EVALUACION MICROBIOLOGICA Y AFLATOXINAS EN LAS MUESTRAS DE MANÍ ALMACENADAS

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1 41 CAPITULO IV EVALUACION MICROBIOLOGICA Y AFLATOXINAS EN LAS MUESTRAS DE MANÍ ALMACENADAS INTRODUCCIÓN Las aflatoxinas son sustancia toxicas producidas como resultado del metabolismo de los hongos y son denominadas micotoxinas. Hay al menos 13 tipos diferentes de aflatoxinas que son producidas en la naturaleza. Las aflatoxinas que más se desarrollan en los granos de maní son las aflatoxinas B1, B2 y G1 y G2. La aflatoxina B1 es considerada la más tóxica y es producida tanto por Aspergillus flavus como Aspergillus parasiticus, al igual que la B2. La aflatoxina G1 y la G2 son producidas exclusivamente por A. parasiticus. En la figura 3.1 se observan las estructuras químicas de estas familias de aflatoxinas. Figura 3.1. Estructuras químicas de las principales aflatoxinas y su precursor. Según otros autores, numerosas clases de hongos pueden estar involucrados en el almacenamiento de maní, tales como las especies aspergillus, penincilium, fusarium y alternaria en bajo porcentaje (Chulze 2005). La contaminación fúngica causa una reducción en la calidad, mediante la utilización de stock de carbohidratos y proteínas y produciendo una oxidación suave en los granos (Wu et al., 2016). Estos fenómenos interactúan con otros

2 42 factores adversos tales como, humedad, daño mecánico, condiciones ambientales desfavorables, secado incorrecto, almacenaje y factores del proceso, todos estos contribuyen al deterioro de la calidad del maní, causando una pérdida tanto de calidad como económica (Torres et al., 2014; Igbal et al., 2013). Por otro lado la presencia y desarrollo de microorganismos afectan a la seguridad alimentaria de los granos de maní para poder ser procesados. Se estima en el mundo que cerca del 30% de las personas en países industrializados sufrieron de alguna enfermedad de etiología ETA (enfermedad de transmisión alimentaria) por año y en el año 2000 al menos dos millones de personas murieron por enfermedades diarreicas en el mundo (WHO, 2002). Las enfermedades alimentarias resultan de la ingestión de alimentos y productos alimenticios contaminados e incluyen un amplio grupo de enfermedades causadas por patógenos, químicos y parásitos los cuales contaminan el alimento en diferentes puntos durante la producción y los procesos de preparación de los alimentos (Chang et al., 2013). La mayoría de las muertes por síndromes diarreicos ocurren en países pobres, las enfermedades alimentarias no sólo afectan a países en desarrollo o a niños. En los Estados Unidos se estiman enfermedades alimentarias en 76 millones de enfermos con hospitalizados y muertos por año (Mead et al., 1999). Estas enfermedades resultan en costos médicos y pérdida de productividad en el rango de los 6,6 billones de dólares hasta los 37,1 billones de dólares. Pero las enfermedades alimentarias no se presentan únicamente como epidemias locales. El crecimiento del comercio internacional, la migración y el incremento de los viajes han diseminado patógenos peligrosos y alimentos contaminados aumentando la vulnerabilidad mundial. Es debido a estas interconexiones que una enfermedad alimentaria local se puede convertir en un potencial riesgo global. En 1991, la epidemia de cólera desarrollada en Latinoamérica y esparcida en agua y pescados en Perú rápidamente se dispersó a través de estos países generando casos con muertes reportadas en varios países (PAHO, 1995) El objetivo de este capítulo fue evaluar la calidad microbiológica y el desarrollo de aflatoxinas bajo las condiciones de envasado y almacenamiento estudiadas.

3 43 AFLATOXINAS: MATERIALES Y MÉTODOS Muestras Las muestras se obtuvieron de acuerdo a lo realizado en el objetivo 2 (capítulo 3). Las cuales en el momento de extracción fueron realizados los análisis. Determinación de aflatoxinas totales La determinación de aflatoxinas totales se realiza de acuerdo a la metodología descripta por AOAC por medio de una extracción con metanol-agua de los granos de maní, posterior clarificación y concentración por medio de un cartucho de inmunoafinidad Aflatest y posterior inyección en HPLC con sistema detector de fluorescencia. Los resultados se realizaron por triplicado y se calculó la media y el desvío estándar. RESULTADOS Las figuras 4.1 y 4.2 muestran los resultados obtenidos de aflatoxinas totales para los tratamientos maní blancheado y confitería. Los resultados obtenidos a lo largo del tratamiento no mostraron una tendencia firme con respecto a un incremento o una disminución de la aflatoxinas totales sino que son datos que se presentan en forma aleatoria debido a la falta de uniformidad en cuanto al desarrollo de las aflatoxinas en los granos de maní. Tanto para maní blancheado y confitería se evidencio el mismo comportamiento. Tampoco se evidencia diferencias significativas en el contenido de aflatoxinas totales con respecto a los diferentes tratamientos ya sea con temperatura ambiente y cámara frío o con envase al vacío o no. Estos resultados demuestran que el contenido de aflatoxinas se ve influenciado por otras variables que no afectan el almacenamiento al cual han sido sometidos los diferentes tratamientos. Estas variables, que no han sido consideradas, y que afectan el contenido, son la humedad y la posibilidad de contaminación con los hongos generadores de aflatoxinas. La cantidad de nutrientes disponibles en el alimento, la temperatura ambiente, la actividad de agua y la disponibilidad de oxígenos son los más importantes factores que gobiernan el crecimiento y la producción de micotoxinas del hongo (Filtenborg et al, 2000). Las

4 44 condiciones a lo cual se promueve la producción de micotoxinas son usualmente más restringidas o estrictas con respecto a las cuales el hongo puede crecer (kokkonen et al. 2005). Los hongos presentes en los productos almacenados como los Aspergillus generadores de micotoxinas necesitan factores y condiciones para su desarrollo lo cual necesitan un contenido de humedad en la semilla de entre el 15-20%, una humedad relativa ambiente (70-90%), rango de temperatura entre 0 y 45ºC y puede crecer a menor concentración de oxigeno (Carrillo, 2003) 0,50 B TA SV B TA CV B CF SV B CF CV Contenido de Aflatoxinas Totales (ppm) 0,41 0,32 0,23 0, Días Figura 4.1 Contenido de aflatoxinas totales para los tratamientos temperatura ambiente con vacío (B TA CV) y sin vacío (B TA SV) y cámara fría con vacío (B CF CV) y sin vacío (B CF SV).

5 45 0,27 C TA SV C TA CV C CF SV C CF CV Contenido de Aflatoxinas Totales (ppm) 0,21 0,15 0,10 0, Días Figura 4.2 Contenido de aflatoxinas totales para los tratamientos temperatura ambiente con vacío (C TA CV) y sin vacío (C TA SV) y cámara fría con vacío (C CF CV) y sin vacío (C CF SV). CONCLUSIONES No se observaron cambios o tendencias marcadas en cuanto al contenido de aflatoxinas totales durante el almacenaje de los diferentes maníes y condiciones. El contenido de aflatoxinas no se modifica ni genera una pérdida de la inocuidad del maní en las condiciones a las cuales fueron envasadas todas las muestras presentando valores muy bajo y solo diferencias pequeñas debido a la limitación de reproducibilidad de la técnica. CALIDAD MICROBIOLÓGICA: MATERIALES Y MÉTODOS Muestreo Las muestras se obtuvieron de acuerdo a lo realizado en el objetivo 2 (capítulo 3). Las cuales en el momento de extracción fueron realizados los análisis.

6 46 Preparación de muestras en general Se tiene que preparar diluciones decimales seriales de acuerdo a la estimación de unidades formadoras de colonia: 9 ml de diluyente estéril (agua peptonada) más 1 gramo de la muestra y en posteriores diluciones se diluye 1 ml de la anterior en 9 ml de agua peptona y así sucesivamente. Agitar 25 veces en un arco de 30cm (o con agitador durante 30 seg.). No usar pipeta para tomar volumen que sea menor o igual al 10% del volumen total como por ejemplo, tomar 1 ml con una pipeta de 10 ml, se la tiene que tomar con una de 5 ml. Dejar reposar entre 3 y 5 minutos justo en el momento anterior de realizar diluciones seriadas o de la inoculación. Preparación de muestra para análisis de salmonella 1- Pesar asépticamente 25g de muestra dentro de un recipiente estéril. Adicionar 225 ml de diluyente estéril y agitar vigorosamente en agitador durante 30 segundos para obtener una dilución 1/ Dejar reposar entre 3 y 5 minutos y tomar muestra justo en el momento anterior de realizar diluciones seriadas o de la inoculación. Técnica de siembra a. profundidad Durante la incubación las colonias crecen en el interior de la masa del agar y se realiza de la siguiente manera: 1- depositar 1 ml de la muestra (si es líquido) o de cada dilución en placas estériles vacías. 2- Agregar a cada placa 5 a 10 ml del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y mantenido a unos 45 C +/- 2 C. 3- Agitar moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se consigue mezclar el inóculo en el agar. 4-Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos 5 minutos) y llevar las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubación elegidos varían según el tipo de microorganismos).

7 47 5-Pasado el tiempo de incubación las colonias habrán crecido dentro del agar (en la masa del agar). Elegir entre todas las placas, las dos correspondientes a aquella dilución que presenten un número de entre 10 y 100 colonias/placa (esto proporciona una precisión estadística suficiente y no es engorroso de hacer). Poner las placas de Petri con la base hacia arriba, y si es preciso, se divide en sectores marcando con un lápiz graso a lo largo de los diámetros. 6- El número de unidades formadoras de colonias o UFC/g de la muestra original será: Numero de UFC/g= número de colonias x factor de dilución b. superficie 1- utilizar las placas previamente preparadas que contiene el medio de cultivo solidificado unos 15ml/placa. 2- depositar en la superficie del agar 0,1ml de la muestra o de cada dilución. 3- Luego de realizada la descarga de la muestra, proceder a extenderla sobre toda la superficie de las placas, utilizando una ansa de Drigalski estéril o asa de vidrio estéril. 4-Esperar 2 o 3 minutos a que se seque el inóculo. 5-Llevar las placas a incubar y proceder de la misma manera que en el caso anterior. Determinación de Coliformes totales 1- Procesar la muestra de producto de maní de acuerdo a lo descripto anteriormente en preparación de muestra. 2- Preparar dilución de la muestra 1/10 en agua peptonada para la siembra de profundidad en medio VRBA (Violeta rojo bilis agar). 3- Sembrar en profundidad 1ml de la solución madre de la muestra. 4- Una vez solidificado el VRBA agregar una sola capa del mismo medio. 5- Incubar 24hs a 31 C +/- 2 C. 6- Los coliformes presentan color rosado a rojo. 7- Si en el conteo de colonias la placa contiene más de 300 coliformes realizar dilución mayor.

8 48 Determinación de Coliformes fecales 1- Procesar la muestra de producto de maní de acuerdo a lo descripto anteriormente en preparación de muestra. 2- Preparar dilución de la muestra 1/10 en agua peptonada para la siembra de profundidad en medio VRBA (Violeta rojo bilis agar). 3- Sembrar en profundidad 1ml de la solución madre de la muestra 4- Una vez solidificado el VRBA agregar una capa del mismo medio 5- Incubar 24hs a 44,5 C +/- 1 C. 6- Los coliformes presentan color rosado a rojo. Determinación de hongos y levadura 1- Procesar la muestra de producto de maní de acuerdo a lo descripto anteriormente en preparación de muestra. 2- Preparar dilución de la muestra 1/10 en agua peptonada para la siembra de profundidad en medio H y L Medio (Hongos y levaduras Britania desarrollado por Mosel y norma FIL 94:1980). 3- Sembrar en profundidad 1ml de la solución madre de la muestra 4- Incubar 3 a 5 días a temperatura entre 20 a 25 C. 6- Si en el conteo de colonias la placa contiene más de 300 UFC realizar dilución mayor. Las UFC crecidas en el medio H y L son hongos y levaduras. Determinación de Recuento Total de Mesófilos aerobios 1- Procesar la muestra de producto de maní de acuerdo a lo descripto anteriormente en preparación de muestra. 2-Preparar dilución de la muestra 1/10 en agua peptonada para la siembra de profundidad en medio RPA (Recuento en agar placa BRITANIA). 3- Sembrar en profundidad 1ml de la solución madre de la muestra 4- Incubar 24 a 48 horas a temperatura de 33 +/- 2 C.

9 49 6- Si en el conteo de colonias la placa contiene más de 300 UFC realizar dilución mayor. Las UFC crecidas en el medio RPA son microorganismos mesófilos aerobios. Determinación de Escherichia coli 1- Procesar la muestra de producto de maní de acuerdo a lo descripto anteriormente en preparación de muestra. 2- Preparar dilución de la muestra 1/10 en agua peptonada para la siembra en superficie en medio Mac Conkey, Chromobrit cc o Agar EMB (Agar Cromogénico). 3- Sembrar en superficie 100 ul o 0,1 ml de la solución madre de la muestra dependiendo de la concentración de microorganismos en el inóculo con el fin de poder obtener colonias aisladas para confirmación. 4- Incubar y verificar la presencia de E. coli en el medio Agar EMB (Agar Cromogénico). A continuación, se detallan los colores que presentan las colonias E. coli según el medio: MAC CONKEY CHROMOBRIT CC AGAR EMB Tiempo de incubación 24 hs 24 hs 24 hs T de incubación 42 +/- 2 C 35 +/- 2 C 35 +/- 2 C Colores Rojas con halo turbio Azulado violeta y la E. coli H7O157 rosada a rojiza Verde azulado metalizada

10 50 5- Si el medio utilizado presenta colonia sospechosa de E. coli, se las someterá a prueba de confirmación detallada en fuente cursiva según tabla: PRUEBAS DE CONFIRMACION Mac Conkey Chromobrit cc Agar EMB (Agar Cromogenico) Prueba de indol Prueba de indol Prueba de indol Prueba de la oxidasa Prueba de la oxidasa Prueba de la oxidasa Prueba de la catalasa Prueba de la catalasa Prueba de la catalasa Si la colonia sospechosa de ser E. coli se presenta en productos alimenticios, se realizarán determinaciones paralelas sobre los tres medios Agar EMB, Agar Chromobrit y Agar Mac Conkey, repitiendo desde el paso 1. Color RESULTADOS Mac Conkey Chromobrit cc Agar EMB Pruebas Bioquímicas Medios de cultivos Rojo halo Azul a rosada a turbio violeta rojiza Agar Mac Conkey: rojas turbias Oxidasa Chromobrit cc: Azul oscurovioleta. Rojarojiza H7O157 Catalasa EMB Agar verde Indol azulado metalizada Bacteria E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli H7O157 Determinación de Salmonella 1- Pesar 25g de alimento a analizar en bolsas estériles y agregar 225 ml de agua peptonada e incubar durante 24 hs a 35 C +/- 2 C (Pre enriquecimiento). 2-Colocar 1 ml de caldo Selenito-Cistina y 1 ml en Caldo Tetrationato e incubar durante 24hs a 32 C +/- 2 C (Enriquecimiento). 3-Tomar 100 ul y sembrar en superficie sobre agar Samonella-Shigela y sobre agar entérico Hektoen e incubar durante 24hs a 35 C +/- 2 C (medio selectivo de crecimiento).

11 51 4- Observar si manifiesta la presencia de colonias con centro negro en el agar Salmonella- Shigela y colonias verdes o verdes azuladas con o sin centro negro en el agar entérico Hektoen para la posterior confirmación. Prueba de confirmación A las colonias sospechosas de ser Salmonella provenientes de los medios Salmonella-Shigela agar y entérico Hektoen Agar se le realizaran las siguientes técnicas: 1-Agar lisina hierro (LIA) 2-Agar hierro triple azúcar (TSI) Bacteria SS Agar Agar Hektoen Salmonella Negro Verde azulada con o sin negro Confirmación Salmonella LIA y TSI 5- tomar las colonias sospechosas (al menos 2) de ser Salmonella provenientes del medio Agar Salmonella-Shigela y Agar entérico Hektoen con un ansa en aguja. 6- Sembrar primero por punción en un tubo conteniendo el medio Triple Azúcar Hierro (TSI: Triple Sugar Iron) y en segundo lugar el medio Lisina Hierro Agar (LIA: Lysin Iron Agar) ambos en pico de flauta. 7- Incubar en TSI Y LIA durante 24 hs a 35+/- 2 C Resultado de pruebas bioquímicas: Bacteria Color del pico Color del fondo Ennegrecimiento Salmonella LIA Purpura Purpura + Salmonella TSI Rojo Amarillo +

12 52 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Maní blancheado En las siguientes tablas se pueden observar los resultados obtenidos de los análisis microbiológicos de los diferentes tratamientos que recibieron los granos de maní blancheado durante su almacenaje. Maní blancheado a temperatura ambiente y sin vacío: 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 50 UFC/g 80 UFC/g 200 UFC/g 300 UFC/g Recuento total UFC 170 UFC 600 UFC 800 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g 40 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Maní blancheado a temperatura ambiente y con vacío: 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 50 UFC/g 60 UFC/g 10 UFC/g 9 UFC/g Recuento total UFC 140 UFC 40 UFC 20 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia

13 53 Maní blancheado en cámara de frío y con vacío. 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 50 UFC/g 80 UFC/g 20 UFC/g 20 UFC/g Recuento total UFC 670 UFC 500 UFC 280 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g 120 UFC/g < 10 UFC/g 40 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Maní blancheado en cámara de frío y sin vacío: 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 50 UFC/g 20 UFC/g 90 UFC/g 336 UFC/g Recuento total UFC 260 UFC 1670 UFC UFC Coliformes totales < 10 UFC/g 20 UFC/g 410 UFC/g 712 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g 408 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Se puede observar que hay ausencia de Escherichia coli y Salmonella desde el día 0 del almacenaje en todos los tratamientos. No hubo contaminación ni crecimiento de dichos microorganismos en todos los meses de tratamiento. En cuanto a los coliformes las muestras no presentan diferencias significativas entre ellas, se muestra que el incremento es levemente superior en las muestras que no presentan vacío en su almacenaje, respecto a las que si presentan vacío. En cuanto a los hongos y levaduras y recuento total de aerobios mesófilos se puede observar diferencias en las unidades formadoras de colonia (UFC) de acuerdo a si el tratamiento presento o no vacío.

14 54 Los tratamientos sin vacío evidencian una tendencia de incrementar el valor de UFC a lo largo del almacenaje al tener disponible oxígeno para su crecimiento, en cambio las muestras con vacío presentan una disminución a lo largo del almacenaje. Para el maní blancheado en cámara fría y sin vacío, se presenta una contaminación durante la manipulación para el objetivo 2 (crear muestras para el almacenaje), se observa una tendencia de incremento en los indicadores microbiológicos. Maní confitería En las siguientes tablas se pueden observar los resultados obtenidos de los análisis microbiológicos de los diferentes tratamientos que recibieron los granos de maní confitería durante su almacenaje. Maní confitería a temperatura ambiente y sin vacío 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 500 UFC/g 70 UFC/g 20 UFC/g 40 UFC/g Recuento total 570 UFC/g 330 UFC 100 UFC 200 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia

15 55 Maní confitería a temperatura ambiente y con vacío 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 500 UFC/g 40 UFC/g 56 UFC/g 80 UFC/g Recuento total 570 UFC/g 60 UFC 85 UFC 120 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Maní confitería en cámara de frío y con vacío 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 500 UFC/g 250 UFC/g 20 UFC/g 70 UFC/g Recuento total 570 UFC/g 770 UFC 340 UFC 210 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g 25 UFC/g 17 UFC/g 60 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia

16 56 Maní confitería en cámara de frío y sin vacío 0 días 122 días 244 días 366 días Hongos y levaduras 500 UFC/g 490 UFC/g 60 UFC/g 70 UFC/g Recuento total 570 UFC/g 306 UFC 114 UFC 630 UFC Coliformes totales < 10 UFC/g 119 UFC/g 197 UFC/g < 10 UFC/g Coliformes fecales < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g < 10 UFC/g Escherichia coli Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Salmonella Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Los resultados encontrados en maní confitería son similares a los obtenidos en maní blancheado. Cabe recordar que estos son valores de granos de maní crudo, por lo que su calidad microbiológica es muy buena, ya que no han sufrido proceso alguno de reducción de carga microbiana, por muerte térmica, con lo que mejoraría aún más su perfil microbiológico. La utilización de envasado al vacío (envasado en atmosfera modificada) tiene la ventaja de presentar una disminución del crecimiento de microorganismos evitando el deterioro por putrefacción y pérdida de inocuidad alimentaria (Mills et al. 2014). En el trabajo realizado por Govaris et al. (2011), utilizaron atmosfera modificada en el empaque de queso feta para probar la actividad antibacteriana de orégano y tomillo de aceite esencial. Govaris et al. (2011) observó que las UFC disminuyen a lo largo del almacenaje para todos los quesos que han sido guardados en envases con atmosfera modificada en la cual tenía una proporción de dióxido de carbono (50%) y nitrógeno (50%). Si bien en el trabajo de Govaris et al. Se utilizan gases para la modificación de la atmósfera y en el presente trabajo se aplica vacío para el envasado, en ambos lo que se busca es disminuir el contenido de oxígeno dentro del envase. CONCLUSIONES Las muestras de maní confitería y blancheado no presentaron diferencias significativas entre ellas en cuanto a unidades formadoras de colonia. Los tratamientos con vacío presentan una sustancial mejora en cuanto a los indicadores microbiológicos pero siempre con valores bajos

17 57 ya que se trata de productos que se encuentran sin haber sufrido un proceso de reducción microbiana por cocción. Debido a los pequeños cambios microbiológicos no se justifica una conservación en cámara fría con respecto a los cambios microbiológicos sino que una mejora se observa con la utilización de envasado al vacío.