MINISTERIO DE LA AGRICULTURA PROPUESTA A PREMIO RAMAL STUDIOS

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1 MINISTERIO DE LA AGRICULTURA PROPUESTA A PREMIO RAMAL E STUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS DE LA ENFERMEDAD HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN TRES LOCALIDADES DE CUBA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN FRUTICULTURA TROPICAL LA HABANA, 2013

2 INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN FRUTICULTURA TROPICAL MINISTERIO DE LA AGRICULTURA PROPUESTA A PREMIO RAMAL MINAG ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS DE LA ENFERMEDAD HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN TRES LOCALIDADES DE CUBA LA HABANA AÑO 2013

3 Presentación y Resumen MINISTERIO DE LA AGRICULTURA PROPUESTA A PREMIO PRESENTACIÓN DE LA PROPUESTA A PREMIO RAMAL MINAG 2013 Título: ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS DE LA ENFERMEDAD HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN TRES LOCALIDADES DE CUBA. Unidad Ejecutora Principal del Resultado: Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT) 1. Ministerio de la Agricultura. Otras entidades participantes: Instituto de Meteorología (INSMET) 2, Centro Nacional de Sanidad Vegetal (CNSV) 3, Embrapa Yuca y Fruticultura (Brasil) 4, Empresa Agroindustrial Ceballos (Ciego de Ávila) 5, Estación Experimental Félix Duque, IIFT (Matanzas) 6, Empresa Cítricos Ceiba (Artemisa) 7, Empresa de Cítricos Victoria de Girón (Matanzas) 8. Autores principales: Lochy Batista 1, Lester Hernández 1, Maritza Luis 1, Inés Peña 1, Daylé López 5, Caridad González 1. Otros autores: Irina Acosta 8, Doris Hernández 1, Daniel Pérez 5, Jorge L. Rodríguez 1, Jazmín Núñez 1, Paulo L Ortiz 2, Livia González 6. Colaboradores: Raixa Lauger 1, Juan Carlos Casín 3, Cyrelys Collazo 1, Lumey Pérez 1, Jorge L. Leyva 1, Yanet Martínez 6, Luis García 5, Pedro L. Ramos 1, Edel Pérez 1, Gabriel García 1, Francisco F. Laranjeira 4, Victoria Zamora 1, Juana M. Pérez 1, Sergio Lázaro Mieres 1, Xenia Ferriol 1, José Piñeiro 7 y Armelio Borroto 5. Filiación:. Ministerio de la Agricultura. Ave 7ma, # 3005 e/ 30 y 32, Playa. La Habana. Cuba. Fax CP Autor por correspondencia: Dra. Lochy Batista. E mail: orgcientifica@iift.cu, lochy@infomed.sld.cu. 1.1 Resumen 2

4 Presentación y Resumen La enfermedad huanglongbing de los cítricos (HLB) es una de las principales limitantes de este cultivo distribuida ampliamente en todo el mundo. En Cuba fue informado su insecto vector Diaphorina citri Kuwayama en el 1999, y en el 2007 se reportó la enfermedad causada en el país por la proteobacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas). La realización de estudios epidemiológicos de HLB es imprescindible para el diseño de estrategias de manejo de la enfermedad en el país, por lo que el objetivo de este trabajo fue implementar estudios básicos de epidemiología en tres regiones citrícolas de Cuba. Se validó la reacción en cadena de la polimerasa anidada para la confirmación de la asociación de la infección por CLas con los síntomas estudiados. La validación de la metodología mostró parámetros de desempeño que resultan adecuados para su uso y superiores a la PCR convencional. Se estudiaron los síntomas de la enfermedad, así como la correlación y frecuencia de su aparición en plantas naranjo y pomelo, cultivares que conformaron las áreas experimentales. Se evaluó la diseminación temporal y espacial de HLB y las poblaciones de su vector D. citri, en campos de tres empresas: Empresa Cítricos Ceiba, Empresa de Cítricos Victoria de Girón y Empresa Agroindustrial Ceballos. Se determinó que la frecuencia de evaluación bimestral resultó la adecuada para realizar los estudios epidemiológicos. El progreso temporal de la enfermedad y su vector se ajustó a los modelos epidemiológicos Logístico y Gompertz al 71% de los campos, con excepción de Ceiba donde se ajustó el modelo Monomolecular. Para evaluar los patrones de diseminación espacial se utilizaron varias técnicas que analizan la relación entre plantas, dentro y entre sub-áreas de un campo. Los resultados indicaron la ausencia de agregación entre plantas vecinas, mientras que en escalas mayores se encontró agregación significativa. Se determinó que el inicio de la epidemia ocurre de forma agregada y su desarrollo también muestra este patrón. Los focos de infección aparecieron mayormente en los bordes colindantes con plantaciones enfermas y progresaron a partir de estos, destacando la importancia de la infección primaria. Se comprobó que en las plantaciones jóvenes sin erradicación de plantas sintomáticas y control del vector, la enfermedad alcanza incidencias superiores al 50% en un periodo de tres a cinco años; mientras que aún con un manejo eficiente, la influencia de la colindancia con plantaciones enfermas repercute finalmente en su incremento hasta niveles similares. Los resultados indican que para lograr nuevas plantaciones que entren en producción es indispensable aplicar las medidas de manejo de HLB establecidas. 1.2 Aporte científico personal de cada autor 3

5 Presentación y Resumen Autores principales: Lochy Batista, Lester Hernández, Maritza Luis, Inés Peña, Daylé López, Caridad González. Lochy Batista (15%): Diseñó, planificó y ejecutó todos los experimentos desarrollados en este trabajo con el objetivo de las prospecciones de HLB y su manejo. Confeccionó las bases de datos, realizó el procesamiento estadístico y discusión de los resultados. Participó en el diagnóstico de plantas con síntomas de HLB en Ceiba, procesamiento, integración y discusión de resultados. Participó en la evaluación de las diferentes estrategias de manejo. Preparó y presentó varias ponencias en eventos nacionales e internacionales, participó en la elaboración de un plegable con los síntomas de HLB y de las publicaciones. Tutora de una tesis de maestría defendida con los datos de este resultado, lo que contribuye a la preparación de personal calificado y a la divulgación de los resultados. Confeccionó todos los informes de proyectos en los que los resultados de este trabajo han formado parte. Confeccionó y presentó varios resultados científicos derivados de los resultados que se incluyen en la propuesta a premio. Participó en la elaboración del documento de la propuesta a Premio Ramal MINAG, Lester Hernández (13%): Participó en el experimento de determinación de la sintomatología en plantas con síntomas asociados a HLB en Ceiba, que permite perfeccionar las prospecciones de HLB y su manejo. Participó en la preparación de una ponencia para un evento internacional y en la elaboración de un plegable con los síntomas de HLB, lo que contribuye a la preparación de personal calificado y a la divulgación de los resultados. Como parte de los servicios científicostécnicos desarrollados en las empresas del Grupo Empresarial Frutícola en que participa ha divulgado los resultados que se han ido obteniendo como parte de los diferentes proyectos que han conformado esta propuesta a premio. Trabajó en el procesamiento e integración de los resultados tanto de HLB como de su vector. Elaboró el documento de la propuesta a Premio Ramal MINAG, Maritza Luis (10%): Participó en el diseño del experimento para determinar la sintomatología en plantas con síntomas asociados a HLB en Ceiba, que permite perfeccionar las prospecciones de HLB y su manejo. Realizó el diagnóstico por PCR y tinción con yodo de plantas con síntomas asociados a HLB en las tres áreas experimentales. Participó en la discusión de resultados y elaboración de los informes y del documento propuesto a Premio Ramal MINAG Participó en la preparación de varias ponencias para eventos nacionales e internacionales y 4

6 Presentación y Resumen coordinó la elaboración de un plegable con los síntomas de HLB. Participó en la confección de varias publicaciones nacionales e internacionales. Fue co-tutora de una tesis de licenciatura presentada parte de los resultados que conforman esta propuesta. Como parte de los servicios científicos-técnicos desarrollados en las empresas del Grupo Empresarial Frutícola en que participa ha divulgado los resultados que se han ido obteniendo como parte de los diferentes proyectos que han conformado esta propuesta a premio. Participó en la elaboración del documento de la propuesta a Premio Ramal MINAG, Inés Peña (10%): Participó en el diseño del experimento para determinar la sintomatología en plantas con síntomas asociados a HLB en Ceiba, que permite perfeccionar las prospecciones de HLB y su manejo. Participó además en el procesamiento y discusión de resultados. Participó en la preparación de una ponencia para un evento internacional y en la elaboración de un plegable con los síntomas de HLB. Tutora de una tesis de maestría defendida con los datos de esta propuesta, lo que contribuye a la preparación de personal calificado y a la divulgación de los resultados. Como parte de los servicios científicos-técnicos desarrollados en las empresas del Grupo Empresarial Frutícola en que participa ha divulgado los resultados que se han ido obteniendo como parte de los diferentes proyectos que han conformado esta propuesta a premio. Participó en la elaboración del documento de la propuesta a Premio Ramal MINAG, Daylé López (10%): Participó en el diseño, montaje y evaluación de las estrategias de manejo de HLB y D. citri. Capacitó el personal técnico. Procesó los datos y analizó los resultados obtenidos. Preparó y presentó ponencias en eventos nacionales e internacionales, lo que contribuye a la divulgación de los resultados. Además organizó la información y colaboró en la confección de esta propuesta a Premio Ramal MINAG Participó en la elaboración del documento de la propuesta a Premio Ramal MINAG, Caridad González (7%): Participó en el diseño, montaje y evaluación de los experimentos de dinámica poblacional de D. citri. Participó en la preparación de una ponencia para un evento internacional y coordinó la elaboración de un plegable con los síntomas de HLB. Como parte de los servicios científicos-técnicos desarrollados en las empresas del Grupo Empresarial Frutícola en que participa ha divulgado los resultados que se han ido obteniendo como parte de los diferentes 5

7 Presentación y Resumen proyectos que han conformado esta propuesta a premio. Fue autora de una publicación internacional. Otros autores: Irina Acosta, Doris Hernández, Daniel Pérez, Jorge Luis Rodríguez Tapia, Paulo L Ortiz, Livia González. Irina Acosta (5%): Participó en el diseño del experimento para determinar la sintomatología en plantas con síntomas asociados a HLB en Jagüey, que permite perfeccionar las prospecciones de HLB y su manejo. Además confeccionó las bases de datos de esta área citrícola. Autora de una tesis de maestría defendida con los datos de este resultado, lo que contribuye a su preparación como profesional de a una empresa citrícola. Diagnóstico de plantas con síntomas HLB y monitoreo de poblaciones de D. citri en Jagüey. Doris Hernández (5%): Monitoreo de poblaciones de D. citri en Ceiba. Jorge L. Rodríguez (5%): Monitoreo de poblaciones de D. citri en Ceiba. Daniel Pérez (5%): Capacitó el personal técnico y participó en la evaluación de las estrategias de manejo de HLB y D. citri. Diagnóstico de plantas con síntomas HLB y monitoreo de poblaciones de D. citri, procesamiento y discusión de resultados de Ciego de Ávila. Presentó trabajos relacionados con esta temática en eventos provinciales. Jazmín Núñez (5%): Trabajó en la estandarización de la metodología de PCR anidada para la detección de Candidatus Liberibacter asiaticus. Autora de una tesis de licenciatura defendida con los datos de este resultado, lo que contribuye a su preparación como profesional. Paulo L Ortiz (5%): Trabajó en el procesamiento estadístico de datos y discusión de resultados del experimento para determinar la sintomatología en plantas con síntomas asociados a HLB, que permite perfeccionar las prospecciones de HLB y su manejo. Participó en la preparación de una ponencia en un evento internacional, asesoró el procesamiento estadístico de una tesis de maestría defendida con los datos de este resultado, lo que contribuye a la preparación de personal calificado y a la divulgación de los resultados. Livia González (5%): Monitoreo de poblaciones de D. citri en Jagüey Grande. 1.3 Publicaciones 6

8 Presentación y Resumen Luis, M., Collazo C., R. Llauger, I. Peña, L. Batista, J. R. Cueto, J. C. Casín, A. Borroto, D. López y R. Riaño Situación actual de la enfermedad huanglongbing en Cuba. Memorias de IV Simposio Internacional citrícola, Colima. México. ISBN , p Luis, M., Collazo, C., Llauger, R., I. Peña, L. Batista, J. D. Texeira, E. Kitajima y J. M. Bové Identificación y diagnóstico de la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus asociada a la enfermedad huanglongbing de los cítricos en Cuba. Memorias de IV Simposio Internacional citrícola, Colima. Mexico. ISBN , p González C., Gómez M., Fernández M., Hernández D., Tapia J. L. R. and Batista L Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae), behavior and natural enemies in Cuban citriculture Proceedings, 17th Conference IOCV: Llauger R., Luis M., Collazo C., Peña I., González C., Batista L., Pérez L., Borroto A., Pérez D., López D., Alonso E., Acosta I., Casín J. C., Torres L. A., Hernández D. y. Rodríguez J. L Huanglongbing y su vector en Cuba. Epidemiología y manejo. Citrifrut 27 (2): 3-8. Entomófagos asociados a las plagas citrícolas, Lepidosaphes gloverii Pack (Hemiptera: Diaspididae), Phyllocnistis citrella Stt. (Lepidoptera: Gracillariidae) y Diaphorina citri (Kuw.) (Hemiptera: Psyllidae) en naranjo Valencia. C. González, M. Gómez, D. Hernández, J. Rodríguez. Centro Agrícola, 37(4):59-65; oct.-dic., Collazo, C., Núñez, J., Luis, M. y Llauger, R Optimización de una reacción en cadena de la polimerasa anidada para el diagnóstico de la enfermedad huanglongbing de los cítricos. Citrifrut. Vol. 28 (2):

9 Índice 2 ÍNDICE 1 PRESENTACIÓN DE LA PROPUESTA A PREMIO RAMAL MINAG Resumen Aporte científico personal de cada autor Publicaciones ÍNDICE COMUNICACIÓN CORTA Impacto ambiental Impacto social Impacto económico DESCRIPCIÓN DETALLADA Introducción Diseño y selección de las áreas experimentales para la implementación de los estudios epidemiológicos de la enfermedad huanglongbing de los cítricos en tres regiones de Cuba Implementación de herramientas para la confirmación molecular de la infección por Candidatus Liberibacter asiaticus en las áreas en estudio Cuantificación de CLas en muestras de ADN de cítricos empleadas como controles positivos para la optimización de la PCR anidada Optimización de la PCR anidada para el diagnóstico de HLB Variación de las condiciones de amplificación Determinación del límite de detección de la PCR anidada Cálculo de los parámetros de validación de la PCR anidada Diagnóstico mediante PCR anidada de muestras con síntomas sospechosos de HLB en las áreas en estudio Evaluación de la sintomatología asociada a HLB y su evolución en plantas de fomento de pomelo y naranjos Determinación de los síntomas asociados a HLB en las especies en estudio Análisis de la frecuencia de aparición de los síntomas en plantas infectadas Evaluación del progreso temporal de HLB en plantaciones de fomento Determinación de la frecuencia de evaluación para realizar los estudios epidemiológicos de HLB Progreso temporal de la diseminación de HLB y las poblaciones de Diaphorina citri en plantaciones de fomento Análisis de los patrones de diseminación espacial de HLB en las tres principales áreas citrícolas comerciales Análisis del primer orden de la jerarquía espacial (relación entre plantas vecinas): Análisis de secuencias ordinarias Análisis del segundo orden de la jerarquía espacial (relación dentro de sub-áreas): Índice de dispersión y aplicación de la Ley de Taylor modificada

10 Índice Análisis del tercer orden de la jerarquía espacial (relación entre sub-áreas): Determinación de áreas isópatas Análisis espacial mediante índices de distancia (Spatial Analysis by Distance Indices) Consideraciones Generales REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACREDITACIÓN DE LA INTRODUCCIÓN DEL RESULTADO Y DE SU IMPACTO Participación en eventos Publicaciones Resultados Científicos para la para la Investigación (RI) e Introducciones Directas (ID) Tesis presentadas AVALES DE ACREDITACIÓN DE LA PROPUESTA A PREMIO RAMAL MINAG

11 Comunicación Corta 3 COMUNICACIÓN CORTA ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS DE LA ENFERMEDAD HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN TRES LOCALIDADES DE CUBA Lochy Batista, Lester Hernández, Maritza Luis, Inés Peña, Daylé López, Caridad González, Irina Acosta, Doris Hernández, Daniel Pérez, Jorge L. Rodríguez, Jazmín Núñez, Paulo L Ortiz, Livia González. La enfermedad huanglongbing de los cítricos (HLB) es una de las principales limitantes de este cultivo que se encuentra distribuida ampliamente en todo el mundo. En Cuba fue informado su principal insecto vector Diaphorina citri Kuwayama en el 1999 (González et al., 2007), y en el 2007 se reportó la enfermedad causada en el país por la proteobacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) (Martinez et al., 2009, Luis et al., 2009). Teniendo en cuenta que los estudios epidemiológicos de HLB resultan clave en el diseño e implementación de las estrategias de manejo de la enfermedad se condujeron investigaciones para (1) optimizar y estandarizar la PCR anidada como método para la confirmación de la presencia de CLas en muestras con síntomas dudosos, (2) evaluar el complejo de síntomas asociados a la enfermedad HLB en plantaciones de los cultivares naranjo dulce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) y pomelo (Citrus paradisi Macf.) c, así como su progreso temporal, (3) determinar el progreso temporal de la enfermedad en plantaciones de estos cultivares y sometidas a diferentes niveles de intervención en el manejo, así como su relación con la dinámica poblacional de D. citri, y (4) evaluar la diseminación espacial de HLB en las plantaciones en estudio. La integración de estos resultados contribuirá a mejorar la estrategia de manejo de HLB en Cuba, con el objetivo de la reducción de las pérdidas económicas asociadas a esta enfermedad y garantizar la supervivencia de la citricultura. El estudio se realizó mediante evaluaciones para la detección de síntomas asociados a HLB y las poblaciones de su vector D. citri, en ocho campos 10

12 Comunicación Corta seleccionados de las empresas: Empresa Cítricos Ceiba, Artemisa, Empresa de Cítricos Victoria de Girón, Matanzas y Empresa Agroindustrial Ceballos, Ciego de Ávila, en lo adelante Ceiba, Jagüey y Ceballos. Primeramente, con el objetivo de realizar la confirmación de la infección por CLas en los campos estudiados y en los síntomas dudosos se validó la reacción en cadena de la polimerasa anidada. Se encontraron valores superiores en la sensibilidad de la PCR anidada implementada respecto a la convencional, así como mayores valores de concordancia con los síntomas no característicos de HLB. Estos resultados indicaron que es recomendable para el diagnóstico de HLB en los estudios de epidemiología de la enfermedad por lo que se utilizó como prueba confirmatoria de la presencia de CLas en las áreas en estudio. Debido a la importancia del diagnóstico visual de la enfermedad en campo, se evaluó la sintomatología asociada a HLB y su evolución, analizando la frecuencia de aparición de cada síntoma en plantas de fomento de naranjo y pomelo de Ceiba y Jagüey respectivamente. Las diferencias encontradas en la manifestación de los síntomas entre ambas regiones pudiera deberse a la especie cítrica, las características de cada localidad (suelo y condiciones meteorológicas) y las diferencias en la fitotecnia aplicada al cultivo. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por varios autores en Brasil y E.E.U.U. que determinaron las diferencias en el desarrollo de los síntomas dependiendo de los cultivares (Bové, 2006; Deng, et al., 2008; Gomez, 2010; Foliminova et al., 2009). Teniendo en cuenta estos resultados se hace necesario considerar otros síntomas no específicos y su orden de aparición, para las prospecciones dirigidas a la erradicación de plantas enfermas. Para determinar la frecuencia de evaluación más adecuada para los estudios epidemiológicos se analizaron los datos de incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB, obtenidos a partir de diferente periodicidad en la observación: mensual, bimestral y trimestral. El ajuste de los modelos epidemiológicos a los datos de progreso temporal de HLB en cada una de estas frecuencias fue similar. Este resultado es característico de enfermedades como HLB cuyas epidemias se desarrollan en varios años (Gottwald, 2010). Los resultados mostraron que es 11

13 Comunicación Corta posible realizar los muestreos en los estudios epidemiológicos con una frecuencia de hasta tres meses sin que se observen cambios en el progreso temporal de la enfermedad. De la misma forma, son validos para el programa de reducción de fuentes de inóculo en las plantaciones comerciales dentro de los programas de manejo de la enfermedad. Esto permitirá disminuir los costos de estos programas y facilitar el trabajo de los inspectores en el campo, que podrían cubrir mayores áreas en menor tiempo. Sin embargo, se consideró apropiado realizar las evaluaciones de los estudios epidemiológicos cada dos meses, teniendo en cuenta que son realizados en campos experimentales, donde el número de plantas a evaluar es pequeño. Para evaluar el progreso temporal de la diseminación de HLB se realizaron muestreos en las ocho áreas en estudio con frecuencia bimestral. Se consideraron enfermas aquellas plantas que presentaran hojas con el síntoma de moteado asimétrico, síntoma que se ha considerado como característico de HLB en Cuba, E.E.U.U. y Brasil (Luis et al., 2009; Gómez, 2010; Bové, 2006). A partir del resultado de las evaluaciones se le asignó a cada planta la categoría de enferma (1) o sana (0) y se calculó la incidencia acumulada de plantas con síntomas asociados a HLB (relación entre el número de plantas con síntomas y el total de plantas incluidas en el estudio). En los campos evaluados en Ceiba, desde la primera evaluación se detectaron plantas con síntomas asociados a HLB con valores de incidencia inicial de 0,041 en CEI 1112 y 0,034 en el CEI 3184 (Figura 1). En las dos áreas se observó que el 50% de las plantas estaban enfermas en un tiempo aproximado de 15 meses después de la primera evaluación (MDPE), mientras que en el campo CEI 1112, la incidencia alcanzó 0,721 pasados 44 MDPE. En el CEI 3184 no se pudo continuar con las evaluaciones por lo que la incidencia solo alcanzó el valor de 0, MDPE (~50%). Las curvas que describen el progreso temporal de la epidemia en ambas plantaciones coinciden en su forma y en los valores de incidencia que se alcanzan en cada momento, lo que sugiere que el progreso de la enfermedad en ambos campos fue similar. En las dos áreas en estudio los picos poblacionales de D. citri coincidieron con los periodos de brotación masiva de los cultivares de 12

14 Comunicación Corta naranjo en Cuba. Este resultado concuerda con lo observado en estudios similares realizados en las localidades de Cienfuegos y La Habana y en otros países (González et al., 2004; Vera, 2007; Yamamoto, 2010; Fogliata et al., 2010). En los campos en Jagüey desde la primera evaluación se detectaron plantas con síntomas de HLB con valores de incidencia inicial de 0,008 y 0,017 en los campos JG T-25-3a y JG T-25-3b, respectivamente (Figura 1). Durante los 20 primeros meses de evaluación las incidencias en las dos áreas se mantuvieron por debajo de 0,048. A partir de esta evaluación no se continuaron las evaluaciones en el campo JG T-25-3b. Se alcanzó un valor de incidencia de 0,496 a los 31 MDPE, lo que representa aproximadamente el 50% de las plantas del área (Figura 1). La incidencia de plantas con síntomas en este campo alcanzó 0,95 a los 39 MDPE. En cuanto a la dinámica poblacional de D. citri, los datos disponibles contabilizaron las poblaciones del insecto en el campo JG T-25-3a desde enero de 2010 hasta septiembre de En los meses de marzo a mayo de 2010 (13-15 MDPE), se observaron poblaciones altas del insecto, y en los meses posteriores se observaron bajas poblaciones, lo que indica que se logró en este periodo el control del vector. Sin embargo, a partir de la evaluación 28 MDPE las poblaciones se desestabilizaron y alcanzaron niveles altos, principalmente en los meses de noviembre de 2011 y de febrero a marzo de 2012 (evaluaciones 33 y MDPE). Se encontró una relación entre los picos poblacionales de D. citri observados con el incremento exponencial de los síntomas Figura 1. Comparación de las curvas de progreso temporal de plantas con síntomas asociados a HLB en plantas procedentes de campos de dos empresas citrícolas, Victoria de Girón: JG T 25-3a y JG T 25-3b, ambos de pomelo 'Marsh'; Ceiba del Agua: CEI 1112 de naranjo 'China' y CEI 3184 de naranjo 'Valencia' y de la Empresa Agroindustrial Ceballos: CA 1497 y CA 1498 de Pomelo Ray Ruby, CA 2041 de Pomelo 'Rio Red' y CA 4185 de limero 'Persa'. 13

15 Comunicación Corta en las plantaciones hasta cinco meses después. De forma similar a las áreas de Ceiba, la disponibilidad de brotaciones determinó la aparición de picos poblaciones del insecto. Al inicio de las evaluaciones en los campos en estudio de Ciego de Ávila (CA 1497, CA 1498, CA 2041 y CA 4185) no se observó ninguna planta con síntomas asociados a HLB (incidencia 0) (Figura 1). A diferencia de las otras regiones en las que se realizaron los mismos estudios, de los cuatro campos incluidos en los muestreos solamente dos mostraron similitud en las curvas del progreso temporal de HLB (Figura 1, campos 1497 y 1498). En estas dos áreas, la incidencia de plantas con síntomas se mantuvo por debajo de 0,1 durante 40 meses en el CA 1497 y 44 meses en el CA Es importante decir que al cabo de este tiempo se decidió detener la eliminación de las plantas enfermas, actividad que se había realizado con estricto cumplimiento desde la fecha de plantación de las dos áreas. De forma progresiva la incidencia en estos dos campos alcanza el 50% después de los 46 MDPE en CA 1497 y 50 MDPE en CA 1498 (Figura 1, campos 1497 y 1498). La comparación del progreso temporal de la enfermedad y la dinámica poblacional del insecto vector mostró resultados análogos a los encontrados en Jagüey Grande. Los datos de progreso temporal de la incidencia de HLB se ajustaron en la mayoría de los campos a los modelos epidemiológicos Logístico y Gompertz, con excepción de los campos de Ceiba donde se ajustó al Monomolecular. Las tasas aparentes de infección en estas plantaciones jóvenes resultaron elevadas y describen el incremento acelerado observado en áreas jóvenes en el país. Relacionando el progreso temporal de la enfermedad y la dinámica poblacional de su vector D. citri en las áreas en estudio, se comprobó que donde no hay erradicación de plantas sintomáticas y control del vector, en las plantaciones jóvenes la enfermedad puede alcanzar incidencias de HLB superiores al 50% en un periodo de tres a cinco años; mientras que aún con un manejo eficiente, la influencia de la colindancia con plantaciones enfermas repercute finalmente en un incremento de la incidencia hasta niveles similares. Los resultados coinciden con los estudios realizados en Brasil y E.E.U.U en los cuales se encontró que los 14

16 Comunicación Corta modelos Logístico y Gompertz son los que mayormente describen el progreso de la enfermedad HLB en las áreas (Gottwald, 2010; Bassanezi et al., 2013). Para evaluar los patrones de diseminación espacial se utilizaron varias técnicas que analizan la relación entre plantas (Análisis de secuencias ordinarias), dentro de sub-áreas de un campo (Índice de dispersión y Ley de Taylor binaria) y entre sub-áreas de un campo (Determinación de áreas isópatas) en los campos y las evaluaciones más representativas del comportamiento de las epidemias. Adicionalmente en el tercer nivel de la escala espacial para los datos de los campos sin erradicación se aplicó la técnica SADIE (Spatial Analysis by Distance Indices). Los resultados del análisis del primer nivel de la jerarquía espacial indicaron que aunque D. citri forme colonias en las plantas hospedantes, su movimiento no es hacia las plantas inmediatamente vecinas; sin embargo, no se elimina la posibilidad de detectar agregación si se analizan áreas de mayores dimensiones. Los resultados del segundo orden de la jerarquía espacial sugieren que las plantas infectadas constituyen fuente de inóculo para otras plantas en subáreas de los campos hasta una distancia de al menos 35 metros. Indicaron además que el inicio de las epidemias ocurre con agregación significativa y su desarrollo también es agregado. Un patrón espacial agregado de las plantas enfermas puede corresponder a una distribución agregada del patógeno en la primera fuente de inóculo y además es el resultado de las infecciones secundarias mediante la dispersión del inóculo de los focos primaros a las plantas sanas. Al determinar las áreas isópatas en el tercer nivel de la escala espacial, se observó mayor presencia de focos de infección y la progresión de estos a partir de los bordes colindantes con plantaciones enfermas, destacando la importancia de la infección primaria en el progreso de la enfermedad. Este hecho fue confirmado por los resultados de SADIE. El trabajo desarrollado aporta elementos básicos para el perfeccionamiento de los diferentes componentes establecidos en Cuba en el Programa Nacional para el Manejo de HLB. La información generada como parte de la investigación contribuyen a perfeccionar (1) la producción de material de propagación certificado de cítricos, base del programa de manejo, con la implementación de una nueva 15

17 Comunicación Corta metodología de diagnóstico, (2) reducción de las fuentes de inóculo, por la determinación de los síntomas característicos y asociados a la enfermedad en áreas de Cuba, así como la determinación de la frecuencia de los muestreos de las prospecciones de plantas enfermas, y (3) manejo del vector, con el conocimiento de la dinámica poblacional y los efectos de las plantaciones colindantes. Los estudios muestran la importancia de los diferentes escenarios de intervención en el manejo de HLB en la diseminación de la enfermedad en las plantaciones. Este trabajo valida la importancia de los estudios epidemiológicos como herramienta para la evaluación y adecuación de las estrategias de manejo en general y particularmente para el huanglongbing de los cítricos, enfermedad compleja y de difícil manejo. Igualmente indica que para lograr nuevas plantaciones que entren en producción es indispensable aplicar las medidas de manejo de HLB establecidas. 3.1 Impacto ambiental Huanglongbing es considerada la enfermedad más importante de los cítricos debido a su difícil manejo y la devastación en las plantaciones que esta provoca. Debido a esto, realizar estudios epidemiológicos de la enfermedad que repercutan en estrategias de manejo eficientes garantizará la convivencia con la enfermedad y su vector, lo que permitirá la supervivencia de este cultivo en nuestro país. Particularmente las aplicaciones de plaguicidas para el control del vector a nivel mundial han conducido a la alteración de los ecosistemas, por lo que las herramientas que permitan aumentar la eficiencia de las estrategias de manejo de este complejo patógeno vector, traerán consigo la disminución de la carga tóxica en los ecosistemas conduciendo paulatinamente al restablecimiento de su equilibrio. 3.2 Impacto social El cultivo de los cítricos en Cuba ha formado parte de la cultura local en varias regiones del país desde la época de la colonia, generando numerosos empleos en 16

18 Comunicación Corta el sector privado y estatal y alcanzando producciones de alrededor de las TM, en un área de ha. Esto ha hecho posible que nuestro país ocupe el lugar 17 entre los países productores de cítricos y se ubique junto a Israel y EE.UU. entre los principales proveedores de pomelos, aportándose al país aproximadamente 64 millones de dólares y se acumula un capital pretérito de 600 MM USD. Desde la detección de la enfermedad huanglongbing en Cuba en el año 2007 los daños han resultado cuantiosos y las áreas del cultivo han disminuido considerablemente. La aplicación de estrategias eficientes de manejo permitirá recuperar las plantaciones y alcanzar los niveles de producción necesarios para el mercado interno y la exportación, garantizando la supervivencia de la citricultura con toda su repercusión social. En este sentido los estudios epidemiológicos juegan un importante rol al constituir herramientas para la evaluación y adecuación de estas estrategias. Por otra parte, este trabajo permite mantener las fuentes de empleo en las áreas eminentemente citrícolas y genera nuevas fuentes, además de contribuir al aumento del nivel técnico de los trabajadores vinculados con estas actividades. 3.3 Impacto económico La enfermedad huanglongbing de los cítricos es considerada mundialmente la enfermedad más devastadora de este cultivo debido a los daños ocasionados a las plantaciones y las considerables pérdidas de los productores. El impacto de HLB en la citricultura cubana conllevó a la pérdida de millones de USD por erradicación de plantaciones enfermas. Esto sin contar con el déficit de frutas en el mercado interno, de frontera y la exportación de jugos que generaban ingresos sustanciales. En nuestras condiciones lograr un eficiente manejo de HLB es indispensable para garantizar la supervivencia de la citricultura y disminuir los elevados costos y pérdidas. Por lo que contar con herramientas de diagnóstico adecuadas y aquellas, como los estudios epidemiológicos, que permitan evaluar la efectividad de las estrategias sobre la marcha de estas, resulta vital. Sobre todo si tenemos en cuenta el ahorro de los costos por erradicación de plantas aisladas (60 USD/ha), áreas completas (300 USD/ha), aplicación de productos químicos 17

19 Comunicación Corta (incremento de 150 a 300 USD/ha), compra de medios de aplicación ( USD) y su reparación ( USD). Además de los ingresos que generarán las nuevas plantaciones cuando comiencen su etapa productiva. 18

20 Descripción Detallada 4 DESCRIPCIÓN DETALLADA ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS DE HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN TRES LOCALIDADES DE CUBA Lochy Batista, Lester Hernández, Maritza Luis, Inés Peña, Daylé López, Caridad González, Irina Acosta, Doris Hernández, Daniel Pérez, Jorge L. Rodríguez, Jazmín Núñez, Paulo L Ortiz, Livia González. 4.1 Introducción Huanglongbing (HLB) es considerada la enfermedad más devastadora de los cítricos a nivel mundial. La enfermedad ha sido asociada a patógenos procariontes exclusivos del floema: tres especies de α Proteobacterias Gram-negativas: Candidatus Liberibacter (Ca. L.) asiaticus, Ca. L. americanus y Ca. L. africanus (con acrónimos CLas, CLam y CLaf, respectivamente) (Jagoueix et al., 1994; Garnier et al., 2000; Teixeira, et al., 2005a) y dos fitoplasmas pertenecientes a los grupos 16Sr IX y I (Teixeira et al., 2008a; Chen, et al., 2009).Las bacterias son diseminadas por los insectos vectores Diaphorina citri Kuwayama (CLas y CLam) y Trioza erytreae (del Guercio) (CLaf) (Capoor y Viswanath, 1967; McClean y Oberholzer, 1965), y también a través del injerto de yemas infectadas (Lin, 1956). No se han realizado estudios para determinar si los fitoplasmas son transmitidos por insectos (Texeira et al., 2008a; Chen, et al., 2009). El síntoma característico de HLB es el moteado asimétrico difuso de las hojas (Bové, 2006). En los estadios más avanzados, las hojas muestran deficiencias nutricionales de zinc y manganeso y brotan cloróticas, progresivamente más pequeñas, erectas y coriáceas. Las nervaduras pueden engrosarse, tornarse cloróticas y, en algunos casos, corchosas. Además, ocurre una fuerte defoliación y caída de frutos, reducción del crecimiento, progresivamente la planta adopta un aspecto esparcido y ocurre la muerte regresiva de las ramas (Bové, 2006; Deng, et al., 2008). Los cultivares de naranjos (Citrus sinensis (L) Osbeck), mandarinos (Citrus reticulata Blanco) y pomelos (Citrus paradisi Macf) manifiestan la mayor diversidad de síntomas en hojas y frutos. Los síntomas más relacionados con la enfermedad en estos cultivares incluyen los brotes cloróticos, hojas con moteado asimétrico difuso, carencia de zinc, frutos deformados y con inversión de color, así como declinamiento de la planta (ramas secas y defoliación). En los limoneros (C. limon Burn), limeros ácidos (C. aurantifolia 19

21 Descripción Detallada Swingle y Citrus latifolia Tanaka, C. volkameriana Tan. & Pasq., C. macrophylla y otras especies similares, el moteado asimétrico es muy contrastante y resulta muy fácil de distinguir. En estas especies es raro observar síntomas en frutos, defoliación y ramas secas y el deterioro de la planta ocurre más lentamente (Bové, 2006; Deng, et al., 2008). El manejo de HLB es complejo y requiere una estrategia integrada que necesariamente incluya el uso de material de propagación certificado, la eliminación de las fuentes de inóculo, el uso de plaguicidas químicos para controlar los vectores psílidos en los viveros y plantaciones y el control de estos en otras plantas hospedantes. Además, para el manejo de la enfermedad se necesitan metodologías de diagnóstico rápidas y robustas, estudios epidemiológicos de la enfermedad para estudiar su comportamiento en cada región geográfica, así como de los vectores y su control (Halbert y Manjunath, 2004). El diagnóstico de los agentes causales de HLB se ha realizado mediante varias metodologías como la microscopia electrónica, diagnóstico biológico, hibridación de ácidos nucleicos, métodos serológicos y varios formatos de PCR (Bové, 2006). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es uno de los métodos de diagnóstico más empleados en la actualidad debido a los elevados valores de especificidad y sensibilidad que desarrolla esta técnica. Las principales plataformas de PCR están basados en la amplificación de fragmentos de la región 16S del ADN ribosomal de las especies asiática y africana de la bacteria (cebadores OI1/OI2c/OA1) (Jagoueix et al., 1996). Para discernir entre ambas especies, se lleva a cabo la digestión de estos productos de amplificación, con la enzima de restricción Xba I (Jagoueix, et al., 1994). Otro de los métodos empleados se basa en la amplificación de un fragmentos del operón ribosomal rplkajl (cebadores rpla2/rplj5) que permite distinguir entre ambas especies de Ca. Liberibacter incluso en infecciones mixtas (Hocquellet et al., 1999). La PCR anidada es una variación de la PCR convencional que utiliza dos pares de cebadores, uno de los cuales amplifica un fragmento incluido dentro de la secuencia amplificada por el otro, lo cual aumenta la sensibilidad y especificidad con respecto a la PCR convencional (OIE, 2008). Es por ello que esta técnica ha sido muy utilizada en el diagnóstico de patógenos que se encuentran en concentraciones muy bajas en los extractos de ADN (Chen et al., 2009; Teixeira et al., 2008a). HLB fue informada en Cuba en 2007 asociada a la especie asiaticus, y actualmente se encuentra distribuida en todo el país, al igual que su vector D. citri (González et al., 2007; Luis et al., 2009). La enfermedad ha causado un alto impacto económico en la citricultura cubana, por lo que se ha considerado un serio problema para el cultivo que limita el 20

22 Descripción Detallada desarrollo del mismo en el país (Llauger et al., 2011). Desde la detección de D. citri en Cuba en el año 1999, se iniciaron estudios encaminados a sentar las bases para su manejo, entre los que se incluyeron el comportamiento de su población y la incidencia de los enemigos naturales en diferentes regiones del país. Asimismo, se determinó que la presencia de brotes jóvenes en las plantas de cítricos constituye un factor clave en el comportamiento de esta especie de vector (González et al., 2008). A su vez, inmediatamente a la detección de CLas en el país, se implementaron varias metodologías para el diagnóstico como la PCR convencional, la PCR dúplex y la tinción de iodo (Luis et al., 2009). Sin embargo, además de los estudios encaminados al diagnóstico de la enfermedad y el control del vector, se requieren realizar estudios epidemiológicos que permitan definir la evolución de la enfermedad en las principales áreas citrícolas. Este trabajo se condujo siguiendo los siguientes objetivos: (1) optimizar y estandarizar la PCR anidada como método para la confirmación de la presencia de CLas en muestras con síntomas dudosos, (2) evaluar el complejo de síntomas asociados a la enfermedad HLB en plantaciones de los cultivares naranjo dulce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) y pomelo (Citrus paradisi, así como su progreso temporal, (3) determinar el progreso temporal de la enfermedad en plantaciones de estos cultivares y sometidas a diferentes niveles de intervención en el manejo, así como su relación con la dinámica poblacional de D. citri, y (4) evaluar la diseminación espacial de HLB en las plantaciones en estudio. La integración de estos resultados contribuirá a mejorar la estrategia de manejo de HLB en Cuba, con el objetivo de la reducción de las pérdidas económicas asociadas a esta enfermedad y garantizar la supervivencia de la citricultura. 4.2 Diseño y selección de las áreas experimentales para la implementación de los estudios epidemiológicos de la enfermedad huanglongbing de los cítricos en tres regiones de Cuba Para cumplimentar los objetivos propuestos se seleccionaron ocho plantaciones distribuidas en tres empresas: Cítricos Ceiba, Artemisa, Empresa de Cítricos Victoria de Girón, Matanzas y Empresa Agroindustrial Ceballos, Ciego de Ávila (Figura 2), que serán denominadas en lo adelante Ceiba, Jagüey y Ceballos, respectivamente. Estas empresas operan las mayores áreas citrícolas y tienen los planes de desarrollo más amplios entre todas las empresas que se agrupan en el Grupo Empresarial Frutícola (GEF) de Cuba. De manera general, todos los campos tienen riego localizado, excepto el campo CEI 1112, de Ceiba. Las áreas fueron establecidas con material de propagación certificados 21

23 Descripción Detallada Figura 2. Ubicación de las empresas incluidas en el estudio: Cítricos Ceiba, Artemisa, Empresa Agroindustrial Victoria de Girón, Matanzas y Empresa Agroindustrial Ceballos, Ciego de Ávila en las que se situaron las áreas experimentales. procedentes de instalaciones del Sistema Nacional de Producción de Material de Propagación Certificado de Cítricos. En todos los campos seleccionados se inspeccionó el 100% de las plantas dentro de los diferentes bloques experimentales (el tamaño del bloque depende de cada área en particular, Tabla 1) y se anotaron todos los síntomas que mostraban las plantas en el momento de la inspección para conformar una base de datos. Ceiba: Se evaluaron dos bloques de 900 plantas de los campos: CEI 1112 (20 hileras por 45 plantas, plantado en abril de 2007 con naranjo dulce (Citrus sinensis L. Osb.) cv. 'China' injertado sobre citrumelo 'Swingle' (Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) y CEI 3184 (30 hileras por 30 plantas, plantado en septiembre de 2007 con naranjo 'Valencia' injertado sobre mandarino 'Cleopatra' (Citrus resnhi Hort. ex Tan) de las UBPC 30 de noviembre y 9 de abril, respectivamente (Tabla 1). La plantación CEI 1112 colinda con una de tangelo Sampson injertado sobre naranjo agrio, de más de 30 años de plantada, con más del 50% de las plantas con síntomas de HLB y sin atenciones culturales. Por otro lado, el campo CEI 3184 estaba situado en frente de un bloque de limero Persa de más de cinco años de plantado y con una alta incidencia de HLB en toda el área. Al fondo de esta plantación se encuentra un campo de pomelo Marsh injertado sobre naranjo agrio plantado en En ninguna de las áreas se practica la eliminación de plantas con síntomas y el control del vector no es riguroso. Para realizar los muestreos de las poblaciones de D. citri se realizaron evaluaciones quincenales, al 10% de las plantas de fomento de naranjo en los campos CEI 1112 y CEI En cada planta evaluada se contabilizaron los brotes susceptibles al ataque de D. 22

24 Descripción Detallada citri y los brotes atacados por huevos, ninfas y adultos del insecto. Los adultos observados en otros brotes también fueron contabilizados. Jagüey: Se seleccionaron dos bloques denominados JG T-25-3a y JG T-25-3b, compuestos por plantas de pomelo 'Marsh Jibarito' (Citrus paradisi Macf) injertadas sobre citrange 'Carrizo' (Citrus sinensis (L.) Osb. x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) (Tabla 1). Estas áreas se ubican en la Granja 1, lote T-25, cuadrante 3, banda C. Ambos bloques, de 832 plantas, están conformados por 32 hileras de 26 plantas cada uno y fueron plantados en abril de Al costado y en toda la parte del frente de las dos plantaciones se ubican bloques de plantaciones de entre 20 y 30 años de naranjo dulce, con alta incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB. En ninguna de las áreas se práctica la eliminación de plantas con síntomas y el control del vector es riguroso. Tabla 1. Campos incluidos en las evaluaciones epidemiológicas en cada área citrícola. Campo Localidad Ubicación Total de Fecha Cultivar Patrón plantas plantación CEI 1112 Ceiba UBPC 30 nov /2007 Naranjo China Citrumelo swingle CEI 3184 Ceiba UBPC 9 abril 900 9/2007 Naranjo Valencia Mandarino Cleopatra JGT-25-3a Jagüey Grande G-1 T-25 3C 832 4/2007 Pomelo Marsh Jibarito Citrange carrizo JGT-25-3b Jagüey Grande G-1 T-25 3C 832 4/2007 Pomelo Marsh Jibarito Citrange carrizo CA 1497 Ceballos UBPC Lenin Pomelo Rio Red Citrus macrophylla CA 1498 Ceballos UBPC Lenin 800 9/2008 Pomelo Rio Red C. macrophylla CA 2041 Ceballos UBPC Wilber Segura 400 7/2007 Pomelo Rio Red Mandarino Cleopatra CA 4185 Ceballos F-Ceballos /2011 Limero Persa Naranjo agrio Las evaluaciones de las poblaciones de D. citri se realizaron en el campo de fomento de pomelo JGT-25-3a. En esta área se marcaron 20 plantas distribuidas en dos diagonales cruzadas y cada diez días se recolectaron cuatro brotes susceptibles al ataque del vector por planta, uno por cada punto cardinal. Los brotes se llevaron al laboratorio y se observaron bajo la lente 16X de un microscopio estereoscópico, contabilizándose los huevos, ninfas y adultos presentes. Ceballos: Se seleccionaron cuatro campos: dos de pomelo 'Rio Red', injertado sobre mandarino 'Cleopatra' (campos CA 1497 y CA 1498), uno de pomelo 'Rio Red', sobre 23

25 Descripción Detallada patrón Citrus macrophylla Wester (campo CA 2041) y otro de limero 'Persa' sobre naranjo agrio (4185), de las UBPC Wilber Segura (CA 1497 y CA 1498) y Lenin (CA 2041) y la finca estatal Ceballos 9 (CA 4185) (Tabla 1). En el campo CA 2041, que se plantó en julio de 2007, y en el campo CA 1497, plantado en diciembre de 2008, se evaluaron 400 plantas en un bloque de 20 x 20 plantas. Por otra parte en el CA 1498, plantado en septiembre de 2008, fueron observadas 800 plantas incluidos en un área de 20 x 40, mientras que en el CA 4185, plantado en febrero de 2011, se observaron 896 plantas agrupadas en un bloque de 28 x 32. Los campos CA 1497, CA 1498 y CA 2041 se encontraban colindantes a plantaciones comerciales de más de 20 años con elevada incidencia de HLB, mientras que el campo CA 4185 colinda por el sudeste con plantas aisladas de limero Persa sobre naranjo agrio de aproximadamente 15 años de edad perteneciente al sector privado y con síntomas asociados a HLB. Los campos CA 1497, CA 1498 y CA 2041 se encontraban colindantes a plantaciones comerciales de más de 20 años con elevada incidencia de HLB, mientras que el campo CA 4185 colinda por el sudeste con plantas aisladas de limero Persa sobre naranjo agrio de aproximadamente 15 años de edad perteneciente al sector privado y con síntomas asociados a HLB. La eliminación de plantas con síntomas se mantuvo durante una parte del periodo evaluado y se realizó control del vector. Para determinar las poblaciones de D. citri se marcaron 25 plantas y se observaron semanalmente todos los brotes de las plantas marcadas con ayuda de una lupa con aumento 10x y dos ramas por planta se analizaron en el laboratorio con un microscopio estereoscopio. En cada planta se contabilizaron los brotes susceptibles al ataque del insecto y el número de brotes con D. citri (huevos, ninfas, adultos). 4.3 Implementación de herramientas para la confirmación molecular de la infección por Candidatus Liberibacter asiaticus en las áreas en estudio Los experimentos de epidemiología requieren el diagnóstico certero del estado sanitario de las plantas que se incluirán en cada una de las plantaciones que se seleccionen para el desarrollo de los mismos. La detección de CLas en Cuba se ha realizado mediante la amplificación del ADN 16Sr con los cebadores OI1 (5') y OI2c (3') utilizando la plataforma de PCR convencional (Luis et al., 2009). Sin embargo, varios autores han informado que con el uso de esta metodología no es posible el diagnóstico de las bacterias en muestras de hojas que no presentan los síntomas de moteado asimétrico (Mackay et al., 2002; Li et al., 2006, 2007, 2008; Texeira et al., 2008; Palacio-Bielsa et al., 2009). 24

26 Descripción Detallada En este sentido, se desarrolló otra variante de PCR, la PCR anidada (npcr, por las siglas en inglés nested PCR), método que emplea dos reacciones de amplificación en las que el producto de la primera reacción es el sustrato de la segunda. La primera reacción se efectuó con los cebadores externos FD1/RP1, los cuales amplifican un fragmento de 2,0 kb de la región 16S del ADNr de procariontes (Weisburg et al., 1991). La segunda reacción utiliza los cebadores internos OI1/OI2c que son específicos para el ADNr 16S de CLas y que amplifican un fragmento de 1160 pb a partir del producto de amplificación de la primera reacción (Jagoueix et al., 1994). Esta aproximación diagnóstica diferente permite realizar el diagnóstico con una sensibilidad analítica hasta 100 veces superior a la PCR convencional, y similar a la que se obtiene utilizando la PCR cuantitativa (Texeira et al., 2008b). Además, esta técnica posibilita reducir la influencia que inhibidores como los polifenoles tienen en la PCR convencional, como ha sido observado en múltiples ensayos de detección de patógenos (Robene-Soustrade et al., 2006; Cullen y Lee, 2007; Palacio-Bielsa et al., 2009) Cuantificación de CLas en muestras de ADN de cítricos empleadas como controles positivos para la optimización de la PCR anidada. Para contar con controles positivos con el título bacteriano calculado y que permitieran calcular los parámetros de evaluación de la PCR anidada con mayor exactitud se estimó el título de bacteria en muestras foliares colectadas en varias provincias de Cuba (Tabla 2). Para la cuantificación se empleó la PCR en tiempo real a través de la metodología SYBR Green. La reacción se llevó a cabo en 25 µl de volumen total conteniendo: 1X de Master Mix (Applied Biosystems), 10 µm de los cebadores AsF-161 y AsR-406 (Teixeira et al., 2008b) y 500 ng de ADN total. La amplificación se realizó en un termociclador a tiempo real: StepOne Real time-pcr (Applied Biosystems), aplicando el siguiente programa: 35 ciclos de 95ºC por 10 minutos, 95ºC por 25 segundos y 63ºC por 60 segundos. Para realizar la cuantificación del número de copias de ADN de la región del operón rplkajl de la bacteria, se utilizaron 8 diluciones seriadas de concentración conocida (50 pg/µl-0,005 fg/µl) de un plásmido con un fragmento del gen rpll clonado. En cada amplificación se incluyeron dos controles negativos (ADN de una planta de cítrico sana y agua), un control positivo, y las diluciones de los plásmidos estándar. Cada muestra de ADN fue amplificada por triplicado. El número de copias en cada dilución del plásmido estándar se determinó a través de la siguiente fórmula: # copias/µl = [Concentración del 25

27 Descripción Detallada plásmido en g/µl/ (número de bases del plásmido + número de bases del amplicón) x peso promedio en Daltons de una base en la doble cadena: 660] x número de Avogadro: 6,022 x A través del programa de análisis de datos StepOne software V2.1 se obtuvo la media de la cantidad de copias en 500 ng de ADN total de las tres réplicas de cada aislado. Las extracciones de ADN se realizaron empleando el método de Murray y Thompson (1980), en el cual, partiendo de 500 mg de tejido fresco y resuspendiendo en 100 µl de agua destilada estéril se obtiene alrededor de 500 ng/µl de ADN total, por lo que cada microlitro de ADN total en la reacción de PCR representa 5 mg de tejido fresco. Se dividió entre 5 el valor obtenido para representar los resultados como: número de copias/mg de tejido fresco. Considerando que el operón rplkajl presenta una copia en el genoma de CLas (Kim y Wang, 2009), se estimó que el número de bacterias coincide con el número de copias de esta región cuantificadas por este método. Como resultado de la amplificación con los cebadores AsF-161/ AsR-406 a través del método de SYBR Green de PCR en tiempo real se obtuvieron fragmentos con la talla esperada 161 pb (Teixeira et al., 2008b) (resultados no mostrados). La cuantificación realizada a través de la comparación de la emisión de fluorescencia de cada aislado con lo emitido por los controles estándar de concentración conocida permitió determinar el número de copias del gen rpll por cada g de tejido vegetal fresco de muestras de ADN de cítricos infectadas por CLas de varias provincias del país (Tabla 2). Estos controles se utilizaron posteriormente en la estandarización de la npcr. Así como en los subsiguientes ensayos de verificación del estado sanitario de las plantas en las áreas en estudio. Tabla 2. Resultados de la cuantificación del número de copias del gen rpll de Ca. Liberibacter asiaticus presente en muestras de cítricos de diferentes regiones geográficas de Cuba por el método de la curva de calibración. Muestra Procedencia Ct (medio) Número de copias/g de tejido vegetal (medio) Control positivo Sao Paulo, Brasil 21,3 1,6 x La Habana 19,27 1,1 x Matanzas 21,41 3,2 x Cienfuegos 22,45 1,74 x Banes, Holguín 23,25 1,1 x Pinar del Río 21, 00 3,8 x

28 Descripción Detallada Optimización de la PCR anidada para el diagnóstico de HLB Para evaluar los parámetros de desempeño de la PCR anidada se recolectaron 182 muestras de hojas de diferentes cultivares cítricos que presentaban síntomas asociados a HLB (brotes cloróticos, moteado asimétrico difuso, clorosis internervial por deficiencia de cinc, nervadura clorótica y corchosa). Las muestras fueron colectadas en plantaciones de las provincias de Pinar del Río, La Habana, Artemisa, Matanzas, Cienfuegos, Holguín y Santiago de Cuba, así como 76 plantas que fueron utilizadas como controles negativos y que se obtuvieron mediante la siembra in vitro de semillas certificadas que se mantuvieron en condiciones de aislador protegido con malla antiáfidos. Se purificó el ADN de las muestras foliares colectadas empleando la metodología de Murray y Thompson (1980). Para optimizar la PCR anidada para el diagnóstico de CLas se variaron un conjunto de parámetros físicos y químicos de ambas reacciones y se usaron los controles positivos previamente cuantificados por PCR en tiempo real. Se empleó una mezcla básica con volumen total de 25 μl que contuvo: tampón de PCR 1X (Tris-HCl 20 μm ph 8,4, KCl 50 μm); 0,5 μm de cada uno de los cebadores (FD1/RP1 para la primera reacción y OI1/OI2c para la segunda), 200 μm de dntps, 1u de Taq ADN polimerasa y 1,0 μl de ADN para la primera amplificación (100 ng/μl) y una dilución de 1/5 del producto de amplificación de la primera PCR para la segunda. Cada uno de los parámetros se varió individualmente, manteniendo invariables el resto de las condiciones mencionadas anteriormente. En la primera reacción de PCR se evaluaron tres concentraciones de cloruro de magnesio: 1,5 mm; 2,0 mm y 2,5 mm. De la misma forma, para seleccionar la concentración de cebadores (FD1/RP1) más adecuada se ensayaron tres concentraciones finales: 0,3; 0,5 y 1,0 μm. Con el uso de todas las concentraciones de reactivos utilizadas se amplificaron fragmentos de ADN con la talla esperada, lo que es una muestra de la capacidad del ensayo de ofrecer resultados similares en diferentes condiciones (resultados no mostrados). Sin embargo, se seleccionó 1,5 mm de MgCl 2 y 0,5 µm de cada cebador como concentraciones de uso de estos reactivos en la primera reacción de los ensayos posteriores. Para determinar el balance óptimo de deoxinucleótidos y cloruro de magnesio, en la segunda reacción se ensayaron nueve combinaciones de dntps/mgcl 2 : 150 μm/1,5 mm; 150 μm/2,0 mm; 150 μm/2,5 mm; 200 μm/1,5 mm; 200 μm/2,0 mm; 200 μm/2,5 mm; 300 μm/1,5 mm; 300 μm/2,0 mm; 300 μm/2,5 mm, utilizando los productos obtenidos en la primera amplificación. Posteriormente se evaluaron tres concentraciones finales de cebadores (OI1/OI2c): 0,3 μm; 0,5 μm y 1,0 μm en la segunda reacción de PCR utilizando 27

29 Descripción Detallada como molde los productos de la primera amplificación empleando 0,5 μm de cloruro de magnesio. Se ensayaron varias diluciones de los productos de la primera reacción para determinar una concentración media aproximada para la segunda amplificación adecuada para el trabajo de diagnóstico. Se evaluaron varias diluciones del producto de amplificación de la primera reacción como ADN de partida para la segunda amplificación (producto sin diluir, 1/5, 1/20, 1/50, 1/100). Los resultados de la evaluación de diferentes concentraciones de cloruro de magnesio en la segunda amplificación respecto a las diferentes concentraciones utilizadas en la primera difieren en cuanto al rendimiento (Figura 3). Se observó un incremento de este en la medida que se aumentó la concentración, y los mayores rendimientos se obtuvieron empleando 2,0 mm. No obstante, no se observaron diferencias considerables al utilizar las combinaciones 1,5 mm/2,0 mm y 2,0 mm/2,0 mm, por lo que se seleccionó la combinación de menor cantidad de reactivos (1,5 mm [1 ra reación]/2,0 mm [2 da reación]), resultado que están en correspondencia con los informados en la literatura para análisis similares (Texeira et al 2008b). En la optimización de las cantidades de dntps se obtuvieron los mejores resultados utilizando 2,0 mm de cloruro de magnesio en combinación con 150 y 200 μm de dntps. Se seleccionó la concentración de 200μM de dntps y 2,0 mm de MgCL 2 debido al mejor rendimiento y calidad de las bandas obtenidas. Por otro lado, en el ajuste de la concentración inicial de los cebadores se utilizaron varias combinaciones en la segunda amplificación y se obtuvieron bandas de la talla esperada en todas las combinaciones con Figura 3. Evaluación del efecto de la variación de la concentración de cloruro de magnesio (c(mgcl 2 )) en la PCR anidada. Electroforesis en gel de agarosa al 8% de los productos de amplificación de la segunda reacción empleando 1,0 mm, 1,5 mm y 2,0 mm de MgCl 2 obtenidos a partir de la primera amplificación empleando 1,5 mm, 2,0 mm y 2,5 mm de MgCl 2. Carriles 1-3 muestras de ADN de plantas: A: LH1141, B: 1141, C: 1474, C-: agua. M: marcador de peso molecular 1kb. 28

30 Descripción Detallada rendimientos similares, por lo que se seleccionó la concentración de 0,5 µm de cada uno de los cebadores como concentración de uso. De acuerdo a los resultados obtenidos ensayando diferentes muestras se determinó que la dilución más adecuada era la de 1/5 y se seleccionó para las evaluaciones subsiguientes. La realización de diluciones entre la primera y la segunda amplificación es un aspecto variable en experimentos realizados por otros investigadores, ya que en algunos casos se utiliza el producto de amplificación directamente y en otros se realizan diluciones de hasta 1/10 (Llop et al, 2000; Deng et al. 2008; Teixeira et al., 2008b) Variación de las condiciones de amplificación Los parámetros físicos de amplificación se evaluaron variando los tiempos de incubación y las temperaturas de anillamiento. Se ensayaron además amplificaciones sin el paso de desnaturalización inicial y polimerización final con el control LH1141 (Tabla 2). Se partió de dos programas básicos para la primera y segunda reacción. Para la primera amplificación: desnaturalización inicial a 94ºC durante dos minutos, 35 ciclos de: desnaturalización a 94ºC por un minuto, acoplamiento de cebadores a 52ºC por un minuto, polimerización a 72ºC por 90 segundos y un paso de polimerización final de 72ºC por cinco minutos. Para la segunda reacción las condiciones fueron las siguientes: 35 ciclos de: desnaturalización a 94ºC por 40 segundos, acoplamiento de cebadores a 62ºC por 40 segundos y polimerización a 72ºC por 50 segundos. Se varió cada parámetro de forma independiente, dejando constante el resto de las condiciones de amplificación. Para evaluar la temperatura más adecuada para el acoplamiento de los cebadores se utilizaron programas de amplificación aplicando gradiente de temperatura. Para la primera amplificación se seleccionaron dos muestras de ADN foliar (1141 y 1223) con diferentes títulos de la bacteria (Tabla 2). Se ensayaron 12 temperaturas de anillamiento: 43,5ºC; 43,7ºC; 44,6ºC; 46ºC; 47,8ºC; 49,9ºC; 52,1ºC; 54,3ºC; 56,3ºC; 58ºC; 59,3ºC y 60ºC. Para la segunda reacción se utilizaron diluciones 1/5 de ambos productos de amplificación, obtenidos utilizando 52ºC como temperatura de acoplamiento y se amplificó a las siguientes temperaturas: 59,4ºC; 59,7ºC; 60,7ºC; 62,1ºC; 64ºC; 66,1ºC; 68,3ºC; 70,4ºC; 72,4ºC; 74,1ºC; 75,3ºC y 76ºC. En la primera amplificación no se observaron diferencias apreciables entre las temperaturas evaluadas por lo que se seleccionó una temperatura intermedia (52ºC). Condiciones similares para la primera amplificación fueron establecidas por Teixeira y colaboradores, 2008b al emplear una PCR anidada similar para la detección de CLas y 29

31 Descripción Detallada CLam. En la segunda amplificación, los resultados mostraron diferencias apreciables entre una y otra muestra de acuerdo probablemente a que el incremento de la astringencia de la reacción limita la amplificación en correspondencia con la menor cantidad de patógeno. De las temperaturas evaluadas, se seleccionó 62ºC como temperatura adecuada para la amplificación, resultados similares a los informados en la literatura para esta reacción (Teixeira et al., 2008b) Determinación del límite de detección de la PCR anidada Para determinar el límite de detección de la técnica se amplificaron varias diluciones en agua (1, 1/25, 1/50, 1/250, 1/500, 1/1000, 1/5000) del ADN total de una planta de cítrico infectada por CLas a una concentración inicial de 100 ng/μl donde la cantidad de equivalentes de genoma de la bacteria se había cuantificado previamente. Se emplearon las mezclas de reacción con las condiciones optimizadas para la primera y segunda amplificaciones. Utilizando estas condiciones se obtuvo amplificación hasta una dilución de 1/1000 (0,1 ng/µl), lo que se corresponde con 1,1 x 10 2 copias de fragmentos del gen rpll y 110 bacterias por gramo de tejido vegetal (Figura 4). Resultados del mismo orden de sensibilidad analítica fueron obtenidos por Teixeira y colaboradores (2008) a través de una PCR anidada para el diagnóstico de CLam empleando cebadores que amplifican la misma región del genoma amplificada en este estudio. Así mismo los resultados son similares a los obtenidos por Wang y colaboradores (2006) empleando la metodología de la PCR en tiempo real con sondas TaqMan y SYBR Green (Teixeira et al., 2008b; Wen et al., 2009). Este límite de detección es de 10 a 100 veces mayor que el obtenido empleando la PCR convencional con cebadores OI1/OI2c, con la cual Li y colaboradores (2007) obtuvieron amplificaciones hasta una dilución de 10-2 de 200 μl de ADN total extraído por el método Figura 4. Evaluación del límite de detección de la PCR anidada. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de la segunda amplificación a partir de diluciones seriadas del extracto de ADN total de la muestra LH1141 infectada con Ca. L. asiaticus, realizadas en agua destilada estéril: 1: 1/5, 2: 1/10, 3: 1/25, 4: 1/50, 5: 1/100, 6: 1/250, 7: 1/500. M: marcador de peso molecular 1kb. 30

32 Descripción Detallada QIAGEN a una concentración inicial de 50 μg/ml. Texeira y colaboradores (2008) detectaron 10 4 bacterias en 10 ng de ADN total mediante este PCR convencional. Sin embargo el límite de detección de la PCR convencional fue superior (3,9 fg/μl) al emplear un plasmidio con el fragmento de la región 16S del ADN clonado (Wang et al., 2006) Cálculo de los parámetros de validación de la PCR anidada La PCR anidada optimizada se estandarizó a través de 20 repeticiones inter-ensayo y cinco repeticiones intra-ensayo de los controles 1141, 1474, 1223 (Tabla 2) y tres controles negativos: dos muestras de ADN total de plantas de cítricos provenientes de viveros protegidos por malla antiáfidos de Pinar del Río y uno mantenido en condiciones similares en Sao Paulo, Brasil. Las amplificaciones de los controles mostraron resultados coincidentes en el 100% de los casos: una banda de 1160 pb según lo esperado para CLas empleado el par de cebadores utilizados (Jagoueix et al., 1994). Para determinar los parámetros de desempeño de la metodología se elaboró una tabla de contingencia con los resultados del análisis a través de la PCR anidada optimizada, de una población de 182 controles: 106 positivos y 76 negativos (Tabla 3), los que en su conjunto garantizan una proporción equilibrada de controles positivos y negativos (Ochoa et al., 2000; OIE, 2008). La población incluyó 76 controles negativos de 19 cultivares diferentes obtenidos in vitro o mantenidos en condiciones de aislador y 182 controles positivos de 51 cultivares cítricos diferentes recolectados en diferentes provincias de Cuba. Como controles positivos de referencia para la evaluación de la PCR anidada se consideraron plantas que mostraban el síntoma de moteado asimétrico difuso, síntoma característico de la enfermedad (Bové, 2007). Se calcularon los parámetros de desempeño según las fórmulas de Jacobson (1996). Los intervalos de confianza para los parámetros estimados fueron calculados usando la aproximación del error estándar para las proporciones de las distribuciones binomiales (Gardner y Altman, 1989). Tabla 3. Tabla de contingencia de los resultados del análisis de la población de controles de plantas de cítricos, a través de la PCR anidada para la detección de Ca. L. asiaticus, empleados para el cálculo de los parámetros de validación Resultados de la Estado sanitario de la planta Total técnica Infectados Sanos Positivos Negativos Total

33 Descripción Detallada Se obtuvieron dos falsos positivos al realizar la amplificación de los controles negativos debido a contaminación durante la manipulación de los productos amplificados, altamente volátiles, al realizar las diluciones de la primera amplificación para ser empleadas como muestra de partida en la segunda. Este es un inconveniente de las técnicas de reamplificación que ha sido discutido por diferentes autores (Llop et al., 2000; Wolf et al., 2010) y que pudiera solucionarse realizando ambas reacciones en un mismo tubo sin abrirlos entre una y otra. Sin embargo, este tipo de ensayo incrementa las probabilidades de inhibición debido al exceso de reactivos presentes en la reacción. A partir de los datos mostrados en la Tabla 3, se calcularon los parámetros de validación (Tabla 4). Los resultados de la sensibilidad diagnóstica y el valor predictivo positivo indican una alta probabilidad de que los resultados positivos coincidan con plantas infectadas, considerando que el 90% de los controles utilizados eran muestras de campo en estadios iníciales de la enfermedad, en los cuales se ha informado que presentan bajos títulos de la bacteria (Tsai et al., 2008) la especificidad obtenida muestra la gran confiabilidad de esta técnica en la discriminación de la presencia de la enfermedad teniendo en cuenta una prevalencia media debido a la baja probabilidad de obtener falsos positivos (Olmos- Castelló et al., 2008). El valor predictivo negativo muestra que existe un 75% de probabilidades de obtención de resultados negativos a partir de plantas sanas. El valor de razón de verosimilitud positiva demuestra la alta confiabilidad de la técnica para la detección de la enfermedad independientemente de la prevalencia de la misma, lo cual es de gran importancia para su aplicación en viveros donde la prevalencia es cercana a cero y la hace apropiada como prueba de diagnóstico. Los resultados obtenidos permiten realizar una valoración previa de la factibilidad de la utilización de la técnica para el diagnóstico de HLB en estadios más tempranos de la infección en la planta. Tabla 4. Resultados del cálculo de los parámetros de validación obtenidos a partir del análisis de la población de controles de plantas de cítricos empleadas en el estudio. Parámetro Valor ± Error Parámetro Valor ± Error Prevalencia 58,2%±0,0366 Tasa de falsos negativos 24,5%±0,0319 Precisión 84,61%±0,0319 Valor predictivo positivo 97,6%±0,0114 Sensibilidad diagnóstica 75,4%±0,0319 Valor predictivo negativo 74%±0,0325 Especificidad diagnóstica 97,3%±0,0119 Razón de verosimilitud positiva 28,68 Tasa de falsos positivos 2,6%±0,0119 Razón de verosimilitud negativa 0,2519 Para la determinación de la concordancia entre la PCR anidada y la convencional se elaboró una tabla de contingencia con los resultados obtenidos del análisis de la población de controles antes mencionada, a través de la PCR anidada y la convencional 32

34 Descripción Detallada empleando los cebadores OI1/OI2c (Jagoueix et al., 1994). Se evaluó a través de la PCR anidada optimizada y la PCR convencional empleando iguales cebadores internos, una población de 167 muestras de 51 cultivares cítricos recolectados en diferentes provincias de Cuba y 76 controles negativos de 19 cultivares diferentes (Tabla 5). Con estos datos se calculó el índice de Kappa de Cohen como indicador de concordancia entre ambas técnicas en el análisis de muestras con síntomas característicos de la enfermedad y de muestras con síntomas menos característicos (Cohen, 1960; Landis y Koch, 1977). Tabla 5. Valores de contingencia obtenidos a través de la PCR anidada y la PCR convencional a partir del análisis de controles de ADN de plantas de cítricos, negativos y positivos para CLas mostrando síntomas característicos de HLB (A) y mostrando síntomas menos característicos asociados a HLB (B). A Análisis de muestras con PCR convencional síntomas característicos de Total HLB Positivo Negativo Positivos PCR anidada Negativos Total B Análisis de muestras con PCR convencional síntomas no característicos Total de HLB Positivo Negativo Positivos PCR anidada Negativos Total El análisis de los datos mostró un índice Kappa de Cohen de 0,7374, lo cual indica que existe una concordancia considerable entre los resultados de la PCR convencional y la PCR anidada, según lo establecido (0,61-0,80) para los estándares aplicados en veterinaria y medicina (Landis y Koch, 1977; Ochoa et al., 2000). La superioridad del límite de detección de la PCR anidada respecto a la convencional y los valores de concordancia con los síntomas no característicos de HLB, los cuales pueden presentarse en condiciones tempranas del desarrollo de las plantas cítricas, indican que la PCR anidada es recomendable para el diagnóstico en las plantaciones seleccionadas para los estudios de epidemiología de la enfermedad. A partir de estos resultados se utilizó esta técnica como prueba confirmatoria de la presencia de CLas en los campos incluidos en los estudios como se describirá más adelante. 33

35 Descripción Detallada Diagnóstico mediante PCR anidada de muestras con síntomas sospechosos de HLB en las áreas en estudio Para corroborar la presencia de CLas en las plantas de las áreas de estudio que presentaban síntomas de moteados similares al asimétrico, pero que no se mostraban claramente, así como plantas con diversos síntomas asociados a la enfermedad pero sin presentar el moteado asimétrico, se colectaron hojas de cada una y se realizó el análisis con la técnica de la PCR anidada de un total de 529 muestras, colectadas en todas las áreas en las que se desarrollaron los experimentos (Tabla 6). Tabla 6. Resultados del análisis mediante la PCR anidada para la detección de Ca. Liberibacter asiaticus en muestras colectadas en los campos incluidos en las evaluaciones epidemiológicas en cada área citrícola. Masi: moteado asimétrico, DNut: deficiencias nutricionales, BClo: brotes cloróticos, VCl: venas cloróticas, VCor: venas corchosas, Hpa: hojas pequeñas y acucharadas. Campo Resultados positivos en la PCR anidada en hojas con el síntoma/total de muestras analizadas Masi* DNut BClo VCl VCor Hpa CEI /30 (100%)** 8/10 (80%) CEI /45 5/7 (100%) (71,4%) JGT-25-3a 40/40 11/15 (100%) (73,3%) JGT-25-3b 25/25 5/8 (100%) (62,3%) CA /38 7/11 (97,4%) (63,6) CA /20 3/5 (100%) (60%) CA /30 3/4 (96,7%) (75%) CA /30 5/8 (100%) (62,3%) *Síntoma de moteado asimétrico dudoso **Porcentaje que representa 3/5 (96,7%) 5/7 (71,4%) 8/10 (96,7%) 8/10-3/5 (80%) (96,7%) 4/6 5/8 2/4 (66,6%) (62,3%) (50%) 2/4-7/8 (50%) (87,5%) 7/8 3/5 2/5 (87,5%) (60%) (40%) 2/5 4/6 2/5 (40%) (66,6%) (40%) 9/11 2/4 4/6 (81,8%) (50%) (66,6%) - 2/4 4/6 (50%) (66,6%) 2/10 (20%) 1/7 (14,3%) 4/10 (40%) 2/7 (28,6%) 1/8 (12,3%) 4/10 (40%) 2/7 (28,6%) 2/7 (28,6%) El análisis de los porcentajes de positividad de la PCR anidada para la detección de la presencia de CLas en los extractos de ADN de las hojas con diversos síntomas, mostró que la mayor coincidencia entre el resultado de la PCR y el número de hojas con el síntoma se obtuvo con el moteado similar al asimétrico (Tabla 6). Por otro lado, la correlación con los otros síntomas asociados a la enfermedad pero diferentes de moteado asimétrico fue baja, y se obtuvo el menos valor en las hojas pequeñas y acucharadas. La relación del síntoma de moteado asimétrico con la presencia de CLas en Cuba se observó de forma similar en experimentos realizados para la validación de la PCR dúplex, así 34

36 Descripción Detallada como en otras investigaciones en las que se utilizó la técnica de tinción con yodo de cortes histológicos (Collazo et al., 2010; Luis et al., 2010). Resultados similares se obtuvieron por otros autores con el uso de diversas metodologías de diagnóstico (Bové y Garnier, 2002; Gottwald et al., 2007; Llauger et al., 2008), incluso realizando análisis de PCR cuantitativo, una metodología con mayor sensibilidad que la PCR anidada (Teixeira et al., 2008b; Wenbin et al., 2009). Sin embargo, se ha demostrado que las metodologías de PCR anidada y PCR cuantitativa no detectan la presencia de las bacterias cuando se practicaron los análisis utilizando como tejido vegetal para las extracciones de ADN hojas con los síntomas relacionados (sin moteado asimétrico), colectadas de en plantas que mostraban moteados asimétricos en otras ramas (Teixeira et al., 2008b). El bajo título bacteriano, así como la distribución irregular de las bacterias en las plantas enfermas determinan estos resultados (Teixeira et al., 2008b; Wenbin et al., 2009). 4.4 Evaluación de la sintomatología asociada a HLB y su evolución en plantas de fomento de pomelo y naranjos La importancia de un diagnóstico rápido y preciso de las plantas infectadas por CLas en áreas citrícolas comerciales incrementa considerablemente el éxito de los programas de erradicación de HLB. Los síntomas asociados a esta enfermedad por sí mismos, no poseen valor diagnóstico, debido a las similitudes con los síntomas producidos por otras enfermedades (stubborn, tristeza, blight o Phytophthora spp.) y/o deficientes atenciones culturales. No obstante, en las plantaciones comerciales los plantas enfermas son reconocidos por el moteado asimétrico especialmente si está acompañado de otros síntomas asociados a la enfermedad (Gómez, 2010). Por esta razón, para corroborar la presencia de CLas en las plantas sintomáticas, es necesario el uso de otros métodos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que actualmente se considera la prueba principal para el diagnóstico de la enfermedad. No obstante el diagnóstico presuntivo de HLB en base a los síntomas asociados a esta enfermedad constituye una herramienta indispensable de trabajo en los programas de erradicación de plantas infectadas (Gómez, 2010). Para determinar la evolución temporal de los síntomas y su frecuencia de aparición en las plantas infectadas por HLB, se anotaron y almacenaron en cada muestreo los datos concernientes a los síntomas que se han asociado a la enfermedad HLB. Se registró la sintomatología observada en 382 plantas del campo CEI 1112 de Ceiba, y 53 plantas del 35

37 Descripción Detallada campo JG T-25-3a de Jagüey (Tabla 1). Las observaciones se realizaron con una frecuencia mensual y bimestral en Jagüey y Ceiba, respectivamente. Los resultados se incluyeron en una base de datos donde se registró la sintomatología de las plantas en cada evaluación. Para definir la presencia de síntomas asociados a infecciones por HLB se tuvo en cuenta la sintomatología descrita para esta enfermedad (Bové 2006). Se evaluó la presencia de brotes cloróticos, moteado asimétrico, venas corchosas, venas cloróticas, síntomas de carencias de zinc y manganeso (deficiencias nutricionales), brotes con hojas pequeñas y acucharadas, porte o aspecto esparcido del follaje, islas verdes y defoliación de las plantas. No se incluyeron en las evaluaciones los síntomas en frutos por ser plantaciones muy jóvenes Determinación de los síntomas asociados a HLB en las especies en estudio En las áreas escogidas para desarrollar el estudio, formadas con las especies de naranjo dulce 'China' y pomelo Marsh, las plantas de ambas especies mostraron síntomas, independientes o en combinaciones, de moteado asimétrico, brotes cloróticos, venas corchosas, venas cloróticas, islas verdes, hojas pequeñas y acucharadas, aspecto esparcido de la planta, deficiencias nutricionales y defoliación (Figura 5). Este complejo de síntomas se corresponde con los descritos para la enfermedad huanglongbing de los cítricos por varios autores (Bové, 2006; Deng, et al., 2008; Gómez, 2010; Coletta-Filho y Carlos, 2010). El síntoma de moteado asimétrico se observó en las hojas maduras de las dos especies cítricas de las que están conformadas las plantaciones en estudio (naranjo dulce 'China' y pomelo Marsh ) (Figura 5). El aspecto de moteado se caracteriza por la presencia de zonas parcialmente amarillas o verde claro y otras de coloración verde oscuro, que se mezclan entre sí, sin límites definidos. Los moteados fueron visibles por ambos lados de las hojas y distribuidos de forma asimétrica con relación a ambos lados de la vena central (Figura 5). La observación de la presencia de este síntoma en las plantaciones constituye un elemento importante para realizar el diagnóstico presuntivo de esta enfermedad en plantaciones comerciales. El moteado asimétrico ha sido observado en todas las regiones donde se ha informado el HLB con independencia del agente causal, el hospedero y las condiciones ambientales donde está establecido el cultivo (Bové, 2006). Por otra parte, en países como Estados Unidos, se considera que el moteado asimétrico es la herramienta 36

38 Descripción Detallada A B C D E F F G H I Figura 5. Síntomas asociados a la enfermedad HLB observados en las evaluaciones durante los experimentos de epidemiología en el campo de naranjo China de Ceiba del Agua, Artemisa (CEI 1112). (A): moteado asimétrico (MA), (B): brotes cloróticos (BCl), (C): venas corchosas (VC), (D): venas cloróticas (VCl), (E): islas verdes (IV), (F): deficiencias nutricionales de manganeso (DN), (G): defoliación (D), (H): brotes con hojas pequeñas, acucharadas y deficiencias de zinc (HP y DN), e (I): porte o aspecto esparcido del follaje (AE). de diagnóstico visual de HLB más importante, al permitir la detección en el campo de plantas infectadas del género Citrus y otros relacionados (Gómez, 2010). Los brotes cloróticos se presentaron en todas las plantas de pomelo en Jagüey Grande al menos una vez durante el período de 19 meses de evaluación. Con relación a la presencia de este síntoma es importante destacar que la clorosis generalizada de los brotes no es considerada un síntoma asociado a HLB, aunque es característico de esta 37

39 Descripción Detallada enfermedad la presencia de estos brotes de forma aislada en la planta (Colleta-Filho y Carlos, 2010). En el caso de la plantación de pomelo de Jagüey Grande es necesario considerar que los patrones trifoliados en suelos con alto contenido de caliza (mayor de 3% de caliza activa) y ph alto, mayor que 7,3 desarrollan en las plantas brotes cloróticos (Jiménez et al., 2010). Debido a esto la elevada presencia de plantas manifestando brotes cloróticos, observada en Jagüey, probablemente no se corresponda solamente con plantas afectadas por huanglongbing, teniendo en cuenta además la remisión de estos síntomas obtenida en un estudio donde se aplicó nutrición foliar (Forteza, 2010). En las plantas de naranjos evaluadas este síntoma fue observado aunque con una baja frecuencia y generalmente pocos brotes por planta (Figura 5). No obstante es un síntoma a tener en cuenta para la correcta identificación de la enfermedad debido a que en estudios realizados en condiciones controladas, para determinar la reacción de distintos fenotipos cítricos ante la infección por CLas, las plantas en su mayoría desarrollaron brotes cloróticos como respuesta a la infección (Folimonova et al., 2010). El síntoma de corcho en las venas se observó en hojas maduras en ambas especies (Figura 5). Este síntoma se desarrolla como consecuencia de las alteraciones anatómicas y fisiológicas que ocurren en las plantas infectadas. Estas alteraciones provocan una excesiva formación de tejido floemático producto de una intensa actividad cambial y la necrosis de los tejidos, por lo que las nerviaciones de las hojas enfermas se engrosan, se hinchan y se tornan de aspecto corchoso (Aubert, 2008). Este síntoma no se manifestó de manera generalizada en las plantas sintomáticas. De igual forma, tanto en naranjo 'China' como en pomelo Marsh se detectó la presencia de plantas con síntomas foliares de deficiencia de microelementos, principalmente zinc y manganeso, sectorizados en una o varias ramas de la planta (Figura 5). Estos síntomas se han relacionado a diferentes estadios de desarrollo de HLB (Bové, 2006; Brlansky et al., 2007; Deng, et al., 2008), y generalmente estos se manifiestan en estadios avanzados de la enfermedad (Bové, 2006; Gottwald et al., 2007; Deng, et al., 2008). Sin embargo, en las observaciones realizadas en el área de naranjo (Ceiba, Artemisa) se manifestaron incluso antes que las plantas desarrollaran otros síntomas (datos no mostrados). En las plantas de naranjo que mostraban los síntomas característicos de HLB se observó además el síntoma denominado islas verdes, que está asociado a deficiencias agudas de zinc (Figura 5). En trabajos desarrollados en Brasil, plantas que se inocularon con CLam desarrollaron este síntoma, que no desapareció después de aplicaciones foliares de 38

40 Descripción Detallada micronutrientes (Lopes y Frare, 2008). En Florida este síntoma se considera estrechamente asociado a huanglongbing en los cultivares de naranjo (Gómez, 2010). Los síntomas de hojas pequeñas, porte esparcido del follaje y defoliación, se observaron en las plantas con estadios avanzados de la enfermedad donde además eran evidentes otros síntomas como brotes cloróticos, deficiencias de nutrientes y moteado asimétrico (Figura 5). La aparición de este conjunto de síntomas en las plantaciones en estudio es notable debido a Las plantaciones en las que se evaluaron los síntomas tuvieron en los periodos de observación Se ha planteado en la literatura que si la infección por las bacterias causantes de HLB ocurre en edades tempranas de las plantas, estas suelen mostrar varios de los síntomas asociados a la enfermedad (da Graça, 1991) Análisis de la frecuencia de aparición de los síntomas en plantas infectadas A partir de la base de datos, donde se registraron los síntomas asociados a HLB en las plantas de naranjo y pomelo, se realizó el procesamiento estadístico para determinar el orden de aparición de los síntomas, así como los mayoritarios y las asociaciones más frecuentes entre ellos, mediante el cálculo de la distribución de frecuencias y del coeficiente de correlación Gamma. En las plantas de naranjo, evaluadas en Ceiba, se determinó que los síntomas que aparecieron con mayor frecuencia fueron: moteado asimétrico, deficiencias nutricionales, brotes cloróticos y venas corchosas (Figura 6A). Los síntomas de hojas pequeñas, venas cloróticas, islas verdes, aspecto esparcido y defoliación de las plantas se presentaron con una frecuencia por debajo del 10%, por lo que no fueron significativos (Figura 6A). Estos últimos síntomas, observados con frecuencia menor que el 10%, se asocian a estadios avanzados de la enfermedad (Gottwald et al., 2007). La baja frecuencia de observación registrada se relaciona con la edad de la plantación en estudio (plantada en noviembre de 2007 y los datos para determinar la evolución de los síntomas se colectaron hasta el 2009). Al analizar en las plantas de Ceiba, la correlación entre los síntomas predominantes se determinó que el moteado asimétrico y las venas corchosas se correlacionan con el resto de los síntomas más frecuentes con valores de coeficiente de correlación (r) mayores de 0,3. Las deficiencias nutricionales y los brotes cloróticos se correlacionan con todos (r>0,3); excepto con venas cloróticas y defoliación. La evolución temporal de los síntomas de mayor frecuencia de aparición mostró en las dos áreas en estudio que su desarrollo aumenta en el tiempo (Figura 7A). Sin embargo, el 39

41 Descripción Detallada A B Figura 6. Frecuencia de aparición de los síntomas predominantes en las plantas de naranjo China de Ceiba del Agua (A) y de pomelo Marsh en Jagüey Grande (B). DN: deficiencias nutricionales, BCl: brotes cloróticos, VCl: venas cloróticas, VC: venas corchosas, MA: moteado asimétrico, IV: Islas verdes, HP: hojas pequeñas y acucharadas, AE: aspecto esparcido de la planta, D: defoliación. campo de Ceiba se diferencia del de Jagüey Grande por la aparición de deficiencias nutricionales que es el síntoma predominante al final del estudio, con una frecuencia que alcanzó el 90%, así como por la presencia de venas corchosas. Se destacó en esta área que la frecuencia de brotes cloróticos disminuyó en las últimas evaluaciones, probablemente debido a la aplicación de nutrientes foliares. Los resultados sugieren que el orden de aparición de los síntomas en Ceiba es: deficiencias nutricionales, moteado asimétrico, brotes cloróticos y venas corchosas (Figura 7A). Los análisis realizados en Jagüey mostraron que en esta área se desarrolla una menor diversidad de aparición de síntomas asociados a la enfermedad (Figura 6A vs. B). Los síntomas que aparecieron con mayor frecuencia fueron los brotes cloróticos y el moteado asimétrico, que alcanzaron frecuencias de aparición superiores al 25% (Figura 6B). Sin embargo, el aspecto esparcido de las plantas, hojas pequeñas, venas corchosas, venas cloróticas, deficiencias nutricionales y la defoliación de las plantas se presentaron con una frecuencia por debajo del 10%, valor que no es significativo. Este comportamiento puede estar causado por la aplicación de las tecnologías de cultivos diferentes a las de Ceiba pero eficientes para las condiciones de esta empresa (riego, nutrición, etc.). Otra causa podría ser la influencia de las condiciones edafoclimáticas de ambas regiones. En el análisis de correlación de los síntomas predominantes en las plantas de Jagüey, al establecer la relación con los síntomas que aparecen con mayor frecuencia, se determinó que el moteado asimétrico se correlaciona significativamente con la presencia de brotes cloróticos (r=0,68), hojas pequeñas y acucharadas (r=0,32) y venas corchosas (r=0,29). 40

42 Descripción Detallada Con el resto de los síntomas la correlación fue muy pequeña. Los brotes cloróticos solo se correlacionan con moteado asimétrico. Los síntomas que se encontraron correlacionados son los más comúnmente encontrados en observaciones de campo para esta enfermedad en las condiciones de Jagüey. En Jagüey Grande, al igual que en A Ceiba, el análisis de la evolución de los síntomas de brotes cloróticos y moteado asimétrico (mayor frecuencia de aparición), mostró que ambos aumentan progresivamente con el transcurso del tiempo (Figura 7B). El porcentaje de plantas con moteado asimétrico aumenta en el tiempo y se hace más pronunciado a partir de la observación 16, cuando B las plantas contaban con dos años y Figura 7. Evolución de los síntomas de HLB que se diez meses de edad, y se alcanza el presentaron con mayor frecuencia en plantas de naranjo 'China' y 'Valencia' en Ceiba del Agua (A) y 100% en la observación 20, a los tres pomelo Marsh en Jagüey Grande (B). años de edad de las plantas. La presencia de brotes cloróticos también se incrementó en el tiempo, con fluctuaciones que podrían estar asociadas a la respuesta temporal de las plantas a la aplicación de soluciones nutritivas foliares o edáficas utilizadas para la corrección de deficiencias minerales, especialmente de zinc y manganeso. De acuerdo a estos resultados en Jagüey Grande en las plantas enfermas inicialmente manifiestan el síntoma de brotes cloróticos y después el moteado asimétrico. Este análisis se debe tener en cuenta en las prospecciones de esta enfermedad que se realicen en Jagüey Grande para la erradicación de plantas de pomelo enfermas. Los resultados indican que se deben dirigir principalmente a la búsqueda de los síntomas de 41

43 Descripción Detallada moteado asimétrico y el seguimiento de los brotes cloróticos, los cuales posteriormente pueden desarrollar moteado asimétrico típico. Por otro lado, el resto de los síntomas pueden estar o no relacionados con la enfermedad en esta región. Las diferencias encontradas en la manifestación de los síntomas entre ambas regiones citrícolas en cuanto a la frecuencia de aparición y la evolución de los síntomas de HLB pueden deberse, a que se trataba de especies cítricas distintas, a las características de cada localidad en cuanto a suelo y clima, así como a las diferencias en la agrotecnia brindada al cultivo, especialmente el riego y la nutrición. En estudios realizados a partir de la inoculación en condiciones de aisladores protegidos de varias especies cítricas, entre ellas patrones y cultivares comerciales, se determinó aunque la bacteria puede multiplicarse en todas las especies analizadas existió una amplia gama de respuestas a la infección (Foliminova et al., 2009). Experimentos desarrollados en plantaciones con diferentes especies de cítricos (naranjo Dulce (cultivares Hamlin, Valencia, y navel), pomelo ( Marsh, Ruby Red, y Flame ), tangor ( Temple, Murcott, and Ortanique ), y varios híbridos de mandarinos ( Fallglo, Minneola, y Sunburst )) también mostraron un desarrollo diferencial de los síntomas de la enfermedad, así como el título que alcanzó la bacteria en los plantas difirió entre los diferentes cultivares (Stover y McCollum, 2011). 4.5 Evaluación del progreso temporal de HLB en plantaciones de fomento Para determinar el progreso temporal de la enfermedad HLB en las áreas seleccionadas se visitaron los campos con una frecuencia mensual para realizar el diagnóstico visual a partir del registro de los síntomas encontrados en cada planta. Se determinó la incidencia de HLB como la proporción de plantas que mostraban los síntomas asociados a la enfermedad, utilizando como criterio de positividad el síntoma de moteado asimétrico con respecto al total de plantas en cada bloque de experimentación Determinación de la frecuencia de evaluación para realizar los estudios epidemiológicos de HLB Para determinar la frecuencia de evaluación más adecuada para realizar los estudios epidemiológicos se analizaron los datos de incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB obtenidos a partir de diferente periodicidad en la observación de los síntomas. Se compararon tres frecuencias: mensual, bimestral y trimestral, en los campos CA 1497, CA 1498, CA 2041, CA 4185 y JG T-25-3a, de Ciego de Ávila y Jagüey Grande, Matanzas 42

44 Descripción Detallada (Figura 8). De la misma forma, se evaluó el ajuste de modelos epidemiológicos a los datos de progreso temporal de HLB en cada una de estas frecuencias. Para ello se seleccionaron tres modelos epidemiológicos, Logístico, Gompertz y Muestreos mensuales A Muestreos bimestrales B Muestreos trimestrales Figura 8. Curvas del progreso temporal de plantas con síntomas asociados a HLB determinadas con diferentes frecuencias de muestreos en los campos CA 1497, CA 1498, CA 2041 y CA 4185 de Ceballos y el campo JG T-25-3a de Jagüey (A) Frecuencia mensual, (B) frecuencia bimestral y (C) frecuencia trimestral. C 43

45 Descripción Detallada Monomolecular, recomendados por Campbell y Madden (1990). Los modelos se ajustaron a los datos mediante regresión no-lineal con el paquete estadístico Statistica 5.0 (Statsoft, Tulsa, AZ, USA). La selección del mejor modelo se realizó en base al coeficiente de determinación (R 2 ) entre valores observados y valores esperados, y la existencia o no de patrones en el gráfico de residuos contra valores esperados (Campbell y Madden, 1990). La comparación de las gráficas del progreso temporal de HLB con frecuencias mensual, bimestral y trimestral, evidenció que la frecuencia bimestral, en la cual se realiza el doble de visitas a los campos es similar a la mensual (Figura 8). Sin embargo, la gráfica de la frecuencia trimestral aun que las formas de las curvas del progreso temporal son similares a la mensual y trimestral, en algunos segmentos se observan modificaciones podrían implicar cambios al describir la epidemia utilizando modelos epidemiológicos. Los datos obtenidos con las diferentes frecuencias de muestreo se utilizaron para describir las epidemias en cada campo según los modelos Logístico, Gompertz y Monomolecular (Tabla 7). A pesar de las diferencias observadas entre los campos en el ajuste de los modelos a los datos de incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB, los resultados son semejantes para las frecuencias mensual, bimestral y trimestral. En el caso del campo CA 4185 no se obtuvo un buen ajuste de ninguno de los modelos evaluados. Este resultado, como se analizará más adelante, pudiera deberse a que la fuente de inóculo inicial provenía del vivero y no del campo. Los resultados indican que con cualquiera de las frecuencias de observación evaluadas sería seleccionado el mismo modelo para describir el progreso temporal de las epidemias de HLB. A partir de estos resultados se determinó que en las condiciones de Ciego de Ávila y Jagüey Grande, Matanzas, las evaluaciones para estudios epidemiológicos de HLB pueden realizarse con una frecuencia de hasta tres meses sin que se observen cambios en el progreso temporal de la enfermedad. Este resultado es esperado debido a que HLB es una enfermedad poliética, cuyas epidemias se desarrollan en varios años (Gottwald, 2010). Teniendo en cuenta lo anterior y considerando la importancia de la eliminación de plantas enfermas para el manejo de HLB sería recomendable realizar los muestreos de plantas con síntomas de la enfermedad en las plantaciones y su erradicación cada tres meses. En investigaciones realizadas en Brasil, se ha sugerido que la erradicación de plantas sintomáticas en el campo no tiene que ser inmediata mas no debe exceder un período de tres meses, porque podría comprometerse la supervivencia del resto de las plantas por la migración de vectores infectados con la bacteria (Bassanezi et al., 2013). Por otra parte 44

46 Descripción Detallada realizar el rastreo con menor frecuencia permitirá disminuir los costos y facilitar el trabajo de los inspectores en el campo, que podrían cubrir mayores áreas en menor tiempo. Tabla 7. Comparación de la frecuencia de evaluación de plantas con síntomas asociados a HLB a partir de los datos de incidencia analizados con periodicidad mensual, bimestral y trimestral en campos de Ciego de Ávila y Jagüey Grande. En negrita se destacan los valores de mejor ajuste de los modelos). Campo Modelo Evaluación mensual Evaluación bimestral Evaluación trimestral R 2 PR R 2 PR R 2 PR Log * JG T-25 Gomp a Mono Log CA1497 Gomp Mono Log CA1498 Gomp Mono Log CA2041 Gomp Mono Log CA4185 Gomp Mono * Presencia (+) o ausencia ( ) de patrones de residuos en el gráfico de residuos contra valores esperados. Log: Logístico, Gomp: Gompertz y Mono: Monomolecular R 2 : Coeficiente de determinación PR: Patrón de residuos En este trabajo, a partir de los resultados de la evaluación de la frecuencia de muestreo, se realizaron las observaciones de síntomas asociados a HLB en las plantaciones con una frecuencia bimestral. Teniendo en cuenta que se trata de estudios epidemiológicos realizados solamente en campos experimentales, donde el número de plantas a evaluar es limitado, se consideró apropiado realizar las visitas de campo cada dos meses Progreso temporal de la diseminación de HLB y las poblaciones de Diaphorina citri en plantaciones de fomento La evaluación del progreso temporal de la diseminación de HLB se realizó a partir de los datos colectados en las observaciones realizadas con frecuencia bimestral en cada área experimental. Se consideraron enfermas aquellas plantas que presentaran hojas con el síntoma de moteado asimétrico. A partir del resultado de las evaluaciones se le asignó a cada planta la categoría de enferma (1) o sana (0) y se calculó la incidencia acumulada de 45

47 Descripción Detallada plantas con síntomas asociados a HLB (relación entre el número de plantas con síntomas y el total de plantas incluidas en el estudio). El tiempo de evaluación de las plantas con síntomas fue de 42 meses en el campo JG T-25 3a de Jagüey Grande y 16 meses para el T-25 3b. En Ceiba se evaluó durante 44 meses el CEI 1112 mientras que el CEI 3184 fue observado durante 15 meses. En Ciego de Ávila se evaluaron los campos CA 1497 y CA 1498 durante 46 y 50 meses, en el CA 2041 el estudio se prolongó por 30 meses y el campo CA 4185 se evaluó un periodo de 22 meses. En las plantas cuyos síntomas resultaron dudosos, se colectaron muestras compuestas por diez hojas con el síntoma y se enviaron al IIFT con el propósito de confirmar la presencia de CLas por medio de la PCR anidada específica descrita anteriormente. Se evaluaron un total de 257 muestras de hojas colectadas en los ocho campos en estudio, de las que resultaron positivas 255 que representa el 99,22% del total evaluado (Tabla 6) Evaluación del progreso temporal de HLB y las poblaciones de Diaphorina citri en plantaciones de fomento de Ceiba, Artemisa En los campos evaluados en Ceiba, desde la primera evaluación se detectaron plantas con síntomas asociados a HLB: 37 plantas en el CEI 1112 y 31 plantas en el CEI 3184, lo que representó valores de incidencia inicial de 0,041 y 0,034, respectivamente (Figura 9A). En las dos áreas se observó que el 50% de las plantas estaban enfermas en un tiempo aproximado de 15 meses después de la primera evaluación (MDPE). Posteriormente en el campo CEI 1112, la incidencia de plantas con síntomas alcanzó 0,721 pasados 44 MDPE; mientras que en el CEI 3184 no se pudo continuar con las evaluaciones por lo que la incidencia solo alcanzó el valor de 0, MDPE (~50%). La comparación de las dos curvas que describen el progreso temporal de la epidemia en ambas plantaciones mostró que coinciden en su forma y en los valores de incidencia que se alcanzan en cada momento, lo que sugiere que el progreso de la enfermedad en ambos campos fue similar. Cuando se analizan los datos de la dinámica poblacional del insecto vector D. citri en estas áreas se puede observar que en el campo CEI 1112 se contabilizaron estados inmaduros de D. citri, en los meses de marzo a abril de 2009, lo cual coincide con la primera evaluación del insecto y la siguiente (0 y 1 MDPE) (Figura 9B). Por otra parte, se observaron nuevos incrementos de las poblaciones de noviembre a diciembre de este mismo año (8 y 9 MDPE) y en los meses de abril a junio de 2010 (13 15 MDPE). Un 46

48 Descripción Detallada tercer pico de las poblaciones se observó en los meses desde marzo hasta septiembre de 2012 (36 42 MDPE). De manera similar, en el campo CEI 3184 se encontraron poblaciones del insecto en los meses de noviembre de 2009 (5 MDPE) y de mayo a septiembre de 2010 (11-15 MDPE). En las dos áreas en estudio los picos A poblacionales de D. citri coincidieron con los periodos de brotación masiva de los cultivares de naranjo en Cuba. Este resultado concuerda con lo observado en estudios similares realizados en las localidades de Cienfuegos y La Habana y en otros países (González et al., 2004; Vera, 2007; Yamamoto, 2010; Fogliata et B al., 2010). Si se analiza la correspondencia entre los gráficos de progreso temporal de la incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB en ambas plantaciones, y la dinámica poblacional del insecto vector en los mismos periodos (Figura 9A y B), puede sugerirse una influencia C de los picos poblacionales de D. citri Figura 9. Evolución temporal de la incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB (A) y observados en el incremento poblaciones de Diaphorina citri (B-C) en los exponencial de los síntomas de HLB en campos CEI 1112 (B) y CEI 3184 (C) a la Empresa citrícola Ceiba del Agua, Artemisa. las plantaciones entre tres y cuatro meses posteriores a la presencia de estas poblaciones del vector. Sin embargo, esta correlación no explica del todo la dinámica observada en la progresión temporal de la incidencia de HLB. Esto pudiera deberse a que no se contabilizaron en este estudio las poblaciones migrantes de D. citri que se trasladan desde las plantaciones colindantes, que mostraban 47

49 Descripción Detallada altos valores de incidencia de la enfermedad. Los resultados demuestran que existe en la región un control ineficiente del insecto vector, lo cual propició los elevados índices de incremento de plantas con síntomas de HLB observados en las áreas en evaluación Evaluación del progreso temporal de HLB y las poblaciones de Diaphorina citri en plantaciones de fomento de Jagüey Grande, Matanzas En los campos en Jagüey Grande desde la primera evaluación se detectaron plantas con síntomas de HLB: siete plantas en el JG T-25-3a y 14 plantas en el JG T-25-3b, lo que se corresponde con valores de incidencia inicial de 0,008 y 0,017, respectivamente (Figura 10A). Durante los 20 primeros meses de evaluación las incidencias en las dos áreas se mantuvieron por debajo de 0,048. A partir de esta evaluación se decidió abandonar las evaluaciones en el campo JG T-25-3b por lo que no se cuenta con los datos posteriores. En el campo JG T-25-3a, en el cual se continuaron las evaluaciones, se alcanzó un valor de incidencia de 0,496 a los 31 MDPE, lo que representa aproximadamente el 50% de las plantas del área (Figura 10A). La incidencia de plantas con síntomas en este campo alcanzó 0,95 al cabo de los 39 meses. Si se analizan las curvas de progreso de la diseminación de la enfermedad en ambas áreas, se puede observar que las dos curvas coinciden completamente en el periodo en el que se realizaron los muestreos en las dos plantaciones (Figura 10A). Esta analogía en las curvas evidencia un comportamiento similar de la diseminación de la enfermedad. De inicio en ambos campos fue muy bajo el número de nuevas plantas con síntomas detectadas en cada evaluación, aunque a partir de los 10 MDPE se contabilizó un progresivo incremento, aunque con una pendiente muy baja en la curva de progreso. Sin embargo, en el JG T-25-3a, a partir de los 22 MDPE se observó un incremento exponencial de la incidencia de HLB, hasta alcanzar el 95% de las plantas del campo pasados los 39 MDPE. En cuanto a la dinámica poblacional de D. citri, los datos disponibles contabilizaron las poblaciones del insecto en el campo JG T-25-3a desde enero de 2010 hasta septiembre de En los meses de marzo a mayo de 2010 (13-15 MDPE), se observaron poblaciones altas del insecto (Figura 10B), y en los meses posteriores se observaron bajas poblaciones, lo que indica que se logró en este periodo el control del vector. Sin embargo, a partir de la evaluación 28 MDPE las poblaciones se desestabilizaron y alcanzaron niveles altos, principalmente en los meses de noviembre de 2011 y de febrero a marzo de 2012 (evaluaciones 33 y MDPE) (Figura 10B). 48

50 Descripción Detallada A Figura 10. Evolución temporal de la incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB (A) en los campos JG T-25 3a y JG T-25 3b y poblaciones de Diaphorina citri (B, ambos de la Empresa citrícola Victoria de Girón en Jagüey Grande, Matanzas. B Al analizar la correspondencia entre los gráficos de progreso temporal de la incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB en ambas plantaciones, y la dinámica poblacional del insecto vector en los mismos periodos (Figura 10A y B), se encontró una relación entre los picos poblacionales de D. citri observados con el incremento exponencial de los síntomas en las plantaciones hasta cinco meses después. De forma similar a las áreas de Ceiba, la disponibilidad de brotaciones en el cultivo determinó la aparición de picos poblaciones del insecto. Es importante destacar que estas áreas se encuentran ubicadas colindantes a bloques de plantaciones adultas con alta incidencia de plantas con síntomas asociados HLB, lo que constituye una fuente de inóculo para las áreas en estudio Evaluación del progreso temporal de HLB y las poblaciones de Diaphorina citri en plantaciones de fomento de Ceballos, Ciego de Ávila Al inicio de las evaluaciones en los campos en estudio de Ciego de Ávila (CA 1497, CA 1498, CA 2041 y CA 4185) no se observó ninguna planta con síntomas asociados a HLB (incidencia 0) (Figura 11A). A diferencia de las otras regiones en las que se realizaron los mismos estudios, de los cuatro campos incluidos en los muestreos solamente dos 49

51 Descripción Detallada mostraron similitud en las curvas del progreso temporal de HLB (Figura 11A, campos 1497 y 1498). En estas dos áreas, la incidencia de plantas con síntomas se mantuvo por debajo de 0,1 durante 40 meses en el CA 1497 y 44 meses en el CA Es importante decir que al cabo de este tiempo se decidió dejar de eliminar las plantas con síntomas asociados a HLB en las plantaciones, actividad que se había realizado con estricto cumplimiento desde el inicio de la siembra de las dos áreas. De forma progresiva la incidencia en estos dos campos alcanza el 50% después de los 46 MDPE en CA 1497 y 50 MDPE en CA 1498 (Figura 11A, campos 1497 y 1498). En estos dos campos el control de D. citri fue eficiente pues a lo largo del periodo de experimentación solamente se observaron dos picos poblacionales del insecto, los cuales coincidieron con los meses de marzo a mayo de 2010, que representan las evaluaciones MDPE para el campo CA 1497 y MDPE para el CA 1498 (Figura 11B). Los picos poblacionales concuerdan con el periodo de brotación masiva que experimentan estos cultivares en estos meses, lo que coincide con los resultados de las áreas experimentales descritas anteriormente. No obstante, estos picos fueron mayormente de huevos y ninfas, que inmediatamente se controlaron puesto que no se relacionó con la aparición de un pico poblacional de adultos. Además, estos aumentos en las poblaciones del insecto no influyeron en la aparición de plantas enfermas en las áreas (Figura 11A vs., B, campos 1497 y 1498). Por otro lado, en el campo CA 4185, a los cuatro meses de plantado se incrementó bruscamente el número de plantas con síntomas asociados a HLB hasta alcanzar un valor de incidencia de 0,2 a los ocho meses (Figura 11A, campo 4185). Posteriormente el número de plantas enfermas se mantuvo constante durante un periodo de siete meses. La incidencia de insectos vectores encontrada fue prácticamente nula durante todas las evaluaciones, evidenciando un eficiente control de D. citri en el área (Figura 11A vs., B, campo CA 4185). Esta plantación (campo CA 4185) se plantó alejada de las áreas comerciales de cítricos de la empresa que pudieran constituir fuentes de inóculo. Sin embargo colindó por el sudeste con plantas aisladas con síntomas asociados a HLB del sector privado durante las primeras evaluaciones. A pesar de esto y. tomando en cuenta que: (1) a los cuatro meses de plantado apareció un número importante de plantas con síntomas asociados a HLB (corto período de tiempo entre la fecha de plantación y la aparición de las primeras plantas con síntomas) y (2) no se encontraron poblaciones de D. citri durante las 50

52 Descripción Detallada evaluaciones, los resultados sugieren que las plantas fueron extraídas del vivero infectadas con la bacteria. Las evaluaciones en el campo CA 2041 mostraron que a partir de los 11 MDPE, la incidencia en el área se incrementa desde un valor de 0,005 hasta 0,113 a los 15 MDPE (Figura 11A, campo 2041). A partir de este mes la incidencia continuó aumentando, pero de forma menos abrupta. La evaluación de la dinámica poblacional de D. citri en esta área mostró que a partir del mes de abril de 2009 (8 MDPE) se encontraron poblaciones estables de D. citri en el área (Figura 11B, campo CA 2041). La comparación de los gráficos de progreso temporal de la enfermedad y la dinámica poblacional del insecto vector en el área muestra que la infestación a los 8 MDPE pudiera haber influido en el aumento de la incidencia de la enfermedad en los meses del 12 al 15, puesto que posteriormente la incidencia se mantiene en un valor constante (Figura 11A vs. B, campo 2041). A B C D Integración de los resultados del progreso temporal de HLB en las tres áreas en estudio En los campos de las tres áreas citrícolas donde se mantuvieron las evaluaciones por periodos superiores a los 36 MDPE (tres años) la incidencia alcanzó valores superiores a 0,4925 (Figura 12). Solo se E Figura 11. Evolución temporal de la incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB (A) y poblaciones de Diaphorina citri (B-E) en áreas de los campos CA 1497 (B), CA 1498 (C), CA 2041 (D) y CA 4185 (E) pertenecientes Empresa Agroindustrial Ceballos, Ciego de Ávila. 51

53 Descripción Detallada encontraron incidencias menores en los campos que se evaluaron por periodos de tiempo inferiores a los tres años. Los resultados del progreso temporal de HLB en las tres regiones en las que se ubicaron los campos muestreados en este estudio coinciden con lo descrito por Gottwald (2010). Este autor al realizar una revisión de las epidemias de HLB en países como China, Sudáfrica, Viet Nam, Brasil y Florida concluye que donde la enfermedad es endémica o no hay un manejo efectivo de HLB (ausencia de erradicación y control del vector), en plantaciones jóvenes la enfermedad puede alcanzar valores de incidencia superiores al 50% en un periodo de tres a cinco años. Los diferentes escenarios en que se desarrollaron los experimentos determinaron diferentes comportamientos del progreso temporal de la enfermedad HLB (Figura 12). Solo se alcanzaron valores de incidencias por debajo de 0,05 durante periodos prolongados (38 meses) en las áreas en las cuales se consiguió un control estricto del vector y se mantuvo la erradicación de las plantas enfermas (Figura 12, campos 1497 y 1498, Empresa Agroindustrial Ceballos, Ciego de Ávila). Sin embargo, por estar estas plantaciones colindantes a campos adultos con alta incidencia de HLB, la vulnerabilidad fue tan alta que al suspender la eliminación de las plantas enfermas, la incidencia se incrementó en un corto periodo de tiempo hasta los mismos niveles que las áreas sin un manejo eficiente. Figura 12. Comparación de las curvas de progreso temporal de plantas con síntomas asociados a HLB en plantas procedentes de campos de dos empresas citrícolas, Victoria de Girón: JG T 25-3a y JG T 25-3b, ambos de pomelo 'Marsh'; Ceiba del Agua: CEI 1112 de naranjo 'China' y CEI 3184 de naranjo 'Valencia' y de la Empresa Agroindustrial Ceballos: CA 1497 y CA 1498 de Pomelo Ray Ruby, CA 2041 de Pomelo 'Rio Red' y CA 4185 de limero 'Persa'. 52

54 Descripción Detallada Ajuste de modelos a las curvas de progreso de HLB en el tiempo Para determinar el modelo de mejor ajuste a las curvas del progreso temporal de HLB en las diferentes áreas en estudio se examinaron los tres modelos epidemiológicos que se utilizaron para la determinación de las frecuencias de muestreos (Campbell y Madden, 1990). Los modelos Logístico, Gompertz y Monomolecular se ajustaron a los datos mediante regresión no-lineal con el paquete estadístico Statistica 5.0 (Statsoft, Tulsa, AZ, USA). La selección del mejor modelo se realizó en base al coeficiente de determinación (R 2 ) entre valores observados y valores esperados, y la existencia o no de patrones en el gráfico de residuos contra valores esperados (Campbell y Madden, 1990). El procesamiento de los datos generados a partir de los muestreos en los ocho campos en estudio mostró que en siete de ellos se pudo ajustar alguno de los modelos evaluados (Tabla 8). Se detectaron diferencias entre los campos en cuanto al valor del coeficiente de determinación que varió entre 0,833 y 0,955, con un promedio entre los siete campos de 0,90. El modelo Logístico resultó el que mejor se ajustó a los datos en cuatro de los ocho campos evaluados, en los que se obtuvieron los mayores valores del coeficiente de determinación (R 2 ), y ausencia de patrones de residuos (PR) en el gráfico de residuos contra valores esperados. En el caso del campo CA 2041, donde el mejor ajuste fue del modelo de Gompertz, se observó además un buen ajuste del modelo Logístico, también con valores de R 2 superiores a 0,9 y sin presencia de patrones de residuos. Para los campos CEI 1112 y CEI 3184 el modelo Monomolecular fue el de mejor ajuste a los datos. Este resultado no es lo más común en epidemias de HLB (Gottwald et al., 2010), por lo que resulta interesante que este sea el modelo que mejor represente el progreso temporal de la enfermedad en los dos campos de Ceiba. Teniendo en cuenta que HLB es una enfermedad poliética, cuyas epidemias se desarrollan en varios años, es recomendable realizar un análisis de los datos cuando los valores de incidencia alcancen valores cercanos a la asíntota. El mejor ajuste del modelo Logístico a los datos del progreso temporal de HLB ha sido encontrado también por otros autores para epidemias de esta enfermedad en China e Islas Reunión (Gottwald et al., 1989) y en Brasil (Bassanezi et al., 2006) a partir de la incidencia acumulada con una frecuencia de evaluación anual. Sin embargo, el modelo Gompertz, fue el mejor para el ajuste a datos de HLB de campos de cítricos afectados por la enfermedad en la Florida, Estados Unidos (Gottwald et al., 2010). Los resultados de 53

55 Descripción Detallada este estudio indican que en el 71% de los campos pudo ser ajustado a alguno de estos dos modelos, lo que indica coincidencia con lo descrito por estos autores. En el caso del campo CA 4185 de limero 'Persa' sobre naranjo agrio no se obtuvo un buen ajuste de ninguno de los modelos evaluados. Este resultado pudiera deberse a que, como se pudo comprobar en el transcurso de los estudios, la fuente de inóculo inicial en el campo no se debió a la transmisión por vectores que migraron de áreas vecinas. Las plantas se infectaron en condiciones de vivero y los síntomas fueron desarrollándose gradualmente según el período de incubación de la bacteria en la planta. A estas observaciones se añade que durante el tiempo del estudio solamente se detectó en el campo la presencia de un brote infestado con adultos de D. citri. Tabla 8. Coeficientes de determinación, tasa aparente de infección y patrones de residuos después de ajustar tres modelos a los datos de progreso temporal de HLB en campos de tres regiones citrícolas de Cuba. Campo Modelo R 2 Y 0 r PR CEI 1112 Log Gomp Mono CEI 3184 Log Gomp Mono JG-T-25-3a Log Gomp Mono JG-T-25-3b Log Gomp Mono CA1497 Log Gomp Mono CA1498 Log Gomp Mono CA2041 Log Gomp Mono CA4185 Log Gomp Mono * Presencia ( +) o ausencia ( ) de patrones de residuos en el gráfico de residuos contra valores estimados. L: Logístico, G: Gompertz y M: Monomolecular. Y 0: Inóculo inicial, r: Tasa Aparente de Infección, R 2 : Coeficiente de determinación y PR: Patrón de residuos. 54

56 Descripción Detallada A partir del ajuste de los modelos se pudo determinar la tasa aparente de infección para los campos de Ceiba: CEI 1112 (r=0,033) y CEI 3184 (r=0,039), Jagüey Grande: JG T-25 3a (r=0,293) y JG T-25 3b (r=0,093) y para los evaluados en Ciego de Ávila: CA1497 (r=0,179), CA1498 (r=0,16) y CA 2041 (r=0,054). Como se puede apreciar la tasa aparente de infección varió entre 0,033 y 0,293. Estas tasas no son comparables con las reportadas para otras epidemias de HLB debido a que estas se han analizado en años, a diferencia de este estudio que se basó en meses porque aún no dispone de más de 4 años de evaluación. Sin embargo, si se comparan con las tasas encontradas en Cuba para el progreso temporal de la infección por el virus de la tristeza de los cítricos (CTV) (Batista et al., 2008) se apreciará que las de HLB en muchos casos son superiores. Se ha visto en las epidemias de HLB que han podido ser evaluadas que la tasa de incremento de la enfermedad en general es baja comparada con la de otras enfermedades dispersadas por vectores (Gottwald, 2010). No obstante, en plantaciones jóvenes como las evaluadas durante este estudio se incrementa la incidencia más rápidamente (Bassanezi et al., 2010). 4.6 Análisis de los patrones de diseminación espacial de HLB en las tres principales áreas citrícolas comerciales Para caracterizar la epidemia en cuanto a su diseminación espacial en las tres regiones en estudio se prepararon mapas espaciales binarios a partir de las diferentes evaluaciones de plantas con síntomas asociados a HLB en cada campo. El análisis espacial se realizó en tres escalas de la jerarquía espacial para todos los campos, y se seleccionaron secuencias de evaluaciones que tuvieran condiciones adecuadas para los análisis. Todas las técnicas empleadas requieren la presencia de plantas con síntomas asociados a HLB y en algunos casos ausencia de la erradicación como medida de manejo. Por estas razones, para realizar la caracterización espacial de HLB en las áreas en estudio se seleccionaron campos y evaluaciones representativas del comportamiento de las epidemias a partir de los datos obtenidos Análisis del primer orden de la jerarquía espacial (relación entre plantas vecinas): Análisis de secuencias ordinarias El objetivo de este análisis fue evaluar la disposición de las plantas infectadas en el primer nivel de la jerarquía espacial, o sea para evaluar las relaciones entre plantas inmediatamente vecinas. La premisa básica para el uso de este análisis fue que el 55

57 Descripción Detallada agrupamiento significativo de las plantas positivas indica que el patógeno se está diseminando predominantemente de planta a planta. El análisis se aplicó solo en hileras con más de una planta con síntomas asociados a HLB. Se realizó el análisis de secuencias ordinarias y se calculó el índice Zso para cada secuencia (Madden et al., 1982), en dos direcciones perpendiculares entre sí (a lo largo y entre las hileras del campo). El valor de Zso tiene en cuenta el número mínimo de secuencias ordinarias para n 1 plantas infectadas x n 2 plantas sanas a una probabilidad de error de 5% (Zar, 1996). Las secuencias fueron consideradas alejadas de la aleatoriedad si el valor de Zso era igual o inferior a -1,64 (P<0,05). Seguidamente se calculó el porcentaje de secuencias agregadas y aleatorias para cada campo, evaluación y dirección. En el campo de Ceiba no fueron observadas tendencias relacionadas con el incremento de la incidencia de plantas enfermas en el análisis de secuencias ordinarias. No se encontró predominio de secuencias agregadas en ninguno de los campos y direcciones analizadas (Figura 13A). En el campo CEI 1112, aunque de manera general, no se encontraron diferencias entre los resultados de las dos direcciones analizadas, la agregación fue superior dentro de las hileras que entre ellas (Figura 13A). La proporción de hileras con secuencias aleatorias fue siempre superior en ambas direcciones: dentro y entre las hileras. Se observaron secuencias regulares, aunque solamente en las dos primeras evaluaciones (resultados no mostrados). En el análisis de secuencias ordinarias en el campo JG T-25 3a se obtuvieron valores indicativos de agregación cuando se analizaron las secuencias ordinarias en la dirección de las hileras de plantas (Figura 13B). De forma análoga a los campos de Ceiba, no se observaron tendencias relacionadas con el incremento de la proporción de plantas con síntomas asociados a HLB. Se destaca en este caso la ausencia de secuencias agregadas o aleatorias en la dirección entre las hileras de plantas, donde el patrón espacial fue regular (resultados no mostrados). En los resultados del análisis de secuencias ordinarias en el campo CA 4185 se encontró un predominio de las secuencias aleatorias (Figura 13B). El incremento de las proporciones de secuencias aleatorias en ambas direcciones y agregadas en la dirección entre hileras fue más notable en las primeras evaluaciones. Posteriormente estos valores varían muy poco, lo que está relacionado con la fuente de inóculo de este campo. Anteriormente se analizó que las plantas que se infectaron en esta área se extrajeron del vivero comercial infectadas, y al no ocurrir nuevas infecciones en el campo debido al 56

58 Descripción Detallada eficiente control del vector, la disponibilidad de fuentes de inóculo primarias se mantuvo poco variable. Teniendo en cuenta el predominio de aleatoriedad en los campos de Ceballos y Ceiba y en la dirección entre hileras de Jagüey, los resultados de este análisis del primer nivel de la jerarquía espacial, indican que aunque D. citri forme colonias en las plantas A hospedantes, su movimiento no es hacia las plantas inmediatamente vecinas. Sin embargo, no se elimina la posibilidad de detectar agregación si se analizan áreas de mayores dimensiones. Otros estudios realizados en China e Islas Reunión, contrastan con los resultados aquí presentados ya que indicaron la presencia de B secuencias ordinarias indicativas de agregación (Gottwald et al., 1989). De igual forma en evaluaciones realizadas en Brasil se encontró agregación a este nivel de la jerarquía espacial (Bassanezi et al., 2005) Análisis del segundo orden de la C jerarquía espacial (relación dentro de sub-áreas): Índice de dispersión y aplicación de la Ley de Taylor modificada Para evaluar la presencia de agregación de plantas infectadas a Figura 13. Proporción de secuencias ordinarias en evaluaciones diferentes de las plantas con síntomas asociados a HLB a lo largo de las hileras y entre hileras. En los gráficos se muestran los resultados de los campos: (A) CEI 1112, (B) JG T-25 3a y (C) CA

59 Descripción Detallada diferentes escalas espaciales, los campos se dividieron en rectángulos (quadrats) de hileras por plantas. Cada mapa de cada campo fue dividido en quadrats de tamaños 2x2, 3x3, 4x4, 3x5 y 5x3. Para cada uno de ellos fue determinada la proporción de plantas infectadas en cada evaluación y calculada la incidencia de la enfermedad. Estos datos constituyeron la base para el estudio de la Ley de Taylor modificada y el cálculo del índice de dispersión (D). Se calculó el índice de dispersión para todas las evaluaciones por medio de la relación D= V obs /V bin (V obs : varianza observada y V bin : varianza binomial esperada) (Gottwald et al., 1996). El alejamiento de la aleatoriedad fue determinado a través del test de χ 2 al nivel de 5% de significación. La hipótesis nula fue que el patrón observado era aleatorio y la hipótesis alternativa que era agregado. Valores de D que no difirieran estadísticamente de 1 fueron considerados como indicativos de aleatoriedad de los datos. De forma complementaria, valores estadísticamente superiores a 1 fueron tomados como indicadores de agregación. Por otro lado, se aplicó la Ley de Taylor binaria para evaluar la presencia de agregación. Esta ley relaciona por medio de una regresión lineal, la varianza observada y la varianza binomial esperada para una distribución aleatoria. Su ecuación es [log (V bin ) = log (A) + b log (V obs )], en la que A y b son parámetros de la regresión. Para cada evaluación en cada área y para el conjunto de quadrats fueron calculadas V obs y V bin (Hughes y Madden, 1992; Hughes et al., 1996). Las regresiones fueron realizadas mediante el método de los cuadrados mínimos, utilizando el programa Microsoft Excel La significación de las relaciones entre log (V bin ) y log (V obs ) fue determinada por la prueba F y la adecuación del ajuste del modelo a los datos por medio de los valores de los coeficientes de determinación R 2 y de los patrones de distribución de los residuos, en gráficos de residuos contra valores esperados de log (V bin ) (Madden y Hughes, 1995). Se determinaron los parámetros log (A) y b, correspondientes al intercepto y la pendiente de la recta de regresión. En los casos en que el parámetro log (A) resultó significativamente mayor que 0 se consideró que al inicio la epidemia fue agregada. Como hipótesis nula se consideró la igualdad del parámetro b a 1 y se testó a través del test t (Madden y Hughes, 1995), utilizando la estimación del parámetro y su error estándar, mientras que la hipótesis alternativa fue la de b > 1 (p < 0.01). En todas las evaluaciones del campo de Ceiba se encontraron valores de D estadísticamente superiores a 1 (χ 2 test, P<0.05), indicativos de agregación para todos los tamaños de quadrat (Tabla 9.). Solo en las dos primeras evaluaciones se observó 58

60 Descripción Detallada tendencia a la aleatoriedad, mientras que se detectó agregación en todos los tamaños de quadrat analizados en las observaciones posteriores. Estos resultados indican que las plantas infectadas son fuente de inóculo para otras plantas en sub-áreas, quadrats, de los campos hasta una distancia de al menos 35 metros. Los valores del índice de dispersión (D) sugieren agregación espacial significativa de las plantas con síntomas asociados a HLB para diferentes tamaños de quadrat en el tiempo. Este resultado fue observado en campos de las tres áreas citrícolas, aunque en el caso de Jagüey Grande, esto solo ocurre en las últimas evaluaciones, donde se incrementa la incidencia de HLB (Tabla 9.). Este índice generalmente se incrementó a lo largo del tiempo y con la incidencia de la enfermedad. Una excepción de este patrón fue el campo CA 1498 de Ciego de Ávila (Tabla 9.). Al aplicar la Ley de Taylor binaria fue posible determinar los valores de los parámetros resultantes de la regresión del log (V obs ) por el log (V bin ): log (A) y b. Los valores obtenidos para cada quadrat, así como la indicación de su significación por la prueba t en cada área, se muestran en la Tabla 10. Valores de los parámetros b y log (A) de la ecuación de ajuste a la Ley de Taylor binaria para mapas de plantas con síntomas asociados a HLB en campos de Ceiba (CEI), Jagüey (JG), y Ceballos (CA), y para cinco tamaños de quadrat. Se destacan los valores de b significativamente superiores a 1 y los de log (A) significativamente superiores a 0 calculado a través del test t con P<0.05. Tamaño de Quadrat Parámetro Campo CEI 1112 JG T 25-3a CA 1498 CA x2 log (A) ,292 b ,864 3x3 log (A) ,299 b ,914 4x4 log (A) ,995 b ,335 3x5 log (A) ,294 b ,045 5x3 log (A) ,593 b ,169. Los parámetros log (A) y b fueron significativamente mayores que 0 y 1, respectivamente para todos los campos y tamaños de quadrat, excepto en el 2x2 de los campos CEI 1112 y JG T-25 3b. En ningún caso se observaron patrones en el gráfico de residuos. Estos resultados indican que el inicio de la epidemia ocurre con agregación significativa (log (A)>0) y su desarrollo también es agregado (b>1). Un patrón espacial agregado de las plantas enfermas puede corresponder a una distribución agregada del patógeno en la 59

61 Descripción Detallada primera fuente de inóculo y además es el resultado de las infecciones secundarias mediante la dispersión del inóculo de los focos primarios a las plantas sanas. En el segundo nivel de la jerarquía espacial fueron utilizados el índice de dispersión y el ajuste de la Ley de Taylor binaria para detectar agregación entre plantas infectadas dentro de quadrats predefinidos y también para evaluar la influencia de la incidencia sobre el patrón espacial de aquellas plantas. Se detectó agregación en todos los campos y tamaños de quadrat, lo que indica que existe interacción entre plantas enfermas en una escala mayor que la observada para el primer nivel de la jerarquía espacial. Los resultados de este trabajo coinciden con los obtenidos por Bassanezi et al. (2005) al evaluar epidemias de HLB en Brasil. Tabla 9. Índice de dispersión (D) de plantas con síntomas asociados a HLB para cinco tamaños de quadrat, en campos de Ceiba (CEI), Jagüey (JG) y Ceballos (CA). Se destacan los valores de índice de dispersión significativamente mayores que 1, determinado a través del test de χ2 al nivel de 5% de significación. Campo Evaluación Tamaño de quadrat 2x2 3x3 4x4 3x5 5x3 CEI JG T 25-3a CA

62 Descripción Detallada CA ,942 1,201 1,046 1,443 1, ,421 1,662 2,315 1,868 1, ,307 1,386 2,074 1,489 1, ,292 1,319 1,967 1,456 1, ,315 1,443 2,104 1,619 1, ,315 1,443 2,104 1,619 1, ,305 1,434 2,099 1,644 1, ,246 1,396 2,151 1,537 1,893 Tabla 10. Valores de los parámetros b y log (A) de la ecuación de ajuste a la Ley de Taylor binaria para mapas de plantas con síntomas asociados a HLB en campos de Ceiba (CEI), Jagüey (JG), y Ceballos (CA), y para cinco tamaños de quadrat. Se destacan los valores de b significativamente superiores a 1 y los de log (A) significativamente superiores a 0 calculado a través del test t con P<0.05. Campo Tamaño de Quadrat Parámetro CEI 1112 JG T 25-3a CA 1498 CA x2 log (A) ,292 b ,864 3x3 log (A) ,299 b ,914 4x4 log (A) ,995 b ,335 3x5 log (A) ,294 b ,045 5x3 log (A) ,593 b , Análisis del tercer orden de la jerarquía espacial (relación entre sub-áreas): Determinación de áreas isópatas 61

63 Descripción Detallada Para analizar el tercer nivel de la jerarquía espacial, mediante el cual se determinan las relaciones entre sub-áreas de un campo fue utilizado el análisis de áreas isópatas (AI). En este análisis no es posible la determinación de índices o informaciones puramente matemáticas. Los mapas generados representan la situación de la enfermedad en cada época y AI del mismo color denotan zonas con incidencia de la enfermedad similar. El análisis de las áreas isópatas para cada campo y evaluación se realizó con el programa Statistica 5.0, mediante el procedimiento de los cuadrados mínimos ponderados por la distancia. Para ello se utilizó la matriz de valores de proporción de plantas enfermas de cada sub-área (tamaño 2x2 plantas). Para cada campo, los niveles de cada AI fueron arbitrariamente escogidos, con el objetivo de destacar posibles diferencias (Laranjeira, 1997). Al analizar los mapas más representativos de la evolución de la incidencia de HLB en los campos CEI 1112 de Ceiba, JG T-25 3a de Jagüey y CA 4185 y CA 1498 de Ceballos (Figuras 14, 15, 17 y 16), se puede observar que la incidencia inicial fue relativamente alta en CEI 1112 y CA 4185, mientras que fue baja en JG T-25 3a y CA Se identificaron dos aspectos en común para los campos: el primero es la ocurrencia de focos bien individualizados con mayor incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB en distintas sub-áreas de los campos, que coalescen al aumentar la incidencia de plantas enfermas en el campo. El segundo aspecto es la ausencia de áreas isópatas de mayor Figura 14. Áreas isópatas del campo CEI 1112 de Ceiba del Agua, Artemisa, a partir de los datos de incidencia de cuatro evaluaciones representativas. A: 0 MDPE, B: 5 MDPE, C: 11 MDPE y D: 18 MDPE. Los contornos muestran quadrats de 2x2 plantas, con el eje vertical en la dirección de las hileras. El incremento de la diseminación de HLB es indicado por la variación de los colores de verde (menor incidencia) a rojo (mayor incidencia). 62

64 Descripción Detallada Figura 15. Áreas isópatas del campo JG T-25-3a de Jagüey Grande, Matanzas a partir de los datos de incidencia de cuatro evaluaciones representativas. A: 0 MDPE, B: 9 MDPE, C: 14 MDPE y D: 19 MDPE. Los contornos muestran quadrats de 2x2 plantas, con el eje y en la dirección de las hileras. El incremento de la diseminación de HLB es indicado por la variación de los colores de verde (menor incidencia) a rojo (mayor incidencia). intensidad únicamente alrededor de esos focos, ya que aparecen nuevas AI en evaluaciones posteriores no vinculadas a estos. En la mayoría de los campos fueron observadas áreas de mayor incidencia de plantas con síntomas asociados a HLB en los bordes de las áreas en estudio (Figuras 14, 15, 16 y 17). Esta es una indicación de que la diseminación no ocurrió solamente entre plantas de un mismo campo, sino también por inóculo procedente de áreas colindantes. De la misma forma, estos resultados explican las incongruencias encontradas en los análisis de diseminación temporal de la enfermedad con respecto a la dinámica poblacional de Diaphorina citri en estos mismos campos. Cuando se compararon ambos gráficos en cada campo, se encontró que las variaciones en las poblaciones del insecto vector no explicaban completamente el curso de las curvas de diseminación de HLB en estas áreas. Como anteriormente se comentó, los campos evaluados se plantaron al lado de áreas citrícolas viejas con alta incidencia de HLB, por lo que la infección secundaria, proveniente de campos colindantes, influye en la diseminación de la enfermedad. De forma similar otros autores encontraron usando este análisis, que el origen de los focos de infección en los campos con HLB provenía de fuentes externas a las áreas en estudio (Gottwald, et al., 1989). 63

65 Descripción Detallada Figura 16. Áreas isópatas del campo del campo CA 4185 de Ciego de Ávila a partir de los datos de incidencia de cuatro evaluaciones representativas. A: 5 MDPE, B: 7 MDPE, C: 13 MDPE y D: 19 MDPE. Los contornos muestran quadrats de 2x2 plantas, con el eje y en la dirección de las hileras. El incremento de la diseminación de HLB es indicado por la variación de los colores de verde (menor incidencia) a rojo (mayor incidencia). En el campo CA 4185 de Ciego de Ávila, a diferencia del resto de los campos evaluados no se observa la ocurrencia de focos bien individualizados sino más bien un gradiente de A B C D Figura 17. Áreas isópatas del campo del campo CA 1498 de Ciego de Ávila a partir de los datos de incidencia de cuatro evaluaciones representativas. A: 5 MDPE, B: 9 MDPE, C: 15 MDPE y D: 20 MDPE. Los contornos muestran quadrats de 2x2 plantas, con el eje y en la dirección de las hileras. El incremento de la diseminación de HLB es indicado por la variación de los colores de verde (menor incidencia) a rojo (mayor incidencia). 64

66 Descripción Detallada áreas de mayor incidencia hacia un borde del campo, que no coincide con el extremo colindante a las plantas con síntomas de HLB, propiedad del sector campesino (Figura 16). Este resultado atípico se debe a que la infección inicial de las plantas de este campo ocurrió en la etapa de vivero, como se explicó anteriormente. A partir de este inóculo primario progresó muy lentamente la epidemia Análisis espacial mediante índices de distancia (Spatial Analysis by Distance Indices) Adicionalmente en el tercer nivel de la escala espacial se examinó para los campos sin erradicación, la fortaleza y orientación de la agregación entre quadrats mediante la técnica Spatial Analysis by Distance Indices (SADIE) (Perry et al., 1999). Se analizaron unidades espaciales (quadrats) de 3x3 plantas mediante la técnica SADIE. Se determinaron los Índices de agrupamiento Vi and Vj, que se utilizaron para elaborar mapas de contorno de las áreas patches (áreas que tienen quadrats con número de plantas positivas superior a la media) y gaps (áreas que tienen quadrats con número de plantas positivas inferior a la media) del campo. Se determinó la variación temporal en los patrones espaciales mediante los valores medios absolutos del Índice de agrupamiento V. En el campo CEI 1112, que colinda por el oeste con un campo de Tangelo Sampson injertado sobre naranjo agrio de más de 30 años de edad y alta incidencia de HLB, se encontró un patrón espacial de agrupamiento (Patch-Gap) donde predominan los patches (color rojo) en el oeste, mientras que el este se caracteriza por el predominio de gaps (color azul) (Figura 18, I). Al evaluar la evolución temporal del patrón espacial en este campo se observa un gradiente de diseminación desde el oeste, donde se encuentra el campo adulto enfermo, lo que evidencia que la fuente de inóculo procede del campo vecino. Este proporcionó el inóculo externo (infección primaria) a partir del cual se diseminó la enfermedad al resto de campo mediante infecciones secundarias. En el campo CEI 1112 se observaron patrones espaciales significativamente agregados durante toda la epidemia evaluada, mientras que el patrón en el campo JG T-25 3a de Jagüey Grande es agregado solamente en el centro del tiempo evaluado (Figura 18, II, 22 MDPE), lo que se corresponde con un aumento abrupto de la incidencia de plantas con síntomas. Posteriormente debido a la alta incidencia y la coalescencia de los focos, disminuye la agregación en este campo. 65

67 Descripción Detallada En el campo CA 4185, se encontró un patrón espacial de agrupamiento (Patch-Gap) donde predominan los patches (color rojo) en el este, mientras que el oeste se caracteriza por el predominio de gaps (color azul) (Figura 18, III). Este campo colinda por el sudeste con plantas de limero Persa injertado sobre patrón naranjo agrio de aproximadamente 15 años de edad perteneciente al sector privado y con síntomas asociados a HLB. Sin embargo, a diferencia del campo CEI 1112, no se observó un gradiente de diseminación desde el este, donde se encuentra el campo adulto enfermo. Este resultado unido al hecho de que las primeras plantas con síntomas se detectaran a solo 4 meses de plantadas, periodo inferior a la incubación de la bacteria, sugirió que la fuente de inóculo no procedía del campo vecino. Como se refirió anteriormente en este caso la infección ocurrió en la etapa de vivero. Este inóculo inicial proporcionó la infección primaria a partir I II III Figura 18. Mapas de los Índices de agrupamiento (V) obtenidos a través del análisis espacial Spatial Analysis by Distance Indices (SADIE) para el número de plantas con síntomas asociados a HLB en cuatro evaluaciones representativas. Los ejes muestran la distancia en metros de los quadrats de 3x3 plantas. Los contornos que rodean patches con vi > 1.5 (por encima de lo esperado) se representan en color rojo, mientras que los contornos que rodean gaps con vj < -1.5 (por encima de lo esperado) se representan en color azul. (I): campo CEI 1112, Ceiba del Agua, Artemisa (A: 0 meses después de a primera evaluación (MDPE), B: 11 MDPE, C: 26 MDPE, D: 42 MDPE); (II): campo JG T-25 3a, Jagüey Grande, Matanzas (A: 0 MDPE, B: 10 MDPE, C: 22 MDPE, D: 32 MDPE y (III): campo CA 4185, Ciego de Ávila (A: 5 MDPE, B: 7 MDPE, C: 11 MDPE, 66

68 Descripción Detallada Figura 19. Variación en los patrones espaciales de plantas con síntomas asociados a HLB determinados mediante los valores medios absolutos del índice de agrupamiento v en los campos: CEI 1112, Ceiba del Agua, Artemisa; JG T-25 3a, Jagüey Grande, Matanzas y CA 4185, Ciego de Ávila. Los símbolos rellenos representan valores significativamente superiores a 1. de la cual se diseminó la enfermedad en toda la extensión del campo mediante infecciones secundarias (Figura 18, I). Al graficar los valores medios absolutos del Índice de agrupamiento v se evidenció la variación en los patrones espaciales de plantas con síntomas asociados a HLB en los tres campos en los que se aplicó SADIE para el estudio de la diseminación espacial (Figura 19). A diferencia de los campos de Ceiba y Jagüey, el CA 4185 mostró un patrón agregado solamente en la primera evaluación donde se observaron plantas con síntomas, a partir de esta el patrón espacial continuó de forma aleatoria. En el campo de Jagüey se encontró evidencia de la existencia de varios ciclos de infección, mientras que en los campos de Ceiba y Ciego el proceso parece ser más continuo. 4.7 Consideraciones Generales El manejo de HLB es complejo y requiere una estrategia integrada que necesariamente incluya el uso de material de propagación certificado, la eliminación de las fuentes de inóculo, el uso de plaguicidas químicos para controlar los vectores psílidos en los viveros y plantaciones y el control de estos en otras plantas hospedantes. Además, para el manejo de la enfermedad se necesitan metodologías de diagnóstico rápidas y robustas, estudios epidemiológicos para estudiar su comportamiento en cada región geográfica, así como de los vectores y su control (Halbert y Manjunath, 2004). En este sentido, durante la ejecución de este trabajo se implementó y validó una metodología nueva para el diagnóstico de CLas, lo que permitió confirmar la presencia de las bacterias durante los experimentos de epidemiología en plantas con los síntomas más 67

69 Descripción Detallada característicos de HLB, utilizables con valor diagnóstico, así como la confirmación de la enfermedad en plantas con síntomas no característicos. Esta metodología mostró parámetros de desempeñó superiores a la PCR convencional (método de diagnóstico utilizado en el IIFT para la certificación del material de propagación de cítricos). Una aplicación directa y aporte del trabajo fue la sustitución de la PCR convencional por la PCR anidada en los protocolos de diagnóstico incluidos en el Sistema de Producción de Material de Propagación Certificado de Cítricos, aumentando así la seguridad y confiabilidad en la liberación de los materiales producidos. Disponer de material de propagación con certificación sanitaria es un elemento básico en los programas de manejo de esta enfermedad. Otra de las bases de los programa de manejo de HLB y de enfermedades que son diseminadas por insectos vectores es la reducción de las fuentes de inoculo por medio de la eliminación de las plantas enfermas (Gómez, 2010; Bassanezi et al., 2013a). En este trabajo se describen los síntomas característicos y asociados a la enfermedad en áreas de naranjo y pomelo de Ceiba y Jagüey, respectivamente. Se encontraron valores de correlación significativos de los brotes cloróticos y deficiencias nutricionales con los moteados asimétricos. Aunque el moteado asimétrico es el síntoma característico considerado como criterio de positividad para la eliminación de plantas enfermas en Cuba (Llauger et al., 2011), los resultados indican que debe considerarse el seguimiento de las plantas con brotes cloróticos y deficiencias nutricionales en plantas que pudieran evolucionar posteriormente y mostrar el moteado asimétrico. Por otra parte, las diferencias encontradas en la manifestación de los síntomas entre las plantas de naranjo de Ceiba y de pomelo de Jagüey pudieran ser explicadas por las características de cada localidad (suelo y clima) y las diferencias en la agrotecnia aplicada en estas plantaciones. De la misma forma, se ha demostrado que existe una respuesta diferencial entre los cultivares a la infección por la bacteria causante de HLB (Foliminova et al., 2009; Stover y McCollum, 2011). La evaluación y el conocimiento de la diseminación espacial y temporal de las enfermedades de las plantas constituyen un complemento importante y útil como punto de partida para la definición de sus manifestaciones biológicas. Además es la base de los estudios de predicción de la enfermedad e indicativo de la eficiencia de los distintos métodos de control implementados (Bassanezi et al., 2003). Los estudios epidemiológicos de HLB en los campos evaluados en este trabajo indican que el progreso temporal y espacial de la enfermedad en Cuba es similar a lo informado 68

70 Descripción Detallada en países como Brasil y E.E.U.U. donde se han llevado a cabo estudios similares (Gottwald, 2010; Bassanezi et al., 2013). Los resultados indicaron que los muestreos de plantas sintomáticas de HLB en las plantaciones comerciales y su erradicación podrían realizarse cada tres meses. Esto permitirá disminuir los costos y facilitar el trabajo de los inspectores en el campo, que podrían cubrir mayores áreas en menor tiempo. En cuanto al progreso temporal, en el 71% de los campos pudo ser ajustado a alguno de los dos modelos reportados en la literatura para esta epidemia (Logístico o Gompertz), con elevadas tasas aparentes de infección que describen el incremento acelerado observado en áreas jóvenes en el país. Los resultados del progreso temporal de HLB relacionados con la dinámica poblacional de su vector en las tres regiones donde fueron evaluados campos durante este estudio, corroboran que donde no hay un manejo efectivo de HLB (ausencia de erradicación y control del vector) en las plantaciones jóvenes la enfermedad puede alcanzar valores de incidencia superiores al 50% en un periodo de tres a cinco años. Por otra parte aún con un manejo eficiente de HLB, la influencia de la colindancia con plantaciones enfermas repercute a partir de los 3 años en un incremento de la incidencia de HLB en un corto periodo de tiempo hasta los mismos niveles que las áreas sin este manejo. Observaciones de campo realizadas de forma general en el resto de las plantaciones comerciales del país describen similar comportamiento. Esto se debe a la imposibilidad de controlar las infecciones primarias que constantemente se están produciendo en los campos, por las poblaciones del vector que migran de las áreas colindantes diseminando la bacteria. Los resultados de los análisis espaciales reafirman esta hipótesis observándose siempre mayor presencia de focos y la progresión de estos a partir de los bordes de los campos cercanos a plantaciones enfermas, destacando la importancia de la infección primaria en el progreso de la enfermedad en nuestras condiciones. Teniendo en cuenta lo anterior expuesto para lograr un mejor control de D. citri sería necesario introducir el empleo de trampas amarillas en los bordes de los campos para contabilizar las poblaciones migrantes de D. citri, que se trasladan desde las plantaciones colindantes y pueden generar infecciones primarias. Podemos concluir que el trabajo desarrollado aporta elementos básicos para el perfeccionamiento de los diferentes componentes establecidos en Cuba en el Programa Nacional para el Manejo de HLB. La información generada como parte de la investigación contribuyen a perfeccionar (1) la producción de material de propagación certificado de cítricos, base del programa de manejo, con la implementación de una nueva metodología 69

71 Descripción Detallada de diagnóstico, (2) reducción de las fuentes de inóculo, por la determinación de los síntomas característicos y asociados a la enfermedad en áreas de Cuba, así como la determinación de la frecuencia de los muestreos de las prospecciones de plantas enfermas, y (3) manejo del vector, con el conocimiento de la dinámica poblacional y los efectos de las plantaciones colindantes. Los estudios muestran la importancia de los diferentes escenarios de intervención en el manejo de HLB en la diseminación de la enfermedad en las plantaciones. Este trabajo valida la importancia de los estudios epidemiológicos como herramienta para la evaluación y adecuación de las estrategias de manejo en general y particularmente para el huanglongbing de los cítricos, enfermedad compleja y de difícil manejo. Igualmente indica que para lograr nuevas plantaciones que entren en producción es indispensable aplicar las medidas de manejo de HLB establecidas. 70

72 Referencias Bibliográficas 5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Altman, D. G., J. M. Bland Statistics Notes: Diagnostic tests 1: sensitivity and specificity. BMJ 308: Applied Biosystems Applied Biosystems Users Manual PCR basics Copyright, The Perkin-Elmer Corporation Aubert B Citrus Huanglongbing experiences of integrated vector management (IVM) in Reunion and Guadeloupe, two ultraperipheral regions of the European Union. Keynote Lectures. Proc. Int. Res. Conf. Huanglongbing, pp Bassanezi R.B., L.H. Montesino N. Gimenes-Fernandez, P.T. Yamamoto, T.R. Gottwald, L. Amorim and A. Bergamin Filho Efficacy of area-wide inoculum reduction and vector control on temporal progress of Huanglongbing in young sweet orange plantings. Plant Disease 97 (6): Bassanezi RB, Bergamin Filho A, Amorim L & Gottwald T Epidemiology of huanglongbing in São Paulo. Proceedings of Huanglongbing Greening International Workshop, Ribeirão Preto. p.37. Bassanezi RB, Busato LA, Bergamin-Filho A, Amorim L, Gottwald TR Preliminary spatial pattern analysis of Huanglongbing in Sao Paulo, Brazil. Proc. 16th Conf. Intern. Org. Citrus Virol., pp IOCV, Univ. Calif., Riverside, CA. Bassanezi, R.B., Lopes, S.A., Belasque Junior, J, Spósito, M.B., Yamamoto, P.T., Miranda, M.P., Teixeira, D.C. & Wulff, N.A Epidemiologia do huanglongbing e suas implicações para o manejo da doença. Citrus Research & Technology. 31(1): Bassanezi, R.B., Bergamin Filho A, Amorim L. Giminez Fernandes N., Gottwald TR. And Bové JM Spatial and temporal analisis of citrus sudden death as a tool to generate hypotheses concerning its etiology. Phytopathology 93 (4): Batista, L., Velázquez, K., Estévez, I., Peña, I., López, D., Reyes, M. Rodríguez, D. and Laranjeira, F Spatial Temporal Dynamics of Citrus Tristeza Virus (CTV) in Cuba. Plant Pathology 57: Bové J. M Huanglongbing: A destructive, Newly-Emerging, century-old disease of citrus. J. Plant Pathol. 88(1):

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74 Referencias Bibliográficas huanglongbing (citrus greening) under different conditions. Phytopathology. Vol.99, No 12. Forteza, L.A Manejo de la fertilización foliar en plantaciones de naranjo valencia (Citrus sinensis L. Osb.) con síntomas de deficiencias nutricionales. Tesis presentada en opción al titular de master en Fruticultura tropical. IIFT. Gardner, M.J., D.G. Altman, Statistics with confidence. Br. Med. J. Lond. Garnier, M., S. Jagoueix-Eveillard, P. Cronje, H. Le Reoux, J.M. Bové Genomic characterization of a liberibacter present in an ornamental rutaceous tree, Calodendrum capense, in Western Cape Province of South Africa. Proposal of Candidatus Liberibacter africanus subsp. capensis. Int. J. Syst. Bacteriol. 50: Gelfand, D.H., T.J. White Thermostable DNA polymerases. En: PCR protocols a guide to methods and applications. Innis M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. eds. Academic Press Emeryville. CA, pp Gómez H Screening Aid for Huanglongbing (HLB) or Citrus Greening Disease Symptoms. González C., M. Gómez, M. Fernández, D. Hernández, J-L. Tapia, L. Batista Diaphorina citri Kuw. (Hemipthera: Psillidae) Behavior and natural enemies in Cuban citriculture. Proceedings, 17th Conference IOCV, González, C; M. Borges, M. Gómez; R. Llauger; M. Fernández; C. Murguido, Y. Hernández Establecimiento de metodologías eficientes para la detección y control de Diaphorina citri Kuw. y la enfermedad HLB de los cítricos. Informe final de Proyecto CITMA. 43pp. Gottwald TR, Cambra M, Moreno, Camarasa E, Piquer J, Spatial and temporal analyses of citrus tristeza virus in eastern Spain. Phytopathology 86, Gottwald TR Current Epidemiological Understanding of Citrus Huanglongbing. Annu. Rev. Phytopathol. 48: Gottwald, T. R., Aubert, B., and Xue-Yuan, Z Preliminary analysis of citrus greening (Huanglongbing) epidemics in the People's Republic of China and French Reunion Island. Phytopathology 79: Gottwald, T. R., da Graça, J. V., and Bassanezi, R. B Citrus huanglongbing: the pathogen and its impact. Plant Health Progress. Online publication. doi: /php pubmed RV 73

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79 Acreditación de la Introducción del Resultados y de su Impacto 6 ACREDITACIÓN DE LA INTRODUCCIÓN DEL RESULTADO Y DE SU IMPACTO La ejecución de este proyecto hizo posible la presentación, publicación y aprobación de los siguientes trabajos científicos: 6.1 Participación en eventos 2008 VI Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal. 48 Reunión Anual de la Sociedad Americana de Fitopatología-División Caribe, La Habana, Cuba: Inés Peña, Daylé López, Maritza Luis, Cyrelys Collazo, Raixa LLauger y Juan Carlos Casín. Síntomas asociados al huanglongbing de los Cítricos en Cuba, VI Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal. Septiembre La Habana. La psila asiática de los cítricos, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), en cítricos de Cuba. C. González, D. Hernández, J. L Rodríguez, L. Pérez, M. Fernández th International Citrus Congress (ICC2008) China. Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae), incidence and control in Cuban citriculture. C. González, M. Gómez, L. Pérez, D. Hernández, Jorge L. Tapia, M. Fernández, A. Vera, O. Rodriguez Taller internacional sobre plagas cuarentenarias de los cítricos, Tabasco, México, 2009: Situación actual, manejo e impacto económico del HLB en Cuba. Raixa Llauger, Maritza Luis, Cyrelys Collazo, Inés Peña, Caridad González, Lochy Batista, Lumey Pérez, Armelio Borroto, Daniel Pérez, Daylé López, Eugenio Alonso, Irina Acosta, Juan Carlos Casín, Luis Alberto Torres Fórum de Ciencia y Técnica. Empresa Citrícola Ciego de Ávila, Cuba, Relevante. Huanglongbing y su vector Diaphorina citri Kuwayama en la Empresa Citrícola Ciego de Ávila. Estrategia seguida por nuestra Empresa en la lucha contra el vector y la enfermedad. Daniel Pérez Valladares y Daylé López Hernández VI Congreso argentino de citricultura y II Reunión de entomólogos dedicados al HLB, Ciudad, Argentina 2010: Situación actual del HLB en Cuba. Maritza Luís III Simposio de Fruticultura tropical, La Habana, Cuba, 2010: Evaluación de la efectividad del manejo de huanglongbing en plantaciones de tres áreas citrícolas de Cuba. Lochy Batista, Juan Carlos Casín, Daniel Pérez, Daylé López, Maritza Luis, Inés Peña, Cyrelys Collazo, Lester Hernández, Pedro Luis Ramos, Caridad González, Lumey Pérez, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez, Irina Acosta, Reinaldo Israel Cabrera, Jorge Leyva, Eugenio Alonso, Raixa Llauger, Luis Alberto Torres. Validación de la PCR dúplex para el diagnóstico de huanglongbing de los cítricos en Cuba. Cyrelys Collazo, Maritza Luís, Raixa Llauger, Daylé López, Inés Peña, Noel Herrera, Lochy Batista. Parámetros poblacionales de Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae) en plantas de Citrus aurantium L. en condiciones de laboratorio. Lumey Pérez, C. González, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez y Miriam Fernández Cría de Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae) en Citrus aurantifolia L. y Murraya paniculata (L.) Jack en condiciones de laboratorio. Lumey Pérez, C. González, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez y Miriam Fernández. Evaluación de los aceites minerales Sigatoka y Rocio spray en el control de Diaphorina citri Kuw. Reinaldo I. Cabrera; C. González; Doris 78

80 Acreditación de la Introducción del Resultados y de su Impacto Hernández; Jorge L. Rodríguez; Jesús Ferrer; Noel Herrera 2010 XVIII Congreso Internacional de Virólogos de Cítricos, Campinas, Brasil, 2010: Temporal progress of huanglongbing and its symptoms in two citrus areas in Cuba. Lochy Batista, Inés Peña, Maritza Luís, Cyrelys Collazo, Irina Acosta, Lester Hernández, Pedro L. Ramos, Jorge L. Leyva, Raixa Llauger, Juan C. Casín, Paulo L. Ortiz. Citrus Huanglongbing in Cuba: diagnostics, characterization and management. Cyrelys Collazo, Maritza Luis, Raixa Llauger, Diva D.C. Teixeira, Sandrine Jagoueix, Lochy Batista, Inés Peña, Daylé López, Daniel Pérez, Jorge R. Cueto, Joseph M. Bové Taller internacional HLB, Mérida, México, 2010: Huanglongbing (HLB) de los Cítricos en Cuba. Situación actual, su manejo e impacto económico. Jorge R; Cueto, Raixa Llauger, Maritza Luis, Cyrelys Collazo, Inés Peña, Caridad González, Lochy Batista, Lumey Pérez, Armelio, Daniel Pérez, Daylé López, Eugenio Alonso, Irina Acosta, Juan Carlos Casín, Luis A. Torres IV Simposio Internacional citrícola, Colimero, México, 2010: Situación actual de la enfermedad huanglongbing en Cuba. Luis, M., Collazo C., R. Llauger, I. Peña, L. Batista, J. R. Cueto, J. C. Casín., A. Borroto, D. López y R. Riaño. Identificación y diagnóstico de la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus asociada a la enfermedad huanglongbing de los cítricos en Cuba. Luis, M., Collazo, C., Llauger, R., I. Peña, L. Batista, J. D. Texeira, E. Kitajima y J. M. Bové Forum de Ciencia y Técnica de la Empresa Citrícola Ciego de Ávila. Destacado. Evaluación preliminar del comportamiento de Huanglongbing y su vector Diaphorina citri Kuwayama en la Empresa Citrícola Ciego de Ávila. Daylé López Hernández y Armelio Borroto 2011 VII Simposium Internacional de Limón Mexicano, Michoacán, México, 2011: Enfermedades de alto impacto para la citricultura. Inés Peña. Huanglongbing de los cítricos en Cuba, Diagnóstico y manejo de la enfermedad. Maritza Luís. Seminario Internacional de Sanidad Agropecuaria SISA 2011 mayo 2011: Diaphorina citri kuw., (Hemiptera: Psyllidae). Fluctuación poblacional e índices ecológicos en cítricos de Jagüey Grande y Cienfuegos. C. González, M. Gómez, O. Rodríguez, A. Vera, M. Alonso, D. Hernández, J. L. Rodríguez. Distribución espacio - temporal de las poblaciones de Diaphorina citri Kuw. en Citrus sinensis Osbeck. L. Pérez, C. González, D. Hernández, J. L. Rodríguez y M. Fernández ta Semana Internacional de la Citricultura, Martínez de la Torre, México, 2012: Huanglongbing de los cítricos en Cuba. Situación actual, manejo y principales investigaciones en una de las más importantes regiones productoras de cítricos del país. López, D., Borroto, A., Pérez, D., Batista, L., Peña, I., Luis, M., Collazo, C., González, C., Pérez, L., Zamora, V., Llauger, R., Casín, J.C Congreso Internacional de Cítricos, Valencia, España, 2012: Analysis of citrus Huanglongbing spatial dynamics in non-intervened groves of Cuba by Spatial Analysis by Distance Indices (SADIE). Batista L., Peña I., Luis M., Acosta I., Hernández L., Llauger R., Casín J.C., and Laranjeira F.F Taller Perspectivas del manejo integrado de los cítricos en el control de huanglongbing en el XIII Congreso Científico Internacional del Instituto Nacional 79

81 Acreditación de la Introducción del Resultados y de su Impacto de Ciencias Agrícola (INCA), 2012: Aporte de los estudios epidemiológicos para el manejo de HLB. Lochy Batista, Inés Peña, Maritza Luís, Lester Hernández, Daylé López, Juan Carlos Casín, Irina Acosta, Caridad González, Lumey Pérez, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez, Daniel Pérez y Francisco F. Laranjeira Taller nacional de manejo del HLB, 2012: Epidemiología de HLB. Estudio de casos en Ceiba, Jagüey Grande y Ciego de Ávila. Lochy Batista, Inés Peña, Maritza Luís, Lester Hernández, Daylé López, Juan Carlos Casín, Irina Acosta, Caridad González, Lumey Pérez, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez, Daniel Pérez y Francisco F. Laranjeira Fórum de Ciencia y Técnica. Empresa Citrícola Ciego de Ávila, Cuba, Destacado. Evaluación de la estrategia de manejo de HLB en la Empresa Citrícola Ciego de Ávila. Daylé López, Daniel Pérez, Armelio Borroto, Lochy Batista, Inés Peña, Lumey Pérez y Silvia Jiménez VII Congreso Argentino de Citricultura, Mayo 2013: Diagnóstico y manejo de la enfermedad Huanglongbing de los cítricos en Cuba: estudio de casos. Maritza Luis, Lochy Batista, Dayle López, Miguel Aranguren, Lester Hernández, Inés Peña, Edel Pérez y Gabriel García IV Simposio Internacional de Fruticultura Tropical y Subtropical. Mayabeque, Cuba: Estandarización de la reacción en cadena de la polimerasa anidada para el diagnóstico de la enfermedad huanglongbing de los cítricos. Maritza Luis, Jazmín Núñez, Cyrelys Collazo y Raixa Llauger. Epidemiología de enfermedades de los cítricos en Cuba: herramientas para el manejo? Lochy Batista, Inés Peña, Maritza Luis, Lester Hernández, Daylé López, Juan C. Casín, Irina Acosta, Caridad González, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez, Daniel Pérez, Edel Pérez y Francisco Laranjeira. Brachyacantha bistripustulata Fabric. (Coleoptera: Coccinelidae), primer informe como enemigo natural de Diaphorina citri Kuw. en Ceiba del Agua. Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez y Caridad González, Hanser Fortes Consideraciones acerca del manejo de Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae) Caridad González, Lumey Pérez, Ossiel Rodríguez, Adisbel Vera, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez 6.2 Publicaciones 2010 Luis, M., Collazo C., R. Llauger, I.Peña, L. Batista, J. R. Cueto, J. C. Casín, A. Borroto, D. López y R. Riaño Situación actual de la enfermedad huanglongbing en Cuba. Memorias de IV Simposio Internacional citrícola, Colima. México, p ISBN Luis, M., Collazo, C., Llauger, R., I. Peña, L. Batista, J. D. Texeira, E. Kitajima y J. M. Bové Identificación y diagnóstico de la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus asociada a la enfermedad huanglongbing de los cítricos en Cuba. Memorias de IV Simposio Internacional citrícola, Colima. Mexico, p , ISBN Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae), behavior and natural enemies in Cuban citriculture C. González, M. Gómez, M. Fernández, D. Hernández, J. L. R. Tapia and L. Batista. Proceedings, 17th Conference IOCV, 2010 p Entomófagos asociados a las plagas citrícolas, Lepidosaphes gloverii Pack (Hemiptera: Diaspididae), Phyllocnistis citrella Stt. (Lepidoptera: Gracillariidae) y 80

82 Acreditación de la Introducción del Resultados y de su Impacto Diaphorina citri (Kuw.) (Hemiptera: Psyllidae) en naranjo Valencia. C. González, M. Gómez, D. Hernández, J. Rodríguez. Centro Agrícola, 37(4):59-65; oct.-dic., Raixa Llauger, Maritza Luis, Cyrelys Collazo, Inés Peña, Caridad González, Lochy Batista, Lumey Pérez, Armelio Borroto, Daniel Pérez, Daylé López, Eugenio Alonso, Irina Acosta, Juan Carlos Casín, Luis Alberto Torres, Doris Hernández y Jorge L. Rodríguez Huanglongbing y su vector en Cuba. Epidemiología y manejo. Citrifrut 27 (2): Collazo, C., Núñez, J., Luis, M. y Llauger, R Optimización de una reacción en cadena de la polimerasa anidada para el diagnóstico de la enfermedad huanglongbing de los cítricos. Citrifrut. Vol. 28 (2): Resultados Científicos para la para la Investigación (RI) e Introducciones Directas (ID) 2010 Aplicación de los estudios epidemiológicos de huanglongbing para evaluar la efectividad del manejo en plantaciones de tres áreas citrícolas de Cuba. Lochy Batista, Juan Carlos Casín, Daniel Pérez, Daylé López, Maritza Luis, Inés Peña, Cyrelys Collazo, Lester Hernández, Pedro Luis Ramos, Caridad González, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez, Irina Acosta. 6ID Evolución de los síntomas de huanglongbing en plantaciones de dos áreas citrícolas de Cuba. Lochy Batista, Inés Peña, Maritza Luis, Cyrelys Collazo, Irina Acosta Lester Hernández, Pedro Luis Ramos, Paulo L. Ortiz. Código: 6RI Optimización y estandarización de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para el diagnóstico de huanglongbing de los cítricos. Cyrelys Collazo Cordero, Jazmín Y. Núñez Luis, Maritza Luis-Pantoja, Raixa Llauger- Riverón. Código: 6ID Comportamiento ecológico de Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae) en toronjo Marsh de la Empresa de Cítricos Victoria de Girón, Matanzas. Caridad González, Maylén Gómez, Doris Hernández, Jorge L. Rodríguez, Osiel Rodríguez. 6.4 Tesis presentadas 2008 Comportamiento de Diaphorina citri Kuw. (Hemiptera: Psyllidae) en pomelo Marsh (Citrus paradisi), de la Empresa de Cítricos Victoria de Girón, Matanzas. Tesis en opción al título de Master en Sanidad Vegetal Universidad Agraria Matanzas Estudios epidemiológicos de la enfermedad huanglongbing en áreas de fomento de la Empresa de Cítricos Victoria de Girón de Jagüey Grande. Tesis presentada en opción al grado de Master en Fruticultura Tropical Validación de una técnica de PCR anidada para el diagnóstico de HLB en Cuba. Tesis presentada en opción al grado de Licenciada en Microbiología, de la Facultad de Biología, Universidad de la Habana. Junio. 81

83 Avales de Acreditación de la Propuesta a Premio Ramal MINAG AVALES DE ACREDITACIÓN DE LA PROPUESTA A PREMIO RAMAL MINAG 2013 Se presentan documentos que avalan tanto el valor científico de la propuesta a premio ramal, como la aplicabilidad en los sistemas productivos del país. Estos avales fueron emitidos por las siguientes instituciones: Dictamen del Consejo Científico del Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT). Aval de Arisbel Ferro Barrios, Presidenta Grupo Empresarial Frutícola (GEF), MINAG. Aval del Ing. Humberto Vásquez Vega, Director General del Centro Nacional de Sanidad Vegetal (CNSV). Aval de Nelson Paz, Director Empresa Agroindustrial Ceballos, Ciego de Ávila. Aval del Ing. Rolando Alberto Rodríguez, Director Empresa Cítricos Ceiba, Artemisa. 82

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