Espectroscopía de emisión molecular

Transcripción

1 Espectroscopía de emisión molecular 1

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6 RELAJACION NO RADIATIVA no se emite luz, sino que el estado excitado decae a traves de mecanismos vibracionales y rotacionales CONVERSION INTERNA de un estado electronico a otro en tiempos del orden del segundos. RELAJACION VIBRACIONAL dentro de un estado electronico en tiempos de a segundos. RELAJACION RADIATIVA: LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado excitado electrónico FLUORESCENCIA Estado excitado singulete, transición permitida, tiempos cortos, del orden de a 10-7 segundos. FOSFORESCENCIA Estado excitado triplete, transición prohibida, tiempos largos, mayores a 10-6 segundos, y hasta horas. QUIMIOLUMINISCENCIA Cualquiera de los anteriores si se alcanza el estado excitado por una reacción química. (Palitos de luz en recitales, Luminol, bichos de luz, Noctiluca, etc.) RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA (Q): fotones emitidos Rendimiento (Q) = <1 fotones absorbidos Aquellas moleculas que decaen rapidamente por relajacion no radiativa tienen menos fluorescencia. Por eso las moleculas mas fluorescentes suelen ser rígidas y/o estericamente impedidas de rotar y vibrar. Si tenemos que: k f k d = constante de velocidad de emisión = constante de velocidad de decaimiento no radiativo entonces Q = k f / (k f + k d ) 6

7 TIEMPO DE VIDA INTRINSECO DE LA FLUORESCENCIA: es el tiempo de vida si sólo volviera al estado basal por fluorescencia = tiempo de vida intrínseca o natural, sin ningún proceso no radiativo τ n = 1 / k d TIEMPO DE VIDA EXPERIMENTAL: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía) = tiempo de vida experimental τ = 1 / (k f + k d ) Hay equipos para medir tiempos de vida de fluorescencia, que son muy utiles en análisis químico. Tambien hay microscopios de tiempos de vida de fluorescencia. Fluorómetro de 2 monocromadores 7

8 Fluorómetro de 1 monocromador y detector de matriz de diodos Fluorómetro con fuente de luz monocromática 8

9 Fuentes de luz Lamparas de arco de Xe Lamparas de Xenon, continuas y pulsadas Lamparas de Hg Hg / Xe, fuertes en el UV Lamparas de filamento (malas) LEDs Laseres UV Ozone Free Visible Lamparas de arco de Hg/Xe 9

10 Light Emitting Diodes (LED) 350 nm to 1300 nm nm, UV cercano Laseres Helium-cadmium 325nm 295nm Blu-Ray laser 405 nm 351 nm 364 nm 445nm Nd- YAG doblado 532 nm 576nm Diodo laser rojo Titanium:Sapphire 690 nm 990 nm 650 nm Wavelength (nm) 10

11 Diodos Laser Diodos Laser: 405 nm Violeta (Blu Ray) 445 nm Azul (diodo) 473 nm Azul (Nd-YAG) 532 nm Verde (Nd-YAG) 588 nm Amarillo 635 nm Rojo (diodo) no es un diodo: nm IR (TiSa) Detectores Scallop Eyes From Image courtesy of BioMEDIA ASSOCIATES 11

12 APD El fotomultiplicador (PMT) es voluminoso, rápido y precisa de una fuente de muy alta tension (1000 V). Sirve para contador de fotones y en regimen lineal. Tiene mejor respuesta a cortas longitudes de onda. El fotodiodo de avalancha es muy rapido, chiquito, robusto, sirve para contador de fotones y tambien en régimen lineal (analógico). Tiene buena respuesta en el IR cercano. El PMT clásico fotocátodo Vacío dinodos λ Window e - e e -e- eē- - e anodo Salida de corriente Fuente de 1000 a 2000 Volts divisor de tension hecho con resistencias 12

13 Photon Counting (Digital) y detección analógica time Signal Medición Photon Counting: Discriminator Sets Level Constant High Voltage Supply PMT level TTL Output (1 photon = 1 pulse) Computer Analog: Voltage Supply PMT Anode Current = Pulse averaging Primary Advantages: Sensitivity (high signal/noise) Increased measurement stability Primary Advantage: Broad dynamic range Adjustable range Ocean Optics Red Tide Entrada de fibra óptica 2 - Rendija única (entrada) 3 - filtro de entrada 4 - espejo enfocador red de difracción 6 - espejo enfocador lentecitos (opcionales) 8 - detector de array de diodos 13

14 Ocean Optics Red Tide señales analógicas A/D 12 bits procesador interno USB Detector Sony ILX511 CCD No. of elements 2048 pixels Sensitivity 75 photons per count (at 400 nm) Pixel well depth ~62,500 electrons Signal-to-noise ratio 250:1 (at full signal) A/D resolution 12 bit Dark noise 3.2 RMS counts (RMS = σ) Corrected linearity >99.8% Optical resolution ~2.0 nm FWHM Stray light <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Dynamic range: 2 x 10 8 (system); 1300:1 for a single acquisition Data transfer rate: Full scans into memory every 13 milliseconds with USB 2.0 port Integration time: 10 microseconds to >60 seconds (detector's limit is ~15 sec) Desde la fuente de luz a la medición 14

15 Desde la fuente de luz a la medición E foton = hc/λ λ = 405 nm h = 6.62x10-34 J.s c = 3x10 8 m.s -1 E foton = 4.9x10-19 J I fuente = 0.1 mw de luz = 10-4 W = 10-4 J.s -1 = 2.04x10 14 fotones/s Desde la fuente de luz a la medición de los 2.04x10 14 fot/s, solo el 1% llega al centro de la cubeta, porque el LED lanza luz en un angulo amplio. Quedan 2.04x10 12 fot/s 15

16 Excitacion efectiva: 2.04x10 12 fot/s Desde la fuente de luz a la medición Absorbancia = 0.1 Transmitancia T = 10 -A = = 79.4% Fracción absorbida = 1 - T = = 20.6% absorbió 4.20x10 11 fot/s Desde la fuente de luz a la medición absorbió 4.20x10 11 fot/s eficiencia cuantica de fluorescencia = 0.22 emision = 9.24x10 10 fot/s 16

17 Desde la fuente de luz a la medición emision = 9.24x10 10 fot/s pero solo una minima fracción pasa por el agujero de 2 mm a la entrada del instrumento! distancia al agujero = 3 cm Area esfera de 3cm de radio = 4πR 2 = 113 cm 2 Area agujero = πr 2 = cm 2 fracción de luz que entra = (0.03%) Desde la fuente de luz a la medición emision total = 9.24x10 10 fot/s emision que entra = 2.57x10 7 fot/s 17

18 Desde la fuente de luz a la medición emision que entra = 2.57x10 7 fot/s Ancho de banda de la fluorescencia = 150 nm, se divide entre 150 partes del sensor, aprox fotones por cada una (aunque a los centrales les toca mas que a los bordes) Desde la fuente de luz a la medición fotones por cada parte del sensor correspondiente a un nanometro, a 75 fotones por cuenta (especificacion del sensor del equipo) = 2630 cuentas / nm (si dejamos que la luz se capte durante 1 segundo). 18

19 La absorbancia de la muestra atenúa la entrada de la luz de excitación Efecto de filtro interno Rhodamine B from Jameson et. al., Methods in Enzymology (2002), 360:1 Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo Efecto de filtro interno epsilon [F]/um Abs Abs /2 T 1-T fluorescencia fluorescencia absorbancia absorbancia Se usan concentraciones con absorbancia menor a

20 Geometría de la medición de fluorescencia Tiempos de vida La luminiscencia decae exponencialmente Φ Φ τ L L 0 L (t) Φ L ( t) = Φ 0 L e emision a tiempo = t emision a tiempo = 0 t τ tiempo de vida experimental L τ = 1 / (k f + k d ) 20

21 Midiendo tiempos de vida obtenemos informacion valiosa Quenching estatico (formacion de complejos): El fluoroforo se une a una molecula quencher, y el complejo formado no es emisivo. Solamente el fluoroforo no unido puede emitir luz.. Los tiempos de vida son los mismos, los correspondientes al fluoroforo. Quenching dinámico (colisional): La molecula quencher colisiona con el estado excitado del fluoroforo y le hace perder su energia en forma no radiativa.. El tiempo de fluorescencia se reduce porque k nr aumenta, ya que hay una nuevo paso de desactivacion. Quenching dinamico por mecanismo de Förster (FRET): Un aceptor de energía cerca (pero no tanto) del fluoroforo le come su energia por un mecanismo de acoplamiento dipolo-dipolo dipolo.. Al fluoroforo se lo llama donor y al quencher aceptor aceptor. La constante de energy transfer cae como R -6. Se usa mucho en estudios biológicos. Quenching estatico La emision decae con la concentración de quencher. 21

22 Quenching dinámico que tipo de quenching es? dinámico estático 22

23 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 23