábila utilizando tres sustratos: catequina, pirocatecol y pirogalol como sustrato y las condiciones de ph, temperatura y -4 Figura 5.Cuantificación de Km y Vmax de la PPO del gel de sábila mediante Lineweaver Burk para el pirocatecol En la tabla 2 se muestran los valores de actividad de PPO obtenidos cuando se empleó catequina.4 M como sustrato. Aquí se puede observar que estos compuestos para la PPO de sábila se comportan como activadores ya que incrementan la actividad de la polifenol oxidasa. A diferencia de lo reportado por Aranda (24), que indican que la cisteína inhibe la PPO de chicozapote. En la tabla 3 se presentan los resultados de actividad residual cuando se empleó pirogalol.3 M como sustrato, se puede observar que los tres compuestos: cisteína, ácido Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):

7 ascórbico y ácido aspártico inhibieron drásticamente la actividad de la PPO. Es decir se observo que la cisteína con una concentración de.8 M inhibió de manera importante la actividad de la PPO del gel de sábila, ya que disminuyo de a UA/ml x min. Yang et al., (21), encontraron que la Cisteína inhibió al 1 % la actividad de la PPO de la pulpa del plátano y Nuñez Delicado et al., (23) en la cáscara de plátano obtuvo una inhibición de aproximadamente 65 % con el mismo aminoácido. Tabla 2. Porcentaje de actividad residual de Catequina.4 M en los diferentes inhibidores Inhibidor Concentración (M) Actividad de PPO (2 min.) UA % actividad residual % Inhibición L Cisteína Ácido ascórbico Ácido aspártico Tabla 3. Porcentaje de actividad residual de pirogalol.3 M con los diferentes inhibidores Inhibidor Concentración (M) Actividad de PPO (2 min.) UA % actividad residual % Inhibición L cisteína Ácido ascórbico Ácido aspártico Tabla 4.Porcentaje de actividad residual de pirocatecol.3 M con los diferentes inhibidores Inhibidor Concentración (M) Actividad de PPO (2 min.) UA % actividad residual % Inhibición L Cisteína Ácido ascórbico Ácido Aspártico Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):

8 En la tabla 4 observamos que los tres compuestos producen inhibición cuando se usa Pirocatecol como sustrato. Siendo el más agresivo el ácido ascórbico. En este sentido, Rocha et al., (1998). indica que el acido ascórbico y sus derivados constituyen uno de los grupos de inhibidores del oscurecimiento enzimático de mayor aplicación y con mejor efecto en el control del oscurecimiento de frutas y verduras debido principalmente a su poder reductor. Debido a que el mecanismo de acción del ácido ascórbico actúa sobre los productos de reacción y reduce el catecol a O quinonas, inhibiendo completamente la velocidad de transformación de catecol a productos coloreados, pero no ejerce inhibición en términos del consumo de oxígeno durante la reacción. CONCLUSIONES En conclusión, la presencia de PVPP mantuvo la estabilidad del color del extracto crudo en congelación del gel de sábila durante dos meses, debido a su poder secuestrante de compuestos fenólicos presentes en el gel de sábila. Las fenolasas son inestables a la temperatura de congelación pues la actividad se perdió en una semana de almacenamiento. La actividad de la polifenol oxidasa en el extracto crudo se presume que cuenta con actividad difenolasa ya que presentó actividad sobre los sustratos difenólicos: Pirocatecol, Pirogalol y Catequina. Las condiciones óptimas de ph y temperatura bajo las condiciones de ensayo dependieron del sustrato empleado; para Pirocatecol ph 7 y 5 o C; Pirogalol ph 7.5 y temperatura 2 o C, Catequina 6.5 y temperatura 2 o C. manera se hallo la inhibición de la actividad de PPO sobre los sustratos: Pirocatecol y Pirogalol; en presencia de Cisteína, ácido Aspártico y ácido Ascórbico. Pero cuando se evaluaron en Catequina los tres se comportaron como activadores de la PPO. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aranda, C. B. 24. Evaluación de diferentes inhibidores orgánicos para el control de la actividad de la polifenoloxidasa purificada en chicozapote (Acharas sapota). Tesis de Maestría en ciencias. ITM. Lineweaver, H.; Burk, D The Determination of enzyme dissociation constants J. Am. Chem. Soc. 56, Nuñez Delicado E., Sojo M., Garcif., Sanchez A. 23. Partial purification of latent persimmon fruti polyphenoloxidase.agric. Food Chem. 51, Oktay Empleo el método modificado en la preparación del extracto enzimático. Palmer, J. K Banana polifenol oxidase. Prepareation and propertis. Plant Physol.38: Rios, G.T.R. 24. Tésis. Efecto de la temperatura de almacenamiento y el uso de aditivos para evitar el deterioro del gel de sábila. México. Rocha Ada M.C.N., Cano M. Pilar, Galeazzi Maria A.M., Morais and Alcina M.M.B Characterisation of starking apple polyphenoloxidase. J. Food Agric. 77, Whitaker, J.R principles of enzymology for the food sciencie. New York. Marcell Dekker, Inc. Pp La diferencia en los parámetros cinéticos frente a los tres sustratos usados en la actividad de la PPO, indica que esta enzima puede participar activamente en los procesos de pardeamiento en el gel de sábila. De igual Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol. 11(2):