ES A1 B01D 9/02 //(A61K 31/575) (A61P 31/04) OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA. 11 Número de publicación:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl. 7 : C07J 13/00 B01D 9/02 //(A61K 31/575) (A61P 31/04) 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 Fecha de presentación: Solicitante/s: ERCROS INDUSTRIAL, S.A. Passeig de Gràcia, Barcelona, ES 43 Fecha de publicación de la solicitud: Fecha de publicación del folleto de la solicitud: Inventor/es: Requena Pérez, Felipe; Díaz Tejo, Luis Ángel; Coca Benito, Raquel; Asensio Domínguez, Ramón y Cruzado Rodríguez, María Carmen 74 Agente: Olmo Extremeño, Mario A. del 54 Título: Formas cristalinas de ácido fusídico y procedimientos para su obtención. 57 Resumen: Formas cristalinas de ácido fusídico y procedimientos para su obtención. Mediante cristalizaciones en mezclas de agua-alcohol o cetona de bajo peso molecular, se pueden obtener distintas formas cristalinas de ácido fusídico, denominadas Formas I, II y III. Cada una de dichas formas cristalinas presenta un punto de fusión, un espectro de infrarrojos, un difractograma de rayos X de polvo y un registro de calorimetría diferencial de barrido característico. La forma cristalina identificada como Forma III es un hemihidrato estable. ES A1 Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES A1 2 DESCRIPCIÓN Formas cristalinas de ácido fusídico y procedimientos para su obtención. Campo de la invención La invención se refiere a unas formas cristalinas del ácido fusídico y a procedimientos para su obtención. Antecedentes de la invención El ácido fusídico [ácido [3α,4α,8α,9β,11α,13α, 14β,16β,17Z) - 16-(acetoxi) - 3,11 - dihidroxi nordammara-17(20),24- dien-21-oico], de fórmula (I) es un antibiótico esteroideo con acción bacteriostática, producido por fermentación en caldos de cultivo con cepas del hongo Fusidium coccineum. La acción antibacteriana del ácido fusídico resulta de la inhibición de la síntesis de proteínas bacterianas, interfiriendo en el proceso de translocación, es decir, el movimiento del ribosoma respecto al RNA mensajero de la posición terminal 5 a la 3. Actúa tanto sobre bacterias Gram-positivas como contra cocos Gram-negativos. Se han descrito solvatos y sales de ácido fusídico en las patentes GB y GB También se han descrito otros derivados del ácido fusídico, tales como el ácido dihidrofusídico en la patente US o el ácido tetrahidrofusídico en la patente US En la patente GB se describe la capacidad del ácido fusídico para formar sales con bases orgánicas e inorgánicas. También se citan solvatos con determinados disolventes, concretamente, se describen los solvatos de benceno con un punto de fusión de ,5 C y de metanol con un punto de fusión de ,5 C. El solvato de benceno se obtiene a partir de ácido fusídico crudo que se disuelve en benceno caliente y se precipita por enfriamiento. El ácido fusídico crudo se obtiene, a su vez, de un caldo de cultivo del hongo Fusidium coccineum al que se le somete a una serie de extracciones alternativas con disolventes orgánicos y acuosos, en donde la última extracción se realiza a partir de una solución acuosa a ph 10, desde la cual se pasa el ácido a metilisobutilcetona (MIBC) a ph 3,2. La fase orgánica (MIBC) se evapora a vacío hasta sequedad y el residuo resultante se transforma en el solvato anteriormente citado. También se describe un ácido fusídico procedente de secar dicho solvato de benceno a 50 C hasta peso constante, con un punto de fusión de C. El espectro de infrarrojos (IR) de este último tiene bandas características a 1265, 1385, 1695, 1730 y 3450 cm 1. El solvato de metanol se obtiene a partir de una disolución del solvato de benceno en cloruro de metileno, la cual se evapora hasta sequedad bajo vacío y el residuo obtenido se redisuelve en metanol caliente y posteriormente, por enfriamiento a 0 C, cristaliza el citado solvato. El ácido fusídico que se describe en la Farmacopea es el ácido fusídico hemihidratado; sin embargo, no se ha encontrado ninguna referencia bibliográfica donde se citen sus características cristalográficas ni el modo de obtenerle. Asimismo, la Farmacopea advierte de la inestabilidad de este producto en condiciones normales para su almacenaje y transporte estableciendo que se mantenga en contenedores bien cerrados y protegidos de la luz, a temperaturas comprendidas entre 2 C y 8 C. De hecho, ensayos realizados por los inventores mostraron la existencia de diversos estados hidratados del ácido fusídico que presentaban distintos comportamientos en los periodos de estabilidad, bien perdiendo la humedad o bien generando impurezas relacionadas que reducían sensiblemente la calidad del producto impidiendo que cumpliese las especificaciones de las Farmacopeas. Ahora se ha encontrado que, sorprendentemente, mediante cristalizaciones en mezclas de agua-alcohol o cetona de bajo peso molecular, en determinadas condiciones, se pueden obtener 3 formas cristalinas distintas del ácido fusídico, que han sido denominadas Formas I, II y III, respectivamente, presentando cada una de ellas un espectro de infrarrojos (IR), de difracción de rayos X de polvo (RDX) y de calorimetría diferencial de barrido (DSC) característicos. La Forma III es un hemihidrato que permanece estable durante largos periodos de tiempo, en condiciones normales de almacenamiento y transporte, sin perder sus propiedades de calidad iniciales. Los inventores han observado que, dependiendo de las condiciones de cristalización del ácido fusídico, se pueden obtener formas cristalinas diferentes. Por tanto, en un aspecto la invención se relaciona con nuevas formas cristalinas de ácido fusídico, denominadas Forma I, Forma II y Forma III, las cuales han sido identificadas y caracterizadas por su punto de fusión, espectroscopía de infrarrojos (IR), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y difracción de rayos X (DRX) (polvo). En otro aspecto, la invención se relaciona con unos procedimientos para la preparación, de forma inequívoca y reproducible, de dichas formas cristalinas puras de ácido fusídico. Breve descripción de las figuras La Figura 1 es una gráfica que muestra el espectro de infrarrojos (IR) de la forma cristalina I del ácido fusídico (Forma I). En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de transmitancia y en el eje de abscisas el número de ondas (cm 1 ). La Figura 2 es una gráfica que muestra el comportamiento térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la forma cristalina I del ácido fusídico (Forma I). En el eje de ordenadas se representa

3 3 ES A la energía absorbida o transmitida por unidad de tiempo (mw) y en el eje de abscisas la temperatura ( C). La Figura 3 es una gráfica que muestra el espectro de difracción de Rayos X (DRX) de polvo de la forma cristalina I de ácido fusídico (Forma I). En el eje de ordenadas se representa la intensidad y en el eje de abscisas el ángulo 2θ. La Figura 4 es una gráfica que muestra el espectro de infrarrojos (IR) de la forma cristalina II del ácido fusídico (Forma II). En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de transmitancia y en el eje de abscisas el número de ondas (cm 1 ). La Figura 5 es una gráfica que muestra el comportamiento térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la forma cristalina II del ácido fusídico (Forma II). En el eje de ordenadas se representa la energía absorbida o transmitida por unidad de tiempo (mw) y en el eje de abscisas la temperatura ( C). La Figura 6 es una gráfica que muestra el espectro de difracción de Rayos X (DRX) de polvo de la forma cristalina II de ácido fusídico (Forma II). En el eje de ordenadas se representa la intensidad y en el eje de abscisas el ángulo 2θ. La Figura 7 es una gráfica que muestra el espectro de infrarrojos (IR) de la forma cristalina III del ácido fusídico (Forma III). En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de transmitancia y en el eje de abscisas el número de ondas (cm 1 ). La Figura 8 es una gráfica que muestra el comportamiento térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la forma cristalina III del ácido fusídico (Forma III). En el eje de ordenadas se representa la energía absorbida o transmitida por unidad de tiempo (mw) y en el eje de abscisas la temperatura ( C). La Figura 9 es una gráfica que muestra el espectro de difracción de Rayos X (DRX) de polvo de la forma cristalina III de ácido fusídico (Forma III). En el eje de ordenadas se representa la intensidad y en el eje de abscisas el ángulo 2θ. La Figura 10 es una gráfica que muestra el porcentaje de humedad perdida (ordenadas) a lo largo del tiempo (abscisas) e ilustra la estabilidad, por seguimiento de la variación del contenido en agua, de las distintas formas cristalinas del ácido fusídico proporcionadas por esta invención envasadas en contenedores cerrados y protegidos de la luz, durante 210 días, a una temperatura de 5 C (Figura 10A) o de 25 C (Figura 10B). La Figura 11 es una gráfica que muestra el porcentaje de impurezas de sustancias relacionas con el ácido fusídico (ordenadas) a lo largo del tiempo (abscisas) e ilustra la estabilidad, por seguimiento de la variación del contenido en impurezas, de las distintas formas cristalinas del ácido fusídico proporcionadas por esta invención envasadas en contenedores cerrados y protegidos de la luz, durante 210 días, a una temperatura de 5 C (Figura 11A) o de 25 C (Figura 11B). La Figura 12 es una gráfica que muestra el espectro de infrarrojos (IR) del ácido fusídico técnico. En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de transmitancia y en el eje de abscisas el número de ondas (cm 1 ). La Figura 13 es una gráfica que muestra el comportamiento térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC) del ácido fusídico técnico. En el eje de ordenadas se representa la energía absorbida o transmitida por unidad de tiempo (mw) y en el eje de abscisas la temperatura ( C). Los espectros de infrarrojos han sido realizados en pastilla de bromuro potásico y en un equipo NICO- LET Avatar 360 FT-IR con transformada de Fourier. Los DSC han sido realizados en un equipo de METTLER TOLEDO modelo DSC821 e. En cápsula agujereada y a una velocidad de calentamiento de 10 C/minuto. Los espectros de difracción de Rayos X (DRX) de polvo se han realizado en un equipo SIEMENS D5000. Descripción detallada de la invención En un aspecto, la invención se relaciona con unas formas cristalinas de ácido fusídico denominadas Forma I, Forma II y Forma III, respectivamente, que han sido identificadas y caracterizadas por espectroscopia de infrarrojos (IR), calorimetría diferencial de barrido (DSC), difracción de rayos X (DRX) y punto de fusión. La Forma I del ácido fusídico presenta las siguientes características: exhibe un espectro de IR sustancialmente similar al mostrado en la Figura 1, que posee bandas significativas a aproximadamente 973, 1253, 1377, 1721, 3559 cm 1 ; el análisis por DSC muestra un pico exotérmico a 143 C y otro endotérmico a 180 C (véase la Figura 2); presenta un difractograma de rayos X (DRX) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 3, con picos característicos de intensidad superior al 20%, respecto al pico más grande, que aparecen a valores de 2θ de 2,080; 6,845; 9,388; 10,375; 11,840; 12,790; 13,669; 14,249; 15,819; 17,264; 18,457; 22,915; y tiene un punto de fusión 170 C-172 C. La Forma II del ácido fusídico presenta las siguientes características: exhibe un espectro de IR sustancialmente similar al mostrado en la Figura 4, que posee bandas significativas a aproximadamente 976, 1255, 1377, 1697, 1721 cm 1 ; el análisis por DSC muestra un único pico endotérmico a 200 C (véase la Figura 5); presenta un difractograma de rayos X (DRX) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 6, con picos característicos de intensidad superior al 20%, respecto al pico más grande, que aparecen a valores de 2θ de 8,826; 11,454; 13,638; 14,364; 17,436; y tiene un punto de fusión 187 C-189 C. La Forma III del ácido fusídico presenta las siguientes características: exhibe un espectro de IR sustancialmente similar al mostrado en la Figura 7, que posee bandas significativas a aproximadamente 1229, 1377, 1686, 1748 cm 1 ; el análisis por DSC muestra varios picos endotérmicos, siendo mayoritario el primero de ellos a 142 C y uno segundo de menor área a 187 C (véase la Figura 8); 3

4 5 ES A1 6 presenta un difractograma de rayos X (DRX) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 9, con picos característicos de intensidad superior al 20%, respecto al pico más grande, que aparecen a valores de 2θ de 7,047; 13,681; 15,988; y tiene un punto de fusión que se inicia a 140 C y finaliza a 170 C. La Forma III es un hemihidrato, que posee una humedad KF (Karl-Fisher) estable comprendida entre 1,4% y 2,0%, a temperaturas comprendidas entre 25 C y 60 C durante largos periodos de tiempo. En otro aspecto, la invención se relaciona con unos procedimientos para la obtención, de forma inequívoca y reproducible, de las formas cristalinas I, II, y III del ácido fusídico proporcionadas por esta invención. Numerosos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que, en función de las condiciones de cristalización, se puede obtener cada una de las formas cristalinas (I, II o III) de ácido fusídico de forma independiente. Efectivamente, los inventores, a través de numerosas experiencias, han observado que el ácido fusídico que se obtiene directamente de los caldos de fermentación presenta un nivel alto de impurezas relacionadas procedentes de la fermentación, que obligan a realizar alguna etapa de purificación. Los métodos de purificación, donde el contenido en disolventes orgánicos supera el contenido del agente precipitante, por ejemplo, agua, impiden la formación de estructuras cristalinas estables, al no mantener la estabilidad en el contenido de humedad y sufrir, con el tiempo, un incremento en el contenido de impurezas de productos relacionados, a pesar de almacenarlo a bajas temperaturas (entre 2 C y 8 C). A partir de ese ácido fusídico obtenido del caldo de fermentación denominado ácido fusídico técnico en esta descripción y cuya obtención se describe en el Ejemplo de Referencia, se pueden obtener las formas cristalinas deseadas mediante cristalización en condiciones específicas. Las variables que se han considerado determinantes en el proceso han sido las siguientes: la naturaleza del disolvente de disolución y del agente precipitante, las proporciones entre el disolvente de disolución y el agente precipitante, la temperatura de mezcla, la temperatura de cristalización y la forma de realizar la mezcla de cristalización. Aplicando combinaciones de estas variables se pueden obtener las distintas formas cristalinas de ácido fusídico proporcionadas por esta invención, tal como se describirá con mayor detalle más adelante. Como disolvente para la disolución del ácido fusídico (disolvente de disolución) puede utilizarse un alcohol o una cetona de bajo peso molecular en el que dicho ácido sea soluble. En una realización particular, dicho disolvente es un alcohol o una cetona de hasta 3 átomos de carbono, por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol o propanona, productos comunes y de fácil suministro. La relación entre el ácido fusídico y el disolvente se elige dentro del intervalo que permita la disolución del ácido fusídico en el disolvente elegido. En una realización particular, dicha relación ácido fusídico:disolvente de disolución fue fijada en 1:10 (p:v), relación que permite la disolución del ácido fusídico en cualquiera de los disolventes considerados en un intervalo de temperaturas comprendido entre 34 C y 36 C. Como agente precipitante puede utilizarse cualquier disolvente en el que el ácido fusídico presente baja solubilidad y que, ventajosamente, pueda homogeneizarse fácilmente con el disolvente de disolución. En una realización particular, el agente precipitante es el agua debido a su fácil homogeneización con el tipo de disolventes de disolución utilizados y por la baja solubilidad que presenta el ácido fusídico en el agua. Partiendo de una disolución de ácido fusídico técnico en las condiciones antes citadas, se estudió la influencia de la proporción de agua añadida en la cristalización, observándose que, cuando la cantidad de agua añadida era del 20% al 45% respecto al alcohol, el ácido fusídico no empezaba a precipitar hasta que la temperatura descendía de los 25 C, momento en el que aparecían los primeros núcleos de cristalización de la Forma I. Una proporción de agua superior al 45% respecto al alcohol conducía a la obtención de mezclas de las Formas I y II. Al estudiar la influencia de la temperatura en la cristalización se observó que, al situar la disolución alcohólica a temperaturas inferiores a 36 C, la adición de más agua aumentaba el rendimiento de ácido fusídico recuperado pero proporcionaba mezclas de las Formas I y II. Aumentando la temperatura de la disolución alcohólica, a valores superiores a 50 C, y añadiendo agua en una relación 1:1 respecto al alcohol, se observaba que la precipitación del ácido fusídico ocurría antes de acabar la adición del agua y el cristal formado evolucionaba hacia su forma más estable termodinámicamente, obteniéndose así la Forma II de manera exclusiva. En general, añadir menores proporciones de agua respecto al alcohol a temperaturas superiores a 50 C, conducía a la obtención de mezclas de las Formas I y II, puesto que la precipitación ya no tenía lugar a esa temperatura sino que era necesario bajar la temperatura para llegar a la cristalización, lo que favorecía la formación de la Forma I. Estudiando la influencia del modo de adición, se probó añadir la disolución de ácido fusídico en alcohol o cetona a C, sobre el agua, de manera que la proporción de agua fuera siempre superior a la del disolvente de disolución, ya que de ese modo el ácido fusídico se encontraría en condiciones de máxima insolubilidad y se obtendría la forma cristalina cinéticamente más favorecida. Operando de esta manera se observó que la precipitación se producía de forma instantánea y el cristal obtenido correspondía a la Forma III y, a lo largo de la cristalización, no evolucionaba hacia ninguna otra forma cristalina (Formas I o II), siempre que la proporción de agua fuera igual o superior al doble del disolvente de disolución. En este caso, sólo afectaba al rendimiento del ácido fusídico recuperado pero no influía en la obtención de la Forma III. Utilizando cantidades inferiores de agua, después de añadir la solución de ácido fusídico, al enfriar, se observaba que la Forma III inicialmente obtenida evolucionaba a las Formas I o II. Este mismo proceso se probó manteniendo el agua durante la adición de la disolución alcohólica o cetónica a diferentes temperaturas (30 C, 40 C y 50 C), comprobándose que por encima de los 40 C se obtenía la Forma III. De forma más concreta, la invención proporciona un procedimiento para la obtención de la Forma I de ácido fusídico que comprende disolver, por calenta-

5 7 ES A1 8 miento, el ácido fusídico en un alcohol C 1 -C 3, y posterior cristalización por adición de agua y enfriamiento, en donde el agua se añade a la disolución alcohólica de ácido fusídico en una cantidad comprendida entre el 20% y el 45% respecto al alcohol. La relación entre el ácido fusídico y el disolvente puede variar dentro de un intervalo que permita la disolución del ácido fusídico en el alcohol elegido, lo que se ve favorecido por el calentamiento. En una realización particular, dicho alcohol C 1 -C 3 se selecciona entre metanol, etanol e isopropanol y la relación ácido fusídico:alcohol es de 1:10 (p:v), relación que permite la disolución del ácido fusídico en dicho alcohol a una temperatura comprendida entre 34 C y 36 C. A partir de la disolución alcohólica de ácido fusídico resultante se puede obtener la Forma I por cristalización mediante adición de agua y enfriamiento. En una realización particular, el agua se añade a dicha disolución alcohólica de ácido fusídico a una temperatura comprendida entre 35 C y 40 C, en una cantidad comprendida entre el 20% y el 45% respecto al alcohol, y, a continuación, se deja enfriar a una temperatura comprendida entre 0 C y 10 C. La Forma II de ácido fusídico puede obtenerse, de forma inequívoca y reproducible, mediante un procedimiento que comprende disolver el ácido fusídico, por calentamiento, en un alcohol C 1 -C 3, y posterior cristalización por adición de agua y enfriamiento, en donde el agua se añade a la disolución alcohólica de ácido fusídico en una relación agua: alcohol de 1:1. La relación entre el ácido fusídico y el alcohol puede variar dentro de un intervalo que permita la disolución del ácido fusídico en el alcohol elegido, lo que se ve favorecido por el calentamiento. En una realización particular, dicho alcohol C 1 - C 3 se selecciona entre metanol, etanol e isopropanol y la relación ácido fusídico:alcohol es de 1:10 (p:v). El calentamiento favorece la disolución del ácido fusídico en el alcohol elegido. A partir de la disolución alcohólica de ácido fusídico resultante se puede obtener la Forma II por cristalización mediante adición de agua y enfriamiento. En una realización particular el agua se añade a la disolución de ácido fusídico a una temperatura comprendida entre 50 C y 60 C, en una relación agua:alcohol de 1:1, y, a continuación, se deja enfriar a una temperatura de 25 C. La Forma III de ácido fusídico puede obtenerse, de forma inequívoca y reproducible, mediante un procedimiento, en adelante procedimiento III.1, que comprende disolver, por calentamiento, el ácido fusídico en un disolvente seleccionado entre un alcohol C 1 - C 3 y propanona, seguido de cristalización mediante adición de dicha solución alcohólica o cetónica sobre agua caliente y posterior enfriamiento. La relación entre el ácido fusídico y el disolvente puede variar dentro de un intervalo que permita la disolución del ácido fusídico en el disolvente elegido, lo que se ve favorecido por el calentamiento. En una realización particular, dicho disolvente se selecciona entre metanol, etanol, isopropanol y propanona, y la relación ácido fusídico:disolvente es de 1:10 (p:v). Según este procedimiento 111.1, para cristalizar la Forma III, la disolución alcohólica o cetónica de ácido fusídico se añade sobre agua caliente, generalmente a una temperatura comprendida entre 42 C y 50 C, en una relación agua:disolvente comprendida entre 2:1 y 10:1, manteniendo la temperatura entre 42 C y 50 C, y, una vez finalizada la adición de la disolución de ácido fusídico sobre el agua caliente, se deja enfriar a una temperatura de 25 C. Alternativamente, la Forma III de ácido fusídico puede obtenerse de forma inequívoca y reproducible mediante un procedimiento alternativo, denominado procedimiento III.2, que comprende disolver, por calentamiento, el ácido fusídico en propanona, seguido de cristalización mediante adición de agua y posterior enfriamiento. La relación entre el ácido fusídico y la propanona puede variar dentro del intervalo que permita la disolución del ácido fusídico en dicha cetona. En una realización particular, la relación ácido fusídico:propanona es de 1:10 (p:v). El calentamiento favorece la disolución del ácido fusídico en la propanona. Según este procedimiento III.2, a partir de la disolución cetónica de ácido fusídico se puede obtener la Forma III de ácido fusídico mediante adición de agua y enfriamiento. En una realización particular, el agua se añade a dicha disolución cetónica de ácido fusídico a una temperatura comprendida entre 35 C y 40 C, en una relación agua:propanona comprendida entre 1:1 y 1:2, y, a continuación, se deja enfriar a una temperatura comprendida entre 0 C y 10 C. La presente invención aporta novedades ventajosas a las conocidas en el estado de la técnica, mejorando sensiblemente la estabilidad del producto comercial (véase el Ejemplo 8), gracias al novedoso método de cristalización final proporcionado por esta invención. Además, se pueden destacar, entre otras, las siguientes ventajas: - Las Formas II y III presentan una mayor estabilidad en cuanto a sustancias relacionadas (impurezas), lo que significa que se alarga la fecha de caducidad del antibiótico y que se requieren condiciones de manipulación y almacenamiento del producto menos estrictas de las requeridas para el producto según recomienda la Farmacopea. - El contenido de disolventes orgánicos en el producto es mínimo comparado con el del ácido fusídico elaborado según procedimientos convencionales pertenecientes al estado de la técnica. - Los procesos de obtención de cualquiera de las 3 formas cristalinas de ácido fusídico proporcionadas por esta invención suponen una simplificación de los procedimientos convencionales, empleándose disolventes comunes y tiempos de obtención de cada forma cristalina muy cortos, lo que mejora su aplicación industrial. - Los cristales de las Formas I, II y III de ácido fusídico son completamente distintos entre sí y pueden ser distinguidos al microscopio. - La Forma III del ácido fusídico supone una enorme ventaja para la comercialización del ácido fusídico, ya que una de las especificaciones fijadas es la humedad y esta forma cristalina no la pierde ni aún sometiéndola a temperaturas de hasta 70 C durante largos periodos de tiempo. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos de la misma. El Ejemplo de Referencia describe la obtención de ácido fusídico técnico. Los Ejemplos 1 y 2 des- 5

6 9 ES A1 10 criben la obtención de la Forma I del ácido fusídico, el Ejemplo 3 la obtención de la Forma II, los ejemplos 4 a 7 la obtención de la Forma III y el Ejemplo 8 describe un ensayo de estabilidad de dichas formas cristalinas. Ejemplo de referencia Obtención de ácido fusídico técnico Se parte de un volumen inicial de ml de caldo de fermentación, con un contenido total de ácido fusídico de 12 g. Se añaden al caldo 160 g de coadyuvante de filtración y se ajusta el ph a 3 con ácido fosfórico. Después de una hora de agitación a temperatura ambiente, el caldo se filtra. El principio activo (ácido fusídico) permanece ligado al micelio retenido en el filtro con un rendimiento superior al 99%. A continuación, el micelio conteniendo el principio activo se suspende en ml de cloruro de metileno y se mantiene en agitación durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla se filtra y el sólido resultante es suspendido de nuevo en ml de cloruro de metileno, manteniéndolo en agitación durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla se filtra y el filtrado de cloruro de metileno se une al anterior. Seguidamente, la solución rica de cloruro de metileno se destila a presión atmosférica hasta obtener una solución aceitosa. A dicha solución se le añaden 120 ml de xileno y se destila a vacío para eliminar los restos de cloruro de metileno. La solución se enfría a 10 C, manteniéndola durante 2 h a esa temperatura para facilitar la cristalización del ácido fusídico, que se recupera por filtración. Se obtienen 10,6 g de ácido fusídico con una riqueza, determinada por HPLC, del 98 %. Este ácido fusídico se caracteriza por el IR y DSC de las Figuras 12 y 13 respectivamente. Ejemplo 1 Obtención de ácido fusídico (Forma I) 25 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 250 ml de metanol y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. A la disolución resultante (mantenida a 35 C) se le añaden 112,5 ml de agua en el transcurso de 1 hora. Se observa que el producto empieza a precipitar cuando va a acabar la adición del agua. La suspensión se enfría a 5 C y se deja madurar durante 1 hora. A continuación, se filtra y se lava con una mezcla agua/metanol en la misma proporción inicial (30 ml de metanol y 15 ml de agua). El sólido se seca a 50 C y vacío, obteniéndose 23 g de ácido fusídico Forma I, con un punto de fusión de 170 C-172 C, identificado y caracterizado por IR, DSC y RDX. Ejemplo 2 Obtención de ácido fusídico (Forma I) 50 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 500 ml de metanol y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. A la disolución resultante (mantenida a 35 C) se le añaden 125 ml de agua en el transcurso de 1 hora. Hasta que no termina la adición dé agua y se empieza a enfriar no se observa la aparición de precipitado. La solución se enfría a 5 C y se deja madurar durante 1 hora. A continuación, se filtra y se lava con una mezcla agua/metanol en la misma proporción inicial (80 ml de metanol y 20 ml de agua). El sólido se seca a 50 C y vacío obteniéndose 33 g de ácido fusídico Forma I, identificado y caracterizado por su punto de fusión, IR, DSC y RDX Ejemplo 3 Obtención de ácido fusídico (Forma II) 50 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 500 ml de metanol y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. La disolución resultante se calienta a 60 C y se le añaden 500 ml de agua en el transcurso de 1 hora. Cuando se llevan añadidos aproximadamente 250 ml de agua empieza la aparición de precipitado. La suspensión se enfría a 25 C y se deja madurar durante 1 hora. A continuación, se filtra y se lava con una mezcla agua/metanol en la misma proporción inicial (50 ml de metanol y 50 ml de agua). El sólido se seca a 70 C, sin vacío, obteniéndose 47 g de ácido fusídico Forma II, con un punto de fusión de 187 C-189 C, identificado y caracterizado por IR, DSC y RDX. Ejemplo 4 Obtención de ácido fusídico (Forma III) 60 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 600 ml de metanol y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. La disolución resultante se mantiene a 35 C-40 C para que el ácido fusídico no precipite. Aparte, se calientan ml de agua a 47 C y se añade la disolución metanólica de ácido fusídico sobre el agua en el transcurso de 1 hora manteniendo la temperatura entre 42 C y 47 C. Con la primera gota de disolución metanólica que cae sobre el agua se observa la aparición de precipitado. La agitación en el reactor debe ser buena para permitir la homogeneización de la mezcla. A continuación, se enfría a 25 C y se deja madurar durante 1 hora antes de filtrar y lavar con 120 ml de agua. El sólido se seca a 50 C y vacío, obteniéndose 52 g de ácido fusídico Forma III, con un rango de fusión que se inicia a 140 C y se completa a 170 C, identificado y caracterizado por IR, DSC y RDX, con un grado de humedad del 1,77%. Ejemplo 5 Obtención de ácido fusídico (Forma III) 60 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 600 ml de metanol y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. La disolución resultante se mantiene a 35 C-40 C para que el ácido fusídico no precipite. Aparte, se calientan ml de agua a 47 C y se añade la disolución metanólica de ácido fusídico sobre el agua en el transcurso de 1 hora manteniendo la temperatura entre 42 C y 47 C. Con la primera gota de disolución metanólica que cae sobre el agua se observa la aparición de precipitado. La agitación en el reactor debe ser buena para permitir la homogeneización de la mezcla. A continuación, se enfría a 25 C y se deja madurar durante 1 hora antes de filtrar y lavar con 120 ml de agua. El sólido se seca a 50 C y vacío, obteniéndose 55 g de ácido fusídico Forma III, identificado y caracterizado por su rango de fusión, IR, DSC y RDX, con un grado de humedad del 1,70%. Ejemplo 6 Obtención de ácido fusídico (Forma III) 20 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 200 ml de acetona y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. La disolución resultante se mantiene a 35 C-40 C para que el ácido fusídico no precipite. Aparte, se calientan 400 ml de agua a 45 C y se añade la disolución de acetona de ácido fusídico sobre el agua en el transcurso de 1 hora 6

7 11 ES A1 12 manteniendo la temperatura entre 42 C y 47 C. Con la primera gota de disolución de acetona que cae sobre el agua se observa la aparición de precipitado. La agitación en el reactor debe ser buena para permitir la homogeneización de la mezcla. A continuación, se enfría a 25 C y se deja madurar durante 1 hora antes de filtrar y lavar con 40 ml de agua. El sólido se seca a 50 C, sin vacío, obteniéndose 18,6 g de ácido fusídico Forma III, identificado y caracterizado por su rango de fusión, IR, DSC y RDX, con un grado de humedad del 1,70%. Ejemplo 7 Obtención de ácido fusídico (Forma III) 20 g de ácido fusídico técnico se suspenden en 200 ml de acetona y se calienta a 36 C. Una vez disuelto, se decolora con carbón y se filtra. Sobre esta disolución se añaden 200 ml de agua en el transcurso de 1 hora manteniendo la temperatura entre 35 C y 40 C. A continuación, se enfría a 5 C-10 C y se deja madurar durante 1 hora. Seguidamente, se filtra y el sólido se lava con agua:acetona en una proporción 1:1, 20 ml de agua y 20 ml de acetona. El sólido se seca a 50 C y vacío, obteniéndose 17,3 g de ácido fusídico Forma III, identificado y.caracterizado por su rango de fusión, IR, DSC y RDX, con un grado de humedad del 1,68%. Ejemplo 8 Estudios de estabilidad Se llevaron a cabo estudios controlados de estabilidad en muestras de ácido fusídico sintetizado según los Ejemplos 1-7, haciendo un seguimiento de la variación del contenido en agua e impurezas de sustancias relacionadas, especialmente de la forma cristalina III que ha sido considerada la más estable. Las muestras estudiadas se mantuvieron en contenedores cerrados y protegidos de la luz a temperaturas entre 5 C y 25 C, durante un periodo de 210 días. Los resultados se muestran en las Figuras 10 y 11, y ponen de manifiesto que la forma cristalina III es la más estable ya que mantuvo el contenido en agua durante todo el periodo y no experimentó aumento de sustancias relacionadas, lo que supone un aseguramiento y garantía de la calidad del producto fabricado. De igual modo, se llevó a cabo de forma paralela, otra serie de experimentos consistentes en mantener, durante periodos de hasta 7 días, cada una de las formas cristalinas obtenidas en los Ejemplos 1-7, a temperaturas entre 50 C y 70 C. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que: - la Forma I perdía la humedad fácilmente; sin embargo, - la Forma III mantenía la humedad de manera estable incluso sometida a condiciones tan desfavorables; y - la Forma II, al ser prácticamente anhidra, quedaba inalterada. Estos resultados confirman la buena estabilidad de la Forma III frente al resto de las formas cristalinas que puede presentar el ácido fusídico

8 13 ES A1 14 REIVINDICACIONES 1. Forma cristalina I del ácido fusídico caracterizada porque presenta las siguientes características: exhibe un espectro de infrarrojos (IR) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 1, que posee bandas significativas a aproximadamente 973, 1253, 1377, 1721, 3559 cm 1 ; el análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) muestra un pico exotérmico a 143 C y otro endotérmico a 180 C (véase la Figura 2); presenta un difractograma de rayos X (DRX) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 3, con picos característicos de intensidad superior al 20%, respecto al pico más grande, que aparecen a valores de 2θ de 2,080; 6,845; 9,388; 10,375; 11,840; 12,790; 13,669; 14,249; 15,819; 17,264; 18,457; 22,915; y tiene un punto de fusión 170 C-172 C. 2. Forma cristalina II del ácido fusídico caracterizada porque presenta las siguientes características: exhibe un espectro de infrarrojos (IR) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 4, que posee bandas significativas a aproximadamente 976, 1255, 1377, 1697, 1721 cm 1 ; el análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) muestra un único pico endotérmico a 200 C (véase la Figura 5); presenta un difractograma de rayos X (DRX) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 6, con picos característicos de intensidad superior al 20%, respecto al pico más grande, que aparecen a valores de 2θ de 8,826; 11,454; 13,638; 14,364; 17,436; y tiene un punto de fusión 187 C-189 C. 3. Forma cristalina III del ácido fusídico caracterizada porque presenta las siguientes características: exhibe un espectro de infrarrojos (IR) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 7, que posee bandas significativas a aproximadamente 1229, 1377, 1686, 1748 cm 1 ; el análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) muestra varios picos endotérmicos, siendo mayoritario el primero de ellos a 142 C y uno segundo de menor área a 187 C (véase la Figura 8); presenta un difractograma de rayos X (DRX) sustancialmente similar al mostrado en la Figura 9, con picos característicos de intensidad superior al 20%, respecto al pico más grande, que aparecen a valores de 2θ de 7,047; 13,681; 15,988; y tiene un punto de fusión que se inicia a 140 C y finaliza a 170 C Forma cristalina III del ácido fusídico según la reivindicación 3, caracterizada porque posee una humedad KF (Karl-Fisher) estable comprendida entre 1,4% y 2,0%, a temperaturas comprendidas entre 25 C y 60 C. 5. Un procedimiento para la obtención de la Forma cristalina I de ácido fusídico, según la reivindicación 1, que comprende disolver, por calentamiento, el ácido fusídico en un alcohol C 1 -C 3, y posterior cristalización por adición de agua y enfriamiento, en donde el agua se añade a la disolución alcohólica de ácido fusídico en una cantidad comprendida entre el 20% y el 45% respecto al alcohol. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho alcohol C 1 -C 3 se selecciona entre metanol, etanol e isopropanol. 7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la relación ácido fusídico:alcohol es de 1:10 (p:v). 8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el agua se añade a la disolución de ácido fusídico a una temperatura comprendida entre 35 C y 40 C. 9. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la temperatura de enfriamiento está comprendida entre 0 C y 10 C. 10. Un procedimiento para la obtención de la Forma cristalina II de ácido fusídico, según la reivindicación 2, que comprende disolver, por calentamiento, el ácido fusídico en un alcohol C 1 -C 3, y posterior cristalización por adición de agua y enfriamiento, en donde el agua se añade a la disolución alcohólica de ácido fusídico en una relación agua:alcohol 1: Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho alcohol C 1 -C 3 se selecciona entre metanol, etanol e isopropanol. 12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la relación ácido fusídico:alcohol es de 1:10 (p:v). 13. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el agua se añade a la disolución de ácido fusídico a una temperatura comprendida entre 50 C y 60 C. 14. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la temperatura de enfriamiento es de 25 C. 15. Un procedimiento para la obtención de la Forma cristalina III de ácido fusídico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, que comprende disolver, por calentamiento, el ácido fusídico en un disolvente seleccionado entre un alcohol C 1 -C 3 y propanona, y posterior cristalización mediante adición de dicha solución alcohólica o cetónica sobre agua caliente y posterior enfriamiento. 16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho alcohol C 1 -C 3 se selecciona entre metanol, etanol, isopropanol y propanona. 17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la relación ácido fusídico:disolvente es de 1:10 (p:v). 18. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la disolución alcohólica o cetónica de ácido fusídico se añade sobre agua en una relación agua:disolvente comprendida entre 2:1 y 10: Procedimiento según la reivindicación 15, en el que durante la adición de la disolución alcohólica o cetónica de ácido fusídico sobre agua se mantiene la temperatura entre 42 C y 50 C. 20. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la temperatura de enfriamiento es de 25 C. 21. Un procedimiento para la obtención de la Forma cristalina III de ácido fusídico, según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, que comprende disolver, por calentamiento, en propanona, y posterior cristalización por adición de agua y enfriamiento. 22. Procedimiento según la reivindicación 21, en 8

9 15 ES A1 16 el que la relación ácido fusídico:propanona es de 1:10 (p:v). 23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el agua se añade a la disolución cetónica de ácido fusídico en una relación agua:propanona comprendida entre 1:1 y 1: Procedimiento según la reivindicación 21, en 5 el que el agua se añade a la disolución cetónica de ácido fusídico a una temperatura comprendida entre 35 C y 40 C. 25. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la temperatura de enfriamiento está comprendida entre 0 C y 10 C

10 10 ES A1

11 ES A1 11

12 12 ES A1

13 ES A1 13

14 14 ES A1

15 ES A1 15

16 16 ES A1

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18 18 ES A1

19 ES A1 19

20 20 ES A1

21 ES A1 21

22 22 ES A1

23 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES Nº de solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 51 Int. Cl. 7 : C07J 13/00, B01D 9/02 // A61K 31/575, A61P 31/04 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reividicaciones afectadas X RU C2 (BIOSINTEZ STOCK CO.) (resumen) World 1-25 Patent Index [en línea]. Londres (Reino Unido): Derwent Publications, Ltd. [recuperado el ]. DW , Nº de acceso [65]. X GB A (LOVENS KEMISKE FABRIK VED A. KONGSTED) , 1-25 página 5, línea página 6, línea 2; ejemplo 7. A DAUBEN, W.G. et al. A formal total synthesis of Fusidic Acid Journal of the American Chemical Society, 1982, Vol. 104, páginas Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página G. Esteban García 1/1