marcadores profibróticos a través del aumento de ROS mediado por MAPK y la activación de COX-2 en células de
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- Juan Manuel Fidalgo Pereyra
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1 El receptor de (pro)renina aumenta la expresión de marcadores profibróticos a través del aumento de ROS mediado por MAPK y la activación de COX-2 en células de túbulo colector renal de ratón Reyes-Martínez, C., Zamora, L., González, Alexis A. Laboratorio de Química Biológica, Instituto de Química, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Los autores no reportan conflicto de interés XXXIII Congreso de nefrología, hipertensión y trasplante renal. Puerto Varas, Chile. Financiado por Proyecto DREAMS PUCV /2016
2 ctivación del receptor de (pro)renina (PRR) en túbulo colecto a activación de MAPK/ERK 1/2 aumenta la síntesis de ciclooxigenasa 2 (COX-2), enzima que se caliza con PRR en células intercaladas. l aumento de los marcadores profibróticos podría estar relacionado a la generación de espe activas de oxígeno (ROS). n hipertensión y diabetes existen altos niveles de prorenina intratubulares, lo que podría favorec ctivación del PRR. Actualmente, los mecanismos moleculares responsables de los efectos d ctivación del PRR en las células de TC renal se desconocen.
3 Hipótesis Nuestra hipótesis es que la activación del PRR aumenta la expresión de proteínas rofibróticas a través del aumento en los niveles de ROS, dependiente de MAPK/ERK 1/2 y po activación de COX-2. Objetivos bjetivo general: determinar si la activación del PRR aumenta la expresión de proteína ofibróticas como consecuencia del aumento de ROS dependiente de MAPK/ERK 1/2, además d activación de COX-2 en células de túbulo colector renal de ratón (M-1). bjetivos específicos: Determinar si la activación del PRR aumenta los niveles de marcadores profibróticos. Determinar si la activación del PRR aumenta los niveles de ROS intracelulares. Determinar si el aumento de ROS es dependientee de la activación de MAPK/ERK 1/2. Determinar si el uso de antioxidantes previene el aumento de los marcadores profibróticos. Obtener una aproximación al papel de COX-determinar si su inhibición previene el aumento de en el aumento de proteínas profibróticas, a estas.
4 Metodología
5 Resultados 1. La activación del PRR aumenta la expresión de ínas profibróticas en células M-1 mientras que el iento con un antioxidante previene este incremento. Figura 2. La activación de PRR aumenta nive ROS en células M-1, mientras que el pretrata con un antioxidante previene este increme lulas fueron tratadas con hrpr 10-8 M durante 6 horas. Un grupo fue prese con ácido p-cumárico 10-7 M (PCA) durante 10 minutos. Posteriormente, western blot para determinar los niveles de proteínas profibróticas (factor de iento de tejido conectivo (CTGF), α-actina de músculo liso (α-sma), inhibidor ivador de plasminógeno-1 (PAI-1)). A) Western blots representativos para las as identificadas. B) Análisis densitométrico de las proteínas profibróticas. 5 vs control, n=3. Los cultivos fueron preincubados con la sonda fl DCFHDA 0,1 mm por 10min antes del tratamiento hr durante 10 minutos. Un grupo fue pre-tratado con ácido 10-7 M durante 10 minutos Se realizó la medición inmediata en el lector de placas. Las muestras fueron no con la concentración de proteína total. Cuantificación de l de la sonda fluorescente DCFHDA, normalizada concentración de proteína. **p<0.01. n=12
6 ra 3. PD98059, (un inhibidor de MAPK) previene ento de proteínas profibróticas en células M-1. Figura 4. PD98059 (un inhibidor de MAPK) previene la producción de ROS en células M lizó un pre-tratamiento de los cultivos celulares con PD µm dor de MAPK). Posteriormente, se trataron los cultivos con hrpr 10-8 rante 6 horas. Luego se midió los niveles de las proteínas róticas mediante western blot. A) Western blots representativos para proteína. B) Cuantificación de proteínas profibróticas por análisis ométrico. *p<0,05 vs. control, **p<0,01 vs. control. n=4. Los cultivos fueron pre-incubados con la sonda fluorescente DCFHDA durante 10 minutos antes del tratamiento con hrpr (10-8 M). Un tratado con PD98058 (30 µm) 10 minutos antes del tratamiento con normalizó las muestras con la concentración de proteína total. Cuantif la oxidación de la sonda fluorescente normalizada por la concen proteína. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. n=10.
7 Figura 5. La activación de PRR aumenta la síntesis del marcador profibrótico PAI-1 en células M-1 y el uso del inhibidor de COX-2, NS-398, previene este efecto. A) B) PAI-1 β-actina Los cultivos se pre-trataron con el inhibidor selectivo de COX-2, NS-398 a una concentración 10-5 M durante 20 minutos. Posteriormente, se procedió al tratamiento con hrpr 10-8 M durante 6 horas y se evaluó los niveles de PAI-1 mediante western blot. A) Western blot representativo paraa las PAI-1. B) Cuantificación de proteínas profibróticas por análisis densitométrico. *p<0,05 vs. control n=5.
8 Conclusiones vía MAPK/ERK 1/2 está involucrada en el ento de síntesis de marcadores fibróticos, como consecuencia de la activación del R, ya que al inhibirla, se previene el aumento de s proteínas. otra parte, el aumento de estas proteínas puedee consecuencia de un aumento en ROS, activado MAPK, como sugieren nuestros resultados. manera paralela, la activación de COX-2 podría r favoreciendo el aumento de los marcadores fibróticos en las células M-1, más no se puedee cluir acerca de su rol definitivo, ya que faltaa luar otros marcadores, además de la generaciónn ROS.
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