INFORME FINAL: "DESARROLLO DE UNA MASA MADRE ESTANDARIZADA PARA PROCESO DE PANIFICACIÓN".

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1 \ INFORME FINAL: "DESARROLLO DE UNA MASA MADRE ESTANDARIZADA PARA PROCESO DE PANIFICACIÓN".

2 1. INTRODUCCIÓN. El proceso de panificación ha tenido una evolución paulatina en el tiempo, lográndose obtener, poco a poco, la información suficiente de modo de controlar las variables que afectan en la obtención de un producto final de calidad estandarizada. Un ejemplo del avance en la tecnología de elaboración del pan es el uso de la "masa madre" o "masa agria", la que es una práctica muy antigua y usual entre los industriales españoles y de otros países europeos como Francia, Italia y Alemania. En este proceso, una porción de masa fermentada es añadida a la masa panaria afectando positivamente a las propiedades reológicas y fermentativas de la masa y a la calidad del pan. La presencia de ciertos microorganismos en la masa hace que los productos elaborados con el uso de la misma, adquiere características especiales muy apreciadas por el consumidor, como olor y sabor al pan, además de contribuir a una mejor conservación. Pero el éxito de la masa madre sigue dependiendo, en gran medida, de la regularidad con la que se realice este proceso, ya que es afectada por muchos factores y su preparación no es un proceso ni regular ni estandar;izado, sino una práctica artesanal con muchas variantes. En Chile actualmente, el pan es uno de los alimentos más consumidos, encontrándose entre aquellas naciones con mayor consumo per cápita, nuestros fabricantes de pan, en general, han privilegiado sistemas más simples y menos trabajosos de fabricación, por lo que el pan obtenido tiene, generalmente, una fermentación incompleta, menos sabor y aroma del que debería tener, con la consiguiente desvalorización de este producto por el consumidor. Además, la aparición en el mercado nacional de nueva competencia para la panadería tradicional, como son los supermercados y estaciones de servicio "automarkets", a hecho necesario buscar nuevas alternativas para competir. Si bien, la elaboración del pan a partir de una masa madre es una práctica muy antigua, puede ser ocupado en nuestro país como una nueva tecnología, debido a las características que esta confiere al producto final. Los objetivos de este estudio son los siguientes: le> Estudiar los procesos de fermentación de levaduras, complementado con bacterias lácticas utilizados en masa madre. Desarrollar una masa madre para ser utilizada como cultivo o método de siembra en procesos de panificación.

3 2. PLAN DE TRABAJO 2.1. LÍNEA DE PROCESOS a) Masa madre nativa:.---1 Harina 1 lr l Agua S-al AMASADO' 1.FERMENTACIÓN :: 1 Harina 1 1 rr=l Agua 1 1 Sal 1 AMAsÁo'o i1

4 b) Masa madre con inoculación de lactobacilos y levaduras: FERMENTACIÓN' 1

5 2.2. METODOLOGÍAS a) Masa madre nativa: La primera masa elaborada (1) se debe fermentar durante 24 horas a 28 C y 85% de humedad relativa en una cámara de fermentación. A continuación la masa se "refresca", amasando una porción de la misma con igual cantidad de harina, agua y sal. La masa así obtenida (2) se fermenta durante 23 horas en condiciones idénticas a la masa anterior (1). Tras este tiempo una porción de la misma se "refrescó" de nuevo con harina, agua y sal, para obtener una tercera masa (3) la cual se deja madurar durante 22 horas también a 28 C y 85% de humedad relativa, tras las cuales la masa fermentada se "refresca" una tercera vez, amasando como en los casos anteriores, una porción de masa con harina, agua y sal. Esta nueva masa (4), debe fermentar durante 22 horas y se vuelve a amasar para obtener la masa correspondiente (5), que se puede considerar lista para su empleo en panificación tras 22 horas de fermentación a 28 C y 85% de humedad relativa. Se realizaron controles tanto al comienzo de la preparación como durante el proceso de fermentación. Los parámetros estudiados fueron recuento de levaduras, recuento de lactobacilos, medición de ph y acidez titulable contra tiempo de fermentación. b) Masa madre con inoculación de lactobacilos y levaduras: Se prepara una masa con harina agua y sal, a la que se le adiciona los lactobacilos (disueltos en agua sin cloro) y las levaduras, para conseguir una distribución uniforme en la masa madre. Luego los componentes se mezclan y se fermenta a una temperatura constante de 28 C. El proceso de elaboración termina después de 12 a 24 horas dependiendo de la acidificación deseada. Se realizaron controles tanto al comienzo de la preparación como durante el proceso de fermentación. Los parámetros estudiados fueron recuento de levaduras, recuento de lactobacilos, medición de ph y acidez titulable contra tiempo de fermentación.

6 3.RESULTADOS En el Laboratorio de cereales de la IAT A se efectuaron las siguientes pruebas: 3.1. Proceso de elaboración de pan (método directo): Formulación: Ingrediente Harina Agua Sal Levaduras deshidratadas Acido ascórbico Cantidad 3 Kg 1.66 Kg 36 gr 23.5 gr. 100 mg TABLA 1: Registros de temperatura ambiental, en el centro de la masa, y el nivel de volumen alcanzado por la masa durante la fermentación. TIEMPO TEMPERATURA TEMPERATURA EN NIVEL ALCANZADO EN A V *2(*) (min) AMBIENTAL ("C) EL CENTRO DE LA EL VOLUMENÓMETRO o 27 MASA ("C) (*) DiferenCia entre el volumen med1do y el antenor Como se puede observar, existe un aumento de volumen de la masa durante el proceso de fermentación, lo cual es un comportamiento lógico. También se pudo demostrar que el proceso de fermentación es exotérmico, es decir genera calor; las temperaturas en el centro de la masa aumenta durante el proceso de fermentación.

7 3,5 3 e G) 2,5 E :S o 2 > G) 1,5 'D...: i:5 1 0,5 o Tiempo (m in) Figura 1: Aumento del volumen de una masa de pan elaborada por el método directo durante el proceso de fermentación. De acuerdo con los antecedentes bibliográficos, los niveles de volumen obtenidos se encuentran dentro de los rangos esperados para una masa de estas características.

8 3.2. Proceso de elaboración de pan con masa madre nativa: Formulación de la Masa Madre nativa: Las experiencias efectuadas en el Laboratorio de cereales de la lata, fueron de gran provecho y sirvieron de base para las experiencias realizadas en la escuela de Alimentos de la universidad Católica de Valparaíso. Masa madre Refresco Ingredientes Cantidad Ingredientes Cantidad Harina 3 Kg Harina 1 Kg Agua 1.8 Lt Agua 600 gr Sal 15 gr Sal 5 gr TABLA 11: Resultados de recuentos microbiológicos registrados durante la fermentación de una masa madre. Tiempo R. Total Coliformes Coliformes Levaduras Lactobacilos {hrs) A35 C Totales fecales 24 C UFC/g NMP/g NMP/g UFC/g UFC/g o < > > > <3 300 > Corresponde al refresco de la masa en donde se dobla la cantidad de masa con 1ngred1entes que se agregan en la misma proporción con que se hizo al principio. Hubo un crecimiento acelerado de los lactobacilos, mientras que las levaduras se desarrollaron en forma más lenta. Esto pudo deberse al hecho de que las proporciones iniciales de cada microorganismo fue de 1: 1. De esta manera, y dado a que cada microorganismo posee su propio metabolismo y requiere condiciones de desarrollo específicas, se desarrollaron más los lactobacilos impidiendo que las levaduras crecieran al consumir del medio los nutrientes necesarios. Cabe destacar que el refresco realizado en esta oportunidad no fue el adecuado, pues se adicionó una cantidad inferior de masa "fresca" en relación a la que había; se debe recordar que el refresco debe efectuarse en una proporción de 1: 1 = masa semifermentada: refresco.

9 TABLA 111: Resultados de ph y acidez obtenidos en la elaboración de masa madre nativa. Tiempo ph mi de NaOH 0.1 N % ácido láctico (hrs) x 100 gr o corresponde al refresco de la masa en donde se dobla la cant1dad de masa con ingredientes que se agregan en la misma proporción con que se hizo al principio. Hubo un aumento de ph y acidez muy por encima de lo normal. La masa presentaba signos de haber seguido una fermentación butírica por el olor, se licuó probablemente debido al exceso de crecimiento de los lactobacilos, los que además deben haber ejercido una actividad proteolítica acentuada. 5,5 6 0,8 0,7 0,6 5 0,5 :I: Q. 0,4 4,5 0,3 4 0,2 0,1 3,5 o o Tiempo (min) -.-ph -+-Acidez(% A. láctico) 1 Figura 2: Variación de la acidez, expresada como% de ácido láctico, y el ph de una masa madre incubada a 28 C por 3 días, con la aplicación de un refresco. Queda de manifiesto que las condiciones ambientales pueden afectar en gran medida el proceso de fermentación, por lo que los controles deben ser rigurosos.

10 La masa inicial presentó buenas características desde el punto de vista sanitario; los niveles de coliformes se encuentran dentro de los límites aceptados. Dado estos resultados, se efectuó una segunda masa madre nativa, variando la temperatura de incubación y las proporciones de los refrescos. Los resultados son: Formulación de la masa madre nativa: Masa madre Refresco Ingredientes Cantidad Ingredientes Cantidad Harina 2.5 Kg Harina 925 gr Agua 1.5 Lt Agua 550 gr Sal 12.5gr Sal 4.6 gr Masa madre 1.5 Kg TABLA IV: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa, y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre nativa. Tiempo Temperatura de Temperatura ph (hrs) incubación ( 0 C) centro de la masa o (OC) Refresco Refresco Refresco o

11 ,5 25 ID 3 "g ID e iil =a 4,5 15 :;: 4., 10 o -::::1 3 11> > 3, o - 3 o o Tiempo (hrs) Figura 3: Variación de ph de masa madre incubada a 28 C, con periodos intermedios de refrigeración a 10 C. Los resultados obtenidos indican que se ha producido una correcta fermentación por parte de los microorganismos nativos de la masa madre elaborada, los refrescos fueron adecuados, aportando los nutrientes necesarios para que se produzcan las reacciones metabólicas que originan las características propias de una masa madre. Se ha podido determinar que la fermentación se retarda al incubar la masa a temperaturas de refrigeración. Idealmente, los refrescos tendrían que haberse realizado cada 8 horas de incubación a 28 C, lo que en la práctica no se pudo realizar. Sin embargo, este resultado puede ser útil y aplicado en forma industrial, optimizando así el proceso de fabricación de pan según lo requiera el fabricante considerando su propia organización. Luego de estas pruebas, se elaboraron 3 masas madres nativas de igual formulación sin obtener resultados concluyentes y comparables a la prueba anterior, debido a la dificultad que presenta este proceso ante la eventual estandarización por la influencia de las variables ambientales propias del lugar, así como las variables biológicas intrínsecas involucradas.

12 3.3. Masa madre inoculada con Lactobacillus brevis y levaduras Formulación 1: Masa madre Ingredientes Cantidad Harina 3 Kg Agua 1.8 Lt Sal - Lactobaci/lus brevis 0.3 gr. Levadura seca instantánea 0.03 gr De acuerdo con los antecedentes bibliográficos, no se emplea refrescos cuando se preparan masas madre con inoculación de lactobacilos. Esto es debido a la pérdida de viabilidad de las bacterias ácido lácticas, el riesgo de proteólisis durante la fermentación y el de contaminación microbiológica. Se le denomina "fermentación en una sola etapa" durante diferentes periodos según el grado de acidez deseado. El uso adecuado de los iniciadores evita las fases críticas y la incertidumbre de la preparación de una masa madre nativa, aunque no siempre son bien aplicados. TABLA V: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacillus brevis y levaduras. Tiempo Temperatura de Temperatura centro de ph (Hrs) cámara incubación ( C) la masa ec) o

13 6,00 33,0 5,50 5,00 J: 4,50 o ,0 CD 3 "' -ii1 - ii1 o n 23,0 CD 18,0 e: 13,0 - -CD :S 4,00 8,0 o 3,50 3,00-2,0 o Tiempo (Hrs) 3,0 3 DI U) DI j-ph ~ra centro masa j Figura 4: Variación del ph y temperatura del centro de una masa madre inoculada con Lactobacil/us brevis en una concentración del 0.01% y levadura en 0.001%. Como se puede observar en la gráfica anterior, se produce una disminución del ph hasta niveles aceptables en etapas tempranas de fermentación, y este ph se mantiene dentro de los niveles adecuados durante periodos cortos de almacenamiento a temperaturas de refrigeración Formulación 2: Masa madre Ingredientes Cantidad Harina 3 Kg Agua 1.8 Lt Sal - Lactobacillus brevis 0.3 gr. Levadura seca instantánea 0.03 gr

14 TABLA VI: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacil/us brevis y levaduras. Tiempo Temperatura de Temperatura centro de ph (HrS) cámara incubación ( 0 C) la masa ( C) o ,0 30,0 5,5 25,0-1 m 3-5,0 20,0 -e i 4,5 15,0 ~ -a 4,0 10,0 i!.. 3,5 5,0 ~ o Trempo(Hr) 1-+-pH -+-r centro masa 1 Figura 5: Variación de ph y temperatura en el centro de una masa madre inoculada con Lactobacillus brevis en una concentración de 0.01% y levaduras en un 0.001%. Comparando estos resultados con los de la experiencia anterior se observan diferencias en la evolución del ph. Esto pudo deberse al hecho de que en este caso la masa madre se almacenó a temperatura de refrigeración por un tiempo mayor (2 horas más). De esta manera, a las 24 horas de proceso los ph registrados son diferentes en más de 1 punto. Factores como la temperatura de almacenamiento, la calidad del iniciador, distribución de los lactobacilos y

15 levaduras en la masa influyen en gran medida en la obtención de una masa madre con las características deseadas. En este caso, y considerando la información entregada por el proveedor de los iniciadores así como la de los antecedentes bibliográficos, el ph considerado como óptimo para una masa madre en general se encuentra en el rango de 4 a 4.5. Al adicionar iniciadores, se está reduciendo factores de riesgo y, por lo tanto, existiría una mayor probabilidad de lograr repeticiones uniformes en los procesos aplicados. TABLA VIl: Variación del % de acidez, recuento de lactobacilos y levaduras en masa madre inoculada Acidez titulable Recuento de levaduras Recuento de lactobacilos (% ácido láctico) (UFC/gr) (UFC/gr) < "" ;:u < o n 1400 iii o Cl) C" (! ::J!!. "O ftl 800 o Cl) > CD J o 0:: > Cll 200 o o Tiempo (hr) 1-- R. Levaduras (ufc/gr} --R. Lactobacilos (ufc/gr} 1 Figura 6: Crecimiento de levaduras y lactobacilos en masa madre inoculada con 0.01% L. brevis y 0.001% levaduras, mantenida a 28 C por 6 horas y 18 a temperatura de refrigeración. o..

16 El comportamiento general de los lactobacilos comienza con un desarrollo rápido en el comienzo de la fermentación para luego disminuir. Esta disminución de las bacterias ácido lácticas en las etapas tardías de la fermentación se debe a la acción inhibitoria de sustancias producidas por su propio metabolismos, como por ejemplo el etanol, ácidos orgánicos y polipéptidos de carácter antibióticos, a la disminución de la disponibilidad de nutrientes y a la falta de oxígeno. Sin embargo, el último recuento registrado es anómalo pues debería haberse mantenido la concentración de lactobacilos, o haber disminuido levemente. Esta anomalía se debe a una mala distribución del inóculo dentro de la masa. Por su parte, la teoría indica que las levaduras presentan un crecimiento inicial más lento que el de los lactobacilos, lo que se refleja en los resultados; los recuentos de levadura son siempre inferiores a los de los lactobacilos, y con una tendencia menos pronunciada que éstos. De acuerdo con lo anterior, el comportamiento observado de crecimiento de levaduras y lactobacilos en esta experiencia concuerda con la teoría. ~ < o... 0,6.. 1/) 0,5 l! ~ IV "' > 0,8 30 0,7 25 0,4 Cll 0,3 0:: 0,2 5 O, 1 o o Tiempo (hr) 1--+-% acidez -R. Levaduras (ufc/gr) 1 20 ~ )> 15 ~- Q. CD 10 N Figura 7: Variación de la acidez y recuento de levaduras en masa madre inoculada con 0.01% L. brevis y 0.001% levaduras, mantenida a 28 C por 6 horas y 18 a temperatura de refrigeración.

17 , ,8 10 < 1600 () 0,7... «1400 0,6 o 1/1 ; ::: g ,5 ~ u e 0,4 i S 800 N u 600 0,3.!!! a: 400 0, ,1 o o o Tiempo (hr) 1-- R. Lactobacilos (ufc/gr) --%acidez 1 Figura 8: Variación de la acidez y recuento de lactobacilos en masa madre inoculada con 0.01% L. brevis y 0.001% levaduras, mantenida a 28 C por 6 horas y 18 a temperatura de refrigeración. En las gráficas anteriores se observa que el crecimiento de levaduras y lactobacilos van directamente relacionados con el aumento de la acidez del medio. Considerando que la acidez de la harina se encuentra cerca de 0.21 %, los niveles alcanzados reflejan un aporte del crecimiento microbiano a esta variable. Además, los resultados graficados confirman el hecho de que el último recuento de lactobacilos es anómalo pues el nivel de acidez no es tan elevado como para demostrar una mortalidad excesiva de estos microorganismos. En relación con las evaluaciones sensoriales, se empleó un panel semi-entrenado compuesto por 6 jueces evaluadores. Se diseñó una cartilla especial para la evaluación del pan (ver ANEXOS), en que se consideraron los siguientes porcentajes para cada característica de calidad en particular:

18 TABLA VIII: Ponderaciones asignadas a cada característica de calidad evaluada en los paneles sensoriales. CARACTERISTICA PORCENTAJE Aroma 30% Sabor 35% Comestibilidad 10% Características de la miga 15% Color de la corteza 5% Apariencia general 5% Se le ha dado mayor importancia a las características de aroma y sabor, así como las características de la miga, por ser estas las variables que más denotan la presencia de lactobacilos a la masa y son más detectables por el consumidor. Por su parte, la baja ponderación de las variables de color de corteza y apariencia general de debe a las características de horno utilizado. Además, cada muestra en ensayo fue contrastada con un pan elaborado por el método tradicional, de modo de evidenciar y cuantificar las posibles diferencias. De esta manera, "la muestra de análisis" es aquella que en este caso consiste en un pan elaborado a partir de masa madre inoculada con Lactobacillus brevís y levadura, y "la muestra control" es un pan elaborado por el método tradicional. La escala es de 1 a 5, con un rechazo en la nota 3. A continuación se resumen los resultados parciales y los promedios ponderados de las evaluaciones hechas por los jueces.

19 TABLA IX: Resultados de la evaluación sensorial al pan preparado a partir de la masa madre inoculada con Lactobacillus brevis y levaduras. Muestra en análisis Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP NP Control Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP NP Tanto la muestra en análisis como la muestra control presentaron la misma nota promedio ponderada final (3.2), lo que nos indica que, en general, existe la misma preferencia por una muestra y otra. Sin embargo, realizando un análisis parcial de las características de calidad, se puede observar que en variables como aroma y color la muestra con lactobacilos presentó una mejor evaluación por parte de los jueces, mientras que en la evaluación de las características de la miga, comestibilidad y apariencia general hubo una peor puntuación de ésta. Ninguna de las dos muestras fue rechazada, aún cuando se encuentran muy cercanas a la nota de rechazo. También se le aplicó un análisis de varianza (ANOVA) a los resultados anteriores, de modo de evaluar estadísticamente si existe una diferencia significativa entre una muestra y otra. El estadístico de prueba es ei"f" de FISHER (F 1 -<X(k-1;k(n-1)), en que a es el nivel de confianza del 95%, k es 2 (muestra control y muestra de análisis) y n es 6 (6 jueces evaluadores). De esta forma, el estadístico de prueba es Fo.os(1; 1 O), que por tabla equivale a

20 Se establecen las hipótesis, las que son: Ho: No existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacillus brevis y la muestra control. H1: Existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacillus brevis y la muestra control. Y se rechaza la hipótesis nula (Ho) cuando el Fteórico < Fcalculado Resta calcular el "F" de la experiencia (Fcalculado). el cual es: TABLA X: Resultados parciales del análisis de varianza para la determinación de la diferencia significativa entre la muestra con Lactobacil/us brevis y muestra control. Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Prueba F variación Cuadrado Libertad Medios Tratamientos Residuos Total El Fteórico resultó ser mayor que el Fcalculado, por lo que se acepta la hipótesis nula, esto es, no existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacillus brevis y la muestra control.

21 3.4. Elaboración de pan a partir de masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum Formulación masa madre: Ingrediente Cantidad Harina 3KQ. Agua 1800 ce. Lactobacillus plantarum 0.3 gr. Levadura seca instantánea 0.03 gr. TABLA XI: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum y levaduras. Tiempo Temperatura de Temperatura centro de ph (Hrs) cámara incubación ( C) la masa COC) o 28 27,6 5, ,1 5, ,2 5, ,1 5, ,1 5, ,2 5, ,5 5, ,6 5, ,7 5, ,9 4, ,1 4, ,2 4,2

22 5,5 5 4, " 15 ñ! ~a a. 10 ~ 5 3 Al o Tiempo (hrs) 1---pH T" centro masa 1 Figura 9: Variación de ph de masa madre incubada a 28 C, con una refrigeración final a 10 C. 30 De acuerdo con los resultados de ph registrados, se ha logrado una fermentación correcta aplicando 8 horas de fermentación a 28 C, 16 horas de refrigeración y una restauración de la actividad microbiana a 28 C para la posterior elaboración del pan. Este antecedente nos indica que los niveles de lactobacilos y levaduras adicionados son los adecuados.

23 Formulación masa madre: Ingrediente Harina Agua Lactobacillus plantarum Levadura seca instantánea Cantidad 2Kg ce. 0.2 gr Qr. TABLA XII: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum y levaduras. Tiempo (Hrs) o Temperatura de Temperatura centro de cámara incubación ( C) la masa ( C) 28 28, , ph 5,75 5, ,5 5 i 4,5 4 3, ~ 3 'i 20 i e iil -n 15 0 CD -a a 10 Ir o ~ ~ ~ 1~ Tiempo (hrs)... ph -+-T" centro masa 1

24 Figura 10: Variación de ph de masa madre incubada a 28 C, con una refrigeración final a 10 C. En esta experiencia, se mantuvo la masa madre por un tiempo superior al ensayado con anterioridad, logrando estabilizar la flora microbiana propia de este producto durante 6 días. Se logra nuevamente un resultado positivo del proceso de fermentación, registrándose además valores de acidez, recuento de levadura y lactobacilos (ver tabla siguiente}. TABLA XIII: Variación del% de acidez, recuento de lactobacilos y levaduras en masa madre inoculada Acidez titulable Recuento de levaduras Recuento de lactobacilos (% ácido láctico) (UFC/gr) (UFC/gr} < > Los últimos resultados registrados significan que el recuento de levaduras disminuyó a niveles inferiores a 3 * 10 6 (ufc/gr}, mientras que los lactobacilos presentaron un crecimiento superior a 3 * 10 8 (ufc/gr}. Sin embargo, dado que no contamos con el resultado exacto, no se construyeron los gráficos respectivos. Los niveles de levaduras y lactobacilos alcanzados antes del cambio de condiciones se encuentran dentro del rango esperado e indicado por el proveedor de cepas liofilizadas. Estos resultados reflejan también que tanto las levaduras como los lactobacilos se mantienen estables en condiciones de refrigeración, y que se produce un mayor aporte a la acidez por parte de los lactobacilos que de las levaduras, debido a que una vez que se inicia el proceso de fermentación, se producen los metabolitos ácidos de las reacciones metabólicas de las levaduras y lactobacilos adicionados a la masa.

25 Formulación masa madre: Se realiza esta experiencia para corroborar los resultados anteriores y efectuar una evaluación sensorial. Ingrediente Harina Agua Lactobacillus plantarum Levadura seca instantánea Cantidad 2Kg ce. 0.2 gr gr. TABLA XIV: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum y levaduras. Tiempo Temperatura de Temperatura centro de ph (Hrs) cámara incubación ( C) la masa ( Cl o 28 29,3 5, ,4 5, ,9 5, , ,7 5, ,6 5, ,7 4, ,7 4, ,1 4, ,6 4, ,9 4, , ,1 4, ,6 4, ,5 4,45

26 6 30 ~ 5, "' CD iil e iil _n i 4,5. 15 CD o a -... o a CD Di' 3 3, (IJ o o Tiempo (hr) ph --+- T" centro masa 1 Figura 11: Variación de ph de masa madre incubada a 28 C, con refrigeraciones intermedias a 10 C. TABLA XV: Porcentaje de acidez, recuento de lactobacilos y levaduras en masa madre inoculada luego de 7 horas de incubación a 28 C, refrigeración intermedia de 17 horas e incubación final de 3 horas a 28 C. Acidez titulable Recuento de levaduras Recuento de lactobacilos (% ácido láctico) (UFC/gr) (UFC/gr) 0.61 < * ' Se obtiene un resultado acorde con lo esperado.

27 Se efectuó una evaluación sensorial de las muestras inoculadas, comparándolas con una muestra control que consistió en una pan de formulación standard elaborado por el método tradicional. Los resultados son: TABLA XVI: Resultados de la evaluación sensorial al pan preparado a partir de la masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum y levaduras. Muestra en análisis Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP , , , , , ,7 NP 4,2 3,5 3,7 4,0 4,0 4,3 3,9 Control Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP , , , , , ,6 NP 3,8 3,5 3,0 4,3 4,0 3,7 3,7 Tal como se indica en la tabla anterior, se prefiere la muestra inoculada con lactobacilos (nota final 3.9) que la muestra control (nota final 3.7), aunque las diferencias no son muy notorias. Sin embargo, existen diferencias notorias en la evaluación parcial de ciertas características de calidad, como por ejemplo el aroma, cuya diferencia de puntuación es considerable; esta diferencia se debe a los aromas generados en la fermentación por medio de bacterias lácticas. También hubo una mejor evaluación de la muestra control, aunque menos importante, en las características de calidad como la comestibilidad y la apariencia

28 general. Por su parte no hubo una diferencia marcada en variables como el sabor y el color, y se prefirió propiedades de la miga de la muestra control. También se le aplicó un análisis de varianza {ANOVA) a los resultados anteriores, de modo de evaluar estadísticamente si existe una diferencia significativa entre una muestra y otra. El estadístico de prueba es el "F" de FISHER {F1-.x{k-1 ;k{n-1)), en que a es el nivel de confianza del 95%, k es 2 (muestra control y muestra de análisis) y n es 6 (6 jueces evaluadores). De esta forma, el estadístico de prueba es Fo.os{1; 1 O), que por tabla equivale a Se establecen las hipótesis, las que son: H 0 : No existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacil/us brevis y la muestra control. H( Existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacil/us brevis y la muestra control. Y se rechaza la hipótesis nula {Ho) cuando el F1eórico < Fcalculado Resta calcular ei"f" de la experiencia {Fcalculado), el cual es: TABLA XVII: Resultados parciales del análisis de varianza para la determinación de la diferencia significativa entre la muestra con Lactobacillus plantarum y muestra control. Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Prueba F variación Cuadrado Libertad Medios Tratamientos Residuos Total Como < 0.201, se acepta la hipótesis nula, esto es que según la opinión de los jueces evaluadores, no existe una diferencia significativa entre la muestra inoculada con Lactobacillus plantarum y la muestra control, con un nivel de confianza del 95%.

29 3.5. Elaboración de pan a partir de masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum y Lactobacillus brevis Formulación masa madre: Ingrediente Harina Agua Lactobacillus brevis Lactobacillus plantarum Levadura seca instantánea Cantidad 3 Kg. 1.8 Kg gr gr gr. TABLA XVIII: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y levaduras mantenida a 28 C por 16 horas. Tiempo Temperatura de Temperatura centro de ph (Hrs) cámara incubación ( C) la masa ( C) o TABLA XIX: Variación del % de acidez, recuento de lactobacilos y levaduras en masa madre inoculada Acidez titulable Recuento de levaduras Recuento de lactobacilos (% ácido láctico) (UFC/gr) (UFC/gr) La masa obtenida se deterioró, quedando liquida y con malos olores típicos a una fermentación excesiva. Esta experiencia indica que la fermentación en incubación a 28 C por 16 horas es muy prolongada y se requiere de una refrigeración intermedia de la masa. Se volvió a repetir la experiencia, empleando la misma formulación antes mencionada, teniendo la precaución de refrigerar la masa madre

30 TABLA XX: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y levaduras, la que fue mantenida a 28 C por un periodo inicial, luego a 6 C y, finalmente a 28 C previo el horneo. Tiempo Temperatura de Temperatura centro de ph (Hrs) cámara incubación ( C) la masa (OC) o

31 6 35 -t 5,5 30 CD 3 'ti CD 25 iil 5 -e iil 20 n -CD o :S a 4,5 o_ 1s- a a. CD 4 10 ; 3 DI 3,5 Ul 5 DI 3 o o Tiempo (hr) ph -+--Temperatura centro de la masa ( C) 1 Figura 12: Variación de ph de masa madre incubada a 28 C, con refrigeraciones intermedias a 10 C Formulación masa madre: Ingrediente Harina Agua Lactobacillus brevis Cantidad 2 Kg. 1.2 Kg. 0.1 gr. Lactobacillus IJ/antarum 0.1 ar. Levadura seca instantánea 0.02 gr.

32 TABLA XXI: Registros de temperatura ambiental y del centro de la masa y ph alcanzado por la masa durante la elaboración de masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum, Lactobacillus brevis y levaduras, la que fue mantenida a 28 C por un periodo inicial, luego a 6 C y, finalmente a 28 C previo el horneo. Tiempo (Hrs) o Temperatura de cámara incubación ( C) Temperatura centro de la masa ( C) ,2 26,9 26,7 26,9 26,9 27,0 27,2 9,1 16,6 21,6 ph 5,67 5,42 5,36 5,32 5,26 4,94 4,93 4,93 4,87 4,36 4, , ~ 4,5 4 3,5 n 15 ~! -a Q. 10 ID 3 DI 5 : 3 o Tiempo (hr) /--ph -+-T" centro masa / Figura 13: Variación de ph de masa madre incubada a 28 C, con una refrigeración intermedia a 10 C.

33 En este gráfico se puede observar que durante el tiempo de incubación refrigerado se produce una estabilidad en los valores de ph, los que luego de restaurar la temperatura a 28 C desciende rápidamente a valores esperados. TABLA XXII: Variación del% de acidez, recuento de lactobacilos y levaduras en masa madre inoculada, incubada por 7 horas a 28 C, un periodo de refrigeración de 17 horas de refrigeración y restauración de temperatura a 28 C por 3 horas. Acidez titulable Recuento de levaduras Recuento de lactobacilos (% ácido láctico) (UFC/gr) (UFC/gr) 0.23 < ,34 * < * ' * 10' 3 21 * 10!* Cl) < o... « ) 0,6 "#..2 u 600 0,5!l > 111 CL.a CD 0,4 N -o u 400 ~ 111! 200 o o Tiempo (hrs) 0,9 0,8 0,7 0,3 0,2 O, 1 o j-o-r. Lactobacilos(ufclgr) -o-%acidez \ Figura 14: Variación de la acidez y recuento de lactobacilos en masa madre inoculada con 0.005% L. plantarum, 0.005% L. brevis y 0.001% levaduras, mantenida a 28 C por 7 horas y 17 a temperatura de refrigeración.

34 El último resultado de recuento de lactobacilos se encuentra fuera del rango normal de la actividad de dicho microorganismos por lo que se piensa que la masa no se encontraba bien mezclada provocándose un crecimiento disparejo. TABLA XXIII: Resultados de la evaluación sensorial al pan preparado a partir de la masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y levaduras. Muestra en análisis Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP , , , , , ,3 NP 3,0 3,3 2,2 3,2 2,2 3,7 3,1 Control Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP , , , , , ,4 NP 3,2 3,5 2,7 3,5 4,0 4,2 3,4 De acuerdo con los resultados de esta evaluación sensorial, se prefiere la muestra control por sobre la muestra inoculada con L. plantarum y L. brevis; hubo una peor evaluación en todas las características de calidad consideradas. También se le aplicó un análisis de varianza (ANOVA) a los resultados anteriores, de modo de evaluar estadísticamente si existe una diferencia significativa entre una muestra y otra. El estadístico de prueba es el "F" de FISHER (F 1 -a(k-1 ;k(n-1)), en que a es el nivel de confianza del 95%, k es 2 (muestra control y muestra de análisis) y n es 6 (6 jueces evaluadores). De esta forma, el estadístico de prueba es Fo.os(1; 1 0), que por tabla equivale a Se establecen las hipótesis, las que son:

35 H 0 : No existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacillus brevis y la muestra control. H 1 : Existe diferencia significativa entre la muestra con Lactobacil/us brevis y la muestra control. Y se rechaza la hipótesis nula (Ho) cuando el Fteórico < Fcalculado Resta calcular el "F" de la experiencia (Fcalculado), el cual es: TABLA XXIV: Resultados parciales del análisis de varianza para la determinación de la diferencia significativa entre la muestra con Lactobacillus p/antarum, Lactobacillus brevis y muestra control. Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Prueba F variación Cuadrado Libertad Medios Tratamientos Residuos Total Como > 0.201, se rechaza la hipótesis nula, es decir que existe diferencia significativa entre la muestra elaborada a partir de una masa madre inoculada con una mezcla de lactobacilos y la muestra de pan de formulación tradicional elaborada por el método directo, según los jueces evaluadores y con un nivel de confianza del 95%. Comparación entre los panes elaborados con los diferentes tipos de masa madre. Jueces Nota final A Nota final B Nota final C NF A: Pan elaborado a partir de masa madre inoculada con L. brevis. 8: Pan elaborado a partir de masa madre inoculada con L. plantarum. C: Pan elaborado a partir de masa madre inoculada con L. plantarum y L. brevis.

36 Una vez finalizadas las pruebas pilotos, en las que se estandarizó el proceso de elaboración de una masa madre inoculada con Lactobacillus sp. (L. brevis y L. plantarum) y se determinó que de las cepas que aportaba mayores diferencias al producto final fue L. plantarum, se realizaron pruebas a escala semi-industrial. Los objetivos planteados para estas pruebas semi-industriales fueron: 1. comprobar si existen diferencias entre el producto obtenido por medio de las pruebas pilotos y aquel que se obtendría a mayor escala. 2. Observar las diferencias entre el producto obtenido por medio de un proceso ininterrumpido de fermentación y aquel aplicado durante las pruebas piloto. 3. Evaluar si existe una diferencia perceptible entre productos de panificación elaborados con diferentes proporciones de masa madre. 4. Evaluar la diferencia entre los productos elaborados con una masa de pan preparada con una cantidad constante de masa madre y cantidades variables de levadura. Los resultados son los siguientes: Objetivo 1: Elaboración de masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum (0.01%) y levadura (0.001%) en una cantidad semi-industrial con. Formulación masa madre: Ingredientes Cantidad Harina 10 Kg. Agua 6000 ce. Lactobacillus plantarum 1 gr. Levadura seca instantánea 0.1 gr. Peso final de la masa madre 16 Kg. Se monitorearon las variables del proceso, las que se resumen en la siguiente tabla.

37 o Tiempo de fennentac:ión (hrs) -ph centro de la masa --iir- Ph periferia de la masa Figura 15: Variación del ph del centro de la masa y de la periferia de la masa madre inoculada con 0.01% de L. plantarum y 0.001% de levaduras fermentada a 28 C. Tabla XXVIII: Variación de la acidez, recuento de lactobacilos y levaduras de la masa madre elaborada con Lactobacillus plantarum (0.01%) y levadura (0.001%), fermentada durante 7 horas a 28 C, refrigerada por 15 horas a 7 C con una reactivación final de 7 horas a 28 C. Acidez titulable Recuento de levaduras Recuento de lactobacilos (% ácido láctico) (UFC/gr) (UFC/gr) O, x10 4 0, x10 0, x10~ 0, x10'u Tal como se observa en la figura siguiente, se produce un aumento de la acidez en el transcurso de la fermentación, debido al aporte de metabolitos ácidos generados por los lactobacilos y las levaduras.

38 Se empleó el mismo método anterior, en que las hipótesis son: Ha: No existe diferencia significativa entre las muestras inoculadas con Lactobacillus sp. y su mezcla. H( Existe diferencia significativa entre las muestras inoculadas con Lactobacil/us sp. y su mezcla. Y se rechaza la hipótesis nula (Ha) cuando el Fte6rico < Fcarculado Resta calcular el "F" de la experiencia (Fcarculado), el cual es: TABLA XXV: Resultados parciales del análisis de varianza para la determinación de la diferencia significativa entre la muestra con Lactobacil/us plantarum, Lactobacillus brevis y muestra control. Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Prueba F variación Cuadrado Libertad Medios Tratamientos Residuos Total En este caso el Fte6rico es Fa.as(2; 15), el que por tabla es De esta manera, > 0.272, lo que nos indica que se rechaza la hipótesis nula. De acuerdo con este resultado y los jueces evaluadores, existe diferencia entre las diferentes muestras analizadas con un nivel de confianza del 95%, prefiriéndose aquella que se elaboró a partir de masa madre inoculada con L. plantarum, luego la con L. brevis y, por último, la con mezcla de ambos lactobacilos, aunque estos últimos poseen una diferencia muy estrecha. En relación a esto último, y según las observaciones hechas por los propios jueces evaluadores, la muestra que fue elaborada con L. brevis poseía un fuerte olor y sabor desagradable, por lo que se invierte el orden de preferencia entre ésta y aquella con la mezcla de lactobacilos.

39 TABLA XXVI: Registro de las temperaturas de la harina, agua, del ambiente y de la masa luego del batido, durante el proceso de elaboración de masa madre a escala semi-industrial. Variables del proceso Temperatura de la harina 16 C Temperatura del agua 15 C Temperatura ambiental 17 C Temperatura de la masa al 22 C término del batido Estas temperaturas corresponden a las alcanzadas durante la fabricación de masa madre en panaderías tradicionales; las condiciones de temperatura final de la masa madre, luego de un batido menos prolongado, no sobrepasan los 28 C. TABLA XXVII: Registros de temperatura ambiental, del centro de la masa y ph alcanzado por la masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum (0.01%) y levaduras (0.001%) durante su fermentación. Tiempo Temperatura de (Hrs) cámara incubación ( 0 C) o (*) C: Centro de la masa. (**) 0: Orillas de la masa. Temperatura de la ph masa ( 0 C) C("} 0(""} C("} 0("") Los tiempos de fermentación no varían considerablemente al aumentar las proporciones de fabricación de masa madre en 5 veces. La temperatura de la masa fue homogénea, sin embargo el ph presenta una gradiente desde el centro de la masa hasta su periferia, el cual llega al equilibrio al término del proceso de fermentación.

40 0,5 0,4, ~ 0,3 ~ ~ 0,2 0,1 o Tlefl1)0 (lts) 1-+-Acidez 1 Figura 16: Variación de la acidez (expresado como ácido láctico) durante la fermentación de una masa madre inoculada con Lactobaci/lus plantarum (0.01%) y levaduras (0.001%) en ~ ;; ~ 80 n 111 oot.q < e e o o "T!ftl o:s ~... j\. ;S' 60,_ o~ IL o Dí 5;:::: > Q. 40 e :S ii1 () &! o o Tiempo de fermentación (Hrs) o (/1 --.-Recuento de Lactobacilos (UFC/gr) ~Recuento de levaduras (UFC/gr) 1 Figura 17: Crecimiento de los lactobacilos y levaduras durante la fermentación de la masa madre inoculada con 0.01% de L. plantarum y 0.001% de levadura.

41 El crecimiento de levaduras y lactobacilos se encuentra acorde con los antecedentes bibliográficos recogidos; el desarrollo, tanto de las levaduras como de los lactobacilos, es el aconsejado por el proveedor. Los resultados sensoriales del pan elaborado con esta masa madre se muestran en el objetivo 3.

42 Objetivo 2: Elaboración de masa madre con Lactobacillus plantarum (0.01% y levaduras (0.001%) con un proceso de 11 horas a 28 C. Formulación masa madre: Ingredientes Harina Agua Lactobacillus plantarum Levadura seca instantánea Peso masa madre final Cantidad 10 Kg ce. 1_gr. 0.1 gr. 16 Kg. TABLA XXIX: Registro de temperaturas de la harina, agua, ambiente y masa madre luego del batido. Variables del proceso Temperatura harina 16 C Temperatura agua 15 C Temperatura ambiental 17 C Temperatura salida del batido 22 C TABLA XXX: Registros de temperatura ambiental, del centro de la masa y ph alcanzado por la masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum (0.01%) y levaduras (0.001%). (Primer duplicado). Tiempo (Hrs) Temperatura de cámara incubación ( C) o (*) C: Centro de la masa. (**) 0: Orillas de la masa. Temperatura de la ph masa_(dcj C(*) 0(**) C(*) O(**)

43 J: 6,1 6 5,9 a. 5,8 5,7 5,6 o Tiempo de fermentación (Hrs) 1-+-pH centro de la masa --ph periferia de la masa 1 Figura 18: Variación del ph en el centro y periferia de la masa madre inoculada con L. plantarum (0.01%) y levadura (0.001%) durante la fermentación a 28 C por 11 horas. Luego de 11 horas de fermentación a 28 C no se alcanza el ph final óptimo, de 4.0 a 4.5. TABLA XXXI: Registros de temperatura ambiental, del centro de la masa y ph alcanzado por la masa madre inoculada con Lactobacil/us plantarum (0.01%) y levaduras (0.001%). (Segundo duplicado) Tiempo (Hrs) Temperatura de cámara incubación ( C) o (*) C: Centro de la masa. (**) O: Orillas de la masa Temperatura de la ph masa ( C) C(*) 0(**) C(*) 0(**)

44 6,1 6 5,9 :z:: Q. 5,8 5,7 5,6 o Tiempo de fennentación (Hrs) -+-ph centro de la masa -+-ph periferia de la masa Figura 19: Variación del ph del centro y orilla de la masa madre durante el proceso de fermentación a 28 C, Al refrigerar a temperaturas inferiores (2 C en vez de 7 C) no se obtiene un resultado considerablemente diferente; la recuperación de la temperatura para una reactivación de la fermentación debiera ser más lenta. En general, de acuerdo con los ph registrados durante el proceso de fermentación sin interrupción, se puede mencionar que esta masa madre con 0.01% de L. plantarum y 0.001% de levaduras requiere un mayor tiempo de fermentación a 28 C para alcanzar el punto final óptimo (ph: ); el tiempo adecuado sería de 18 a 20 horas.

45 Objetivo 3: Variación del porcentaje de masa madre en la preparación de la masa de pan; Elaboración de pan empleando masa madre elaborada con Lactobacil/us plantarum (0.01%) y levaduras (0.001%) con variaciones de adición de un 30 y 15% Formulación masa panaria (30% de masa madre y 70% masa panaria): Ingredientes Harina Agua Masa madre Levadura seca instantánea Sal Peso masa final Cantidad 2 Kg ce. 600 gr. 15 gr, 47.2 gr. 3.5 Kg. TABLA XXXII: Variables del proceso de elaboración del pan a partir de la masa madre inoculada con L. plantarum (0.01%) y levadura (0.001%) adicionada al 30%. Variables del proceso. oh de la masa madre 4,3 Temperatura de la masa madre 24 C Tiempo de batido 8 minutos Temperatura de salida del batido (masa panaria) 28 C oh masa panaria 5,26 Fermentación en bollos 45 minutos Fermentación en piezas 1 H., 15 minutos 3.2. Formulación pan control: Ingrediente Cantidad Harina 2Kg. Agua 1160 ce. Levadura seca instantánea 15 gr. Sal 40 gr. Peso final de masa 3.2 Ka.

46 TABLA XXXIII: Variables del proceso de elaboración del pan control. Variables del proceso Tiempo de batido 8 minutos Temperatura de salida del batido (masa panaria) 23 C ph masa panaria 5,73 Fermentación en bollos 55 minutos Fermentación en piezas 1 H., 10 minutos TABLA XXXIV: Resultados de la evaluación sensorial al pan preparado con un 30% de masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum (0.01%) y levaduras (0.001%) y 70% de masa panaria. Muestra en análisis Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP NP Control Jueces Aroma Sabor Comestibilidad Miga Color Apariencia General NP NP De acuerdo con las notas ponderadas promedio, la muestra control se encuentra por debajo de la nota de rechazo (3), lo que significa que no presentó aceptación por parte de los jueces evaluadores. En cambio la muestra elaborada con masa madre se encuentra dentro del rango de aceptación de la escala de evaluación (3.8 > 3.0). La característica de calidad que produce un descenso en las notas de la muestra con masa madre, aunque en muy poca medida, es el color de la corteza. Por el

47 contrario, aquellas variables que fueron bien evaluadas por los jueces son las características de la miga y la apariencia general. La muestra control presentó una mala evaluación en el sabor, la comestibilidad, las características de la miga y la apariencia general. Los resultados anteriores fueron analizados estadísticamente, por el método estadístico ANOVA, en que las hipótesis son: H 0 : No existe diferencia significativa entre las muestras formuladas con 30% de masa madre inoculadas con Lactobacillus plantarum (0.01 %) y levadura (0.001%), y un 70% de masa panaria, y la muestra control. Hf Existe diferencia significativa entre las muestras las muestras formuladas con 30% de masa madre inoculadas con Lactobacillus plantarum (0.01%) y levadura (0.001%), y un 70% de masa panaria, y la muestra control. Y se rechaza la hipótesis nula (Ho) cuando el Fte6rico < F calculado El "F" de la experiencia (Fcalculado) es: TABLA XXXV: Resultados parciales del análisis de varianza para la determinación de la diferencia significativa entre la muestra con 30% de masa madre inoculada con Lactobacillus plantarum (0.01%) y levadura (0.001%), y 70% de masa de pan, y la muestra control. Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Prueba F variación Cuadrado Libertad Medios Tratamientos Residuos Total El Fte6rico es Fo.os(2; 15), el que por tabla es De esta manera, > 0.272, lo que nos indica que se rechaza la hipótesis nula. Esto significa que, con un 95% de confianza, existe una diferencia significativa entre la muestra elaborada con masa madre y la muestra control, siendo la preferida la primera con una nota de 3.8. Las observaciones hechas por los jueces fueron principalmente las diferencias de aroma y sabor. En el caso del pan control, notaron un aroma definido como "más fuerte". El producto elaborado con masa madre presentó un aroma y sabor más suave y agradable.