Artículo Científico. Citrus leaf blotch virus. Relación con otras enfermedades o desórdenes en árboles de cultivares cítricos

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1 Revista CitriFrut, Vol. 27, No. 2, julio-diciembre, 2010 Artículo Científico Citrus leaf blotch virus. Relación con otras enfermedades o desórdenes en árboles de cultivares cítricos Juana M. Pérez, Xenia Ferriol, Lester Hernández Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave. 7 ma No e/ 30 y 32. Miramar. Playa. La Habana. Cuba. juanaperez@iift.cu RESUMEN Las enfermedades conocidas como moteado foliar de los cítricos y moteado del tangor Dweet son causadas por Citrus leaf blotch virus (CLBV). Este patógeno ha sido detectado en varios países citrícolas y su dispersión ocurre a través de la propagación con yemas infectadas y por semillas. Su presencia se ha relacionado con la incompatibilidad en el punto de unión en árboles de diferentes especies o variedades propagadas en los patrones Poncirus trifoliata (L.) Raf. y sus híbridos: citranges (C. sinensis (L.) Osb. x P. trifoliata (L.) Raf. o citrumelos (C. paradisi Macf. x P. trifoliata (L.) Raf. ). El diagnóstico biológico se realiza en las plantas indicadoras tangor Dweet (C. tangerina (Hort. ex Tan.) x C. sinensis (L.) Osb.) y cidro Etrog (C. medica L.). La detección molecular se puede efectuar mediante la aplicación de RT-PCR o la hibridación de ácidos nucleicos. En este trabajo se describen las características de la enfermedad y su agente causal, la relación con otras afecciones virales, los métodos de detección, así como las medidas para el manejo y control en el cultivo de los cítricos. Palabras clave: CLBV, diagnóstico biológico, virus cítricos, diagnóstico molecular ABSTRACT Citrus leaf blotch and Dweet mottle are citrus diseases caused by Citrus leaf blotch virus (CLBV). This pathogen has been detected in several countries and it is graft and seed transmitted. The virus presence is related to bud union crease in trees of several citrus species, or cultivars propagated on rootstock as Poncirus trifoliata (L.) Raf. and the hybrids: citranges (C. sinensis (L.) Osb. x P. trifoliata (L.) Raf. or citrumelos (C. paradisi Macf. x P. trifoliata (L.) Raf. ). The biological diagnosis is based on indicator plants including Dweet tangor (C. tangerina (Hort. extan.) x C. sinensis (L.) Osb.) and Etrog citron (C. medica L.). Molecular detection can be made through RT-PCR or nucleic acid hybridization. This work is a review of the disease characteristics and the causal agent, relationship with other citrus viral disorders, detection methods and the management and measures in citrus cultivation. Key word: CLBV, biological indexing, citrus virus, molecular diagnosis INTRODUCCIÓN Las enfermedades transmisibles por injerto en el cultivo de los cítricos producen importantes pérdidas económicas en la mayoría de las áreas productoras a nivel mundial (Rocha-Peña y López-Arroyo, 2003). Los agentes causales de estas afecciones transmisibles principalmente mediante injerto, producen síntomas diversos o pueden encontrarse de forma asintomática en los árboles infectados en el campo. Algunos de los desórdenes en árboles de este cultivo pueden tener origen genético pero en otros casos, están asociados con patógenos transmisibles por injertos (Nauriyal et al., 1958; Schneider, 1968; McClean, 1974; Guerri, 2000; Castle y Stover, 2001). Varios agentes virales, viroides, algunas bacterias, espiroplasmas y fitoplasmas o agentes causales desconocidos, están relacionados o son los causantes de las anomalías transmisibles por injertos en cultivares cítricos (Roistacher, 1991 y 2009). Como una consecuencia de las epidemias mundiales causadas por la enfermedad de la tristeza de los cítricos, fue necesario la sustitución o disminución del predominio del naranjo agrio (Citrus aurantium L.) por otros patrones tolerantes al virus de la tristeza de los cítricos (CTV). La diversificación de los patrones puede ocasionar la emergencia de otras enfermedades que afecten los nuevos cultivares usados como portainjertos. Dentro de ellos se CitriFrut 15

2 Pérez J. M. et al.: Citrus leaf blotch virus. Relación con otras enfermedades o desórdenes en cítricos encuentran los patrones trifoliados Poncirus trifoliata (L.) Raf. y sus híbridos, Citrus macrophylla Wester, Citrus volkameriana Pasq. y el mandarino Cleopatra (C. reshni Hort. ex Tan.) (Pérez et al., 1995; Moreno et al., 2008). El virus del rasgado de las hojas de los cítricos (del término en inglés Citrus tatter leaf virus, CTLV) y el virus del moteado de las hojas de los cítricos (del término en inglés Citrus leaf blotch virus, CLBV) son dos de los patógenos relacionados con síntomas de incompatibilidad en el punto de injerto de árboles de cultivares cítricos (Wanami, et al., 1978; Galipienso et al., 2001). CLBV es el agente causal de la enfermedad conocida como moteado foliar de los cítricos. Este virus se ha detectado en colecciones y en plantaciones comerciales en numerosos países y es un miembro del género Citrivirus, familia Flexiviridae (Adams et al., 2005; Martelli et al., 2007). La presencia de esta patología se relaciona con los síntomas de incompatibilidad en el punto de unión de diferentes especies o cultivares propagados en los patrones Poncirus trifoliata y sus híbridos: citranges (C. sinensis (L.) Osb. x P. trifoliata (L.) Raf.) o citrumelos (C. paradisi Macf. x P. trifoliata (L.) Raf. ) (Vives et al., 2002a; Galipienso et al., 2004; Guardo et al., 2007; Harper et al., 2008). La dispersión del agente viral ocurre principalmente a través de la propagación con yemas infectadas y en un bajo porcentaje por semillas (Guerri et al., 2004). CLBV no se ha encontrado infectando huéspedes no cítricos y tampoco se ha demostrado la transmisión por vectores (Vives et al., 2008b). Esta revisión tiene el objetivo de describir las características de la enfermedad del moteado foliar de los cítricos, su agente causal, la relación con otras afecciones virales y los métodos de detección del mismo. Además, discutir las medidas para el manejo y control en el cultivo con la finalidad de resaltar la importancia de la inclusión de métodos de diagnóstico para CLBV en los programas de saneamiento, cuarentena y certificación de cítricos en Cuba. Primeras evidencias de la presencia de un agente viral en árboles del cultivar kumquat Nagami (Fortunella margarita (Lour.) Swing.) Los antecedentes de la presencia de una afección transmisible por injerto en el cultivar kumquat Nagami surgieron como resultado de los trabajos del programa de mejoramiento iniciado en España en el año El objetivo del programa era la obtención de cultivares de cítricos libres de patógenos de tipo viral (Navarro et al., 1975; Navarro et al., 1980). Como parte de estos trabajos, dos fuentes de kumquat Nagami se analizaron para la detección de virosis. La primera fuente procedía de la Station des Recherches Agrumicoles, Córcega, Francia (kumquat SRA-153) y la segunda, fue localizada en una colección particular en Murcia, España (kumquat Alhama). Estos dos cultivares se propagaron sobre los patrones citrange Troyer y limón Rugoso (Citrus jambhiri Lush) para determinar la compatibilidad entre las especies. Los resultados del diagnóstico y desarrollo de los cultivares de kumquat se caracterizaron por la manifestación de aclaramiento de los nervios (traducción del término en inglés «vein clearing») en hojas de naranjo dulce Pineapple (C. sinensis (L.) Osb.); incompatibilidad en las plantas de kumquat sobre citrange Troyer; desarrollo normal de las plantas del mismo cultivar sobre limón Rugoso. Con relación al síntoma de aclaramiento nervial en naranjo Pineapple, no es común observarlo en esta especie, en España, sino que es un síntoma característico de CTV en lima mexicana (Citrus aurantifolia (Christm.) Swing.); y además, la fuente de kumquat SRA-153 en estudio estaba libre de tristeza. Estas consideraciones sugirieron la hipótesis de la posible presencia de un nuevo agente de tipo viral en estas plantas de kumquat Nagami (Navarro et al., 1984). Para determinar las características del agente causal del aclaramiento de los nervios en naranjo dulce Pineapple y la inducción de incompatibilidad entre el injerto de kumquat y el patrón citrange Troyer, se realizaron varias investigaciones. Se seleccionó el aislado de kumquat SRA-153 para ensayos de transmisión en varias especies de cítricos. Este aislado se encontraba libre de tristeza y exocortis, patógenos que causan síntomas similares y que pudieran provocar errores en la investigación. Los resultados de los ensayos biológicos corroboraron la incompatibilidad en el desarrollo de las plantas de kumquat Nagami aislado SRA-153 sobre citrange Troyer. Además, se mostraron manifestaciones de arrugas o crestas en el punto de unión del injerto (del término en inglés «bud union crease»). El aislado SRA-153 también indujo aclaramiento de los nervios en varias especies de cítricos, entre ellas el naranjo Pineapple. Adicionalmente, se produjeron hendiduras alargadas en la madera del tallo solamente en cidro Etrog (C. medica L.). Este constituyó el primer informe de este síntoma en la planta indicadora, por lo cual se incluyó en el diagnóstico biológico de CLBV (Navarro et al., 1984). Caracterización biológica de agente (s) causantes de incompatibilidad en el punto de unión del cultivar kumquat Nagami SRA-153 injertado sobre citrange Troyer En estudios realizados por Galipienso et al., (2000) se determinó el rango de hospederos y la sintomatología ocasionada por agente (s) causantes de las arrugas o crestas en el punto de unión del cultivar kumquat Nagami SRA- 16 CitriFrut

3 Revista CitriFrut, Vol. 27, No. 2, julio-diciembre, injertado sobre patrón citrange Troyer. Los ensayos realizados y resultados obtenidos se describen en los acápites a, b y c. a) Efecto del aislado SRA-153 en el punto de unión de especies de cítricos sobre citrange Troyer En la evaluación del efecto de los agente (s) del aislado SRA-153, sobre especies injertadas en citrange, se utilizaron yemas infectadas por el aislado y yemas sanas de las especies clementino Nules (Citrus clementina Hort. ex Tan.), pomelo Marsh (Citrus paradisi Macf.), naranjo Pineapple y de limonero Eureka (Citrus limón (L.) Burm.f.), las cuales fueron propagadas individualmente sobre plantas de citrange. Además, se incluyeron como controles positivos, las plantas de kumquat aislado SRA-153 injertadas también sobre citrange. La observación de síntomas realizada seis meses después de la propagación de los cultivares mostró decoloración e incompatibilidad en el punto de unión en todas las plantas control positivo de kumquat y parte de las de clementino Nules y de limonero Eureka. Mientras que en las de pomelo Marsh y de naranjo Pineapple sometidas al mismo tratamiento, así como en las de cada cultivar sin inocular no se produjo alteración en el punto de unión injerto/patrón un año después de la propagación. Sin embargo, en estos últimos cultivares puede requerirse un periodo de incubación superior para la expresión de los síntomas, como ha sido informado para otras enfermedades transmisibles por injertos (Roistacher, 1991). b) Síntomas causados por diferentes fuentes de inóculos del aislado SRA-153 Para analizar la variación en la inducción de síntomas del clementino Nules, el limón Eureka, el pomelo Marsh y el naranjo Pineapple como fuentes de inoculo del aislado SRA-153, se realizaron inoculaciones con porciones de corteza en las plantas indicadoras: naranjo Pineapple, tangor Dweet y en cidro Etrog. Usando como fuentes de inóculo: el clementino Nules o el limón Eureka, se logró reproducir los síntomas similares del aislado SRA-153 en las tres especies indicadoras inoculadas. Sin embargo, cuando se inocularon las plantas indicadoras a partir de pomelo Marsh o de naranjo Pineapple portadoras de SRA- 153, solo se indujeron síntomas de moteado clorótico en tangor Dweet y lesiones de hendiduras alargadas en cidro Etrog (Figura 1 A y B). No se observó aclaramiento de los nervios en las hojas de naranjo Pineapple. Además, la proporción de plantas que mostraron síntomas en relación con las inoculadas, el número de hojas con síntomas y la intensidad de estos en las plantas inoculadas fueron mayores cuando los inóculos procedían del aislado SRA-153. Al utilizar otras fuentes infectivas como naranjo Pineapple y pomelo Marsh, la intensidad y frecuencia de transmisión fue muy baja o nula. La detección del moteado clorótico en tangor Dweet constituyó el primer informe de este síntoma asociado a la presencia de un patógeno en el aislado SRA- 153 (Figura 1A) (Galipienso et al., 2000). Fig. 1. Síntomas causados por CLBV, aislado SRA 153 obtenido de kumquat Nagami. A. Moteado foliar en tangor Dweet; B. Stem pitting en un tallo de cidro Arizona 861-S1. (Fotos: Cortesía de J. Guerri. IVIA. España). c) Síntomas inducidos por el clon de kumquat aislado SRA-153 (original) y por tres clones obtenidos por microinjerto in vitro de ápices caulinares (MIV) Para determinar la inducción de sintomas asociados con la presencia de agentes patógenos en las plantas de los clones de kumquat citados, se inocularon grupos de 8 plantas indicadoras de naranjo dulce Pineapple, tangor Dweet y cidro Etrog, a partir de cada planta de kumquat. Se comprobó que uno de los microinjertos fue saneado de los patógenos presentes en la fuente original de kumquat, mientras que los dos restantes fueron liberados del síntoma de aclaramiento de los nervios en naranjo Pineapple. Sin embargo, el aislado SRA-153 causó los tres tipos de síntomas descritos para esta fuente en las plantas indicadoras inoculadas. Los controles sanos de kumquat no provocaron síntomas en las plantas indicadoras. De este modo, se concluyó que una de las tres plantas microinjertadas analizadas estaba libre de los patógenos presentes en la fuente original, a pesar de que resulta difícil la eliminación de este virus mediante esta técnica, pues se ha informado que la mayor concentración viral en este caso está en el tejido meristemático de los brotes, lo cual no es frecuente en otros virus (Navarro et al., 2002, Vives et al., 2008a). Como resultados de los ensayos (incisos b y c) se sugirió la presencia de al menos dos patógenos o dos cepas diferentes de un patógeno en la planta de kumquat SRA Uno de los patógenos se logró excluir por la aplica- CitriFrut 17

4 Pérez J. M. et al.: Citrus leaf blotch virus. Relación con otras enfermedades o desórdenes en cítricos ción del MIV o a través de la inoculación del aislado SRA-153 en pomelo Marsh y/o en naranjo Pineapple y de la reinoculación a partir de estos cultivares en los cuales se observó pérdida de infectividad del virus (Navarro et al., 1984; Galipienso et al., 2000; 2001). Distribución geográfica CLBV ha sido detectado en colecciones y en plantaciones comerciales de cítricos en Valencia (España), Córcega (Francia), Florida y California (EE.UU), Japón y Australia (Galipienso et al., 2001, 2004; Vives et al., 2002a), Italia (Guardo et al., 2007) y recientemente en Nueva Zelanda (Harper et al., 2008). Asimismo, el análisis realizado a cultivares de varios países demostraron la infección viral en naranjo dulce Roble injertado en citrumelo Swingle, en Florida (EE.UU.); en cultivares afectados por declinación e incompatibilidad injerto/ patrón citrange, en Valencia, (España); en tres mandarinos importados de Japón, a través de la Estación Nacional de Cuarentena de España y en Nagami kumquat, procedente de New South Wales (Australia). En Sicilia, Italia, se producen anualmente alrededor de 400,000 plantas de kumquat ornamentales. Durante la inspección realizada a un vivero de plantas de kumquat Nagami injertadas sobre citrange Troyer y en naranjo agrio, se observaron síntomas de follaje pobre e incompatibilidad debido a la unión poco consistente y separación del injerto que provocó la declinación de 50 plantas de kumquat/citrange, después de un año de propagadas. El análisis para la presencia de virosis en un total de 100 plantas incluyendo parte de ellas sobre naranjo agrio asintomáticas, evidenciaron la infección por aislados de CLBV. (Guardo et al., 2007). Estos resultados relacionados con la incompatibilidad en plantas de kumquat sobre citrange coinciden con los obtenidos por Galipienso et al., (2000), asimismo las accesiones de CLBV de Italia tuvieron 96 y 97 % de identidad en las secuencias de nucleótidos respectivamente, así como también ambos tuvieron 99% de identidad aminoacídica con la accesión No AF de CLBV reportada en el Genbank (Guardo et al., 2007). En Nueva Zelanda, la prospección realizada para la detección de CLBV demostró su presencia principalmente en árboles asintomáticos, o sintomáticos de varias especies de cítricos en co-infección con CTV. Solo un árbol de pomelo sobre patrón trifoliado, mostró síntomas de incompatibilidad en el punto de unión del injerto/patrón (Harper et al., 2008). Caracterización molecular del agente causal de CLBV. Vías de diseminación y transmisión La secuenciación completa del genoma y el estudio de su organización, estrategias de replicación y la caracterización bioquímica del virus, permitieron concluir que CLBV es un miembro del género Citrivirus, familia Flexiviridae (Adams et al., 2005; Martelli et al., 2007). Los viriones son partículas filamentosas de tamaño aproximado de 960 x 14 nm y que contienen una simple cadena (ss) de ARN de sentido positivo. El ARN genómico está encapsulado por una proteína de cápside de 42 KDa (Galipienso et al., 2001). La caracterización del aislado SRA-153 de kumquat Nagami, concluyó con la obtención de un clon completo de cdna de CLBV. Esto permitió demostrar que CLBV es el agente causal del Dweet mottle virus. Igualmente se llegó a la conclusión de que los síntomas de aclaramiento de los nervios en naranjo Pineapple, así como la incompatibilidad en el punto de unión del injerto/patrón trifoliado, no se deben a CLBV, sino que son causados probablemente por otro patógeno o debido a una interacción entre CLBV y otro agente (Vives et al., 2008a). La comparación de la secuencia entre el CLBV encontrada en las fuentes del Dweet mottle virus y las secuencias de los aislamientos de SRA-153 depositadas en la base de datos GenBank mostraron de 96,6% a 98,5% de identidad nucleotídica y de 99,5% a 100% de identidad aminoacídica. Por otro lado, las secuencias de varios aislados de CLBV a partir de fuentes diferentes mostraron de 97 a 99% de identidad nucleotídica con el aislado SRA-153 (GenBank accesión No. AF318061) (Vives et al., 2001; Harper et al., 2008). Esto sugiere una alta conservación de las secuencias nucleotídicas del virus. Este resultado se evidenció también con el análisis de 37 aislados de CLBV procedentes de plantaciones de España, los cuales mostraron baja diversidad genética con valores inferiores a 0,0041. Igualmente se encontró baja diversidad y el mismo patrón de polimorfismo de conformación del ADN de simple cadena (SSCP, del inglés single strand conformation polymorphism) en aislados de diferentes especies (naranjos dulces y clementinos) por lo cual se determinó que el hospedero no contribuye a la diversidad de la población viral (Vives et al., 2002b). La principal vía de diseminación de CLBV es a través de yemas infectadas y también es transmitido por semillas de varias especies de cítricos en un porcentaje bajo (Guerri et al., 2004). Para determinar la transmisibilidad del patógeno, fueron extraídas y puestas a germinar entre 120 y 210 semillas de frutos colectados en árboles de citrange Troyer, kumquat Nagami y naranjo agrio, previamente infectados por CBLV. Las plantas obtenidas de cuatro meses de edad fueron analizadas por reverso transcripción asociado a la reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR), mostrando de 2,46 a 2,52 % de plantas positivas en los cultivares analizados. Los resultados moleculares 18 CitriFrut

5 Revista CitriFrut, Vol. 27, No. 2, julio-diciembre, 2010 obtenidos fueron similares a los derivados posteriormente en la comprobación de síntomas en tangor Dweet (Guerri et al., 2004). Estos resultados evidencian la importancia de las medidas de prevención que deben implementarse en un sistema de producción de material de propagación certificado de cítricos. De este modo se puede evitar la transmisión de CLBV tanto por yemas como por semillas. Se plantea que para el control de la diseminación del virus en la propagación de cítricos, es necesario no sólo el uso de semillas libres de virus, sino también de patrones semilleros que se originen de fuentes de semillas libres de CLBV. CLBV también ha sido transmitido experimentalmente de forma mecánica entre diferentes especies de cítricos mediante cortes e inoculación con extractos parcialmente purificados obtenidos de tejidos infectados con el aislado SRA-153. También se ha reproducido la infección viral en Nicotiana occidentalis mediante inoculación mecánica con los extractos obtenidos de cítricos infectados y a partir de estas plantas de Nicotiana occidentalis se inocularon nuevamente los cítricos (Galipienso et al., 2000; Vives et al., 2008b). El resultado de la transmisión en cítricos mostró la aparición de síntomas de moteado foliar en tangor Dweet y hendiduras en el tallo de cidro Etrog. No se lograron reproducir los síntomas de aclaramiento en los nervios en naranjo Pineapple ni la incompatibilidad en citrange. De este modo, se confirma la hipótesis de que CLBV puede ser causante solamente de los síntomas de moteado foliar en tangor Dweet y de hendiduras en el tallo de cidro Etrog (Galipienso et al., 2000; Vives et al., 2008a). CLBV y su relación con Dweet Mottle Virus En la década de 1960, en California, diagnósticos biológicos realizados en plantas de tangor Dweet, y otras especies de cítricos mediante la inoculación de tejidos a partir de vástagos de un mandarino Cleopatra (CRC 20), demostraron la presencia de síntomas débiles de exocortis en cidro y de moteado clorótico foliar solamente en las plantas indicadoras de tangor Dweet. Por tal motivo, se identificó al agente causal de la nueva enfermedad detectada como Dweet mottle virus (con acrónimo, DMV) (Roistacher y Blue, 1968). El mandarino Cleopatra analizado provenía de La Florida (EUA), de un árbol que no mostraba síntomas característicos de alguna enfermedad viral conocida. La similitud de los síntomas de los aislados SRA-153 de CLBV y dos fuentes del DMV obtenidos en plantas indicadoras de tangor Dweet y de cidro Etrog, así como el análisis por RT-PCR de las fuentes de DMV y de otras plantas de especies inoculadas sugirieron que CLBV era precisamente el virus previamente nombrado como DMV (Vives et al., 2004; 2005). El patógeno responsable de la enfermedad del Dweet mottle, fue difícil de eliminar por MIV o por termoterapia al igual que CLBV. La comparación de la secuencia entre el CLBV encontrado en las fuentes del DMV y las secuencias de los aislamientos de SRA-153 depositadas en la base de datos GenBank mostraron de 96,6% a 98,5% de identidad nucleotídica y de 99,5% a 100% de identidad aminoacídica. Esta alta congruencia nucleotídica y aminoacídica indicó que los aislamientos del CLBV estuvieron estrechamente relacionados a otros aislamientos, confirmando así mismo, su estabilidad genética (Vives et al., 2005). Métodos de detección. Diagnóstico biológico CLBV puede ser detectado mediante ensayos biológicos en plantas indicadoras de tangor Dweet y en cidro Arizona 861-S1 injertado sobre limón Rugoso u otra especie de patrón vigoroso. Para el diagnóstico se realiza la inoculación de 3 ó 4 fragmentos de corteza de la variedad a analizar en un mínimo de cuatro plantas de la especie indicadora seleccionada. Es recomendable la utilización del tangor Dweet para los diagnósticos de rutina porque los síntomas de moteado clorótico se observan fácilmente y se manifiestan relativamente rápido, en un periodo de 1 a 3 meses. Las lesiones de acanaladuras en el tallo del cidro pueden expresarse en la región próxima a los inóculos, en un período de 3 a 10 meses después de la inoculación (Navarro et al., 1984; Galipienso et al., 2000). El síntoma de moteado foliar inducido en tangor Dweet por el aislado de kumquat SRA-153 se puede observar desde la primera hasta la tercera brotación. No obstante, la mayor probabilidad de aparición de los síntomas es en la segunda brotación, en un período de 1-3 meses (Galipienso et al., 2000). Algunos de estos síntomas de moteado, patrón de hoja de roble y flequeado foliar son muy similares a los de varias enfermedades de tipo viral (Roistacher, 1991). El síntoma foliar típico de CLBV también ha sido inducido por otros aislados en tangor Dweet (Vives et al., 2008a). Para la detección de los síntomas de hendiduras alargadas en el leño de los cidros se despegan o separan bandas de corteza próximas a los inóculos de 3 a 10 meses post- inoculación. Estas cortezas separadas del tallo pueden colocarse de nuevo en su lugar para que cicatricen o de lo contrario, se desechan y el área se desinfecta con una solución de fungicida para evitar la proliferación de hongos. El método que se describe para la detección de síntomas en el tallo es similar al que se ha indicado para el viroide de la cachexia en la planta indicadora específica (Pérez et al., 2007). Los ensayos biológicos requieren un número elevado de plantas indicadoras y de tejido de corteza a inocular debido a la distribución desigual o baja concentración del virus en las plantas infectadas o sospechosas de CitriFrut 19

6 Pérez J. M. et al.: Citrus leaf blotch virus. Relación con otras enfermedades o desórdenes en cítricos infección por el agente a detectar. Además las plantas inoculadas deben permanecer en un área climatizada con una temperatura entre 18 a 25 ºC, o de lo contrario, los síntomas foliares o en el tallo de las plantas indicadoras se manifiestan con menor intensidad o no se expresan, teniendo como consecuencia un diagnóstico no confiable de la muestra que se analiza (Galipienso et al., 2000). El ensayo biológico es un proceso lento y costoso que requiere facilidades en las casas de cultivos, además, es indispensable contar con personal entrenado en la labor y es inadecuado para el diagnóstico a grandes escalas (Galipienso et al., 2000, 2001). En Cuba, el proceso de selección de cultivares cítricos libres de virus condujo a desarrollar y optimizar el diagnóstico biológico en plantas indicadoras para la detección de enfermedades transmisibles por injerto causadas por virus o agentes similares. Varios agentes virales como los causantes de la psorosis y la concavidad gomosa, inducen síntomas foliares en naranjos dulces y en el tangor Dweet en condiciones de temperaturas frescas. Es por esta razón, que si los síntomas foliares de CLBV en tangor Dweet son similares a los que producen la psorosis y la concavidad gomosa, el CLBV, aún sin haberse reportado en el país, pudo haberse excluido de algún cultivar a través del proceso de saneamiento por MIV (Pérez et al., 1989; 2005; 2007; Zamora et al., 2007). Diagnóstico molecular Con la determinación de la secuencia del ARN genómico de CLBV se implementaron procedimientos de detección rápidos como la hibridación molecular usando sondas de ADN complementario marcadas con digoxigenina (Galipienso et al., 2004). La detección de CLBV por RT (transcripción reversa) y amplificación por PCR usando extractos totales de ARN a partir de brotes jóvenes de limón Eureka, pomelo Marsh, clementina Nules, naranjo dulce Navelina (C. sinensis (L.) Osb) y en kumquat Nagami, se ha descrito con anterioridad (Vives et al., 2002). Sin embargo, los resultados no fueron confiables cuando se procesaron tejidos de naranjo dulce Pineapple, porque se obtuvieron más del 80% de falsos negativos (Galipienso et al., 2004; Vives et al., 2002a). El diagnóstico de rutina de CLBV por RT-PCR tiene sus desventajas comparadas con la hibridización, particularmente la hibridización por impresión de tejidos (TPH). La TPH permite un procesamiento simultáneo de mayor cantidad de muestras, mientras que sólo un número limitado puede ser procesado al mismo tiempo por RT-PCR. Por otro lado, en la RT-PCR es común encontrar tanto falsos positivos debido a la contaminación cruzada como reacciones negativas debido a la inhibición de la reverso transcriptasa y/o de la enzima polimerasa por compuestos polifenólicos. La DBH (hibridación por DOT-BLOT) también puede ser útil en estudios masivos de epidemiología usando al menos seis hojas jóvenes o diferentes brotes alrededor del árbol. Una ventaja de este método de diagnóstico con respecto al diagnóstico biológico es que las membranas impresas o el tejido desecado puede ser enviado a otros laboratorios para su posterior análisis sin el riesgo de diseminar este patógeno en áreas donde aún no se ha detectado (Galipienso et al., 2004). Otro método descrito para el diagnóstico de CLBV es la utilización del PCR en tiempo real acoplado a la reversotranscripción usando sondas Taq Man. Con esta técnica es posible no solo la detección, sino que también puede realizarse la cuantificación de CLBV en las plantas de cítricos. La detección por este método es altamente específica y cerca de mil veces más sensible que por la RT-PCR convencional (Ruiz-Ruiz et al., 2009). Se ha utilizado para la detección de CLBV en varios tejidos de variedades de cítricos infectados con los virus, provenientes de diferentes áreas geográficas. Es rápido y específico, lo cual mejora considerablemente la detección del virus, y el análisis es efectivo para cualquier cultivar. Además, se demostró que puede ser utilizado en cualquier periodo del año, ya que se obtuvieron resultados satisfactorios utilizando muestras de tejidos de corteza y de hojas viejas de las plantas a analizar. Por ello este procedimiento ha sido muy útil para los programas de saneamiento, cuarentena y certificación donde se ha implementado (Ruiz-Ruiz et al., 2009). Manejo y control El manejo de CLBV debe ser preventivo, debido a que los agente(s) se eliminan con dificultad por medio de las técnicas de saneamiento clásicas, la termoterapia y/o la aplicación de la técnica de MIV (Navarro et al., 1984; Navarro et al., 2002). Además, como se ha planteado anteriormente, este virus se transmite por injerto y a través de las semillas de citrange Troyer, kumquat Nagami y de naranjo agrio (Guerri et al., 2004). Por esta razón es necesario el empleo de yemas y semillas de cultivares cítricos sanos. Teniendo en cuenta estos aspectos, es imprescindible que se disponga de técnicas de diagnóstico que puedan ser incluidas en los programas de saneamiento, cuarentena y certificación comprendidos en el Sistema de producción de material de propagación certificado de cada país. La certificación del material vegetal para la obtención y protección del material de propagación y semillas libres de virus, es imprescindible para las estrategias de control sanitario de un país, de gran importancia entre los factores 20 CitriFrut

7 Revista CitriFrut, Vol. 27, No. 2, julio-diciembre, 2010 que pueden dar solución a las pérdidas relacionadas con las enfermedades de tipo viral (Llácer, 1978; Navarro, 1993; IIFT., 1996; Pérez et al., 2002, 2007; Krueger et al., 2005; Zamora et al., 2007). Consideraciones finales Los aspectos más importantes acerca de la caracterización y el diagnóstico de CLBV que se informan en esta revisión permiten discutir las ventajas e inconvenientes relacionados con las metodologías a seguir para el diagnóstico biológico y molecular, así como las medidas de manejo y control que deben aplicarse preventivamente en el sistema de producción de material de propagación certificado del país. En cuanto al diagnóstico molecular, se pueden aplicar varias técnicas de acuerdo con los recursos disponibles por cada laboratorio. En la eficiencia de estos resultados pueden influir el origen y tipo de muestra de los cultivares que se analicen. La PCR en tiempo real acoplado a la reverso transcripción es la técnica adecuada porque se obtienen resultados muy sensibles, ya que no sólo se puede detectar el virus sino cuantificarlo, incluso en aquellos cultivares como el naranjo Pineapple donde las concentraciones son mínimas y el análisis de hojas jóvenes mediante RT-PCR tradicional es errático. Entre los cultivares cítricos se han reportado solamente algunos patógenos entre ellos el CLBV que se transmiten a través de las semillas de varias especies de este cultivo. Debido a ello, se puede evitar la diseminación de agentes transmisibles por esa vía mediante el diagnóstico y la certificación de cultivares libres de patógenos, tanto a los árboles productores de semillas como a las plantas productoras de yemas para la reproducción de cultivares. También se ha informado que el saneamiento de cultivares portadores del CLBV mediante el MIV y/o por termoterapia, es complejo. Por estos motivos, es de vital importancia incluir métodos de diagnóstico altamente sensibles en los programas de saneamiento, cuarentena y certificación de Cuba, teniendo en cuenta la desigual distribución y baja concentración que presenta el virus en diferentes tejidos, según las épocas del año y periodos de desarrollo de las plantas. BIBLIOGRAFÍA Adams, M.J., G.P. Accotto, A.A. Agranovsky, M. Bar-Joseph, D. Boscia, A.A. Brunt, T. Candresse, R.H.A. Coutts, V.V. Dolja, B.W. Falk, G.D. Foster, D. Gonsalves, W. Jelkmann, A. Karasev, G.P. Martelli, M. Mawassi, R.G. Milne, A. Minafra, S. Namba, A. Rowhani, H.J. Vetten, V.K. Vishnichenko, G.C. Wisler, N. Yoshikawa, S.K. Zavriev, Family Flexiviridae. In: Fauquet, C.M., M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, and L.A. Ball, eds. Virus Taxonomy: VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press, London, UK, pp Castle, B. and E, Stover Update on use of Swingle Citrus Rootstocks. 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