Técnicas moleculares aplicadas en Bioquímica Clínica-2013 Dra. María Gabriela Lacoste
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- Lucía García Montoya
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1 Técnicas moleculares aplicadas en Bioquímica Clínica-2013 Dra. María Gabriela Lacoste
2 El diseño de los primers para una PCR es FUNDAMENTAL. Longitud Especificidad Temperatura de Hibridación Complementariedad de secuencias Contendido GC
3 Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado SECUENCIA CORRECTA!! Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo.
4 La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación ESPECIFICIDAD Por ejemplo: Hay una probabilidad de ¼ (4-1 ) de encontrar una A, G, C o T en una secuencia dada. Hay una probabilidad de 1/16 (4-2 ) de encontrar una secuencia de dinucleótidos. Hay una probabilidad de 1/256 (4-4 ) de encontrar una secuencia de tetranucleótidos. Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente una vez cada 4-17 bases o aproximadamente 17 billones de bases. LONGITUD IDEAL: nt Muy largos: fallas en el annealing bajo rendimiento
5 Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer. T annealing depende de la Temperatura de melting (Tm) de los primers. Tm= temperatura a la cual la mitad de las bases del primer están apareadas con el ADN molde. Tm=2 (A+T) + 4(G+C) Tm longitud contenido GC BAJO RENDIMIENTO O NO AMPLIFICACION Los primers no deben tener T a muy diferentes entre si (no mas de 5 C). OPTIMA T annealing: 5 C por debajo del Tm más bajo del par de primers (T a=al menos 50 C) T annealing INESPECIFICIDAD
6 40-60% CONTENIDO GC Asegura la unión estable entre el primer y el ADN templado Evitar tramos de polipurinas o polipirimidinas PoliT, PoliA o PoliA/T unión más débil: se puede separar el complejo primer-templado en esa zona. PoliC, PoliG o PoliG/C unión más fuerte: hibridación no específica.
7 G o C en el extremo 3 Elongación empieza en el extremo 3 del primer. Asegura la unión correcta del primer al molde en el extremo 3 (unión más fuerte que A/T) aumenta la eficiencia de la reacción PROBLEMA: Si el extremo 3 tiene 3 o mas G/C se puede unir establemente a casi cualquier secuencia con tres G/C. IDEAL: Extremo 5 estable con 1 o 2 bases G/C y extremo 3 con no mas de UNA base G/C
8 Complementariedad intra-primer Más de 3 pb: el primer se pliega sobre si mismo en una estructura doble cadena interfiere con el annealing al ADN templado.
9 Complementariedad inter-primer Formación de dímeros disminuye la formación de producto por competencia
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11 Secuencia de ADN blanco: CFTR El gen CFTR está localizado en el brazo largo del cromosoma 7, en la posición 7q31.2. Es un gen de gran tamaño, que posee 250 kb y que incluye 27 exones.
12 National Center for Biotechnology Information
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17 Forward TCCCTTGTATCTTTTGTGCATAGC 5 3 Reverse CGCTCAGGATTCACTTGCCT 5 3 TCCGTTCACTTAGGACTCGC 3 5 AGGCAAGTGAATCCTGAGCG complem. ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t
18 OligoCalc
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21 Primer 3 Primer3 es una aplicación que se encuentra para su libre uso en la web.
22 La página principal del programa consiste en un gran recuadro en blanco, en donde debemos pegar la secuencia en formato FASTA.
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