SEMINARIO: SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PARA PROCESOS FERMENTATIVOS ECOLOGÍA Y SELECCIÓN DE LEVADURAS EN FERMENTACIONES VÍNICAS

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1 SEMINARIO: SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PARA PROCESOS FERMENTATIVOS ECOLOGÍA Y SELECCIÓN DE LEVADURAS EN FERMENTACIONES VÍNICAS La fermentación del mosto es un proceso bioquímico muy complejo, en el que intervienen e interaccionan levaduras, bacterias y otros microorganismos. Entre todos ellos, las levaduras son los microorganismos clave en la vinificación, ya que son los responsables de la fermentación alcohólica, la principal reacción en la conversión del mosto en vino. La transformación de los azúcares en etanol es el proceso básico en la producción de vino pero también existen otras reacciones secundarias que pueden llegar a ser muy importantes. Su importancia se debe sobretodo a sus aportaciones cualitativas al vino, ya que pueden contribuir favoreciendo (producción de glicerol, ésteres, alcoholes superiores, etc.) o perjudicando (producción de ácido acético, sulfhídrico o acetato de etilo) el producto final. - Fermentaciones espontáneas Las fermentaciones espontáneas son aquéllas que se producen de forma natural, es decir, las realizan las levaduras provenientes de la uva y del material de bodega, sin ningún tipo de inoculación externa. Esto hace que las fermentaciones espontáneas no sean producto de la acción de una única especie o cepa de levadura, sino una sucesión de especies y cepas de levaduras diferentes a lo largo de la fermentación. A pesar de que la fermentación espontánea es una sucesión de géneros y especies de levaduras, sólo unas pocas cepas de S. cerevisiae controlan la mayor parte de la fermentación resultado de una selección natural durante la fermentación espontánea. Las levaduras pueden tener su origen en la uva o en la bodega (material que entra en contacto con el mosto). En una uva sana y madura que sea prensada asépticamente, la población de levaduras total en el mosto puede variar entre ufc/ml, aunque el número de especies diferentes presentes en la uva será limitado. La especie mayoritaria en la superficie de la uva es la apiculada Hanseniaspora uvarum y su forma imperfecta, Kloeckera apiculata, que representan aproximadamente el 50-75% de la población total. Otros géneros significativos son Candida, Pichia, Metschnikowia, Hansenula y Rhodotorula. El origen de Saccharomyces es una cuestión controvertida, ya que existen dos teorías. La primera defiende que las uvas dañadas (por hongos, exceso de agua, pájaros, insectos, etc.) sirven de "depósito" para microorganismos, entre los que se incluye Saccharomyces cerevisiae, y que por tanto, estas uvas son la principal fuente de levaduras en las fermentaciones espontáneas. La forma en que estos microorganismos llegan a estas uvas se cree que se debe principalmente a los insectos (Mortimer y Polsinelli, 1999). La segunda teoría apuesta porque su principal procedencia es el ambiente de bodega (superficies del equipamiento de bodega: bombas, tuberías, depósitos de fermentación etc.), aunque no descarta una presencia minoritaria de S. cerevisiae en las uvas. Por lo que respecta a la microbiota que se puede encontrar en el ambiente de bodega, también se han realizado numerosos estudios. En ellos, se ha visto que la principal especie de bodega es S. cerevisiae. Aunque también se han encontrado otras especies pertenecientes a los géneros Candida, Pichia, Hansenula y Brettanomyces (y su forma perfecta Dekkera). Tradicionalmente, los métodos utilizados para la identificación y caracterización de especies y cepas de levadura se han basado en sus características morfológicas, sexuales y

2 bioquímicas, pero estas características están muy influenciadas por las condiciones del cultivo y pueden dar resultados poco precisos. En los últimos años, diversas técnicas de Biología Molecular han sido desarrolladas para la identificación de especies y cepas de levaduras. La aplicación de estas técnicas ha demostrado que hay una amplia diversidad genética entre las cepas vínicas de S. cerevisiae. La diversidad, composición y evolución de la levaduras presente en el mosto se ha visto que depende de varios factores como pueden ser: Localización geográfica y las condiciones climáticas (temperatura, lluvias, etc) Variedad y madurez de la uva, así como la edad de la viña Empleo de funguicidas Daños físicos causados a la uva por hongos, insectos o pájaros Condiciones de vinificación. Además, se ha visto que la calidad del vino también está claramente afectada por la cepa de S. cerevisiae que lleva a cabo la fermentación Esta gran diversidad de factores ha originado muchos trabajos en los que se ha analizado la dinámica poblacional de fermentaciones espontáneas llevadas a cabo en diferentes campañas en una misma bodega, en diferentes bodegas de una misma zona o en diferentes regiones vitivinícolas. Como dijo Pasteur (1876): "las cualidades del vino dependen en gran parte de la naturaleza específica de las levaduras que se desarrollan durante la fermentación de los mostos. Podemos pensar que si se sometiera a un mismo mosto a la acción de levaduras distintas se lograrían vinos de distinta naturaleza". - Utilización de inóculos comerciales La necesidad de asegurar la fermentación y la calidad del producto, ante el hecho de que hay un gran número de variables que intervienen en una fermentación espontánea, ha favorecido que el uso de las levaduras secas activas (LSA) se haya convertido en una práctica habitual en enología. La inoculación con LSA favorece un inicio más rápido de fermentación (normalmente se reduce la fase de latencia) y un consumo total de los azúcares fermentables, reduciendo los posibles problemas de fermentación. Además permite un mayor control microbiológico, lo que no es posible en fermentaciones espontáneas. Asimismo, se ha demostrado que se obtiene un producto de una calidad más uniforme a lo largo de las diferentes campañas. Esta última cuestión tiene sus defensores y detractores, ya que se puede obtener mayor repetitividad a expensas de perder algo de complejidad en el vino final. De hecho, siempre se ha creído que las levaduras autóctonas dan un distintivo de tipicidad y estilo al vino que puede perderse con la inoculación. De todas maneras, un estudio realizado por Querol et al. (1992) ha demostrado que la rápida imposición de la levadura seca activa reduce el número de cepas de Saccharomyces autóctonas pero no las elimina totalmente durante los primeros días de fermentación, con lo que todavía pueden tener un importante efecto en el aroma y características del vino. - Existencia de diversas cepas comerciales A pesar de que ya hacía algunos años que se inoculaba mediante cultivos frescos mantenidos en las estaciones enológicas, no fue hasta mediados de los 60 y como respuesta a las necesidades de las bodegas de California, que se produjeron las primeras levaduras secas. Inicialmente, sólo se produjeron comercialmente 2 cepas de S. cerevisiae (Montrachet y Pasteur Champagne) y éstas se utilizaron universalmente como iniciadores en todo tipo de fermentaciones, con un éxito

3 limitado. Pronto se demostró que estas cepas no eran una solución universal para las fermentaciones del mosto y apareció la necesidad de seleccionar cepas mejor adaptadas a las diferentes regiones del mundo y sus respectivas variedades de uva. Para la selección de cepas es esencial establecer cuáles son sus propiedades enológicas. Hay diferentes criterios de selección que se pueden dividir en: favorables (tolerancia al etanol, buen rendimiento en la transformación de los azúcares en etanol, capacidad de crecer en altas concentraciones de azúcar, etc.) y desfavorables (como la producción de H 2 S, producción de espuma o acidez volátil). No obstante, hay algunos aspectos que habitualmente se han considerado propiedades favorables como la degradación de ácido málico y que se pueden englobar en un tercer grupo denominado neutros. Además, utilizando técnicas de Biología Molecular (cariotipos, amplificación de elementos δ o análisis de restricción del ADN mitocondrial) se ha demostrado la existencia de cepas autóctonas de S. cerevisiae representativas de una determinada región, confirmando que las cepas de levaduras están totalmente adaptadas a determinadas característica climáticas y substratos. Así, algunos enólogos admiten que pueden obtenerse mejores resultados si se utilizan levaduras seleccionadas procedentes de la microzona donde van a ser utilizadas. - Criterios de selección Cuando se quiere seleccionar una cepa de S. cerevisiae para utilizarla como iniciador de fermentación y se parte de un número elevado de cepas diferentes, se puede aplicar lo que se conoce como selección masiva por competencia. Este método de selección es similar a lo que ocurre en las fermentaciones espontáneas, ya que se basa en la propia competencia entre las cepas por los nutrientes del medio, para elegir aquéllas que tengan una mejor capacidad fermentativa. Este criterio, no obstante, puede no ser suficiente, por lo que se hace necesario utilizar otros. En nuestro caso también se emplearon la temperatura de fermentación, la finalización correcta del proceso y los análisis organolépticos de los vinos. - La temperatura de fermentación La temperatura a la que se lleva a cabo la fermentación alcohólica afecta: al crecimiento de las levaduras y por tanto a la duración de la fermentación, a la contribución que las diferentes especies de levaduras tienen en la fermentación y al metabolismo de las levaduras, que es el que determina la composición química y organoléptica del vino. Entre 15 y 35 C se sabe que disminuye la duración de la fase de latencia y aumenta la velocidad de fermentación al incrementar la temperatura, aumentando también la velocidad de consumo de azúcar y nitrógeno. Además, al modificarse el metabolismo de las levaduras, como ya se ha mencionado anteriormente, también se varía la composición del vino final. Así, las temperaturas más elevadas favorecen una mayor producción de la mayoría de los productos de la fermentación glicero pirúvica a costa de una menor producción de etanol. Aún así, los compuestos cuya formación está más influenciada por la temperatura son los alcoholes superiores, los ácidos grasos de cadena corta y sus ésteres, ya que tienen su máximo de producción a los 20 C, para progresivamente ir disminuyendo según aumenta la temperatura. Por tanto, las bajas temperaturas de fermentación están justificadas cuando se desea una concentración elevada de estos compuestos, como es el caso de las vinificaciones en blanco. De hecho, la temperatura de fermentación es una de las características diferenciadoras entre la vinificación en blanco y en tinto. En las vinificaciones en blanco, la temperatura de fermentación idónea es una temperatura entre C ya que así se favorece una mayor producción y retención de los aromas. En las vinificaciones en tinto, por el contrario, se utilizan temperaturas de fermentación más elevadas (22-28 C) porque lo que interesa es que haya una mayor

4 extracción de los compuestos fenólicos de las pieles de la uva, responsables del color tinto del vino, la cual se ve favorecida cuanto mayor es la temperatura. La temperatura de fermentación también afecta a la dinámica poblacional de las levaduras que llevan a cabo el proceso. Varios autores han mencionado que especies como Kloeckera apiculata o Candida stellata pueden mantener altos niveles de población ( ufc/ml) a lo largo de fermentaciones a bajas temperaturas (p.e C), llegando en algunos casos a poder reemplazar a Saccharomyces como especie dominante. Una de las posibles razones para esta mejor supervivencia es que a bajas temperaturas estas especies aumentan su tolerancia al etanol. En cambio, muy pocos estudios, se han realizado sobre el efecto de la temperatura en la diversidad de cepas de S. cerevisiae. Por lo tanto, resultaba interesante profundizar en el análisis de los efectos de la temperatura de fermentación sobre la dinámica poblacional de Saccharomyces durante la fermentación alcohólica. - Mecanismos de adaptación a bajas temperaturas Las fermentaciones a bajas temperaturas aunque proporcionan grandes ventajas como la mayor aromaticidad de los vinos blancos, son procesos bastante problemáticos, ya que suelen producirse ralentizaciones o incluso paradas de fermentación. Las fermentaciones lentas y las paradas son el principal problema de las fermentaciones vínicas, por lo que son objeto de numerosos estudios. Las fermentaciones lentas y en su caso más extremo, las paradas de fermentación, tienen lugar cuando hay un consumo más lento del azúcar del mosto. Esta bajada del consumo es un indicador de que hay unas condiciones ambientales o fisiológicas adversas. Hay muchas causas que pueden generar estos problemas fermentativos: deficiencias en algún nutriente, altas concentraciones de etanol, toxicidad por parte de ácidos orgánicos o ácidos grasos, presencia de toxinas killer, temperaturas extremas, residuos de pesticidas o fungicidas, competencia entre los microorganismos, altas concentraciones de SO2, una excesiva clarificación, falta de agitación y oxigenación, etc. Además, la combinación de varios de estos factores actuando de forma sinérgica provoca una mayor inhibición del crecimiento y por tanto, de la fermentación. Por lo que respecta a la temperatura, ambos extremos pueden provocar este tipo de problemas. El principal efecto tanto de las bajas como de las altas temperaturas se produce en la membrana plasmática. La temperatura afecta la fluidez de membrana y por tanto, al transporte. Las bajas temperaturas reducen la fluidez y restringen los cambios conformacionales de los transportadores mientras que las altas temperaturas causan los efectos contrarios, es decir, aumentan la fluidez, lo que puede resultar en una excesiva disociación de la estructura de los transportadores comportando un menor control de la permeabilidad de los substratos por parte de la membrana (Bisson, 1999). Además, una baja temperatura inicial puede limitar el crecimiento de las levaduras, teniendo una población de levaduras insuficiente para una correcta fermentación (Ribéreau-Gayon et al., 2000). - La fuente de nitrógeno El mosto contiene una concentración relativamente alta de compuestos nitrogenados constituida principalmente por: amonio (3-10% del nitrógeno total), aminoácidos (25-30%), polipéptidos (25-40%) y proteínas (5-10%). La concentración de nitrógeno en la uva depende principalmente de la variedad y de las condiciones ambientales y de crecimiento (sobre todo de los fertilizantes nitrogenados). Ésta disminuye en casos de sobremaduración o podredumbre y en situaciones donde la viña ha sufrido condiciones de sequía. En la vinificación en blanco, debido principalmente al proceso de desfangado, suele disminuir la concentración de nitrógeno asimilable (sobre todo en aminoácidos) y de proteínas, mientras que la vinificación en tinto favorece una mejor extracción de los componentes de la piel, aumentando,

5 por tanto, su concentración. Este es el motivo por el que en las vinificaciones en blanco suele ser tan importante la adición de compuestos nitrogenados al inicio de la fermentación, para intentar evitar una ralentización o parada de fermentación. Normalmente se suele añadir una sal de amonio, siendo las preferidas el sulfato o fosfato de amonio (Ribéreau-Gayon et al., 2000). S. cerevisiae tiene, por tanto, a su disposición una amplia variedad de compuestos nitrogenados en el mosto. Las diferencias observadas en la velocidad de absorción de los diferentes aminoácidos y amonio en condiciones enológicas, ha llevado a clasificar estos compuestos en 4 grupos dependiendo de su velocidad de asimilación por parte de la célula (Tabla 2). De todas maneras, se cree que las fuentes de nitrógeno preferidas por las levaduras son el amonio, la glutamina y la asparagina. El amonio es fácilmente asimilado por S. cerevisiae y puede satisfacer todas sus necesidades de compuestos nitrogenados, ya que a partir de amonio es capaz de sintetizar todos los aminoácidos. Por lo tanto, S. cerevisiae no necesita que en el medio haya aminoácidos, pero su adición estimula el crecimiento. Los polipéptidos y las proteínas no participan en el crecimiento de S. cerevisiae, ya que no es capaz de hidrolizarlos. A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona vitivinícola donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son (Martini y Martini, 1990) Específicas del área, Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona, Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar, Responsables, al menos parcialmente, de las características únicas de los vinos obtenidos. Las características propias de una zona (mostos con alto o bajo contenido en azúcares, grado alcohólico, tipo de vinos elaborados, temperatura de fermentación, etc.) pueden ser, por tanto, un aspecto interesante a la hora de seleccionar una levadura aunque hay muchos otros que también se tienen que tener en cuenta. La importancia de estos parámetros puede ser relativa dependiendo del producto para el cual quieren ser utilizados, por ejemplo, si se quiere seleccionar una levadura apta para una vinificación en tinto (que se realizan prácticamente sin control de temperatura), no tendría demasiado valor añadido el seleccionar una levadura que pudiera fermentar sin problemas a bajas temperaturas. Pero en cambio, esta levadura sería de gran utilidad en vinificaciones en blanco. Algunos de los criterios utilizados para seleccionar levaduras se presentan en la Tabla 1. Por tanto, la selección de la cepa adecuada para cada tipo de fermentación es una estrategia muy importante para garantizar por un lado una fermentación correcta, así como para mejorar las características del vino final, ya que aunque es evidente que la calidad del vino va estar claramente unida a la de la variedad y calidad de la uva, las levaduras pueden producir compuestos que den un toque de distinción al producto obtenido. Tabla 1: Características deseables y no deseables en la selección de levaduras para la producción de vinos de calidad (Degré, 1993). Características deseables Características no deseables Alta tolerancia al etanol Total degradación de los azúcares fermentables Resistencia al SO2 Capacidad fermentativa a bajas Temp. Máxima reducción de la fase de latencia Degradación del ácido málico Capacidad fermentativa a altas presiones Producción de glicerol Producción de β -glucosidasa Fenotipo killer Producción de SO 2 Producción de H 2 S Producción de acidez volátil Producción de acetaldehído y piruvato Producción de espuma Formación de precursores del carbamato de etilo Producción de polifenol oxidasas

6 Luego de leer y en grupos de no más de tres personas discuta y responda las siguientes preguntas. 1- Si Ud. debería asesorar a una bodega, interesada en producir vino con denominación de origen, que tipo de cultivo recomendaría. Justifique comparando las diferentes posibilidades. 2- Si decide iniciar la fermentación con un cultivo de levaduras seleccionadas que parámetros tendría en cuenta? Existen diferencias a considerar en vinos tintos y blancos? 3- Realice un Esquema del aislamiento e identificación de las cepas de levaduras que llevan a cabo la fermentación alcohólica. Qué medio de fermentación se utilizará? 4- Qué medio de fermentación se utilizará? 5- Como evaluaría la temperatura de fermentación? SEMINARIO: PRESENTACIÓN ORAL Y DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS Luego de la presentación de los papers en la clase, responda el siguiente cuestionario: 1. Cual es la importancia de las amilasas? 2. Que sustrato, temperatura y ph utilizan en el paper? Está UD de acuerdo? Por que? 3. Si UD formaría parte de este grupo de investigación que ensayos propondría para mejorar las conclusiones planteadas? 4. Que es el ensilaje y cual es su fundamento? Que ventajas presenta? 5. Que microorganismos están involucrados y que tipo de fermentación se produce? 6. Que es el fenotipo killer y cual es su importancia en la producción de vinos? 7. Cuales son los inconvenientes durante la fermentación enológica, del crecimiento de levaduras indígenas? Cual es la estrategia planteada para evitar estos problemas? 8. Cual es la importancia de las pectinas en la industria de alimentos? 9. Cual es la incidencia de la temperatura en los procesos de obtención de bebidas fermentadas? 10. Luego de la discusión de los trabajos en clase y según su criterio Cual de estos trabajos tiene mayor importancia para su transferencia a la Industria Alimenticia? Justifique SEMINARIO: ESTEQUIOMETRÍA I-a) Que entiende por grado de reducción (γ )? b) En base a la definición de γ calcule el grado de reducción de la alanina (C 3 H 7 O 2 N), del etanol y de la glucosa, con respecto al nivel de referencia: II- Plante las ecuaciones de balance de carbono y energía para un cultivo anaeróbico sin formación de producto.

7 III- En un cultivo continuo de Saccharomyces cerevisiae se encontró que por cada C-mol de biomasa formada se consumieron 4,26 C-moles de glucosa, 0,35 moles de O 2 y se formaron 1,92 C-moles de etanol. La fuente de N fue NH 3 y la glucosa; a fuente de C y energía. La composición elemental es CH 1,8 O 0,56 N 0,17. Verifique si el consumo de O 2 es correcto. IV- - En un sistema cultivo continuo de levadura se producen 0.37 g de biomasa por gr de glucosa y se consumen 0.88 g de O 2 por gr de biomasa formada. La fuente de nitrógeno es amonio y la fórmula molecular de la biomasa es CH 1.79 O 0.56 N Se produce algún otro producto. V- La levadura Saccharomyces cereviseae y la bacteria Zymomonas mobilis produce etanol a partir de glucosa bajo condiciones de anaerobiosis sin otro aceptor de electrones externo. El rendimiento de biomasa a partir de glucosa es de 0.11 g/g para la levadura y de 0.05 g/g para la bacteria. La fuente de nitrógeno es amonio y ambos casos la fórmula molecular de la biomasa es CH 1.8 O 0.5 N 0.2. a) cual es el rendimiento de etanol en glucosa en ambos casos? b) como son los rendimientos comparados con el máximo? c) Que cepa presenta mayor rendimiento de producto? VI- Se cultivo la levadura Candida utilis en glucosa y sales de amonio. La concentración inicial de microorganismos fue de 0.53 g/l y de glucosa 15.2 g/l. Al cabo de 9.5 hs se consumio totalmente la glucosa, se consumieron moles de oxígeno y se formaron moles de CO 2 ; y la biomasa alcanzo un valor de 6.07g/l. Se formo algún producto? VII- Por cada 100g de levadura se consumen 3.1 mol de oxígeno. Cuanto calor se genera? SEMINARIO: SISTEMAS DE CULTIVO 1- En un cultivo continuo de levadura estándar, se encontró que por cada 14.5g de biomasa formada se consumieron 2 C-moles de glucosa, 0,175 moles de O 2 y se formaro un C-moles de etanol. La fuente de N fue NH 3 y la glucosa, fuente de C y energía. Verifique si el consumo de O 2 es correcto. 2- Se realiza un cultivo para obtener biomasa con una levadura de composición estándar. Para este fin se prueban dos sustratos con grado de reluctancia de 3 y 4 respectivamente. Si no hay formación de producto, con que sustrato obtendría mayor rendimiento? Justifique 3- Decidir cual o cuales de las siguientes afirmaciones son verdaderas: A. Sigue una curva típica la cual recibe el nombre de curva de crecimiento en batch. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente diferenciables B. La fase lag es independiente de la fase de crecimiento en que se encuentran las células en el momento de ser sembradas, pero depende directamente de la composición del medio de cultivo en que fueron crecidas C. En la fase exponencial el crecimiento ocurre a velocidad específica (µ) máxima y constante = µm D. Al final del cultivo (fase de decaimiento) se alcanza la máxima concentración microbiana.

8 E. µ varía durante el cultivo, siendo un valor constante y máximo en la fase exponencial (µm) que se mantiene en la fase estacionaria F. La selección de un organismo por la técnica Enriquecimiento del cultivo, depende de su valor de µ comparado con los de los otros microorganismos presentes en el medio de cultivo. G. La principal limitación de las fermentaciones aerobias, es que producen una elevada cantidad de calor que debe ser constantemente removida a fin de mantener estable la temperatura H. Normalmente KS tiene valores muy pequeños ( g/l) por lo que se requieren concentraciones relativamente altas de S para hacer que: I. Ninguna de las anteriores 4- Un cultivo batch de levaduras que crece en glucosa y amonio. El cultivo se encuentra en fase exponencial durante 40 hs, calcular: a. µmáx y µ para la fase de crecimiento exponencial. b. xf alcanzada: c. Tg Datos: S0=50 g/l Sf= 40 çg/l Xo=2 g/l Yx/s= 0.5 (c-mol/c-mol) 5- Calcular la velocidad de consumo del sustrato limitante para un microorganismo que tiene una concentración de biomasa inicial de 0.5 g/l y una concentración final 2.5 g/l, en un medio de cultivo con una concentración inicial de Glucosa de 1 g/l y presenta una afinidad por el sustrato de El proceso de obtención de ac láctico por medio de Klyuveromyces lactis puede dividirse en dos etapas: 1- fermentación aerobia en medio de cultivo con cantidades suficientes de fuente de carbono (lactosa) y nitrógeno para obtener un rendimiento de biomasa optimo. 2- Fermentación anaerobia con alta concentración de fuente de carbono y limitada en fuente de nitrógeno. - Explique el fundamento de este proceso. Que aspectos deberían considerarse? - Plantee una alternativa factible para obtener lactasa de esta cepa. Como seria el rendimiento si emplearía Sacharomyces Cerevisiae en las mismas condiciones? - Sugiera técnicas para evaluar crecimiento y producción de la enzima. 7- A partir de los seminarios discutidos en clase describa y opine sobre los distintos métodos del proceso a) tipo y diseño del cultivo b) Variables que deben tenerse en cuenta c) Cambiaria o mejoraría alguna etapa para obtener una mejor productividad? 8- A- Compare cultivo continuo y batch. B- Que concentraciones de sustrato encontraría en la salida de un cultivo continuo si D s baja? C- Y si D es alta? D-Que ocurriría en el cultivo si D es mayor que µmax? E- Y di D es igual a µmax?

9 9- La UNQ, cuenta con un laboratorio para realizar ensayos de microbiología y técnicas analíticas de medición, teniendo en cuenta los equipos presentes diseñe una técnica de FES para obtener una enzima de interés en la Industria de alimentos. No olvide detallar el protocolo, los materiales y los métodos propuestos. SEMINARIO INTEGRADOR 1. En un sistema cultivo continuo de levadura (µ: µmáx.) µ por cada gramo de glucosa consumida se producen g de biomasa y se consumen moles de de O 2. La fuente de nitrógeno es amonio y la fórmula molecular de la biomasa es CH 1.79 O 0.56 N Hay formación de producto? Que ocurriría si en el sistema, el consumo de oxígeno es de moles por gramo de biomasa? 2. Calcular la velocidad de consumo del sustrato limitante para un microorganismo que tiene una concentración de biomasa inicial de 0.25 g/l y una concentración final 0.5 g/l, en un medio de cultivo con una concentración inicial de Glucosa de 2 g/l y presenta con µ: 0.05/h. 3. Un cultivo de levaduras que se encuentra en fase exponencial, crece en glucosa como fuente de carbono y energía y utiliza como única fuente de nitrógeno, amonio. El cultivo se encuentra en fase exponencial durante 24 hs, calcular: d. µmáx y µ para la fase de crecimiento exponencial. e. Xf alcanzada: f. Tg Datos: S0=20 g/l Xo=0.5 g/l Y x/s= El proceso de obtención de ac láctico por medio de Klyuveromyces lactis puede dividirse en dos etapas: A: fermentación aerobia en medio de cultivo con cantidades suficientes de fuente de carbono (lactosa) y nitrógeno para obtener un rendimiento de biomasa optimo. B: fermentación anaerobia con alta concentración de fuente de carbono y limitada en fuente de nitrógeno. a) Explique el fundamento de este proceso. Que aspectos deberían considerarse? b) Plantee una alternativa factible para obtener lactasa de esta cepa. Como seria el rendimiento si emplearía Sacharomyces Cerevisiae en las mismas condiciones? c) Sugiera técnicas para evaluar crecimiento y producción de la enzima. 5. Cual es la máxima demanda de oxigeno, para un microorganismo promedio que crece en acético (C 2 H 4 O 2 ) con una producción de 0, 1425 g de biomasa por c-mol de sustrato consumido, sin formación de producto? 6. Se realiza un cultivo para obtener biomasa con una levadura de composición estándar. Para este fin se prueban dos sustratos con grado de reluctancia de 3 y 4 respectivamente. Si no hay formación de producto, con que sustrato obtendría mayor rendimiento? Justifique.

10 7. Cual es la máxima demanda de oxigeno, para un microorganismo promedio que crece en acético (C 2 H 4 O 2 ) con una producción de 0, 1425 g de biomasa por c-mol de sustrato consumido, sin formación de producto? 8. Es bien conocida la capacidad de Saccharomyces cereviciae para transformar azucares en etanol en procesos anaerobios. Típicamente de obtienen rendimientos de 0,12 C-mol biomasa por cada C-mol de glucosa consumida. Calcular el rendimiento para la producción de etanol, para un cultivo en anaerobiosis. Que porcentaje representa este valor con respecto al rendimiento máximo teórico para etanol? 9. En un cultivo continuo de levadura (γ x = 4) se encontró que por cada C-mol de biomasa formada se consumieron 4 C-moles de glucosa, 0,35 moles de O 2 y se formaron 2 C-moles de etanol. La fuente de N fue NH 3 y la glucosa; a fuente de C y energía. Verifique si el consumo de O 2 es correcto. 10. Cuál es el rendimiento máximo de biomasa del crecimiento para un microorganismo de composición Standard que crece en amoníaco y las siguientes fuentes carbonadas: glucosa y etanol. Sin hay formación de producto. a) Plantee en cada caso la ecuación estequiométrica (γ x = 4,2). b) Tomando como base los resultados del punto anterior, plantee la ecuación de crecimiento con glucosa o etanol considerando un rendimiento real del 60% del teórico máximo calculado. Se libera la misma cantidad de calor por cada C-mol de biomasa formada, con los dos sustratos? 11. En un sistema cultivo continuo de levadura se producen 0.37 g de biomasa por gr de glucosa y se consumen 0.88 g de O 2 por gr de biomasa formada. La fuente de nitrógeno es amonio y la fórmula molecular de la biomasa es CH 1.79 O 0.56 N Se produce algún otro producto? 12. La levadura Saccharomyces cereviseae y la bacteria Zymomonas mobilis produce etanol a partir de glucosa bajo condiciones de anaerobiosis sin otro aceptor de electrones externo. El rendimiento de biomasa a partir de glucosa es de 0.11 g/g para la levadura y de 0.05 g/g para la bacteria. La fuente de nitrógeno es amonio y ambos casos la fórmula molecular de la biomasa es CH 1.8 O 0.5 N 0.2. a) cual es el rendimiento de etanol en glucosa en ambos casos? b) como son los rendimientos comparados con el máximo? c) Que cepa presenta mayor rendimiento de producto? SEMINARIO CULTIVO CONTINUO I- VERDADERO O FALSO-Justifique sus respuestas 1-Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto sobre el proceso de variables como PH, temperatura, concentración de nutrientes 2-El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del biorreactor por unidad de tiempo, así un valor de D= 0.25 h -1 indica que en una hora se renovó un 25 % del volumen de cultivo

11 3-El caudal de salida la concentración de nutrientes es menor que en el caudal de entrada debido a que en parte fueron consumidos por los microorganismos. 4-En estado estacionario es µ = D, y como D puede ser variado a voluntad por el operador (variable de operación) resulta que el cultivo continuo permite imponerle externamente a los microorganismos el valor de µ al que deben crecer. 5-D <µm En caso contrario ocurrirá el "lavado" del cultivo, debido a que la velocidad de salida de las células del biorreactor será mayor que la de crecimiento 6-A valores de D>µmax, S alcanza un valor máximo y la tasa de crecimiento de microorganismos (µ) dentro del cultivo se hace nula. II- Una bacteria (Biomasa Standard) crece en sistema continuo con glucosa (sustrato limitante) y amonio como fuente de nitrógeno a una velocidad de dilución de 0,2 h -1. El S R es 4,0 g/l y el volumen de cultivo 500 ml. Calcular: a) Caudal de alimentación (F). b) Rendimiento. c) Determine si hay formación de producto. Datos: X = 1,9 g/l S = 0,014 g/l III- Se tiene una cepa de la levadura, capaz de producir un pigmento de amplia aplicación en la Industria de Alimentos. Para evaluar cuales son las mejores condiciones para la producción industrial del pigmento se realizó un sistema de cultivo continuo, donde se trabajo a distintas velocidades de dilución obteniéndose los siguientes resultados: D (h -1 ) biomasa (g/l) glucosa (g/l) Pigmento (g/l) Considere que la concentración de sustrato limitante (glucosa) en el reservorio fue de 50 g/l. -Calcule el rendimiento (Yx/s, Yp/s), rp, tr para cada caso. - Qué condición elegiría? IV- Discusión del paper leído en clase d) Explique los tipos de cultivos utilizados, compare ventajas y desventajas. e) Explique cual es el objetivo de emplear en el mismo trabajo de investigación cultivos batch y en continuo. Que parámetros se analizan en cada caso? f) Escriba una síntesis del trabajo que incluya objetivos, resultados y conclusión.

12 SEMINARIO: TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA 1-Explique los beneficios de emplear procesos enzimáticos frente a emplear proceso químicos. 2- Enumere y describa brevemente tres procesos de la industria alimenticia donde se utilicen enzimas. Explique los procesos de downstrean y upstream relacionados a estos procesos. 3- Explique la acción de las enzimas pépticas en la industria alimenticia. 4- Cual es su potencial específico en la industria del vino. Que otras enzimas se utilizan? 5-Explique brevemente los fundamentos y resultados del paper leído en clase 6- Investigue una enzima de interés en la Industria de Alimentos, que se emplee de forma inmovilizada. Describa la metodología empleada para la inmovilización de una enzima elegida, explique el método, ventajas, desventajas, describa el sustrato y compare con técnicas de inmovilización alternativa.