Verónica Gonzalo Aineto J

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1 P R Á C T I C A S E N C E N T R O N A C I O N A L D E T E C N O L O G Í A Y S E G U R I D A D A L I M E N T A R I A ( C N T A ) Verónica Gonzalo Aineto J

2 M E M O R I A El Centro Nacional de Tecnología y Seguridad Alimentaria (CNTA), consta de diversos laboratorios, en los cuales, los análisis a realizar son específicos de cada departamento. Se divide en tres grandes secciones, siendo éstas: I+D (Investigación y Desarrollo) AT (Asistencia Técnica) Laboratorios Generales Objetivos Familiarización respecto de la legislación microbiológica alimentaria existente. Aprendizaje de técnicas de análisis microbiológicos dentro del sistema de calidad implantado en el CNTA Laboratorio del Ebro: 1. Familiarización en técnicas tradicionales y automatizadas de análisis microbiológico de aguas, alimentos y ambientes. 2. Estudio de los Criterios generales para la acreditación de laboratorios de ensayo y calibración según norma UNE Realización de actividades relacionadas con la seguridad alimentaria: 1. Realización de análisis microbiológicos bajo los procedimientos implantados dentro del sistema de calidad. 2. Participación en los controles de calidad internos y externos (intercomparativos) para el aseguramiento de la calidad de los resultados. 3. Interpretación y valoración de resultados de acuerdo a la legislación aplicable a lo largo de toda la cadena productiva: de la granja a la mesa. 4. Aplicación de nuevas técnicas rápidas de análisis y puesta a punto de las mismas. 5. Estudios de evolución del alimento desde un punto de vista microbiológico: vida útil. 6. Edición de artículos técnicos de divulgación con los resultados obtenidos. A lo largo de estos tres meses, mi incorporación en el departamento de Microbiología fue paulatina y progresivamente. En un principio, me dedique a la lectura de los métodos de trabajo, legislación y normas microbiológicas de los alimentos y asimilados y otros parámetros físico-químicos de interés sanitario; colaborando, en paralelo, en tareas de limpieza y descontaminación de medios y placas de cultivo.

3 Semanas más tarde, fui realizando diversas tareas: - Preparación de medios de cultivo. - Preparación de soluciones madre y diluciones decimales. - Incubación de conservas en cámaras de incubación - Manejo del autoclave. - Verificación y mantenimiento de equipos. - Limpieza y descontaminación del material y muestras empleados. - Colaboración en el mantenimiento del sistema de calidad. - Control de superficies y ambiente del laboratorio. - Calibración del ph-metro. Tras varios semanas de observación y una vez adquiridos los conocimientos necesarios y las habilidades y destrezas requeridas para la realización de análisis microbiológicos, realicé lo que a continuación describo: 1).Análisis rutinarios de conservas: -Comparación de las siguientes características de las muestras incubadas durante 7 días tanto a 37 ºC como a 55 º C, frente a la muestra testigo conservada a temperatura ambiente. - Aspecto exterior del envase (normal, con raneo, convexo o rezumado) - Aspecto, olor y textura del alimento - Turbidez del líquido de gobierno - Variación de ph en relación a la muestra testigo - Examen microscópico si procede (tinción) -Duplicados de Análisis de Conservas Ácidas (ph<4.6): muestra a temperatura ambiente y muestra incubada a 37 º C. - Detección de Mesófilos aerobios - Detección de Mesófilos anaerobios - Detección de Lactobacilos - Detección de Mohos y Levaduras -Duplicados de Análisis de Conservas No Ácidas (ph> 4.6): muestra a temperatura ambiente y muestras incubadas a 37 ºC y a 55 ºC: - Detección de Mesófilos aerobios. - Detección de Mesófilos anaerobios. - Detección de Clostridios Sulfito-reductores. - Detección de Termófilos aerobios. - Detección de Termófilos anaerobios.

4 2).Investigación de Microorganismos en conservas alteradas La alteración del alimento envasado se define como los cambios en el producto (ph, textura, producción de gas, ) causados generalmente por microorganismos alterantes. Es necesario un procedimiento de estudio para obtener un diagnóstico rápido y preciso de las causas de alteración. El estudio debería incluir la siguiente información: histórico del producto defectuoso. análisis de la integridad de la estructura de los envases. análisis del estado físico (características organolépticas) y químico (ph) del alimento y otros factores que quizás estén relacionados con la presencia de microorganismos viables. Esta información junto con el análisis microbiológico sirve para determinar la causa de la alteración. Si no se dispone de toda esta información existe riesgo de generar un diagnóstico erróneo que podría tener repercusiones sanitarias y económicas. El ph del producto en estudio es el factor más importante a tener en cuenta. Por esta razón, los alimentos procesados térmicamente se dividen en dos grandes categorías de ph: Conservas de baja acidez, las cuales son alimentos que tienen un ph superior a 4,6 y una actividad de agua superior a 0,85. Conservas ácidas o acidificadas que tienen un ph natural igual o inferior a 4.6, o son acidificados a ph de 4.6 o inferiores. 3).Análisis de producto fresco y comidas preparadas Determinación de microorganismos mesófilos acidolácticos (ufc/g): Número de colonias de microorganismos encontrados por mililitro o por gramo de muestra cuando el ensayo se realiza según el método especificado. Principio: - Siembra en masa de 1 ml de solución madre o de la muestra (líquidas) o dilución decimal en una placa de Petri sobre la que se vierte el medio para recuento en placa (MRSA). Se incubarán las placas a 30±1ºC durante 72±3 h.

5 Determinación de microorganismos aerobios a 30ºC (ufc/g): Principio: - Siembra en masa de 1 ml de solución madre o de la muestra (líquidas) o dilución decimal en una placa de Petri sobre la que se vierte agar para recuento en placa (PC). - Incubación de las placas en aerobiosis a 30±1ºC durante 72±3 h. Determinación de microorganismos anerobios a 30ºC (ufc/g): Principio: - Siembra en masa de 1 ml de solución madre o de la muestra (líquidas) o dilución decimal en una placa de Petri sobre la que se vierte agar para recuento en placa.(ah) - Incubación de las placas en anaerobiosis a 30±1ºC durante 72±3 h. Determinación/recuento en placa de termófilos aerobios (ufc/g): Aquellas bacterias cuya temperatura óptima supera los 45ºC. Las bacterias termófilas pueden ser facultativas u obligadas. Se siembra un 1mL de solución madre o dilución decimal correspondiente en placa petri y se vierte PC para el recuento. Incubación: se incubarán 2 días a 55ºC Determinación/recuento en placa de termófilos anaerobios (ufc/g): Aquellas bacterias cuya temperatura óptima supera los 45ºC. Las bacterias termófilas pueden ser facultativas u obligadas. Principio:- Es la determinación del número total de microorganismos termófilos anaerobios por gramo o mililitro de alimento. Se siembra en masa con el medio adecuado (AH). - Incubación: se incuban a 55ºC en anaerobiosis durante 2 días. Determinación/recuento en placa de clostridium sulfito-reductores (ufc/g): Grupo integrado por gérmenes pertenecientes al género Clostridium que tienen en común la capacidad de reducir el sulfito a sulfuro. Se suelen usar para apreciar la calidad higiénica del agua y productos animales o de origen animal.

6 La detección de Clostridium sulfito-reductores, así como su recuento, se realizan mediante la numeración de formas vegetativas y esporuladas conjuntamente o sólo de las formas esporuladas. Principio: - Siembra en masa de 1 ml de la solución madre o de las diluciones decimales a placa de petri y adición de agar SPS. - Incubación de las placas en anaerobiosis a 37±1ºC durante 48±5h. El medio agar sulfito polimixina-sulfadiazina (SPS) es selectivo para sulfito-reductores. El sulfito sódico, por la acción sulfito-reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, da lugar a sulfuro de hierro, que se manifiesta por la formación de un precipitado negro alrededor de las colonias. Determinación/recuento en placa de clostridium perfringens (ufc/g): Microorganismos anaerobios, formadores de esporas pertenecientes a la familia Bacillaceae y al género Clostridium. Reducen nitratos a nitritos y producen SH 2. Principio: - Siembra en masa de 1 ml de solución madre o de la muestra (líquidas) o dilución decimal en una placa de Petri sobre la que se vierte agar TSC. - Incubación de las placas en anaerobiosis a 37±1 ºC durante 20±25 h.- Se confirman las colonias, de acuerdo con la norma UNE-EN-ISO 7937, sembrando las colonias en medio lactosa gelatina y nitrato movilidad los cuales se dejarán 24horas a 37ºC en anaerobiosis. - Para la confirmación definitiva de las colonias sembradas en lactosa gelatina y nitrato movilidad, se mantienen los tubos en refrigeración 1 hora para comprobar su estado tras ese tiempo. Si los tubos solidifican si el medio está líquido se vuelven a incubar 24horas más. Determinación/recuento en placa de estafilococos coagulasa-positiva (ufc/g): Bacterias que forman colonias características en un medio de cultivo selectivo y que dan una reacción fuertemente positiva a la coagulasa.

7 Principio: - Siembra en masa de 1 ml de solución madre o dilución decimal en una placa de Petri sobre la que se vierte agar plasma de conejo y fibrinógeno.(baiparker) - Incubación de las placas a 37 ± 1ºC, en aerobiosis, durante horas. - Cálculo del número de estafilococos coagulasa positivos por gramo de muestra a partir del número de colonias características obtenidas. Determinación/recuento en placa de mohos y levaduras (ufc/g): Moho: microorganismo aerobio mesófilo filamentoso, que en la superficie de un medio de agar a 25ºC forma colonias, bien a partir de la germinación de esporas o del crecimiento de fragmentos miceliales. Levadura: microorganismo aerobio mesófilo que crece a 25ºC en superficie sobre medios sólidos, formando colonias mates o brillantes de contorno regular y superficie convexa, o crece en profundidad formando colonias redondeadas o lenticulares. Principio: - Siembra de 1mL de solución madre o dilución decimal en una placa con el medio específico para el crecimiento de estos microorganismos (ML). - Incubación de las placas a 25ºC en aerobiosis durante 5 días. Determinación/recuento en placa de Bacillus cereus (ufc/g): Siembra en superficie de un medio de cultivo definido, repartido en placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra por ensayo, de la suspensión madre o de las diluciones decimales - Incubación de las placas en aerobiosis a 30 ± 1ºC durante 18 a 48 horas. - Cálculo del número de Bacillus cereus por gramo de muestra a partir del número de colonias características obtenidas. - Confirmación en Columbia agar de las colonias con halo amarillento. Se resiembran 5 colonias como máximo de cada placa y se incuban a 37ºC durante 24horas. Determinación/recuento en placa de Listeria monocytogenes (ufc/g): Principio: -Siembra en superficie un 1 ml de solución madre o diluciones decimales en BPW en placas de Petri con medio cromogénico (ALOA). - Incubación de las placas en aerobiosis a 37 ± 1ºC durante 24-48h - Confirmación de las colonias típicas de L. monocytogenes en agar ALOA confirmation

8 - Cálculo del número de Listeria monocytogenes por gramo de muestra a partir del número de colonias características obtenidas. Determinación/recuento de Enterobacterias (Petrifilm) (ufc/g): Microorganismos que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa negativa. Crecen en Petrifilm Enterobacterias dando lugar a colonias de color rojo con formación de burbujas de gas, o asociadas a zonas amarillas. Determinación/recuento de Coliformes totales (Petrifilm) (ufc/g): Bacterias Gram negativas, no esporuladas, fermentadoras de lactosa, y aerobias o anaerobias facultativas.el color oscuro de las colonias es característico de los coliformes. Determinación/recuento de E. coli (Petrifilm) (ufc/g): E. coli β- glucoronidasa + son bacterias que, a 42 ± 1ºC, forman colonias de color azulverdoso a verde oscuro en petrifilm Select E.coli. Principio: - Siembra de 1 ml de solución madre o dilución decimal en petrifilm select E.coli. - Incubación de las placas en aerobiosis a 42 ± 1ºC durante 24 ± 2 h. - Cálculo del número de E. coli β-glucoronidasa + por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenidas. Investigación de Salmonella: Perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas. Principio: - Enriquecimiento primario en agua de peptona tamponada. Incubación en aerobiosis a 37 ± 1ºC durante h. - Enriquecimiento secundario en medio líquido selectivo (Caldo SX2). Incubación en aerobiosis a 41.5 ± 1ºC durante h - El screening inicial se realizará mediante el equipo VIDAS, que realiza un test inmunoenzimático para Salmonella spp., por Método ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay).

9 En caso de obtener resultado positivo en el equipo Vidas: - Obtención de colonias típicas en agar XLD y agar cromogénico de salmonella sembradas a partir del enriquecimiento en caldo SX2. - Aislamiento de colonias típicas en medio general (PC) Confirmación bioquímica y serológica a partir de colonias obtenidas VIDAS Fundamento: La identificación se realizará a partir de los cultivos en caldo SX2 mediante el sistema automatizado VIDAS (ver Manual de Usuario (MIE.M.21/03), que realiza un test inmunoenzimático para Salmonella (VIDAS SLM), que permite la detección de antígenos O y H de Salmonella, tanto móviles como inmóviles, por Método ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay). El cono de uso único sirve a la vez de fase sólida y de sistema de pipeteo. El interior del cono está recubierto de anticuerpos anti-salmonella adsorbidos sobre la superficie. El resto de los reactivos están listos al empleo en cartucho. Todas las etapas se realizan automáticamente por el módulo analítico VIDAS. Una alícuota del caldo enriquecido se coloca en el cartucho y la muestra sufre un ciclo de aspiración/expulsión cuya duración ha sido específicamente calculada para activar la reacción. En caso de presencia de Salmonella, los antígenos presentes en el medio se fijan sobre los anticuerpos monoclonales (anti-salmonella) del interior de la pared del cono. Las nuevas etapas del lavado eliminan el conjugado no fijado. En la última etapa, el substrato, 4-metil umbeliferil fosfato, se introduce en el cono. El enzima unido a la pared del cono cataliza la transformación del substrato en un producto fluorescente, el 4-metil umbeliferona. La intensidad de la fluorescencia se mide por el sistema óptico del sistema VIDAS a 450 nm. Al introducir el cartucho con la muestra en el equipo, los resultados se analizan automáticamente por el sistema que da un valor para cada muestra. Este valor se compara con las referencias internas (umbrales) y cada resultado es interpretado (positivo, negativo).

10 Investigación y recuento de Listeria monocytogenes: Principio: - Enriquecimiento primario en medio líquido selectivo (Caldo Fraser Semi): Incubación en aerobiosis a 30 ± 1ºC durante h. - Enriquecimiento secundario en medio líquido selectivo (Caldo Fraser): Incubación en aerobiosis a 37 ± 1ºC durante h. - Identificación: El screening inicial se realizará mediante el equipo VIDAS, que realiza un test inmunoenzimático para L. monocytogenes, por Método ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay). - Confirmación: Las muestras que sean positivas en el VIDAS, se aislarán en agar cromogénico para Listeria y se identificarán mediante el agar ALOA confirmation. VIDAS: Fundamento: El sistema automatizado VIDAS (ver Manual de Usuario (MIE.M.21), realiza un test inmunoenzimático para L. monocytogenes, que permite la detección de antígenos de L. monocytogenes por Método ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay). El cono de uso único sirve a la vez de fase sólida y de sistema de pipeteado. El interior del cono está recubierto de anticuerpos anti - L. monocytogenes adsorbidos sobre la superficie. El resto de los reactivos están listos al empleo en cartucho. Todas las etapas se realizan automáticamente por el módulo analítico VIDAS. Una alícuota del caldo enriquecido se coloca en el cartucho y la muestra sufre un ciclo de aspiración/expulsión cuya duración ha sido específicamente calculada para activar la reacción. En caso de presencia de L. monocytogenes, los antígenos presentes en el medio se fijan sobre los anticuerpos monoclonales (anti - L. monocytogenes) del interior de la pared del cono. Las nuevas etapas del lavado eliminan el conjugado no fijado. En la última etapa, el substrato, 4-metil umbeliferil fosfato, se introduce en el cono. El enzima unido a la pared del cono cataliza la transformación del substrato en un producto fluorescente: el 4-metil umbeliferona. La intensidad de la fluorescencia se mide por el sistema óptico del sistema VIDAS a 450 nm. 4).Análisis de aguas Microorganismos aerobios a 22ºC y 37ºC (ufc/ml) Principio: - Siembra en masa de 1 ml de agua y sucesivas diluciones en placas de Petri sobre las que se vierte agar extracto de levadura (YEA). - Incubación en aerobiosis: Incubación a 36±2ºC durante 44 ± 4 h (Microorganismos cultivables a 37ºC) Incubación a 22±2ºC durante 68 ± 4 h (Microorganismos cultivables a 22ºC)

11 - Cálculo del número de microorganismos cultivables a 37 y 22ºC por mililitro a partir del número de colonias obtenidas. E. coli (ufc/100 ml) y coliformes totales (ufc/100 ml) 1.- Coliformes totales: organismos que producen color amarillo debido a la presencia de la enzima ß-galactosidasa, tras una incubación de 18-22ºC a 37ºC 2.- Escherichia coli: organismos que producen color amarillo debido a la presencia de la enzima ß-galactosidasa y fluorescencia azul bajo luz ultravioleta debido a la presencia de la enzima ß-glucoronidasa, tras incubación de 18-22ºC a 37ºC. Principio: - Se filtra un volumen determinado de muestra con filtro de 0.45μm suficiente para retener este tipo de bacterias. Colocaremos el filtro sobre el medio selectivo sólido CHR, y se incuba a 36 ± 2ºC durante 24 horas. Pseudomonas aeruginosa Microorganismos que se desarrollan en medios selectivos que contienen cetrimida y que producen piocianina producen fluorescencia bajo la luz U.V. (360 ± 20 nm), y son capaces de producir amoníaco a partir de la acetamida. Principio: - Filtración de un volumen determinado de muestra de agua a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro (0.45μm) suficiente para retener las bacterias. El filtro se coloca sobre un medio selectivo sólido que se incuba horas a 36 ± 2ºC. Una vez incubadas, se cuentan las colonias típicas y se confirman mediante la prueba de la oxidasa, producción de amoniaco y producción de fluorescencia, según se indica en el método. Enterococos (ufc/100 ml) Bacteria que crece formando colonias típicas en el medio especificado en este método y genera ennegrecimiento del medio bilis esculina agar a 44±1ºC. Principio: - Filtración de una parte de la muestra a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro (0.45μm) que retiene los organismos: Situar el filtro sobre un medio selectivo sólido que contenga azida sódica (para inhibir el crecimiento de bacterias

12 Gram negativas) y 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio, un colorante incoloro, que es reducido a rojo formazan por los enterococos. Incubación de las membranas durante 44 ± 4h a 36 ± 2ºC para la detección de enterococos. Contaje directo de colonias características formadas sobre el filtro. Clostridios perfringens (ufc/100ml) La filtración de la muestra de agua se realiza a través de un filtro de membrana con un poro de un tamaño que retenga en él o sobre él las esporas de las bacterias (0.22 μm). Se coloca el filtro en un medio de cultivo especializado (TSC), siguiendo una incubación a 37±1 ºC durante 20±2 h y se realiza un recuento de las colonias negras de la membrana. El recuento de colonias y confirmación se realiza igual que en alimentos (descrito anteriormente) Clostridium sulfito-reductores (ufc/50 ml) Selección de los esporos mediante calentamiento de 50 ml de la muestra a 75±5ºC durante 15minutos. Se filtrará a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro que retiene las esporas (0.22µm). se situa el filtro del revés, en la placa petri y a continuación vertimos el medio de agar con triptosa (TS). - Incubación de las muestras a 37ºC durante 44 horas aproximadamente en anaerobiosis. - Contaje de colonias negras características. Legionella spp: Microorganismo Gram negativo, capaz de crecer en no menos de 2 días en un agar que contiene, carbón activado, un buffer, extracto de levadura y L-cisteina y hierro, formando colonias generalmente blancas, o coloreadas que van desde el púrpura al azul o verde limón. Algunas especies producen fluorescencia al observarlas a la luz ultravioleta. Principio: - Las bacterias, incluida Legionella, presentes en la muestra de agua, son concentradas por filtración por membrana. Para reducir el crecimiento de las bacterias

13 competitivas, una porción de la muestra concentrada es tratada con ácido (5minutos de reposo antes de la siembra) y otra por calor (30 minutos a 80ºC antes de la siembra). Tras el tiempo requerido de espera, se siembra 0,5 ml en placa de agar selectivo (GVPC) tanto siembra directa, siembra tratada ácidamente como la tratada con calor. - Se incubarán durante 10 días a 37ºC y se irán realizando resiembras en BCY y BCYE (con L-cisteína y hierro para crecer) cada 3, 6 y 10 días. Para confirmar si es o no Legionella spp. Colilert: Es un método basado en el número más probable de múltiples pocillos. Se vierten 100mL de muestra con un medio de sustrato definido que contiene o-nitrophenyl-β-dgalactopiranoside (ONPG) y 4-metil-umbeliferil--β-D-glucuronido (MUG) y que lo que provoca es dar color amarillo si existen coliformes en la muestra o fluorescencia si son E.coli. Colifagos 5).Análisis de control de superficies (hisopos) Este método es aplicable tanto a superficies muestreadas mediante hisopos para realización de recuentos ó esponjas para investigación de patógenos y recuento de Listeria spp, en cuyo caso se conoce la superficie muestreada. En cualquiera de los casos el procedimiento de análisis es el siguiente: HISOPO: Añadir al tubo plástico estéril que contiene el hisopo agua de peptona tamponada hasta un volumen final de 10 ml o traspasar el hisopo a un tubo con 10 ml de agua de peptona tamponada, dejarlo estabilizar a Tª ambiente durante 15 minutos. Una vez estabilizado, ponerlo en el agitador de tubos durante unos y considerarlo como solución madre. ESPONJA: Añadir al tubo plástico estéril que contiene el hisopo agua de peptona tamponada hasta un volumen final de 10 ml o traspasar el hisopo a un tubo con 10 ml de agua de peptona tamponada, dejarlo estabilizar a Tª ambiente durante 15 minutos. Una vez estabilizado, ponerlo en el agitador de tubos durante unos y considerarlo como solución madre.

14 LISTERIA spp (petrifilm): Siembra de 3 ml de la solución madre en petrifilm Listeria Incubación de las placas en aerobiosis a 37±1ºC durante 28±2h Cálculo del número de Listeria spp. por muestra a partir del número de colonias características obtenidas. Recuentos: El rango de medida es: Superficies: 10 ufc / superficie muestreada Hisopos: 10 ufc / muestra Esponjas: 100 ufc / muestra Recuento de Listeria spp. (petrifilm): Superficies 1 ufc/ superficie muestreada (muestra recogida con hisopo) 5 ufc/ superficie muestreada (muestra recogida con esponja) Hisopos 1 ufc/muestra Esponjas 5 ufc/muestra 6).Análisis microbiológico del aire. Se realiza mediante un filtrado de aire en placa de Petri con medio PC; existen dos zonas a diferenciar a la hora de la filtración, en las diferentes salas en las cuales se trabaja o en las campanas donde se realizan las siembras. El volumen filtrado también es diferente, en las primeras es de 100 y en las segundas es de Ésta determinación debe salir correcta, ya que el ambiente en el cual se trabaja tiene que estar totalmente estéril para no proceder a la contaminación.

15 OPINIÓN PERSONAL La realización de estas prácticas me han sido de agrado, ya que he empliado mis conocimientos sobre un tema que me interesaba, tanto en aspectos microbiológicos como en alimentación. Al estar en el laboratorio de microbiología, he podido llegar a ver diversos microorganismos y ténicas utilizadas para su detección y confirmación.es un campo muy amplio, ya que la existencia de muchos de ellos, no te deja saber de todos, pero en este centro, la preocupación por el que llega nuevo y el entusiasmo de que aprenda es alta. El ambiente de trabajo es en general muy positivo, por la gran mayoría de gente joven que lo forma. Finalmente decir, que le recomiendo la experiencia a todo el mundo, tanto para ampliar conocimientos como para conocer diferentes ambientes de futuros trabajos.