Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ

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1 Diciembre 2010 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ Versión 1 24 Diagnóstico in vitro cuantitativo Para utilizar con los instrumentos QIAsymphony SP/AS y Rotor-Gene Q ES QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R ES Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN: Tecnologías de preparación de muestras y ensayos de biología molecular QIAGEN es el proveedor líder de tecnologías innovadoras para la preparación de muestras y ensayos de biología molecular, que permite el aislamiento y la detección del contenido de cualquier muestra biológica. Nuestros productos y servicios de vanguardia y máxima calidad garantizan el éxito, desde la muestra hasta el resultado. QIAGEN sienta las bases de excelencia en los siguientes campos: Purificación de ADN, ARN y proteínas Ensayos de ácidos nucleicos y proteínas Investigación con microarn y ARNi Automatización de tecnologías de preparación de muestras y ensayos de biología molecular. Nuestra misión es ayudarle a superar sus retos y a alcanzar un éxito excepcional. Para más información, visite

3 Contenido Contenido del kit 5 Símbolos 5 Almacenamiento 6 Uso previsto 6 Limitaciones de uso del producto 6 Control de calidad 7 Asistencia técnica 7 Información sobre seguridad 7 Introducción 9 Principio 9 Información sobre el patógeno 9 Características de rendimiento 10 Flujo de trabajo 16 Equipo y reactivos que debe suministrar el usuario 21 Notas importantes 23 Precauciones generales 23 Recogida, almacenamiento y transporte de muestras 23 Preparación de los instrumentos QIAsymphony SP/AS 25 Preparación del material de muestra 29 Preparación de las mezclas ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) para muestras de plasma 29 Utilización de un control interno 29 Conjuntos de controles del ensayo y conjuntos de parámetros del ensayo 31 Series multiensayo 32 Rendimiento de ácidos nucleicos 33 Almacenamiento de ácidos nucleicos 33 Establecer el umbral para el análisis de PCR 33 Cuantificación 33 Protocolos Aislamiento de ADN en el QIAsymphony SP 35 Preparación del ensayo en el QIAsymphony AS 44 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010 3

4 Protocolo: PCR y análisis de los datos en el Rotor-Gene Q 52 Guía de resolución de problemas 64 Bibliografía 71 Información para pedidos 72 4 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

5 Contenido del kit Kit artus EBV QS-RGQ (24) Referencia Número de reacciones 24 Azul Mezcla maestra EBV RG Master 3 x 360 μl Rojo EBV RG QS 1* (5 x 10 4 copias/μl) 200 μl Rojo EBV RG QS 2* (5 x 10 3 copias/μl) 200 μl Rojo EBV RG QS 3* (5 x 10 2 copias/μl) 200 μl Rojo EBV RG QS 4* (5 x 10 1 copias/μl) 200 μl Verde EBV RG IC 1000 μl Blanco Agua (de calidad para PCR) 1000 μl Manual 1 * Estándar de cuantificación. Control interno. Símbolos <N> Contiene reactivos suficientes para <n> pruebas Fecha de caducidad Producto sanitario para diagnóstico in vitro Número de referencia Número de lote Número de material Componentes Contiene Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010 5

6 Número Limitación de temperatura Fabricante legal Consultar instrucciones de uso Nota importante Almacenamiento Los componentes del kit artus EBV QS-RGQ deben almacenarse a una temperatura de 20 C y son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Deben evitarse los ciclos repetidos de descongelación y congelación (> 2), ya que pueden reducir el rendimiento del ensayo. Uso previsto El kit artus EBV QS-RGQ es una prueba de amplificación de ácidos nucleicos in vitro para la cuantificación del ADN del virus de Epstein-Barr (EBV). Este kit para pruebas de diagnóstico emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y está configurado para los instrumentos QIAsymphony SP/AS y Rotor-Gene Q. El kit artus EBV QS-RGQ ha sido desarrollado para utilizarse en combinación con la presentación clínica y otros marcadores de laboratorio para realizar un pronóstico de la enfermedad. Limitaciones de uso del producto Todos los reactivos pueden utilizarse exclusivamente para diagnóstico in vitro. Este producto debe ser utilizado exclusivamente por personal con formación y preparación específicas en los procedimientos de diagnóstico in vitro (EN375). Para obtener resultados óptimos con la PCR es necesario un cumplimiento estricto del manual de usuario. Debe prestarse atención a las fechas de caducidad impresas en la caja y en las etiquetas de todos los componentes. No utilice componentes caducados. Aunque poco frecuentes, las mutaciones en el interior de las regiones altamente conservadas del genoma viral cubiertas por los cebadores del kit y/o de la sonda pueden producir en estos casos una subcuantificación o un fallo de 6 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

7 la detección de la presencia del virus. La validez y el rendimiento del diseño del ensayo se revisan en intervalos regulares. Control de calidad En cumplimiento del sistema de gestión de calidad con certificación ISO de QIAGEN, cada lote de kit artus EBV QS-RGQ se analiza en relación con las especificaciones predeterminadas para garantizar la uniformidad de la calidad de los productos. Asistencia técnica En QIAGEN nos enorgullecemos de la calidad y disponibilidad de nuestra asistencia técnica. En nuestros departamentos de Servicio Técnico trabajan científicos expertos con amplia experiencia en los aspectos prácticos y teóricos de las tecnologías de preparación de muestras y ensayos de biología molecular y en el uso de los productos de QIAGEN. Si desea formular cualquier pregunta o si tiene dificultades con el kit artus EBV QS-RGQ o con los productos de QIAGEN en general, no dude en ponerse en contacto con nosotros. Los clientes de QIAGEN son una importante fuente de información sobre los usos avanzados o especializados de nuestros productos. Esta información es de utilidad para otros científicos además de para los investigadores de QIAGEN. Por este motivo, lo animamos a ponerse en contacto con nosotros si tiene cualquier sugerencia sobre el rendimiento de nuestros productos o sobre nuevas aplicaciones y técnicas. Para recibir asistencia técnica y solicitar más información, visítenos en nuestro Centro de Servicio Técnico (Technical Support Center) en o póngase en contacto telefónico con uno de los departamentos de Servicio Técnico de QIAGEN o con los distribuidores locales (consulte la contraportada o visite Información sobre seguridad Siempre que trabaje con productos químicos, utilice una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas protectoras. Para obtener más información consulte las fichas de datos de seguridad de los materiales (MSDS) correspondientes. Estas fichas están disponibles online en un formato PDF cómodo y compacto en donde podrá encontrar, visualizar e imprimir la ficha de datos de seguridad correspondiente a cada kit y a cada componente del kit de QIAGEN. Para obtener información sobre seguridad relativa al kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi, consulte el Manual de uso QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Para obtener información sobre seguridad relativa al kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini, consulte el manual QIAsymphony DNA Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010 7

8 Handbook. Para obtener información sobre seguridad relativa a los instrumentos, consulte el manual de usuario del instrumento correspondiente. Elimine los desechos de las muestras y del ensayo de conformidad con la normativa local sobre seguridad. Información para emergencias disponible las 24 horas Puede obtenerse información médica de emergencia en inglés, francés y alemán las 24 horas del día en: Centro de información toxicológica de Maguncia, Alemania Tel: Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

9 Introducción El kit artus EBV QS-RGQ constituye un sistema listo para usar para la detección del ADN del EBV mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en los instrumentos Rotor-Gene Q, con la preparación de las muestras y del ensayo en los instrumentos QIAsymphony SP/AS. La mezcla maestra EBV RG Master contiene los reactivos y las enzimas necesarios para la amplificación específica de una región de 97 pb del genoma del EBV, así como para la detección directa del amplicón específico en el canal de fluorescencia Cycling Green del instrumento Rotor-Gene Q. Además, el kit artus EBV QS-RGQ contiene un segundo sistema de amplificación heterógena para identificar una posible inhibición de la PCR. Esto se detecta como un control interno (IC) en el canal de fluorescencia Cycling Yellow del instrumento Rotor-Gene Q. No se reduce el límite de detección de la PCR analítica del EBV. Se suministran controles positivos externos (EBV RG QS 1 4), que permiten determinar la cantidad de ADN viral. Para obtener más información, consulte Cuantificación en la página 33. Principio La detección de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se basa en la amplificación de regiones específicas del genoma de los patógenos. Con la PCR en tiempo real, el producto amplificado se detecta mediante moléculas fluorescentes. Estas moléculas suelen estar ligadas a sondas oligonucleotídicas que se unen específicamente al producto amplificado. La monitorización de las intensidades de fluorescencia durante el proceso de PCR (es decir, en tiempo real) permite detectar y cuantificar el producto que se acumula sin tener que volver a abrir los tubos de reacción una vez finalizado el proceso de PCR.* Información sobre el patógeno El virus de Epstein-Barr (EBV) se transmite por vía oral, principalmente por la saliva contaminada. En general, la infección por EBV es asintomática, sobre todo si se contrae en la infancia. El signo clínico de una infección aguda es la mononucleosis infecciosa que cursa con fiebre, cansancio y faringitis, así como con inflamación de los nódulos linfáticos y del bazo. En algunos pacientes estos síntomas reaparecen de forma crónica. Se observan formas graves de la infección con EBV en pacientes immunodeficientes y en personas con defectos de las células T. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010 9

10 Características de rendimiento Sensibilidad analítica (plasma) El límite de detección analítico teniendo en cuenta la purificación (límite de sensibilidad) se evaluó para el kit artus EBV QS-RGQ mediante muestras clínicas EBV positivas en combinación con la extracción con el QIAsymphony SP. En el caso del plasma, la sensibilidad analítica teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ se determinó añadiendo una serie de dilución de material viral EBV de 3160 a 1 copias/ml nominales de EBV a muestras clínicas de plasma. Estas se sometieron a la extracción de ADN con el kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi en combinación con el protocolo Cellfree1000 (volumen de extracción: 1 ml, volumen de elución: 60 μl). Cada una de las 10 diluciones se analizó con el kit artus EBV QS-RGQ en 4 días diferentes y en 4 series analíticas con 8 duplicados cada una. Los resultados se determinaron mediante un análisis Probit. En la figura 1 se muestra una representación gráfica del análisis Probit. El límite de detección analítico teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ y en combinación con el instrumento Rotor-Gene Q es de 157 copias/ml (p = 0,05). Esto significa que existe una probabilidad del 95% de que se detecten 157 copias/ml % Proporciones Proportions , ~ 157 copias/ml copies/ml (95%) ( copias/ml) copies/ml) log log (dosis) (dose) Figura 1. Análisis Probit: plasma, EBV (Rotor-Gene Q). Sensibilidad analítica teniendo en cuenta la purificación (plasma, utilizando el kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi) del kit artus EBV QS-RGQ en el Rotor-Gene Q. 10 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

11 Especificidad (plasma) La especificidad del kit artus EBV QS-RGQ se asegura ante todo mediante la selección de los cebadores y de las sondas, así como mediante la selección de condiciones estrictas para la reacción. Los cebadores y las sondas se comprobaron con respecto a posibles homologías de todas las secuencias publicadas en los bancos de genes por medio de un análisis de comparación de secuencias. De este modo se ha asegurado la detección de los genotipos relevantes. La especificidad se evaluó además con 30 muestras de plasma EBV negativas diferentes. Estas no generaron ninguna señal con los cebadores y las sondas específicos del EBV que se incluyen en la mezcla maestra EBV RG Master. Se analizó una posible reactividad cruzada del kit artus EBV QS-RGQ mediante el grupo de control indicado en la tabla 1 (a continuación). Ninguno de los patógenos analizados mostró reactividad. No se produjo ninguna reactividad cruzada en el caso de infecciones mixtas. Tabla 1. Análisis de la especificidad del kit con patógenos con posible reactividad cruzada Grupo de control Virus del herpes humano 1 (virus herpes simplex 1) Virus del herpes humano 2 (virus herpes simplex 2) Virus del herpes humano 3 (virus varicela-zóster) Virus del herpes humano 5 (citomegalovirus) Virus de la leucemia de células T humana tipo 1 Virus de la leucemia de células T humana tipo 2 EBV (Cycling Green) Control interno (Cycling Yellow) Intervalo lineal (plasma) El intervalo lineal teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ se determinó mediante el análisis de una serie de dilución de material del EBV Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

12 que varía de 1,00 x 10 7 copias/ml a 1,00 x 10 2 copias/ml. La purificación se realizó en duplicados (n = 4 para concentraciones 1,00 x 10 6 copias/ml; n = 8 para concentraciones <1,00 x 10 6 copias/ml) mediante el kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen en combinación con el protocolo Cellfree1000 (volumen de extracción: 1 ml, volumen de elución: 60 μl). Cada una de las muestras se analizó con el kit artus EBV QS-RGQ. Se determinó el intervalo lineal teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ para incluir concentraciones de 3,16 x 10 2 copias/ml hasta 1,00 x 10 7 copias/ml para plasma (figura 2). 10 log log estimated concentración concentration calculada (copies/ml) (copias/ml) y = 1,0528x x 0, R 2 = 0, log log concentración nominal concentration nominal (copias/ml) (copies/ml) Figura 2. Intervalo lineal del kit artus EBV QS-RGQ (plasma). Cálculo del intervalo lineal. La línea recta se determinó mediante una regresión lineal de las concentraciones calculadas por medio de log 10 con las concentraciones nominales log 10. La ecuación de la línea de regresión está incluida en la figura. Robustez (plasma) La verificación de la robustez permite determinar el índice total de fracaso del kit artus EBV QS-RGQ. Para verificar la robustez se añadieron 30 copias/ml de EBV (aproximadamente tres veces la concentración del límite de sensibilidad analítico) a 30 muestras de plasma EBV negativas. Tras realizar la extracción de ADN con el kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi en combinación con el protocolo Cellfree1000_DSP (volumen de extracción: 1 ml, volumen de elución: 60 μl), las muestras se analizaron con el kit artus EBV QS-RGQ. Además, la robustez del control interno se evaluó mediante la purificación y el análisis de 30 muestras de plasma adicionadas. No se observaron inhibiciones. Por tanto, la robustez del kit artus EBV QS-RGQ es 99%. 12 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

13 Sensibilidad analítica (sangre completa) En el caso de la sangre completa, la sensibilidad analítica teniendo en cuenta la purificación del kit artus CMV QS-RGQ se determinó añadiendo una serie de dilución de material viral EBV de 3160 a 3,16 copias/ml nominales de EBV a muestras clínicas de sangre completa. Estas se sometieron a la extracción de ADN con el kit QIAsymphony DNA Mini en combinación con el protocolo VirusBlood200 (volumen de extracción: 200 μl, volumen de elución: 60 μl). Cada una de las 10 diluciones se analizó con el kit artus EBV QS-RGQ en 3 días diferentes y en 3 series analíticas con 11 duplicados cada una. Los resultados se determinaron mediante un análisis Probit. En la figura 3 se muestra una representación gráfica del análisis Probit. El límite de detección analítico teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ y en combinación con el instrumento Rotor-Gene Q es de 288,42 copias/ml (p = 0,05). Esto significa que existe una probabilidad del 95% de que se detecten 288,42 copias/ml % Proporciones Proportions , ~ 288, copias/ml copies/ml (95%) (169,53 710,95 ( copies/ml) copias/ml) log log (dosis) (dose) Figura 3. Análisis Probit: sangre completa, EBV (Rotor-Gene Q). Sensibilidad analítica teniendo en cuenta la purificación (sangre completa, utilizando el kit QIAsymphony DNA Mini) del kit artus EBV QS-RGQ en el Rotor-Gene Q. Especificidad (sangre completa) La especificidad del kit artus EBV QS-RGQ se asegura ante todo mediante la selección de los cebadores y de las sondas, así como mediante la selección de condiciones estrictas para la reacción. Los cebadores y las sondas se comprobaron con respecto a posibles homologías de todas las secuencias publicadas en los bancos de genes por medio de un análisis de comparación Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

14 de secuencias. De este modo se ha asegurado la detección de los genotipos relevantes. La especificidad se evaluó además con 30 muestras de plasma EBV negativas diferentes. Estas no generaron ninguna señal con los cebadores y las sondas específicos del EBV que se incluyen en la mezcla maestra EBV RG Master. Se analizó una posible reactividad cruzada del kit artus EBV QS-RGQ mediante el grupo de control indicado en la tabla 1 (véase la página 11). Ninguno de los patógenos analizados mostró reactividad. No se produjo ninguna reactividad cruzada en el caso de infecciones mixtas. Intervalo lineal (sangre completa) El intervalo lineal teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ se determinó mediante el análisis de una serie de diluciones de material viral de EBV de 5,00 x 10 7 copias/ml a 1 x 10 2 copias/ml en sangre completa. La purificación se realizó en duplicados (n = 4 para concentraciones 1,00 x 10 7 copias/ml; n = 8 para concentraciones <1,00 x 10 7 copias/ml) mediante el kit QIAsymphony DNA Mini en combinación con el protocolo VirusBlood200 (volumen de extracción: 200 μl, volumen de elución: 60 μl). Cada una de las muestras se analizó con el kit artus EBV QS-RGQ. Se determinó el intervalo lineal teniendo en cuenta la purificación del kit artus EBV QS-RGQ para incluir concentraciones de 1,00 x 10 3 copias/ml hasta 5,00 x 10 7 copias/ml para sangre completa (figura 4). 14 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

15 10 log 10 concentración calculada (copias/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y = x 1,0261x ,0477 R 22 = , log log concentración nominal concentration nominal (copias/ml) (copies/ml) Figura 4. Intervalo lineal del kit artus EBV QS-RGQ (sangre completa). Cálculo del intervalo lineal. La línea recta se determinó mediante una regresión lineal de las concentraciones calculadas por medio de log 10 con las concentraciones nominales log 10. La ecuación de la línea de regresión está incluida en la figura. Robustez (sangre completa) La verificación de la robustez permite determinar el índice total de fallos del kit artus EBV QS-RGQ. Para verificar la robustez se añadieron 750 copias/ml de EBV (aproximadamente tres veces la concentración del límite de sensibilidad analítico) a 30 muestras de sangre completa EBV negativas. Tras realizar la extracción de ADN con el kit QIAsymphony DNA Mini en combinación con el protocolo VirusBlood200 (volumen de extracción: 200 μl, volumen de elución: 60 μl), las muestras se analizaron con el kit artus EBV QS-RGQ. Además, la robustez del control interno se evaluó mediante la purificación y el análisis de 30 muestras de sangre completa adicionadas. No se observaron inhibiciones. Por tanto, la robustez del kit artus EBV QS-RGQ es 99%. Reproducibilidad Los datos de reproducibilidad permiten evaluar periódicamente el rendimiento del kit artus EBV QS-RGQ y comparar su eficacia con la de otros productos. Estos datos se obtienen por medio de la participación en programas de competencia establecidos. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

16 Contaminación cruzada Se ha demostrado la ausencia de una contaminación cruzada entre las muestras para el flujo de trabajo completo por medio de la detección correcta de todas las muestras positivas y negativas conocidas en posiciones alternantes (patrón de cuadrícula) para un sistema artus QS-RGQ representativo. Flujo de trabajo El flujo de trabajo con el sistema QIAsymphony RGQ comienza con la purificación de los ácidos nucleicos a partir de muestras de plasma o sangre completa de origen humano utilizando el instrumento QIAsymphony SP. Los eluidos (que contienen ácidos nucleicos purificados) obtenidos con el procedimiento de preparación de muestras se transfieren al módulo QIAsymphony AS, que a continuación realiza la preparación del ensayo (figura 5). En un siguiente paso los ensayos se transfieren al instrumento Rotor-Gene Q para realizar la PCR y el análisis de los datos (figura 6). En las páginas se muestra una descripción general del flujo de trabajo. Para obtener más información, consulte los protocolos detallados descritos en este manual (páginas 35, 44 y 52). Figura 5. Automatización completa en los instrumentos QIAsymphony SP/AS. Las muestras, los reactivos y los consumibles se cargan en los cajones correspondientes. La preparación de las muestras y del ensayo se realiza a continuación de forma completamente automatizada en los instrumentos QIAsymphony SP/AS. 16 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

17 Figura 6. Transferencia de las muestras al Rotor-Gene Q. Tras la preparación de las muestras y del ensayo, las reacciones se cargan en el rotor de 72 pocillos del Rotor-Gene Q para realizar el análisis de PCR en tiempo real. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

18 Descripción general del flujo de trabajo con el sistema QIAsymphony RGQ QIAsymphony SP Cargue el cajón Waste (desechos). Cargue la gradilla de elución en el cajón Eluate (Eluidos). Funcionamiento independiente Funcionamiento integrado Cargue la gradilla de elución en la ranura 1. Cargue la gradilla de elución con el adaptador, incluido el marco de transferencia, en la ranura 1. Cargue el cajón Reagents and Consumables (reactivos y consumibles). Cargue el cajón Sample (muestras) Defina una serie analítica/un lote a través de la interfaz del usuario de la preparación de muestras. Inicie el protocolo Cuando el procesamiento de las muestras haya finalizado, retire manualmente la gradilla de elución del cajón Eluate (funcionamiento independiente) o transfiera directamente la gradilla de elución al QIAsymphony AS mediante el módulo de transferencia (funcionamiento integrado). Funcionamiento independiente Funcionamiento integrado Elimine la orden de la ranura del eluido en la pantalla táctil; a continuación, abra el cajón Eluate y retire manualmente la gradilla de elución. Pulse Transfer (transferir) para transferir la gradilla de elución de la ranura 1 del QIAsymphony SP a la ranura 2 del QIAsymphony AS. Descargue el archivo de resultados del QIAsymphony SP. 18 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

19 QIAsymphony AS Pase a la interfaz del usuario para la preparación del ensayo en la pantalla táctil. Inicie el proceso de definición del ensayo. Funcionamiento independiente Funcionamiento integrado Pulse New (nuevo). Cuando aparezca un mensaje preguntando si desea utilizar la gradilla de elución como gradilla de muestras, pulse Yes (sí) para confirmar. Defina una serie analítica del ensayo. Las pantallas que aparecerán en la pantalla táctil le guiarán paso a paso por el proceso de definición del ensayo. Cargue las muestras, los reactivos y los consumibles correspondientes en los cajones Eluate and Reagents (eluidos y reactivos) y Assays (ensayos). Para obtener información detallada sobre la carga, consulte la pantalla Loading information (información sobre la carga). Otra opción es pulsar Queue (cola) para descargar el archivo de información sobre la carga. Inicie la serie analítica del ensayo. Cuando haya terminado la serie analítica, retire los ensayos. Para ello, pulse Remove (Retirar) y, a continuación, retire manualmente la(s) gradilla(s) de ensayo del cajón Assays. Transfiera la(s) gradilla(s) de ensayo al Rotor-Gene Q. Descargue el archivo de resultados del QIAsymphony AS y el archivo del termociclador. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

20 Transfiera el archivo del termociclador al Rotor-Gene Q. Rotor-Gene Q Seleccione o cree un perfil de temperatura. Haga clic en Start Run. Cuando haya finalizado la serie analítica, analice los resultados. Mantenimiento Lleve a cabo los procedimientos de mantenimiento adecuados para los instrumentos QIAsymphony SP/AS y Rotor-Gene Q especificados en los respectivos manuales de usuario. Consulte el apartado 8 del Manual de usuario del QIAsymphony SP/AS Descripción general y el apartado 9 del Manual de usuario del Rotor-Gene Q para obtener más detalles sobre los procedimientos necesarios para el mantenimiento diario, regular y semanal. 20 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

21 Equipo y reactivos que debe suministrar el usuario Siempre que trabaje con productos químicos, utilice una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas protectoras. Para obtener más información, consulte las fichas de datos de seguridad de los materiales (material safety data sheets, MSDS) correspondientes, que podrá adquirir a través del proveedor del producto. Pipetas (ajustables)* y puntas de pipeta estériles con filtros Agitador vorticial* Centrifugadora de mesa* con rotor para tubos de reacción de 2 ml, capaz de centrifugar a 6800 x g Para la preparación de muestras Instrumento QIAsymphony SP (ref )* Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi (ref ) para las muestras de plasma o el kit QIAsymphony DNA Mini (ref ) para las muestras de sangre completa Adaptadores para el instrumento QIAsymphony SP: Gradilla para microtubos de elución QS (adaptador de refrigeración, EMT, v2, Qsym, ref ) Inserto para tubos 3B (inserto, 2.0ml v2, soporte para muestras (24), Qsym, ref ) Consumibles para el instrumento QIAsymphony SP: Cartuchos de preparación de muestras, 8 pocillos (ref ) Cubiertas para 8 barras (ref ) Puntas con filtro, 1500 μl (ref ) Puntas con filtro, 200 μl (ref ) Microtubos de elución CL (ref ) Bolsas para la eliminación de puntas (ref ) Microtubos de 2,0 ml de tipo H o microtubos de 2,0 ml de tipo I (Sarstedt, refs y , para utilizar con las muestras y los controles internos * Asegúrese de que los instrumentos hayan sido verificados y calibrados siguiendo las recomendaciones del fabricante. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

22 Para la preparación del ensayo Instrumento QIAsymphony AS (ref )* Adaptadores y soportes para reactivos para el instrumento QIAsymphony AS: Soporte para reactivos 1 QS (adaptador de refrigeración, soporte para reactivos 1, Qsym, ref ) Soporte para reactivos 2 QS (adaptador de refrigeración, soporte para reactivos 2, Qsym, ref ) Tubos en tira RG 72 QS (adaptador de refrigeración, tubos en tira RG 72, Qsym, ref ) Consumibles para el instrumento QIAsymphony AS: Tubos en tira y tapones, 0,1 ml (ref ) Tubos, cónicos, 2 ml, Qsym AS (ref )* o microtubos de 2,0 ml de tipo I (Sarstedt, ref , Tubos, cónicos, 5 ml, Qsym AS (ref )* o tubos de fondo plano de PP (Sarstedt, ref , Frascos de reactivo, 30 ml, Qsym AS (ref ) Microtubos de elución CL (ref ) Puntas con filtro, 1500 μl (ref ) Puntas con filtro, 200 μl (ref ) Puntas con filtro, 50 μl (ref ) Bolsas para la eliminación de puntas (ref ) Para la PCR: Instrumento Rotor-Gene Q 5plex HRM Versión del software Rotor-Gene Q 2.02 o superior * Asegúrese de que los instrumentos hayan sido verificados y calibrados siguiendo las recomendaciones del fabricante. Consulte la disponibilidad. 22 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

23 Notas importantes Precauciones generales Respete siempre las siguientes instrucciones: Utilice puntas de pipeta estériles con filtro. Durante los pasos manuales, mantenga los tubos cerrados siempre que sea posible y evite la contaminación. Descongele todos los componentes totalmente a temperatura ambiente (15 25 C) antes de comenzar un ensayo. Una vez descongelados, mezcle los componentes (mediante pipeteo repetido arriba y abajo o mediante agitación vorticial de pulsos) y centrifugue brevemente. Asegúrese de que no haya espuma ni burbujas en los tubos de reactivos. No mezcle componentes de kits que tengan distintos números de lote. Asegúrese de prerrefrigerar a 2 8 C los adaptadores requeridos. Trabaje con rapidez y mantenga los reactivos de PCR en hielo o en el bloque de refrigeración antes de colocarlos en el instrumento. Proceda sin pausa de una parte del flujo de trabajo a la siguiente. No supere un tiempo de transferencia de una hora entre cada módulo (del QIAsymphony SP al QIAsymphony AS al Rotor-Gene Q). Recogida, almacenamiento y transporte de muestras Todas las muestras deben ser tratadas como material potencialmente infeccioso. Solo se permiten los siguientes materiales de muestra, para los cuales deben observarse estrictamente las siguientes normas e instrucciones específicas relativas a la recogida, el transporte y el almacenamiento. La validación interna del kit artus EBV QS-RGQ se ha llevado a cabo utilizando muestras humanas de plasma con EDTA y sangre completa con EDTA. No se han validado otros materiales de muestra. Utilice exclusivamente el kit de aislamiento de ADN recomendado (consulte el Protocolo: Aislamiento de ADN en el QIAsymphony SP en la página 35) para obtener información sobre la preparación de las muestras. Cuando se utilizan ciertos materiales de muestra es preciso seguir estrictamente las instrucciones específicas relativas a la recogida, el transporte y el almacenamiento. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

24 Recogida de muestras Cada extracción de sangre ocasiona una lesión de los vasos sanguíneos (arterias, venas y capilares). Solo debe utilizarse material inocuo y estéril. Para la extracción de sangre hay disponible material desechable adecuado. Para las venopunciones no deben utilizarse agujas capilares demasiado finas. La extracción de sangre venosa debe realizarse en las regiones adecuadas de la flexura del codo, el antebrazo o el dorso de la mano. La sangre debe extraerse con tubos de recogida de muestras estándar (tubo de tapón rojo de Sarstedt o tubo equivalente de otro fabricante). Debe extraerse un volumen de 5 10 ml de sangre con EDTA. Los tubos deben someterse a mezclado vertical justo tras la recogida de las muestras (8 x, sin agitar). No deben utilizarse muestras de sujetos tratados con heparina (véanse Sustancias causantes de interferencias (plasma) y Sustancias causantes de interferencias (sangre completa), a continuación). Almacenamiento de muestras Si se trabaja con plasma, la sangre completa debe separarse en plasma y componentes celulares mediante centrifugación durante 20 minutos a x g en un plazo de 6 horas. El plasma aislado debe ser transferido a tubos de polipropileno estériles. La sensibilidad del ensayo puede verse reducida si se congelan las muestras de forma sistemática o si se almacenan durante un período de tiempo mayor. Transporte de muestras Como norma, el material de muestra debe transportarse en un recipiente de transporte inastillable. De esta manera puede evitarse el peligro potencial de infección a causa de una fuga de muestras. Las muestras deben transportarse de acuerdo con las instrucciones locales y nacionales para el transporte de material patógeno.* Las muestras deben enviarse en el plazo de 6 horas. No se recomienda almacenar las muestras en el lugar de extracción. Es posible enviar por correo las muestras, siguiendo las instrucciones legales para el transporte de material patógeno. Se recomienda realizar el transporte de muestras por mensajero. Las muestras de sangre deben enviarse refrigeradas (2 8 C); el plasma separado debe enviarse ultracongelado (de 15 C a 30 C). * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 24 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

25 Sustancias causantes de interferencias (plasma) Las concentraciones elevadas de albúmina ( 4 g/dl), bilirrubina ( 30 mg/dl) y lípidos ( 1 g/dl de triglicéridos) y las muestras hemolíticas ( 2 g/dl de hemoglobina) no influyen en el sistema. La heparina afecta a la PCR. No deben utilizarse muestras recogidas en tubos que contengan heparina como anticoagulante. Además, no deben utilizarse muestras de pacientes tratados con heparina. Sustancias causantes de interferencias (sangre completa) Las concentraciones elevadas de bilirrubina ( 30 mg/dl), lípidos ( 1 g/dl de triglicéridos) y el ADN genómico humano ( 3 μg/ml) no influyen en el sistema. La heparina afecta a la PCR. No deben utilizarse muestras recogidas en tubos que contengan heparina como anticoagulante. Además, no deben utilizarse muestras de pacientes tratados con heparina. Preparación de los instrumentos QIAsymphony SP/AS Cierre todos los cajones y tapas. Encienda los instrumentos QIAsymphony SP/AS, y espere hasta que aparezca la pantalla Sample Preparation (preparación de muestras) y haya finalizado el procedimiento de inicialización. Inicie una sesión en el instrumento (los cajones se desbloquearán). Carga de los cartuchos de reactivo (RC) en el cajón Reagents and Consumables (reactivos y consumibles) Los reactivos empleados en la purificación de ácidos nucleicos se encuentran en un innovador cartucho de reactivos (RC) (véase la figura 7). Cada recipiente del cartucho de reactivos (RC) contiene un reactivo concreto, como partículas magnéticas, tampón de lisis, tampón de lavado o tampón de elución. Los cartuchos de reactivos (RC) parcialmente usados pueden volver a cerrarse con las tiras de sellado para reutilización para un uso posterior, lo que evita la generación de residuos debido a restos de reactivos al final del procedimiento de purificación. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

26 Tapa de perforación (PL) Gradilla de enzimas (ER) Ranuras para las tapas de rosca de los tubos de enzimas Tira de sellado para reutilización Recipiente de partículas magnéticas Bastidor con recipientes de reactivos Soporte del cartucho de Figura 7. Cartucho de reactivos (RC) de un instrumento QIAsymphony. El cartucho de reactivos (RC) contiene todos los reactivos necesarios para el procedimiento de purificación. Antes de comenzar el procedimiento, asegúrese de que las partículas magnéticas estén totalmente resuspendidas. Retire el recipiente de partículas magnéticas del bastidor del cartucho de reactivos, mézclelo mediante agitación vorticial durante al menos 3 minutos y vuelva a colocarlo en el bastidor del cartucho de reactivos antes del primer uso. Coloque el cartucho de reactivos (RC) en el soporte del cartucho de reactivos. Coloque la gradilla de enzimas (ER) en el soporte del cartucho de reactivos. Antes de utilizar un cartucho de reactivos (RC) por primera vez, coloque la tapa de perforación (PL) encima del cartucho de reactivos (RC) (figura 6). La tapa de perforación (PL) está afilada. Tenga cuidado al colocarla en el cartucho de reactivos (RC). Asegúrese de situar la tapa de perforación (PL) correctamente orientada en el cartucho de reactivos (RC). Una vez que se haya retirado la cubierta del recipiente de partículas magnéticas y que se hayan abierto los tubos de la gradilla de enzimas (las tapas de rosca pueden guardarse en ranuras dedicadas, véase la figura 7), el cartucho de reactivos (RC) se carga en el cajón Reagents and Consumables. 26 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

27 Tapa de perforación (PL) Figura 8. Preparación sencilla de la mesa de trabajo con cartuchos de reactivos (RC). Los cartuchos de reactivos (RC) parcialmente usados pueden almacenarse hasta que vuelvan a necesitarse (consulte el apartado Almacenamiento en el Manual de uso QIAsymphony DSP Virus/Pathogen o en el manual de uso QIAsymphony DNA Handbook). Carga del material de plástico en el cajón Reagents and Consumables Se carga en el cajón Reagents and Consumables el siguiente material: cartuchos de preparación de muestras, cubiertas para 8 barras (ambos preengradillados en cajas unitarias) y puntas con filtro desechables (puntas de 200 μl suministradas en gradillas azules, puntas de 1500 μl suministradas en gradillas negras). Asegúrese de retirar las cubiertas de las cajas unitarias antes de cargar las cajas unitarias en el cajón Reagents and Consumables. Las puntas tienen filtros que ayudan a prevenir la contaminación cruzada. Las ranuras para gradillas para puntas de la mesa de trabajo del instrumento QIAsymphony SP aceptan cualquiera de los dos tipos de gradilla de puntas. El instrumento QIAsymphony SP identificará el tipo de puntas cargadas durante el examen de inventario. No vuelva a llenar las gradillas de puntas ni las cajas unitarias para los cartuchos de preparación de muestras o las cubiertas para 8 barras manualmente antes de iniciar otra ejecución del protocolo. El instrumento QIAsymphony SP puede utilizar cajas unitarias y gradillas de puntas parcialmente usadas. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

28 Carga del cajón Waste (Desechos) Los cartuchos de preparación de muestras y las cubiertas para 8 barras utilizadas durante una serie analítica se vuelven a engradillar en cajas unitarias vacías en el cajón Waste. Asegúrese de que el cajón Waste contenga suficientes cajas unitarias vacías para el material de plástico de desecho que se genera durante la ejecución del protocolo. Asegúrese de retirar las cubiertas de las cajas unitarias antes de cargar las cajas unitarias en el cajón Waste. Si utiliza cajas de cubiertas para 8 barras para la recogida de cubiertas para 8 barras y de cartuchos de preparación de muestras usados, asegúrese de haber retirado el espaciador de cajas. Debe acoplarse a la parte anterior del cajón Waste una bolsa para las puntas con filtro usadas. El sistema no comprueba si hay una bolsa para eliminación de puntas. Asegúrese de que la bolsa para eliminación de puntas esté correctamente acoplada antes de iniciar una ejecución del protocolo. Para obtener más información, consulte los manuales de usuario suministrados con el instrumento. Vacíe la bolsa para puntas después de procesar un máximo de 96 muestras para evitar un atasco de puntas. Un recipiente para desechos recoge los desechos líquidos generados durante el proceso de purificación. El cajón Waste solo puede cerrarse si el recipiente para desechos está colocado en su posición. Elimine los desechos líquidos de conformidad con la normativa local correspondiente sobre seguridad y medio ambiente. No esterilice en autoclave el frasco de desechos lleno. Vacíe el frasco de desechos después de procesar un máximo de 96 muestras. Carga del cajón Eluate (Eluidos) Cargue la gradilla de elución requerida en el cajón Eluate. Utilice la ranura Elution slot 1 (Ranura de elución 1) con el adaptador de refrigeración correspondiente. Para el funcionamiento integrado, cargue la gradilla de elución con el adaptador, incluido el marco de transferencia, en la ranura 1. Examen de inventario Antes de comenzar una serie analítica, el instrumento comprueba que se hayan cargado en los correspondientes cajones consumibles suficientes para los lotes en cola. 28 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

29 Preparación del material de muestra El kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi es adecuado para procesar muestras de plasma humano, mientras que el kit QIAsymphony DNA Mini es adecuado para muestras de sangre completa. Evite la formación de espuma en el interior o en la superficie de las muestras. Las muestras deben equilibrarse a temperatura ambiente (15 25 C) antes de comenzar la serie analítica. Preparación de las mezclas ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) para muestras de plasma El ARN transportador (CARRIER) se debe utilizar cuando se trabaje con el QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi. Para preparar una solución de partida de ARN transportador (CARRIER), añada 1350 μl de tampón AVE (AVE) (suministrado en viales de 2 ml) al tubo que contiene 1350 μg de ARN transportador (CARRIER) liofilizado para obtener una solución de 1 μg/μl. Disuelva bien el ARN transportador (CARRIER), divídalo en partes de tamaño conveniente y almacénelo a una temperatura de 2 8 C durante un máximo de 2 semanas. Cálculo del volumen de mezcla de ARN transportador (CARRIER) por tubo El volumen mínimo de mezcla ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) debe incluir un volumen adicional suficiente para tener en cuenta la pérdida de líquidos debido al pipeteo y a la evaporación. Consulte en la tabla 2 los volúmenes que deben utilizarse para el análisis con el kit artus EBV QS-RGQ. Los tubos que contienen las mezclas ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) y control interno opcional se colocan en un portatubos. El portatubos que contiene la(s) mezcla(s) ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) debe colocarse en la ranura A del cajón de muestras. Puede utilizarse un máximo de 8 tubos de la mezcla por lote y un máximo de 24 tubos por procesamiento de 4 lotes. Utilización de un control interno Se suministra un control interno (EBV RG IC) con el kit artus EBV QS-RGQ. Esto permite al usuario controlar el procedimiento de aislamiento del ADN y también comprobar si se ha producido una inhibición de la PCR. Si se van a analizar el CMV y el EBV en la misma serie de PCR en el Rotor- Gene Q (véase Series multiensayo, página 32), utilice el CMV IC, incluido en el kit artus CMV QS-RGQ (QIAGEN, ref ), para todas las muestras y no el EBV RG IC. Asimismo, se deberá utilizar el mismo CMV IC para la Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

30 preparación de ensayo de los controles de la PCR (paso 13 del protocolo de preparación de ensayos, página 47). No utilice un CMV IC que tenga un número de lote diferente. El uso de los kits QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi o QIAsymphony DNA Mini en combinación con el kit artus EBV QS-RGQ requiere la introducción del control interno (EBV RG IC o CMV IC) en el proceso de purificación para vigilar la eficiencia de la preparación de las muestras y del ensayo posterior. En el caso de las muestras de plasma, es preciso añadir controles internos con la mezcla ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE), y el volumen total de la mezcla control interno ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) sigue siendo 120 μl. En el caso de las muestras de sangre completa, los controles internos se deben diluir en el tampón ATE. Por muestra se añadirá un volumen total de 60 μl de mezcla de control interno y tampón ATE. Para esta aplicación, añada el control interno al aislado tal como se muestra en la tabla 2. Esto supone la adición de control interno al aislado en una proporción de 0,1 μl por 1 μl de volumen de elución. Recomendamos preparar mezclas frescas para cada serie analítica justo antes del uso. 30 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

31 Tabla 2. Preparación de la mezcla control interno ARN transportador (CARRIER) Muestras de Muestras de plasma sangre completa Componente Volume (μl) Volume (μl) ARN transportador (CARRIER) de partida 5 0 Control interno* 9 9 Tampón AVE Tampón ATE 0 51 Volumen total por muestra (excluido volumen muerto) Volumen total de n muestras (n x 120) (n x 60) * El cálculo de la cantidad de control interno se basa en los volúmenes de elución iniciales (90 μl). El volumen vacío adicional depende del tipo de tubo de muestras usado. No llene más de 1,92 ml (correspondiente a un máximo de 13 ó 26 muestras; este volumen es específico para los microtubos de 2,0 ml de los tipos H e I de la marca Sarstedt, refs y ). Se require mezcla de control interno correspondiente a 3 muestras adicionales (p. ej., 360 μl) (este volumen es específico para los microtubos de 2,0 ml de los tipos H e I, Sarstedt refs y ). Se require mezcla de control interno correspondiente a 4 muestras adicionales (p. ej., 480 μl) (este volumen es específico para los microtubos de 2,0 ml de los tipos H e I, Sarstedt refs y ). Conjuntos de controles del ensayo y conjuntos de parámetros del ensayo Los conjuntos de controles del ensayo son la combinación de un protocolo más parámetros adicionales, como el control interno, para la purificación de muestras con el instrumento QIAsymphony SP. Para cada protocolo hay preinstalado un conjunto de controles del ensayo predeterminado. Si se analizan el CMV y el EBV en la misma serie de PCR con el Rotor- Gene Q (véase Series multiensayo, a continuación), utilice el conjunto de controles del ensayo de CMV adecuado para la purificación de la muestra. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

32 Los conjuntos de parámetros del ensayo son la combinación de una definición de ensayo con parámetros adicionales definidos, como el número de duplicados y el número de estándares del ensayo, para la preparación del ensayo con el instrumento QIAsymphony AS. Series multiensayo En algunos casos, se puede analizar una sola muestra para detectar más de un patógeno en la misma PCR con el QIAsymphony RGQ. Esto se denomina serie multiensayo. Para realizar una serie analítica multiensayo es necesario que se cumplan varios requisitos. El kit artus EBV QS-RGQ se puede utilizar con el kit artus CMV QS-RGQ (ref ) en una serie multiensayo si se cumplen las siguientes condiciones. Preparación de las muestras en el QIAsymphony SP Para purificar las muestras que se van a analizar para detectar los virus CMV y EBV utilizando el mismo eluido, utilice para todas las muestras el CMV IC, incluido en el kit artus CMV QS-RGQ, y no el EBV RG IC. Use el conjunto de controles de ensayo de CMV apropiado para la purificación de las muestras. Preparación de los ensayos en el QIAsymphony AS Para garantizar una cuantificación adecuada y la validez de la información del control interno, es necesario que el control interno de la preparación de los dos ensayos sea el mismo que se ha utilizado en la preparación de las muestras (CMV IC). Utilice un CMV IC del mismo lote tanto para la preparación de las muestras como para la preparación de los ensayos de los controles de la PCR (paso 13 del protocolo de configuración de ensayos, página 46). No utilice un CMV IC que tenga un número de lote diferente. PCR en el Rotor-Gene Q Dadas las diferencias en las intensidades de fluorescencia al usar 2 ensayos distintos en una serie multiensayo, es necesario realizar una calibración de ganancia independiente para cada sistema de detección artus que se vaya a utilizar antes de realizar la PCR (pasos 8 15 del protocolo de la PCR, páginas 56 59). 32 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

33 Rendimiento de ácidos nucleicos Los eluidos preparados con ARN transportador (CARRIER) pueden contener mucho más ARN transportador (CARRIER) que ácidos nucleicos diana. Recomendamos utilizar métodos de amplificación cuantitativos para determinar el rendimiento. Almacenamiento de ácidos nucleicos Para el almacenamiento a corto plazo de un máximo de 24 horas, recomendamos almacenar los ácidos nucleicos purificados a una temperatura de 2 8 ºC. Para un tiempo de almacenamiento superior a 24 horas, recomendamos una temperatura de 20 ºC. Establecer el umbral para el análisis de PCR La configuración óptima del umbral para una combinación dada de Rotor- Gene Q y kit artus QS-RGQ se deberá establecer de manera empírica probando las distintas combinaciones, ya que se trata de un valor relativo que depende del procedimiento de diagnóstico global. Como punto de partida, se puede establecer um valor preliminar de 0,04 para la primera PCR. Sin embargo, este valor deberá afinarse en un análisis comparativo con respecto a las siguientes series. El umbral se debe ajustar manualmente, justo encima de la señal de fondo de los controles negativos y las muestras positivas. La media del valor umbral que se obtenga de estos experimentos es el que muy probablemente funcione para la mayoría de series analíticas que se vaya a a realizar. No obstante, el usuario deberá revisar a intervalos periódicos el valor umbral generado. Por regla general, el valor umbral oscilará entre 0,03 y 0,05. Este deberá redondearse para no exceder los 3 decimales. Cuantificación Los estándares de cuantificación (EBV RG QS 1 4) del kit artus EBV QS-RGQ se tratan como muestras previamente purificadas y se utiliza el mismo volumen (20 μl). Para generar una curva de estándares con los instrumentos Rotor-Gene Q, los 4 estándares de cuantificación deben utilizarse y definirse en el cuadro de diálogo Edit Samples (Editar muestras) del instrumento Rotor-Gene Q como estándares con las concentraciones especificadas (consulte el manual de usuario del instrumento). Los estándares de cuantificación se definen como copias/μl. Se debe aplicar la siguiente ecuación para convertir los valores determinados utilizando la curva de estándares en copias/ml de material de muestra: Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

34 Resultado (copias/ml) = Resultado (copias/μl) x Volumen de elución inicial (90 μl)* Volumen de muestra (ml) Como norma, el volumen de muestra inicial debe incluirse en la ecuación anterior. Esto debe tenerse en cuenta cuando se ha cambiado el volumen de muestra antes de la extracción de ácidos nucleicos (p. ej., reduciendo el volumen mediante centrifugación o aumentando el volumen mediante adición hasta el volumen necesario para el aislado). * El cálculo se basa en los volúmenes de elución iniciales (90 μl). 34 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

35 Protocolo: Aislamiento de ADN en el QIAsymphony SP El kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi (QIAGEN, ref ) se ha validado para la purificación de ADN viral a partir de plasma humano; el kit QIAsymphony DNA Mini (QIAGEN, ref ) se ha validado para la purificación de ADN viral a partir de sangre completa de origen humano con el kit artus EBV QS-RGQ. En la tabla 3 se muestra información general sobre los protocolos. Tabla 3. Información general sobre el protocolo Kit Material de muestras Volumen de muestra (incluido el volumen en exceso) Nombre del protocolo Conjunto de controles predetermina-do del ensayo Volumen de elución Versión del software requerida Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Plasma Kit QIAsymphony DNA Mini Whole blood 1200 μl 300 μl Cellfree1000_V4_DSP* ACS_Cellfree1000_V4_ DSP artus EBV* 60 μl 60 μl Versión 3.1 o superior VirusBlood200_V4* ACS_VirusBlood200_V4_ artus_ebv* Versión 3.5 o superior * V4 o superior, dependiendo de los requisitos de la versión de software que se tenga. Para una serie multiensayo en la que se analicen el CMV y el EBV en la misma PCR, utilice el conjunto de controles del ensayo adecuado para la purificación de muestras (ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV or ACS_Virus_Blood200_V4_artus_CMV; V4 o superior). Cuestiones importantes antes de comenzar Asegúrese de que sabe manejar bien los instrumentos QIAsymphony SP/AS. Consulte los manuales de usuario suministrados con los instrumentos para informarse sobre las instrucciones de funcionamiento. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

36 Antes de empezar con el análisis, lea el apartado Notas importantes en las páginas Antes de usar un cartucho de reactivos (RC) por primera vez, compruebe que los tampones QSL2 y QSB1 del cartucho (RC) no contengan un precipitado. En caso necesario, retire del cartucho de reactivos (RC) los recipientes que contienen los tampones QSL2 y QSB1 e incúbelos durante 30 minutos a 37 C agitando de vez en cuando para disolver el precipitado. Asegúrese de volver a colocar los recipientes en las posiciones correctas. Si el cartucho de reactivos (RC) ya está perforado, asegúrese de que los recipientes estén sellados con las tiras de sellado para reutilización e incube el cartucho de reactivos (RC) completo durante 30 minutos a 37 C agitando de vez en cuando en un baño María.* Evite agitar de manera enérgica el cartucho de reactivos (RC), ya que podría formarse espuma, que puede provocar problemas a la hora de detectar el nivel de líquido. Se ha comprobado que todos los componentes del kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi son estables en los instrumentos QIAsymphony SP/AS durante al menos el tiempo normal necesario para el procesamiento de 96 muestras. Antes de comenzar Prepare todas las mezclas necesarias, incluidas las mezclas que contienen ARN transportador (CARRIER) y controles internos, justo antes de comenzar. Para obtener más información, consulte el apartado Preparación de las mezclas ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) para muestras de plasma en la página 29 y el apartado Utilización de un control interno en la página 29. Asegúrese de que la tapa de perforación (PL) esté colocada sobre el cartucho de reactivos (RC) y de que la tapa del recipiente de partículas magnéticas se haya retirado o, si se está utilizando un cartucho de reactivos (RC) parcialmente usado, asegúrese de que se hayan retirado las tiras de sellado para reutilización. Antes de comenzar el procedimiento, asegúrese de que las partículas magnéticas estén totalmente resuspendidas. Mezcle enérgicamente mediante agitación vorticial el recipiente que contiene las partículas magnéticas durante al menos 3 minutos antes del primer uso. * Asegúrese de que todos los instrumentos se hayan verificado, sometido a mantenimiento y calibrado con regularidad según las instrucciones del fabricante. 36 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

37 Antes de cargar el cartucho de reactivos (RC), retire la cubierta del recipiente que contiene las partículas magnéticas y abra los tubos de enzimas. Asegúrese de que la gradilla de enzimas se haya equilibrado a temperatura ambiente (15 25 C). Asegúrese de que la tapa de perforación (PL) esté colocada sobre el cartucho de reactivos (RC) o, si se está utilizando un cartucho de reactivos (RC) parcialmente usado, asegúrese de que se hayan retirado las tiras de sellado para reutilización. Si las muestras tienen un código de barras, oriéntelas en el portatubos de forma que los códigos de barras miren hacia el lector de código de barras del interior del cajón Sample (Muestras) en el lado izquierdo del QIAsymphony SP. Procedimiento 1. Cierre todos los cajones y las tapas de los instrumentos QIAsymphony SP/AS. 2. Encienda los instrumentos, y espere hasta que aparezca la pantalla Sample Preparation (Preparación de muestras) y haya finalizado el procedimiento de inicialización. El interruptor de alimentación se encuentra en la esquina inferior izquierda del instrumento QIAsymphony SP. 3. Inicie una sesión en los instrumentos. 4. Asegúrese de que el cajón Waste esté correctamente preparado (consulte la tabla 4), y realice un examen de inventario de dicho cajón, incluidos el conducto para puntas y el recipiente para desechos líquidos. Sustituya la bolsa para eliminación de puntas en caso necesario. Tabla 4. Preparación del cajón Waste Soporte de caja unitaria 1 4 Soporte de bolsa de desechos Soporte para frasco de desechos líquidos Cajas unitarias vacías Aplique la bolsa de desechos Vacíe e instale el frasco de desechos líquidos Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

38 5. Cargue la gradilla de elución requerida en el cajón Eluate. Utilice exclusivamente la ranura Elution slot 1 con el adaptador de refrigeración correspondiente (adaptador de refrigeración, EMT, v2, Qsym, ref ). Para el funcionamiento integrado, cargue la gradilla de elución con el adaptador, incluido el marco de transferencia, en la ranura Cargue los cartuchos de reactivo (RC) y los consumibles requeridos en el cajón Reagents and Consumables (consulte las tablas 5 y 6). Los números de las puntas con filtro proporcionados pueden diferir de los números mostrados en la pantalla táctil, dependiendo de la configuración. Tabla 5. Preparación del cajón Reagents and Consumables RC, posiciones 1 y 2 Soporte de gradilla de puntas, posiciones 1 4 Soporte de gradilla de puntas, posiciones 5 18 Soporte de caja unitaria, posiciones 1 3 Soporte de caja unitaria, posición 4 Cargue 1 cartucho de reactivos (RC) para un máximo de 48 muestras de plasma o 2 cartuchos de reactivos (RC) nuevos para un máximo de 96 muestras de plasma utilizando el kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Cargue 1 cartucho de reactivo (RC) para un máximo de 96 muestras de sangre completa utilizando el kit QIAsymphony DNA Mini Cargue un número suficiente de gradillas de puntas con filtro desechables de 200 μl (consulte la tabla 6) Cargue un número suficiente de gradillas de puntas con filtro desechables de 1500 μl (consulte la tabla 6) Cargue 3 cajas unitarias que contienen los cartuchos de preparación de muestras Cargue una caja unitaria con cubiertas para 8 barras 38 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

39 Table 6. Material de plástico necesario para 1 4 lotes de muestras Un lote, 24 muestras* Dos lotes, 48 muestras* Tres lotes, 72 muestras* Cuatro lotes, 96 muestras* Muestras de plasma (kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi) Puntas con filtro desechables, 200 μl Puntas con filtro desechables, 1500 μl Cartuchos de preparación de muestras Cubiertas para 8 barras Muestras de sangre completa (kit QIAsymphony DNA Mini) Puntas con filtro desechables, 200 μl Puntas con filtro desechables, 1500 μl Cartuchos de preparación de muestras Cubiertas para 8 barras * El uso de más de un tubo de control interno por lote y la realización de más de un examen de inventario requieren puntas con filtro desechables adicionales. Hay 32 puntas con filtro por gradilla de puntas. El número de puntas con filtro necesarias incluye las puntas con filtro para 1 examen de inventario por cartucho de reactivos. Hay 28 cartuchos de preparación de muestras por caja unitaria. Hay doce cubiertas para 8 barras por caja unitaria. 7. Realice un inventario del cajón Reagents and Consumables. 8. Coloque las muestras en el portatubos adecuado, y cárguelas en el cajón Sample (consulte la tabla 7). Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

40 Tabla 7. Carga de las muestras en el cajón Sample Tipo de muestra Plasma Sangre completa Volumen de muestra (incluido el volumen en exceso) Tubos de muestras 1200 μl 300 μl Microtubos de 2,0 ml de tipo H o microtubos de 2,0 ml de tipo I (Sarstedt, refs y ) Inserto Inserto para tubos 3B (ref ) 9. Coloque el tubo (o los tubos) que contiene(n) la mezcla ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) (para muestras de plasma) o tampón ATE (para muestras de sangre completa), incluido el control interno, en el portatubos y cargue este en la ranura A del cajón Sample. Para obtener más información, consulte los apartados Preparación de las mezclas ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) para muestras de plasma en la página 29 y Utilización de un control interno en la página 29. Si se van a analizar el CMV y el EBV en la misma serie de PCR en el Rotor-Gene Q (véase Series multiensayo, página 32), utilice para todas las muestras el CMV IC, incluido en el kit artus CMV QS-RGQ (QIAGEN, ref ), y no el EBV RG IC. 40 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

41 10. Mediante la pantalla táctil, introduzca la información requerida para cada lote de muestras que se vaya a procesar. Introduzca la siguiente información: Información de la muestra Protocolo que se va a ejecutar (seleccione el conjunto de controles del ensayo ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus EBV * para plasma o ACS_VirusBlood200_V4_artus_EBV * para sangre completa en la categoría artus QS-RGQ ) Volumen de elución de 60 μl (consulte la tabla 8) y posición de salida slot 1 (ranura 1) Tubo(s) que contiene(n) la mezcla ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) (para muestras de sangre) o tampón ATE (para muestras de sangre completa), incluido el control interno (seleccione el nombre del IC ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus EBV * en el caso de plasma o ACS_VirusBlood200_V4_artus_EBV para sangre completa*) Una vez introducida la información sobre el lote, el estado cambia de LOADED (cargado) a QUEUED (en cola). Tan pronto como un lote está en cola aparece el botón Run (Ejecutar). Tabla 8. Volumen de elución preseleccionado Volumen de elución preseleccionado (μl) Volumen de elución inicial (μl) El volumen de elución preseleccionado para el protocolo. Se trata del volumen accesible mínimo de eluido presente en el tubo de elución final. El volumen inicial de solución de elución necesario para garantizar que el volumen real de eluido sea el mismo que el volumen preseleccionado. 11. Pulse el botón Run para comenzar el procedimiento de purificación. Todos los pasos del procesamiento están totalmente automatizados. Al finalizar la ejecución del protocolo, el estado del lote cambia de RUNNING (en ejecución) a COMPLETED (finalizado). * V4 o superior, dependiendo de los requisitos de la versión de software que se tenga. Para una serie multiensayo en la que se analicen el CMV y el EBV en la misma PCR, utilice el nombre de CMV IC adecuado (ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV o ACS_Virus_Blood200_V4_artus_CMV; V4 o superior). Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

42 12. Cuando el procesamiento de las muestras haya finalizado, retire manualmente la gradilla de elución del cajón Eluate (funcionamiento independiente) o transfiera directamente la gradilla de elución al QIAsymphony AS mediante el módulo de transferencia (funcionamiento integrado). Para el funcionamiento independiente, retire la gradilla de elución de la ranura en la pantalla táctil; a continuación, abra el cajón Eluate y retire manualmente la gradilla de elución. Para el funcionamiento integrado, pulse Transfer para transferir la gradilla de elución de la ranura 1 del QIAsymphony SP a la ranura 2 del QIAsymphony AS. Recomendamos proceder de inmediato ( 60 min.) con la preparación del ensayo en el QIAsymphony AS una vez que el procesamiento haya finalizado. Dependiendo de la temperatura y de la humedad, los eluidos dejados en el instrumento QIAsymphony SP una vez finalizado el procesamiento pueden experimentar condensación o evaporación. Para el almacenamiento a corto plazo de un máximo de 24 horas, recomendamos almacenar los ácidos nucleicos purificados a una temperatura de 2 8 ºC. Para el almacenamiento a largo plazo superior a 24 horas de ácidos nucleicos purificados, recomendamos el almacenamiento a una temperatura de 20 ºC. Se generan archivos de resultados para cada gradilla de elución. 13. Si utiliza un cartucho de reactivos (RC) solo parcialmente, séllelo con las tiras de sellado para reutilización suministradas y cierre los tubos que contienen proteinasa K con tapas de rosca inmediatamente después de finalizar la ejecución del protocolo para evitar la evaporación. Para obtener más información sobre el almacenamiento de cartuchos de reactivos (RC) parcialmente usados, consulte el apartado Almacenamiento del Manual de uso QIAsymphony DSP Virus/Pathogen o del manual de uso QIAsymphony DNA Handbook. 14. Elimine los tubos de muestras y las placas usados y el material de desecho de conformidad con la normativa local sobre seguridad. Consulte el Manual de los kits QIAsymphony DSP Virus/Pathogen para obtener información sobre seguridad. 15. Cierre los cajones del instrumento y proceda con la preparación del ensayo en el QIAsymphony AS (página 44). 42 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

43 16. Limpie el instrumento QIAsymphony SP durante la preparación del ensayo en el instrumento QIAsymphony AS o después. Para el funcionamiento integrado, limpie todos los instrumentos una vez finalizado el flujo de trabajo. Siga las instrucciones de mantenimiento descritas en el Manual de usuario del QIAsymphony SP/AS Descripción general. Asegúrese de realizar las tareas de mantenimiento con regularidad para reducir al mínimo el riesgo de contaminación cruzada. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

44 Protocolo: Preparación del ensayo en el QIAsymphony AS El QIAsymphony AS realiza la preparación del ensayo para reacciones. Las muestras procesadas en el QIAsymphony SP pueden transferirse automáticamente al QIAsymphony AS (funcionamiento integrado). Para mayor flexibilidad, los instrumentos QIAsymphony SP y AS también pueden funcionar de manera independiente.* Los detalles del ensayo se muestran en la tabla 9. Tabla 9. Parámetros del ensayo con el kit artus EBV QS-RGQ Información del proceso Material de entrada de muestras Volumen de mezcla maestra Volumen de molde Detalles Eluido 30 μl 20 μl Número de reacciones 6 24 Tiempo de procesamiento Versión del software requerida Para 6 reacciones: aproximadamente 9 minutos Para 72 reacciones: aproximadamente 35 minutos Versión 3.1 o superior Para el análisis del EBV se puede preparar un máximo de 216 (9 x 24) ensayos en una única serie analítica en el QIAsymphony AS. Los ensayos se realizaron con cada reacción de forma única (sin duplicados) y el instrumento preparó la mezcla maestra para una serie analítica del ensayo incluyendo un molde, 4 estándares del ensayo y un control sin molde (NTC). Cuestiones importantes antes de comenzar Antes de empezar con el análisis, lea el apartado Notas importantes en las páginas Los volúmenes de reactivos están optimizados para 24 reacciones por kit y por serie analítica. * Los módulos QIAsymphony SP y AS permanecen conectados físicamente mientras funcionan de modo independiente. 44 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

45 Antes de cada uso, todos los reactivos deben ser descongelados completamente, mezclados (mediante pipeteo repetido arriba y abajo o mediante agitación vorticial rápida) y centrifugados durante al menos 3 s a 6800 x g. Evite que se forme espuma en los reactivos. En el caso de una serie analítica multiensayo en la que se vayan a analizar tanto el CMV como el EBV en la misma PCR, asegúrese de que el CMV IC, del kit artus CMV QS-RGQ, se haya utilizado en el proceso de purificación. Utilice un CMV IC del mismo lote tanto para la preparación de las muestras como para la configuración de los ensayos de los controles de la PCR (paso 13). No utilice un CMV IC que tenga un número de lote diferente. Se ha comprobado que los eluidos generados en la preparación de las muestras y todos los componentes del kit artus EBV QS-RGQ son estables en el instrumento durante al menos el tiempo normal necesario para la purificación de 96 muestras y para la preparación de un máximo de 216 ensayos, incluido un tiempo máximo de 60 min. requerido para transferir las muestras del QIAsymphony SP al QIAsymphony AS y 60 min. para la transferencia del QIAsymphony AS al Rotor-Gene Q. Trabaje con rapidez y mantenga los reactivos de PCR en hielo o en el bloque de refrigeración antes de colocarlos en el instrumento. Procedimiento 1. Introduzca el conducto para puntas. 2. Deseche la bolsa para la eliminación de puntas. 3. Coloque una bolsa vacía para la eliminación de puntas. 4. Pase a la interfaz del usuario para la preparación del ensayo pulsando el botón Switch (Cambiar) en la barra de estado. 5. Inicie el proceso de definición del ensayo. Para el funcionamiento independiente, pulse New. En caso de funcionamiento integrado, aparecerá un mensaje preguntando si desea utilizar la gradilla de elución como gradilla de muestras; pulse Yes (sí) para confirmar. Las pantallas que aparecen en la pantalla táctil guían al usuario por el proceso de definición del ensayo paso a paso. 6. Asigne la gradilla de muestras a una ranura Sample seleccionando el archivo de gradilla de la correspondiente serie analítica en el instrumento QIAsymphony SP. Si la gradilla de elución se ha transferido automáticamente al instrumento QIAsymphony AS, el archivo de gradilla se asignará automáticamente y en la pantalla Sample Rack(s) (Gradilla(s) de Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

46 muestras) de la interfaz del usuario para la preparación del ensayo ya aparecerán los datos pertinentes. 7. Compruebe en la gradilla de muestras las posiciones de la muestra, del EC+ y del EC, los números de identificación de la muestra y los volúmenes. 8. Seleccione el conjunto de parámetros del ensayo que se utilizará en el procesamiento (consulte la tabla 10). Tabla 10. Información del ensayo al utilizar el kit artus EBV QS-RGQ Información facilitada Categoría Conjunto de parámetros del ensayo Detalles artus QS-RGQ artus EBV QS-RGQ_V1* * V1 o superior, según requiera la versión de software que utiliza. En el caso de una serie analítica multiensayo en la que se vayan a analizar el CMV y el EBV en el mismo eluido dentro de la misma PCR, se tendrán que asignar a las muestras los dos conjuntos de parámetros de ensayo artus EBV QS-RGQ_V1 y artus CMV QS-RGQ_V1 (V1 o superior). 9. Asigne el conjunto de parámetros del ensayo a las muestras. El conjunto de parámetros del ensayo define los parámetros de la preparación del ensayo. En el caso de una serie analítica multiensayo en la que se vayan a analizar tanto el CMV como el EBV para el mismo eluido en la misma PCR, se tendrán que asignar a las muestras los dos conjuntos de parámetros de ensayo artus EBV QS-RGQ_V1 y artus CMV QS-RGQ_V Defina las gradillas del ensayo. En esta fase pueden cargarse las gradillas del ensayo en la(s) ranura(s) Assay (consulte la tabla 12). 11. Compruebe la temperatura de las posiciones de refrigeración. Cuando se alcancen las temperaturas de refrigeración deseadas, las ranuras aparecerán en verde. 12. Combine todos los tubos de EBV RG Master pertenecientes a un solo kit en un tubo. Puede resultar difícil manipular reactivos viscosos con pipetas manuales. Asegúrese de que transfiere el volumen completo de la EBV RG Master al tubo. No utilice un CMV IC que tenga un número de lote distinto. 46 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

47 13. Llene cada tubo de reactivo con el volumen necesario del reactivo correspondiente según la información de carga facilitada por el software del instrumento Antes de cada uso, todos los reactivos deben ser descongelados completamente, mezclados (mediante pipeteo repetido arriba y abajo o mediante agitación vorticial rápida) y centrifugados durante al menos 3 s a 6800 x g. Evite que se formen burbujas o espuma, ya que podrían causar errores de detección. Trabaje con rapidez y mantenga los componentes de PCR en hielo o en el bloque de refrigeración antes de la carga. En el caso de una serie analítica multiensayo en la que se vayan a analizar tanto el CMV como el EBV en la misma PCR, asegúrese de que el CMV IC, del kit artus CMV QS-RGQ, se haya utilizado en el proceso de purificación. Utilice un CMV IC del mismo lote tanto para la preparación de las muestras como para la preparación de los ensayos de los controles de la PCR. No utilice un CMV IC que tenga un número de lote diferente. 14. Coloque los tubos de reactivos, sin las tapas, en las posiciones apropiadas de los adaptadores prerrefrigerados para reactivos (consulte la tabla 11). Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

48 Tabla 11. Consumibles Consumibles Tubos en tira y tapones, 0,1 ml (250) Tubos cónicos, 2 ml, Qsym AS (500)* Tubos cónicos, 5 ml, Qsym AS (500)* Frascos de reactivos, 30 ml, QSym AS (50)* Microtubos de elución CL (24 x 96) Nombre que aparece en la pantalla táctil QIA# *StripTubes 0.1 QIA# *T2.0 ScrewSkirt QIA# *T5.0 ScrewSkirt QIA# *Bottle 30ml QIA#19588 * EMTR Para uso con adaptador/soporte para reactivos Tubos en tira RG 72 QS Soporte para reactivos 1 QS Soporte para reactivos 2 QS Soporte para reactivos 1 QS Soporte para reactivos 2 QS Soporte para reactivos 2 QS Soporte para reactivos 2 QS Gradilla para microtubos de elución QS * Para los componentes de la mezcla maestra, la mezcla maestra preparada por el sistema, los estándares del ensayo y los controles del ensayo. También pueden utilizarse los tubos Sarstedt descritos en la página 22. El sufijo (m) que aparece en la pantalla táctil indica que los cálculos del nivel de líquido del tubo en cuestión se han optimizado para reactivos que forman un menisco cóncavo. 15. Abra los cajones Eluate and Reagents y Assays. 16. Cargue el adaptador para reactivos preparado en la ranura correspondiente. Introduzca el código de barras del kit para el ensayo en la ventana List view (Vista de lista) de la pantalla Loading Reagents (Carga de reactivos). 17. Si no lo ha hecho todavía, coloque los tubos en tira en el adaptador prerrefrigerado para tubos en tira RG 72 QS (consulte la tabla 12) y colóquelo en las ranuras correspondientes. 48 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

49 Tabla 12. Adaptadores y soportes para reactivos Gradilla/soporte para reactivos Gradilla de muestras Soportes para reactivos Nombre Gradilla para microtubos de elución QS Soporte para reactivos 1 QS Número necesario* 1 1 Gradillas del ensayo Tubos en tira RG 72 QS 1 * Calculado para una serie analítica del ensayo con 72 reacciones. 18. Si no se ha transferido todavía la gradilla de elución al QIAsymphony AS (consulte el paso 12 del protocolo de purificación, página 41), coloque los microtubos de elución CL en el adaptador prerrefrigerado para la gradilla de microtubos de elución QS (consulte la tabla 12) y coloque el adaptador preparado en la ranura indicada. Para el funcionamiento independiente, retire la gradilla de elución de la ranura en la pantalla táctil y, a continuación, abra el cajón Eluate del instrumento QIAsymphony SP y retire manualmente la gradilla de elución. 19. Cargue puntas con filtro desechables en los cajones Eluate and Reagents y Assays, según el número necesario de cada tipo de punta (consulte las tablas 13 y 14). Cargue las gradillas de puntas comenzando por las ranuras de puntas 1, 2 y 3 en el cajón Eluate and Reagents y, a continuación, cargue las gradillas de puntas en las ranuras de puntas 7, 8 y 9 en el cajón Assays. Tabla 13. Puntas con filtro Consumibles Puntas con filtro, 1500 μl (1024) Puntas con filtro, 200 μl (1024) Puntas con filtro, 50 μl (1024) Nombre que aparece en la pantalla táctil 1500 μl 200 μl 50 μl Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

50 Table 14. Consumo de consumibles* Número para Número para 72 Consumible 24 reacciones reacciones Puntas con filtro, 1500 μl 4 5 Puntas con filtro, 200 μl 9 8 Puntas con filtro, 50 μl Bolsas para eliminación de puntas 1 1 * Esta tabla proporciona ejemplos del consumo de consumibles para una serie analítica del ensayo con las siguientes especificaciones: 19 ó 67 moldes, 4 estándares del ensayo, un control sin molde (NTC), muestras con control interno (IC), mezcla maestra preparada por el instrumento. El consumo de puntas con filtro puede verse afectado por algunos procesos en el instrumento QIAsymphony AS (p. ej., detección del nivel de líquido). Se requerirán más puntas en el caso de realizar una serie analítica multiensayo en la que se analicen el CMV y el EBV en la misma PCR. 20. Cierre los cajones Eluate and Reagents y Assays. 21. Después de cerrar cada cajón, pulse Yes para iniciar el examen de inventario para cada cajón. El examen de inventario comprueba las ranuras, los adaptadores, las puntas con filtro y el conducto para puntas. En caso necesario, corrija los errores existentes. 22. Pulse Queue (Cola). Se inicia la monitorización de la refrigeración. 23. Espere a que se alcancen las temperaturas de refrigeración deseadas. Cuando se alcancen las temperaturas de refrigeración deseadas, las ranuras aparecerán en verde. 24. Pulse Run para comenzar la serie analítica. 25. Una vez finalizado el procesamiento, pulse Remove en la pantalla de preparación del ensayo Overview (Información general). Abra el cajón Assays y descargue las gradillas del ensayo. 26. Descargue los archivos de resultados y del termociclador. 27. Continúe en el apartado Protocolo: PCR y análisis de los datos en el Rotor-Gene Q en la página Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

51 28. Realice el mantenimiento periódico del QIAsymphony AS mientras se realiza la serie de PCR en el Rotor-Gene Q o después. Para el funcionamiento integrado, limpie todos los instrumentos una vez finalizado el flujo de trabajo. Siga las instrucciones de mantenimiento descritas en el Manual de usuario del QIAsymphony SP/AS Descripción general. Asegúrese de realizar las tareas de mantenimiento con regularidad para reducir al mínimo el riesgo de contaminación cruzada. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

52 Protocolo: PCR y análisis de los datos en el Rotor- Gene Q Cuestiones importantes antes de comenzar Antes de empezar con el análisis, lea el apartado Notas importantes en las páginas Dedique tiempo suficiente a familiarizarse con el instrumento Rotor-Gene Q antes de iniciar el protocolo. Consulte el manual del usuario del instrumento. Asegúrese de que se incluyan los 4 estándares de cuantificación y al menos un control negativo (agua, de calidad para PCR) para cada serie de PCR. Para generar una curva de estándares, utilice los 4 estándares de cuantificación suministrados (EBV RG QS 1 4) para cada serie de PCR. Procedimiento 1. Cierre los tubos de PCR y colóquelos en el rotor de 72 pocillos del Rotor-Gene Q. Asegúrese de transferir las tiras de 4 tubos del instrumento Rotor-Gene Q en la orientación correcta, de manera que los índices de posición del adaptador de refrigeración y del rotor coincidan. Asegúrese de que el anillo de bloqueo (accesorio del instrumento Rotor-Gene) esté colocado en la parte superior del rotor para prevenir la apertura accidental de los tubos durante el procesamiento. 2. Transfiera el archivo del termociclador del QIAsymphony AS al ordenador del Rotor-Gene Q. 3. Para la detección de ADN del EBV, cree un perfil de temperatura siguiendo los pasos que se indican a continuación. Configuración de los parámetros generales del ensayo Figura 9 11 Activación inicial de la enzima hot-start Figura 12 Amplificación del ADN (touchdown PCR) Figura 13 Ajuste de la sensibilidad de los canales de fluorescencia Figura Inicio de la serie analítica Figura Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

53 Todas las especificaciones hacen referencia al software Rotor-Gene Q, versión Puede encontrar más información acerca de la programación del instrumento Rotor-Gene Q en el manual de usuario del instrumento. En las ilustraciones, estos valores de configuración aparecen recuadrados en negro. 4. En primer lugar, abra el cuadro de diálogo New Run Wizard (Asistente para nueva serie analítica) (figura 9). Marque la casilla Locking Ring Attached (Anillo de bloqueo acoplado) y haga clic en Next (Siguiente). Figura 9. Cuadro de diálogo New Run Wizard. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

54 5. Seleccione 50 en el campo Reaction Volume (μl): (Volumen de reacción) y haga clic en Next (figura 10). Figura 10. Configuración de los parámetros generales del ensayo. 6. Haga clic en el botón Edit Profile (Editar perfil) en el siguiente cuadro de diálogo New Run Wizard (figura 11) y programe el perfil de temperatura tal como se muestra en las figuras 11 13). Figura 11. Edición del perfil. 54 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

55 Figura 12. Activación inicial de la enzima hot-start. Figura 13. Amplificación del ADN. Asegúrese de activar la función de touchdown durante 10 ciclos en el paso de annealing. 7. El intervalo de detección de los canales de fluorescencia debe determinarse según las intensidades de fluorescencia de los tubos de PCR. Haga clic en Gain Optimisation (Optimización de ganancia) en el cuadro de diálogo New Run Wizard (consulte la figura 11) para abrir el cuadro de diálogo Auto-Gain Optimisation Setup (Configuración de la optimización de ganancia automática). Configure la temperatura de calibración en 65 para que coincida Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

56 con la temperatura de annealing del programa de amplificación (figura 14). 8. En caso de configurar un único ensayo, haga clic en Start (figura 14) y vaya directamente el paso 16, página 60. En caso de una serie multiensayo en la que se vayan a analizar tanto el CMV como el EBV dentro de la misma PCR, vaya al paso 8 para ajustar la intensidad de los canales de fluorescencia de forma manual. 1 2 Figura 14. Ajuste de la sensibilidad de los canales de fluorescencia. 56 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

57 9. Haga clic en Edit (figura 15) para editar los canales de fluorescencia. 1 Figura 15. Ajuste manual de la intensidad de fluorescencia de cada canal de fluorescencia en distintas posiciones de tubo para distintos ensayos (CMV y EBV). 10. Configure la posición de tubo para un tubo del primer ensayo artus (p. ej., CMV). Determine la posición de tubo de todos los canales de fluorescencia y haga clic en OK (figura 16). 1 2 Figura 16. Configurar la posición de tubo. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

58 11. Haga clic en Start para iniciar la optimización de ganancia del primer ensayo artus (figura 17). 1 Figura 17. Inicio de la optimización de ganancia. 58 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

59 12. Se abrirá una nueva ventana Running Auto-Gain Optimisation (ejecutando la optimización ganancia automática). Espere hasta que aparezca el mensaje Completed (concluida) en la siguiente ventana (figura 18). Anote los valores de ganancia seleccionados para los dos canales y, a continuación, haga clic en Close (Figure 18) Figura 18. Optimización de ganancia concluida. Anote los valores de ganancia (en este caso, 1,33 para los dos canales de fluorescencia). 13. Repita los pasos 8 12 para una posición de tubo del segundo ensayo artus (p. ej., EBV). 14. Haga clic en Edit Gain (editar ganancia) para editar los valores de ganancia de forma manual (figura 19). 1 Figura 19. Edición manual de los valores de ganancia. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

60 15. Seleccione el valor de ganancia más bajo para el Cycling Green anotado en el paso 12; a continuación, introduzca manualmente este valor en la ventana Gain for Green (ganancia para canal verde) (figura 20). Seleccione el valor de ganancia más bajo para el Cycling Yellow anotado en el paso 12; a continuación, introduzca manualmente este valor en la ventana Gain for Yellow (ganancia para canal amarillo). 1 2 Figura 20. Introducción manual de los valores de ganancia más bajos. 16. Los valores de ganancia determinados por la calibración de los canales (o asignados manualmente) se guardan automáticamente y se muestran en la última ventana de menú del procedimiento de programación (figura 21). Haga clic en Start Run. Figura 21. Inicio de la serie analítica. 17. Después de iniciar la serie analítica, importe la información del archivo del termociclador haciendo clic en el botón ( Abrir ), o edite las muestras manualmente. 18. Cuando haya finalizado la serie analítica, analice los datos. Son posibles los siguientes resultados (18a, 18b, and 18c). 60 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

61 En el caso de una serie analítica multiensayo en la que se analicen el CMV y el EBV en al misma PCR, se deben analizar separadas las muestras para los análisis de CMV y EBV, respetando los correspondientes estándares de cuantificación. No defina estándares de distintos sistemas de PCR artus al mismo tiempo. Consulte el Manual de uso del kit artus CMV QS-RGQ para saber cómo interpretar los resultados de los ensayos del CMV. En caso de aumentar o disminuir inicialmente la fluorescencia, habrá que ajustar la función Eliminate cycles befote (Eliminar ciclos antes) hasta la primera señal. En algunos casos, habrá que ajustar la función Ignore first (Ignorar primero) para un máximo de 10 ciclos. Esto puede ser necesario si el ajuste de la línea de base no da lugar a una línea de base homogénea que cubra todas las señales, sino que tiene señales de fluorescencia repartidas en un intervalo más amplio. El hecho de utilizar la función Ignore first le permitirá obtener resultados fiables, comparables a los que darían muestras no afectadas. Para recibir asistencia técnica y solicitar más información, visite nuestro Centro de Servicio Técnico (Technical Support Center) en o póngase en contacto telefónico con uno de los departamentos de Servicio Técnico de QIAGEN o con los distribuidores locales (consulte la contraportada o visite En las figuras 22 y 23 se presentan ejemplos de reacciones de PCR positivas y negativas. 18a. Se detecta una señal en el canal de fluorescencia Cycling Green. El resultado del análisis es positivo: la muestra contiene ADN del EBV. En este caso, la detección de una señal en el canal Cycling Yellow no es imprescindible, ya que las concentraciones altas iniciales de ADN del EBV (señal positiva en el canal Cycling Green) pueden dar lugar a una reducción o a la ausencia de señal de fluorescencia del control interno en el canal Cycling Yellow (competición). 18b. No se detectan señales en el canal de fluorescencia Cycling Green. Al mismo tiempo, aparece una señal procedente del control interno en el canal Cycling Yellow. La muestras no contiene ADN del EBV detectable. Puede considerarse negativa. En el caso de una PCR del EBV negativa, la señal detectada del control interno descarta la posibilidad de inhibición de la PCR. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

62 18c. No se detectan señales en los canales Cycling Green o Cycling Yellow. No puede obtenerse un resultado. Puede encontrarse información acerca de las fuentes de error y su solución en el apartado Guía de resolución de problemas, en la página 64. Figura 22. Detección de los estándares de cuantificación (EBV RG QS 1 4) en el canal de fluorescencia Cycling Green. NTC: control sin molde (control negativo). 62 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

63 Figura 23. Detección del control interno (IC) en el canal de fluorescencia Cycling Yellow con amplificación simultánea de los estándares de cuantificación (EBV RG QS 1 4). NTC: control sin molde (control negativo). Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

64 Guía de resolución de problemas Esta guía de resolución de problemas le será de utilidad para resolver los problemas que puedan surgir. Para obtener más información, consulte también la página de preguntas frecuentes de nuestro Centro de Soporte Técnico: Los científicos del Servicio Técnico de QIAGEN se encargarán de responder cualquier pregunta que tenga sobre la información y los protocolos de este manual, así como sobre las tecnologías para la preparación de muestras y ensayos de biología molecular (encontrará la información de contacto en la contraportada o en Manipulación general Aparece un mensaje de error en la pantalla táctil Comentarios y sugerencias Si aparece un mensaje de error durante la ejecución de un protocolo, consulte las guías del usuario suministradas con sus instrumentos. Precipitado en el recipiente de reactivos de un cartucho abierto de los kits QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi o QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini a) Evaporación de tampón Un exceso de evaporación puede provocar un aumento de la concentración de sal o una reducción de la concentración de alcohol en los tampones. Deseche el cartucho de reactivos (RC). Asegúrese de sellar los recipientes de tampón de un cartucho de reactivos (RC) parcialmente usado con las tiras de sellado para reutilización cuando no se estén utilizando para la purificación. 64 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

65 b) Almacenamiento del cartucho de reactivos (RC) Comentarios y sugerencias El almacenamiento del cartucho de reactivos (RC) a una temperatura inferior a 15 C puede causar la formación de precipitados. En caso necesario, retire del cartucho de reactivos (RC) los recipientes que contienen los tampones QSL2 y QSB1 e incúbelos en un baño María* a 37 C durante 30 minutos con agitación ocasional para disolver el precipitado. Asegúrese de volver a colocar los recipientes en las posiciones correctas. Si el cartucho de reactivos (RC) ya está perforado, asegúrese de volver a cerrar los recipientes con las tiras de sellado para reutilización e incube el cartucho de reactivos (RC) completo en un baño María* a 37 C durante 30 minutos con agitación ocasional. Rendimiento bajo de ácidos nucleicos a) Las partículas magnéticas no se resuspendieron completamente Antes de comenzar el procedimiento, asegúrese de que las partículas magnéticas estén totalmente resuspendidas. Mezcle mediante agitación vorticial durante al menos 3 minutos antes del uso. b) Las muestras congeladas no se mezclaron correctamente después de la descongelación c) No se añadió ARN transportador (CARRIER) Descongele las muestras congeladas con agitación suave para garantizar una mezcla minuciosa. Reconstituya ARN transportador (CARRIER) en tampón AVE (AVE) y mézclelo con un volumen adecuado de tampón AVE (AVE) según se describe en Preparación de las mezclas ARN transportador (CARRIER) tampón AVE (AVE) para muestras de plasma, a partir de la página 29. Repita el procedimiento de purificación con nuevas muestras. * Asegúrese de que todos los instrumentos se hayan verificado, sometido a mantenimiento y calibrado con regularidad según las instrucciones del fabricante. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

66 d) Ácidos nucleicos degradados e) Lisis incompleta de la muestra f) Atasco de la punta de pipeta debido a material insoluble Comentarios y sugerencias Las muestras se almacenaron incorrectamente o se sometieron a demasiados ciclos de congelación-descongelación. Repita el procedimiento de purificación con nuevas muestras. Antes del uso, compruebe que los tampones QSL2 y QSB1 no contengan precipitados. En caso necesario, retire del cartucho de reactivos (RC) los recipientes que contienen los tampones QSL2 y QSB1 e incúbelos durante 30 minutos a 37 C con agitación ocasional para disolver el precipitado. Si el cartucho de reactivos (RC) ya está perforado, asegúrese de volver a cerrar los recipientes con las tiras de sellado para reutilización e incube el cartucho de reactivos (RC) completo a 37 C durante 30 minutos con agitación ocasional en un baño María.* No se eliminó de la muestra el material insoluble antes de comenzar el procedimiento de purificación con el instrumento QIAsymphony. Para eliminar el material insoluble para las aplicaciones virales, centrifugue la muestra a 3000 x g durante 1 minuto y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de muestra. * Asegúrese de que todos los instrumentos se hayan verificado, sometido a mantenimiento y calibrado con regularidad según las instrucciones del fabricante. 66 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

67 Comentarios y sugerencias El QIAsymphony AS detecta que el Master es insuficiente No toda la EBV RG Master se ha transferido al tubo Combine todos los tubos de EBV RG Master de un solo kit en un tubo. Puede resultar difícil manipular reactivos viscosos con pipetas manuales. Asegúrese de que transfiere el volumen completo de la EBV RG Master al tubo. En caso de trabajar con reactivos viscosos, recomendamos aspirar un volumen extra de 5% cuando se utilicen pipetas manuales (p. ej., ajuste la pipeta a 840 μl cuando quiera aspirar 800 μl). De manera alternativa, puede intentar lo siguiente: tras dispensar lentamente el líquido y expulsar todo el aire del interior contra la pared del tubo de destino, saque la punta del líquido, suelte el émbolo de la pipeta y espere otros 10 s. El líquido residual caerá por la punta y se podrá volver a aspirar accionando el émbolo por segunda vez. El hecho de utilizar puntas con filtro aptas para PCR denominadas de baja retención puede mejorar la recuperación de líquido. Ausencia de señal con controles positivos (EBV RG QS 1 4) en el canal de fluorescencia Cycling Green a) El canal de fluorescencia seleccionado para el análisis de los datos de PCR no cumple el protocolo Para el análisis de los datos, seleccione el canal de fluorescencia Cycling Green para la PCR analítica del EBV, y el canal de fluorescencia Cycling Yellow para la PCR del control interno. b) Programación incorrecta del perfil de temperatura del Rotor- Gene Compare el perfil de temperatura con el protocolo. Consulte el apartado Protocolo: PCR y análisis de los datos en el Rotor-Gene Q en la página 52. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

68 c) Configuración incorrecta de la PCR d) Las condiciones de almacenamiento de uno o más componentes del kit no cumplían las instrucciones indicadas en el apartado Almacenamiento (página 6) e) El kit artus EBV QS-RGQ ha caducado Comentarios y sugerencias Asegúrese de que la configuración del ensayo se realizó correctamente y de que se utilizó el conjunto de parámetros del ensayo correcto. Repita la PCR en caso necesario. Consulte el apartado Protocolo: Preparación del ensayo en el QIAsymphony AS en la página 44. Compruebe las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad (consulte la etiqueta del kit) de los reactivos y utilice un kit nuevo en caso necesario. Compruebe las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad (consulte la etiqueta del kit) de los reactivos y utilice un kit nuevo en caso necesario. Señal débil o ausente del control interno de una muestra negativa sometida a purificación con los kits QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi o QIAsymphony DNA Mini en el canal de fluorescencia Cycling Yellow y ausencia simultánea de una señal en el canal Cycling Green a) Las condiciones de la PCR no cumplen con el protocolo Compruebe las condiciones de la PCR (véase anteriormente) y repita la PCR con los valores de configuración corregidos en caso necesario. b) Se produjo la inhibición de la PCR Asegúrese de utilizar el método de aislamiento validado (consulte el apartado Protocolo: Aislamiento de ADN en el QIAsymphony SP en la página 35) y siga las instrucciones al pie de la letra. 68 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

69 c) Se perdió ADN durante la extracción Comentarios y sugerencias La ausencia de una señal del control interno puede indicar la pérdida de ADN durante la extracción. Asegúrese de utilizar el método de aislamiento validado (consulte el apartado Protocolo: Aislamiento de ADN en el QIAsymphony SP en la página 35) y siga las instrucciones al pie de la letra. Consulte también Rendimiento bajo de ácidos nucleicos, anteriormente. d) Las condiciones de almacenamiento de uno o más componentes del kit no cumplían las instrucciones indicadas en el apartado Almacenamiento (página 6) Compruebe las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad (consulte la etiqueta del kit) de los reactivos y utilice un kit nuevo en caso necesario. e) El kit artus EBV QS-RGQ ha caducado Compruebe las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad (consulte la etiqueta del kit) de los reactivos y utilice un kit nuevo en caso necesario. Señales con los controles negativos en el canal de fluorescencia Cycling Green de la PCR analítica a) Se produjo contaminación durante la preparación de la PCR Repita la PCR con nuevos reactivos en duplicados. Si es posible, cierre los tubos de PCR inmediatamente después de añadir la muestra que se desea analizar. Asegúrese de descontaminar el espacio de trabajo y los instrumentos a intervalos regulares. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

70 b) Se produjo contaminación durante la extracción Comentarios y sugerencias Repita la extracción y la PCR de la muestra que se desea analizar utilizando nuevos reactivos. Asegúrese de descontaminar el espacio de trabajo y los instrumentos a intervalos regulares. 70 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

71 Bibliografía QIAGEN mantiene online una base de datos extensa y actualizada de publicaciones científicas en las que se utilizan los productos de QIAGEN. Las opciones integrales de búsqueda permiten al usuario encontrar los artículos que necesita, ya sea mediante una búsqueda sencilla de una palabra clave o especificando la aplicación, el área de investigación, el título, etc. Para obtener una lista bibliográfica completa, visite la base de datos bibliográfica online de QIAGEN en o póngase en contacto con el Servicios Técnico de QIAGEN o con su distribuidor local. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

72 Información para pedidos Producto Contenido Referencia artus EBV QS-RGQ Kit (24) Para 24 reacciones: mezcla maestra, 4 estándares de cuantificación, control interno, agua (de calidad para PCR) Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi: para purificación automática de ácidos nucleicos virales o ADN bacteriano de 1 96 muestras QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (96) Para un máximo de 96 preparaciones de 1000 μl cada una: incluye 2 cartuchos de reactivos y gradillas de enzimas y accesorios Kit QIAsymphony DNA Mini: para la purificación automatizada de ADN de 1 96 muestras QIAsymphony DNA Mini Kit (192) Sistema QIAsymphony RGQ QIAsymphony RGQ, System Para un máximo de 192 preparaciones de 200 μl cada una: incluye 2 cartuchos de reactivos y gradillas de enzimas y accesorios QIAsymphony SP, QIAsymphony AS, Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, accesorios y consumibles necesarios, instalación y formación Instrumentos QIAsymphony SP/AS y accesorios QIAsymphony SP Módulo de preparación de muestras QIAsymphony, garantía de 1 año para piezas y mano de obra QIAsymphony AS Sample Prep Cartridges, 8-well (336) 8-Rod Covers (144) Módulo de preparación de ensayos QIAsymphony, garantía de 1 año para piezas y mano de obra Cartuchos de preparación de muestras de 8 pocillos para utilizar con el QIAsymphony SP Cubiertas para 8 barras para utilizar con el QIAsymphony SP Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

73 Producto Contenido Referencia Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym Adaptador de refrigeración para gradillas EMT; para utilizar con los instrumentos QIAsymphony SP/AS (versión del software 3.1 o superior) Reuse Seal Set (20) Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym Elution Microtubes CL (24 x 96) Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym Conjuntos de sellado para reutilización para el sellado de cartuchos de reactivos del QIAsymphony parcialmente usado Adaptador para tubos secundarios (para tubos de tapa de rosca de 2 ml, inserto para tubos 3b) para utilizar con el soporte para tubos del instrumento QIAsymphony SP Tubos de polipropileno no estériles (capacidad máxima de 0,85 ml, menos de 0,7 ml de capacidad de almacenamiento, 0,4 ml de capacidad de elución); 2304 en gradillas de 96; incluye tiras de tapas. Adaptador con capacidad para 18 tubos cónicos de 2 ml y para 6 tubos cónicos de 5 ml; para utilizar con los instrumentos QIAsymphony SP/AS (versión del software 3.1 o superior) Adaptador con capacidad para 18 tubos cónicos de 2 ml, para 2 tubos cónicos de 5 ml y para 2 frascos de reactivos de 30 ml; para utilizar con los instrumentos QIAsymphony SP/AS (versión del software 3.1 o superior) Adaptador con capacidad para 18 tiras de 4 tubos; para utilizar con los instrumentos QIAsymphony SP/AS (versión del software 3.1 o superior) Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

74 Producto Contenido Referencia Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (500) Tubos cónicos (2 ml) para reactivos; para utilizar con el QIAsymphony AS * Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (500) Reagent Bottles, 30 ml, Qsym AS (50) Puntas con filtro, 1500 μl (1024) Filter-Tips, 200 μl (1024) Tubos cónicos (5 ml) para reactivos; para utilizar con el QIAsymphony AS Frascos de reactivos (30 ml) con tapas; para utilizar con el QIAsymphony AS Puntas con filtro desechables, engradilladas (8 x 128). Para utilizar con el QIAsymphony SP. Puntas con filtro desechables, engradilladas (8 x 128). Para utilizar con el QIAcube y QIAsymphony SP * Filter-Tips, 50 μl (1024) Puntas con filtro desechables, engradilladas (8 x 128). Para utilizar con el QIAsymphony AS. Tip Disposal Bags (15) Rotor-Gene Q y accesorios Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Bolsas para eliminación de puntas para utilizar con los instrumentos QIAsymphony SP/AS Termociclador para PCR en tiempo real y analizador de disociación de alta resolución con 5 canales (verde, amarillo, naranja, rojo y carmesí) más un canal HRM, ordenador portátil, software, accesorios, garantía de 1 año para piezas y mano de obra Consultar * Consulte la disponibilidad. 74 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

75 Producto Contenido Referencia Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Termociclador para PCR en tiempo real y analizador de disociación de alta resolución con 5 canales (verde, amarillo, naranja, rojo y carmesí) más un canal HRM, ordenador portátil, software, accesorios, garantía de 1 año para piezas y mano de obra; incluye instalación y formación. Consultar Rotor-Gene Q 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Termociclador para PCR en tiempo real y analizador de disociación de alta resolución con 5 canales (verde, amarillo, naranja, rojo y carmesí) más un canal HRM, ordenador portátil, software, accesorios, garantía de 1 año para piezas y mano de obra Termociclador para PCR en tiempo real y analizador de disociación de alta resolución con 5 canales (verde, amarillo, naranja, rojo y carmesí) más un canal HRM, ordenador portátil, software, accesorios, garantía de 1 año para piezas y mano de obra; incluye instalación y formación. 250 tiras de 4 tubos y tapas para 1000 reacciones 10 x 250 tiras de 4 tubos y tapas para reacciones Para obtener información actualizada sobre licencias y sobre exenciones de responsabilidad específicas del producto, consulte el manual o la guía del usuario del kit de QIAGEN correspondiente. Los manuales y las guías del usuario de los kits de QIAGEN están disponibles en o pueden solicitarse al Servicio Técnico de QIAGEN o a su distribuidor local. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

76 Esta página se ha dejado en blanco intencionadamente. 76 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

77 Esta página se ha dejado en blanco intencionadamente. Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/

78 Esta página se ha dejado en blanco intencionadamente. 78 Manual de uso del kit artus EBV QS-RGQ 12/2010

79 La compra de este producto permite al comprador utilizarlo para la realización de servicios de diagnóstico in vitro en seres humanos. Por el presente documento no se concede por la compra ninguna patente general ni ninguna otra licencia de ningún tipo aparte de este derecho de uso específico. Marcas comerciales: QIAGEN, QIAsymphony, artus ; Rotor-Gene (Grupo QIAGEN). El kit artus EBV QS-RGQ es un kit de diagnóstico con el marcado CE conforme a la Directiva Europea sobre diagnóstico in vitro 98/79/CE. No disponible en todos los países. Acuerdo de licencia limitada La utilización de este producto implica por parte de cualquier comprador o usuario del kit artus EBV QS-RGQ la aceptación de los siguientes términos: 1. El kit artus EBV QS-RGQ puede utilizarse exclusivamente de acuerdo con las especificaciones del Manualde uso del kit artus EBV QS-RGQ y empleando únicamente los componentes contenidos en el kit. QIAGEN no ofrece licencia alguna bajo ninguna de sus propiedades intelectuales para utilizar o incorporar los componentes contenidos en este kit con componentes no incluidos en el mismo, excepto según se describe en el Manualde uso del kit artus EBV QS-RGQ y en protocolos adicionales disponibles en 2. Aparte de las licencias expresamente especificadas, QIAGEN no garantiza que este kit ni su(s) uso(s) no infrinjan los derechos de terceros. 3. Este kit y sus componentes tienen licencia para un solo uno y no pueden ser reutilizados, reacondicionados ni revendidos. 4. QIAGEN específicamente renuncia a cualquier otra licencia, explícita o implícita, distinta de las licencias expresamente especificadas. 5. El comprador y el usuario del kit aceptan no realizar ni permitir a otros realizar ningún paso que pueda conducir a acciones que hayan sido prohibidas en las especificaciones anteriores o que pueda facilitarlas. QIAGEN se reserva el derecho de emprender acciones legales ante cualquier tribunal para el cumplimiento de las prohibiciones especificadas en este Acuerdo de licencia limitada, y recuperará todos los gastos derivados de la investigación y de los costes del juicio, incluidos los honorarios de abogacía, en cualquier acción emprendida para hacer cumplir este Acuerdo de garantía limitada o cualquier otro derecho de propiedad intelectual en relación con este kit y con sus componentes. Para obtener los términos actualizados de la licencia, visite QIAGEN, todos los derechos reservados.

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