GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS (2 Parte) FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA AÑO 2017

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1 FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA 2017 GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS 2 da PARTE 1

2 GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS (2 Parte) FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA AÑO 2017 CONTENIDOS Cronograma Trabajo Práctico N 6: Simulación de Sistemas Biológicos. Sistema Circulatorio (13/10) Trabajo Práctico N 7: Simulación de Sistemas Biológicos. Sistema Respiratorio (20/10) Trabajo Práctico N 8: Sistema Respiratorio (Frecuencia ventilatoria en Peces) (27/10) Trabajo Práctico N 9: Metabolismo Energético (03/11) Trabajo Práctico N 10: Sistemas a Contracorriente (10/11) 2

3 TRABAJO PRACTICO Nº 6 OBJETIVO SIMULACION EN SISTEMAS BIOLOGICOS SISTEMA CIRCULATORIO El objetivo general del TP es que el alumno logre relacionar e integrar los conocimientos y conceptos teóricos por medio de la simulación de condiciones fisiológicas, a través de un programa computacional. IMPORTANTE. A lo largo de todo el trabajo práctico se realizarán distintos ejercicios de simulación. En cada uno de ellos, se presentarán los valores iniciales (o normales ) de determinados parámetros y se observarán los cambios producidos al modificar alguna de las variables. En TODOS los casos tienen que PREDECIR el sentido del cambio ( / / cte) que esperan obtener para las variables analizadas. Finalmente, deberán interpretar los datos obtenidos y proponer la causa de los cambios observados. A pesar de que en cada ejercicio se analizan distintos parámetros, es importante destacar que en toda la simulación el paciente es el mismo. Entonces, si se modifica una variable en un ejercicio y no se vuelve a los valores normales, el siguiente ejercicio comenzará con valores modificados. Entonces, al comenzar cada nuevo ejercicio, es importante verificar que los valores sean los normales, o resetear (salvo en los casos que la guía indique lo contrario). Sin embargo, el hecho de que el paciente sea el mismo para toda la simulación nos brinda una ventaja. Nos va a permitir, una vez que vayamos conociendo los distintos ejercicios y las variables que se analizan en cada caso, volver a los ejercicios de interés para verificar que las causas a las cuales atribuimos los cambios observados sean las correctas. PROCEDIMIENTO y TRABAJO PRACTICO El programa de simulación SimbioSys Physiology Labs (version 3) Abrir el programa y acceder al menú principal. Para el primer ejemplo que se menciona a continuación se explica en detalle el funcionamiento del programa. Por cualquier duda puede consultarse el TUTORIAL, desde este menú. Si no conocen el significado de alguna de las variables presentes en tablas, pueden clickear con el botón derecho del mouse. Aparecerá el nombre y la opción help, si la eligen el programa les brinda una pequeña descripción. Desde el menú principal (ventana CURRICULUM ) activar sistema circulatorio (The Circulatory System) cliqueando sobre el símbolo (+) de la izquierda. Presión y Flujo Activar Pressure and flow. Se pueden consultar las explicaciones teóricas para repasar los conceptos teóricos. Ir a Exercises Seleccionar Sistemic Vascular Resistance. Leer la explicación sobre la SVR y observar las variables del primer cuadro de la pantalla. SVR = (P art P ra ) / Q Dónde: Part= presión arterial media Para= presión de la aurícula derecha (= presión venosa) Q = cardiac output (gasto cardíaco) Presión arterial media = Presión diastólica + 1/3 de Presión en pulso (sístole diástole) 1- Ejercicio: Uso de Drogas (anotar los valores normales de presión arterial media, SVR, gasto cardíaco) - Fenilefrina (agonista de los receptores adrenérgicos alfa1, produce vasoconstricción periférica): para activar la droga dirigirse al segundo cuadro de la pantalla (todas letras en azul) y buscarla. En el último renglón donde dice stopped, modificar por active (cliquear para hacer el cambio) para iniciar la inyección. Antes de ello, prediga el posible efecto de esta droga. Las dosis de fenilefrina a utilizar serán de 4 y 8 ug/kg/min. Comparar los valores normales de presión arterial media, SVR y gasto cardíaco con los obtenidos luego de agregar la droga. 3

4 Resetear (al pie de la pantalla) - Nitroprusida (antagonista de los receptores alfa 1): seguir los pasos anteriores. Las dosis a inyectar son 0,8 ug/kg/min y mayores a esta (probar hasta tres dosis). Cómo varía el gasto cardíaco en cada caso? Cuál es el significado fisiológico de esos cambios? Discutir y sacar conclusiones Resetear Excitación Cardíaca Activar Cardiac excitation Ir a Exercises Seleccionar AV nodal conduction Observar los valores teóricos de los intervalos de las ondas que se pueden ver en un ECG. El complejo QRS (despolarización de los ventrículos) tiene una duración normal de 0,10 segundos. La duración normal del intervalo P-R oscila entre 0,12 y 0,21 segundos. Si éste tiempo se hace más largo, eso significa que la conducción del impulso por el seno AV (auriculoventricular) está ocurriendo más lentamente. Modificar la conductividad del nódulo AV desde 1 hasta 0 (1; 0,75; 0,5; 0,25 y 0). Observar que sucede con los valores del intervalo P-R, con la frecuencia cardíaca, con la frecuencia del seno auricular (sinus rate) y el gasto cardíaco. Hacer un cuadro. Prestar atención al intervalo P-R en las conductividades del AV de 0,25 y 0. Qué sucede al disminuir la conductividad? Qué sucede con la frecuencia cardíaca para la conductividad cero (0)? Qué supone que está pasando? Discutir y sacar conclusiones. Qué sucede con la frecuencia del seno auricular? A qué puede deberse? Resetear Estructura y Función Cardíaca Activar Cardiac Structure and Function Ir a Exercises Seleccionar Ventricular ejection Observando el gráfico, correlacione la apertura de la válvula aórtica con el volumen ventricular y la presión ventricular. Identificar las fases sístole ventricular (usar la herramienta crosshairs). Estime el % de tiempo que dura cada fase. Seleccionar Ventricular filling En este ejercicio se grafican la válvula mitral (comunica la aurícula con el ventrículo izquierdo), el volumen y la presión ventricular. Correlacione las tres variables. A qué se debe la forma de llenado del ventrículo? Qué ocurre con la válvula aórtica durante la diástole? Está abierta o cerrada? Aumentar la frecuencia cardíaca incrementando la variable Sinus rate. Calcule el volumen sistólico antes y después del aumento de la frecuencia cardíaca (en el gráfico utilice las crosshairs para ver el valor del volumen del ventrículo). Qué sucede? Por qué? Discuta y saque conclusiones Resetear 4

5 Rendimiento Cardíaco Activar Cardiac Perfomance Ir a Exercises Seleccionar Systolic PV relationship. Consulte las explicaciones teóricas para repasar los conceptos teóricos (8A: Cardiac PV Relationship). En este punto profundizaremos en el tema volumen de las cámaras del corazón. LV EDV: volumen diastólico final (del ventrículo izquierdo) LV ESV: volumen sistólico final (del ventrículo izquierdo) SV (Stroke Volume): Volumen Sistólico (LV EDV - LV ESV) El ejercicio que se propone es variar la frecuencia cardíaca (frecuencia ventricular). Antes de modificar el valor anotar el estado inicial de todas las variables. Observar, luego de la modificación, como varían con el tiempo el llenado y el vaciado ventricular, así como las variables asociadas ( Qué pasa con el gasto cardíaco?). Observar también la variación en la forma de la curva, que es un reflejo de esos cambios. Discutir los resultados. Resetear Control Autonómico (Tonos simpático y parasimpático sobre el sistema circulatorio) Recordar que ambos componentes del sistema autónomo ejercen un tono (descarga basal) sobre el sistema circulatorio. El TONO PARASIMPÁTICO se ejerce sobre el corazón, manteniendo la frecuencia cardíaca del estado de reposo, mediante fibras nerviosas que viajan por el nervio vago e inervan los marcapasos. El TONO SIMPATICO consiste en el mantenimiento de un estado basal de contracción de los vasos sanguíneos, que permite tanto una vasoconstricción relativa (por aumento de la actividad simpática) como una vasodilatación (por disminución del tono simpático). Al aumentar el tono simpático en el programa se estimula además la actividad cardíaca en forma directa. Vaya a Exercises- PARASYMPATHETIC TONE Realice los ejercicios a) y b) del programa siguiendo las instrucciones del programa. Registrar el valor de frecuencia cardíaca antes de empezar y en cada paso del ejercicio. A qué se deben los efectos de la atropina? Resetear Vaya a Exercises- SYMPATHETIC TONE 1- Registre los valores normales de las siguientes variables: tono simpático, tono parasimpático, Presión arterial media (Part), gasto cardíaco (Q), frecuencia cardíaca (HR), Resistencia vascular sistémica (SVR). Aumente el tono simpático a 0,5 (debe quedar fijo en este valor, candado abierto) Registre los cambios en todas las variables 2- El tono simpático tiene que estar en 0,5. Verifique eso y luego: Active y administre esmolol (bloqueante de los receptores 1) en una dosis de 150 μg/kg/min. Debido a que el efecto es rápido, debe pausar la simulación. Observe y anote cuáles de las variables se modifican y cuáles no. Interprete los resultados obtenidos. 5

6 3- Desactive la administración de esmolol (stopped). Mantener siempre el tono simpático en 0,5 (no se olvide). Esperar a que los valores se estabilicen. Registre nuevamente los valores de todas las variables, antes de continuar con el siguiente ejercicio. Administre ahora una dosis única (5 mg) de fentolamina (bloqueante de los receptores ). Utilice para esto la herramienta "Drug and Fluid infusor". Administre la droga Phentolamine. Registre nuevamente cuáles son las variables que se modifican y saque sus conclusiones. Nota: si tuvo algún problema durante la realización de estos 3 puntos, vuelva a empezar. Durante la realización nunca resetée. Finalizado el punto 3- resetée el ejercicio. 4- Anote los valores iniciales de las variables, incluidos ahora los tonos simpático y parasimpático Hágale una extracción de sangre al paciente (anímese!!!). Utilice para esto la herramienta "Blood withdrawal". Elija un volumen y una tasa de extracción (por ej ml a 8000 ml/h). Observe con cuidado qué variables cambian, incluyendo el tono simpático y parasimpático. Cuáles son los ajustes que realiza el sistema nervioso ante la pérdida de sangre? Qué parámetros tratan de mantenerse constantes? Cuáles varían? Discuta los resultados Finalizado el punto 4- vuelva a resetear el ejercicio. 5- Haga otra extracción de sangre de la misma forma PERO AHORA con los tonos simpático y parasimpático FIJOS en 0,2 y 0,4, respectivamente. Anote los valores de las distintas variables antes y después de la extracción. Observe (y anote) que sucede con los parámetros, en particular con la Presión Arterial cómo se explica? Finalizado el punto 5- resetée nuevamente 6- Practique ahora una infusión de sangre en el paciente. Anote los valores de las distintas variables antes y después de la infusión. Para esto utilice la herramienta Drug and Fluid infusor. Cliquee en Pharmacy - Fluids, Blood, Electrolytes - Blood products - Whole blood (ajuste las tasas y volúmenes de infusión a valores elevados mediante el cuadrito a la izquierda del botón de arranque). Puede infundir 1000 ml a 8000 ml / hora. Observe con cuidado que variables cambian, incluyendo los tonos simpático y parasimpático. Cuál es el efecto agudo del aumento de la volemia? Qué mecanismos compensatorios se ponen en juego? Discuta los resultados. 6

7 INFORME: - Objetivo del Trabajo Práctico - Resultados. Dentro de cada tópico tratado, indicar lo que se realizó junto con el objetivo del ejercicio. Describir las observaciones y simulaciones en tablas o gráficos, los valores iniciales o normales, la predicción realizada y los valores modificados. NO copiar y pegar TODAS las tablas y figuras obtenidas, SELECCIONAR la información a presentar. - Discusión. Interpretar los resultados u observaciones aplicando los conceptos teóricos y efectuando relaciones entre los parámetros estudiados. Analizar qué variaciones se deben directamente a la manipulación realizada y cuáles son consecuencia indirecta. Indicar si existe una variable que parezca importante mantener constante (cuando corresponda) y cuáles son los cambios compensatorios que realiza el sistema. Contestar las preguntas planteadas en los ejercicios. En todos los casos en los que hayan podido verificar las justificaciones planteadas para los resultados obtenidos, indicar que parámetros buscaron y que resultados obtuvieron. Si copian tablas, seleccionen los datos importantes para las justificaciones planteadas. 7

8 TRABAJO PRACTICO Nº 7 OBJETIVO SIMULACION EN SISTEMAS BIOLOGICOS SISTEMA RESPIRATORIO El objetivo general del TP es que el alumno logre relacionar e integrar los conocimientos y conceptos teóricos mediante la simulación de condiciones fisiológicas, a través de un programa computacional. PROCEDIMIENTO El programa a utilizar es el SimbioSys Physiology Labs (version 3). Este programa es un simulador de sistemas biológicos que, a través de modelos matemáticos, calcula en tiempo real los cambios que se presentarían en las distintas variables fisiológicas al modificar otras variables, administrar fármacos, cambiar las condiciones ambientales, etc. Es fundamental que antes de realizar las variaciones propuestas a lo largo de los ejercicios se realicen predicciones acerca de lo que va a ocurrir con las diferentes variables y luego se contrasten con el resultado obtenido. Abrir el programa y acceder al menú principal. Para el primer ejemplo que se menciona a continuación se explica en detalle el funcionamiento del programa. Por cualquier duda puede consultarse el TUTORIAL, desde este menú. Desde el menú principal (ventana CURRICULUM ) activar sistema respiratorio (The Respiratory System) cliqueando sobre el símbolo (+) de la izquierda. 1. Gases en sangre Contenido de oxígeno en sangre Activar Blood Gas Tranport. Desde aquí podrán consultarse las explicaciones teóricas de todos los temas que aparecen desplegados en este menú y que se encuentran referenciados con el ícono de un libro a la izquierda, al igual que toda explicación teórica en el resto de las rutinas del programa. Utilice este recurso para repasar los conceptos discutidos en clases teóricas. Ir a Exercises Seleccionar Hemoglobin Oxygen Dissociation: curva de disociación de O 2 para la hemoglobina.. Leer la explicación sobre el tema. Debajo del primer gráfico tienen un valor de concentración de hemoglobina que es modificable. Para variarlo, cliquear en el candado de la izquierda para abrirlo. Luego, cliquear sobre el valor de concentración, y nuevamente sobre el cuadrito que aparece en la esquina. Se habilita entonces un deslizador que permite modificar la variable en cuestión: la concentración de hemoglobina en sangre.. Variar los valores de la concentración y observar cómo se ve afectada la curva. Qué ocurre cuando la concentración de Hb es de 0 g/dl? Discutir los resultados obtenidos. 8

9 Curva de Saturación de la hemoglobina. Ubicarse en la segunda curva (Curva de saturación de la hemoglobina: % de O 2 en la Hb o saturación de la Hb con O 2 vs. PO 2 ). a) Variar la concentración de hemoglobina (primer renglón) y observar los cambios en la curva. b) Variar el parámetro Hemoglobina P50 (abrir previamente el candado y cliquear a la derecha), en valores mayores y menores al normal (26 mm Hg). Observar los cambios producidos en la curva. Cliqueando dentro de ella aparece una cruz que permite identificar los pares de valores que definen cada punto de la curva. c) Retornar el valor de P50 al original (26 mm Hg). Para resetear los valores iniciales o para obtener mayor información sobre las variables, posicionarse sobre cada renglón y cliquear el botón derecho del Mouse ( Reset default values ). A continuación, observar los efectos de la variación de la PCO 2 y la temperatura, uno por vez, reseteando antes de realizar las variaciones. Contenido de CO 2 en sangre y en hemoglobina (Curva de contenido de CO 2 total vs. PCO 2 en sangre) Seleccionar CO 2 content.. Varíe la concentración parcial de oxígeno en sangre (PO 2 ) hasta llevarla a cero (sangre completamente desoxigenada) y observar en cada caso las modificaciones sobre la curva. 2. Transporte sistémico de oxígeno: Activar Systemic oxygen transport Ir a Exercises Hipoxia hipóxica. Este tipo de hipoxia se produce por una menor disponibilidad del oxígeno. Seleccionar Hypoxic hypoxia.. Realizar un cuadro con los valores normales (los del programa) y a continuación abrir el candado de gasto cardíaco (para que no se compense el cambio producido; así se logra mantener fija esta variable). El ejercicio consiste en llevar la FIO 2 a 0,10 y registrar los valores de las otras variables. Haga sus predicciones, conociendo cada una de las variables (lea cada una de ellas y relaciónelas, tómese su tiempo). Finalmente, comparar los resultados obtenidos con los valores normales y sus propias predicciones.. Describir e interpretar los cambios en los parámetros en función de las modificaciones realizadas. En qué situaciones normales y patológicas se puede producir este tipo de hipoxia? Referencias de las variables:. CaO 2 : contenido arterial de oxígeno. ERO 2 : tasa de extracción de oxígeno: es el cociente entre el oxígeno consumido por el tejido (VO 2 ) y el entregado desde sangre (QO 2 ). Los valores de estas variables estarán entre 0 y 1.. FIO 2 : fracción de oxígeno en el aire inspirado (es la que modifico en este ejercicio).. Hb: concentración total de hemoglobina en sangre.. QO 2 : oxígeno entregado por la sangre.. SaO 2 : saturación arterial de O 2.. SvO 2 : Saturación venosa de O 2.. VCO 2 : producción de CO 2.. VO 2 : consumo total de O 2 por los tejidos. 9

10 Hipoxia isquémica. Se origina por la disminución acentuada o ausencia total de flujo sanguíneo, ya sea a una región del cuerpo o en forma generalizada. Seleccionar Stagnant hipoxia. Realizar un cuadro con los valores normales (los del programa) y sus predicciones (considerando si cada variable subirá, bajará o se mantendrá constante); a continuación, para llegar a las condiciones de la hipoxia isquémica, disminuir aproximadamente un 50% el gasto cardíaco (respecto del valor normal). Registrar los valores alcanzados por las variables estudiadas. Completar el cuadro y discutir los resultados obtenidos. Hipoxia anémica. La anemia se produce cuando disminuye la capacidad de transporte de oxígeno por la sangre, ya sea por una menor concentración de hemoglobina o por una deficiencia en la proteína transportadora. Seleccionar Anemic hipoxia. Hacer un cuadro con los valores normales (los del programa) y los que usted predice. El ejercicio consiste en disminuir la concentración de hemoglobina en sangre. Abrir el candado de gasto cardíaco (queda fijo). Para simular esta hipoxia, se realiza una extracción de sangre al paciente, proveyéndole simultáneamente un mismo volumen de plasma (para evitar cambios en la volemia). Para realizar la extracción de sangre ir a Tools, colocarse en Blood Withdrawal y seleccionar 2000 ml de volumen (a extraer) a una tasa de 8000 ml / hora. Para reemplazar la sangre extraída, en Tools vamos a Drug and Fluid Infusor, cliquear el botón + y seleccionar Pharmacy e ir a Fluids, Blood. De allí pasar a Blood Products y seleccionar FFP, colocando una dosis de 2000 ml a una tasa de 8000 ml / hora (esto permite que tengamos el mismo volumen de fluido pero con una menor concentración de hemoglobina). Finalmente, apretar al mismo tiempo el botón rojo (que pasa a verde) de FFP y la barra withdraw blood en Blood Withdrawal. Observar los valores obtenidos y discutir los resultados. 3. Intercambio de gases en los pulmones. Ventilación pulmonar y CO 2 Activar Lung Gas Exchange Ir a Exercises Seleccionar CO 2 and Ventilation. Leer la explicación. Hacer un cuadro con los valores normales de todas las variables (el valor normal de ventilación es de 5 L/min). Llevar el valor de ventilación hasta 18 L/min (hiperventilación). Esperar que el sistema se estabilice, observar y anotar en la tabla los valores alcanzados de P a CO 2 (presión arterial de CO 2 ), de ph arterial y de presión arterial media. Partiendo de estos valores en hiperventilación, ir reduciendo la ventilación en 1 L/min hasta alcanzar los 2 L/min (hipoventilación); observar cómo se va formando el gráfico de CO 2 vs Ventilación, punto a punto. Completar la tabla con todos los datos. Al finalizar el ejercicio se puede observar la curva de P a CO 2 vs Ve (Ve: ventilación por minuto). Al igual que para los otros ejercicios, posicionarse sobre cada renglón y cliquear el botón derecho del mouse para resetear los valores iniciales u obtener mayor información. Reinicie el ejercicio si fuera necesario, cliqueando en Reset Simulation al final de la pantalla 1 0

11 4. Estática respiratoria Tensión superficial. Repasar el concepto de tensión superficial y los mecanismos que la generan.. Revisar el concepto de complacencia (valoración de la presión necesaria para lograr el llenado del pulmón). Activar Respiratory Statics. Ir a Exercises Seleccionar Water Surface Tension.. En el primer ejercicio se debe llevar a cero (0) la tensión superficial de la película de agua.. En el segundo ejercicio se debe poner en cero (0) la cantidad de surfactante (o sea, maximizar la tensión superficial de la película de agua). Analizar el gráfico en cada uno de los ejercicios. Observar las variaciones en el parámetro relacionado, la complacencia. A continuación deben completar de manera esquemática y resumida cada uno de los resultados que fueron obteniendo en los diferentes ejercicios. Discusión de los resultados Interpretar los resultados u observaciones aplicando los conceptos teóricos y efectuando relaciones entre los parámetros estudiados. Analizar qué variaciones se deben directamente a la manipulación realizada y cuáles son consecuencia indirecta. Indicar si existe una variable que parezca importante mantener constante (cuando corresponda) y cuáles son los cambios compensatorios que realiza el sistema. Contestar las preguntas planteadas en los ejercicios. En todos los casos en los que hayan podido verificar las justificaciones planteadas para los resultados obtenidos, indicar que parámetros buscaron y que resultados obtuvieron. 1 1

12 INFORME TP Nº7: SIMULACION EN SISTEMAS BIOLOGICOS: SISTEMA RESPIRATORIO Integrantes: 1. Gases en sangre A-Contenido de oxígeno en sangre Discuta los resultados obtenidos 21 g/dl 13.6 g/dl 6 g/dl 0.6 g/dl B-Curva de Saturación de la hemoglobina A qué se debe la forma sigmoidea de la curva? Se modifica la curva al variar la concentración de Hb? Por qué? Esquematice los cambios en la curva al cambiar la PCO 2 Qué relación tiene este cambio con el efecto Bohr? Qué factores contribuyen a una disminución en la afinidad de la Hb por el oxígeno? ( P 50 )? En qué situaciones puede ser importante este efecto? 1 2

13 C-Curva de contenido de CO 2 total vs. PCO 2 A qué atribuye las diferencias de esta curva respecto a la de Contenido de O 2 en sangre? Esquematice los cambios en la curva al variar la presión de O 2 A qué se deben? Qué relación tiene este cambio con el efecto Haldane)? 100 mm Hg O 2 0 mm Hg O 2 2- Transporte sistémico de O 2 : Hipoxias Esquematice con flechas o con el signo = las predicciones y las variaciones observadas en los diferentes parámetros. Justifique brevemente. Variables Normal Pred Hipóxica Pred Isquémica Pred Anémica CaO 2 Gasto Cardíaco ERO 2 FIO 2 Hemoglobina QO 2 SaO 2 SvO 2 VCO 2 (normaliz) VO 2 (total)

14 Qué conclusión puede extraer respecto a la relación entre el O 2 entregado vs. el O 2 consumido (ERO 2 )? 3- Intercambio de gases en los pulmones: Ventilación pulmonar y CO 2 Qué ocurre con el ph y la PaCO 2 al variar la ventilación (considerar tanto hiperventilación cómo hipoventilación)? A qué lo atribuye? A qué puede deberse el cambio en la presión arterial? 4- Estática respiratoria: Tensión superficial Esquematice los cambios provocados en la curva al variar la tensión superficial y la concentración de surfactante Discuta los resultados obtenidos

15 TRABAJO PRACTICO Nº 8 Sistema Respiratorio (Frecuencia Ventilatoria en Peces) Objetivo general: Determinar el efecto de variables fisiológicas tales como O 2, ph y temperatura ambiente sobre la frecuencia ventilatoria en un pez de agua dulce. Objetivos particulares: 1) Analizar los cambios en la frecuencia ventilatoria ante modificaciones en el contenido de oxígeno disuelto en el agua. 2) Evaluar el efecto del ph y la temperatura del agua sobre la ventilación. Materiales y Métodos - Frascos de vidrio - Agua caliente en termos y agua fría (hielo) - Termómetros - Quelantes de oxígeno (bisulfito de sodio) - Medidores de ph (en tiras de papel y en gotas) - NaOH y HCl para modificar el ph del agua Variable a medir: Frecuencia ventilatoria. Se deberá observar detenidamente el opérculo derecho de cada animal y estimar el número de aperturas del opérculo por unidad de tiempo (min). Contar los batidos del opérculo durante 30 segundos, repitiendo la operación dos veces. Tomar un promedio de las tres mediciones y relativizar a un (1) minuto y al peso del animal. Diseño experimental: Los animales, previamente mantenidos en condiciones controladas de temperatura (25 C) y fotoperíodo (14Luz:10Osc), serán expuestos a los siguientes tratamientos: - Animales en condiciones controladas (normales) de temperatura ambiente, O 2 y ph. - Animales expuestos a una temperatura 5 grados menor a la normal, agregando hielo. - Animales expuestos a una temperatura 5 grados mayor a la normal, agregando agua caliente. - Animales expuestos a un ph 0,5 unidades menor al normal, agregando unas gotas de HCl (ácido clorhídrico) con pipeta pasteur. - Animales expuestos a un ph 0,5 unidades mayor al normal, agregando unas gotas de NaOH (hidróxido de sodio) con pipeta pasteur. - Animales expuestos a bajo O 2, para lo cual se agregará al agua bisulfito de sodio en polvo para disminuir el contenido de O 2 en 1 mg/l (ppm) respecto del nivel normal. Cada grupo de alumnos recibirá tres frascos control, numerados, conteniendo un pez en cada uno. Lo primero que deben hacer es pesar cada animal y anotar el peso en el frasco. Además, contarán con otros dos frascos con agua sin animal, que serán utilizados como frascos tratamiento, ya que en ellos deberán modificar alguna variable en particular (TºC, ph, O 2 ). Cada grupo deberá medir inicialmente la frecuencia ventilatoria en los tres peces en condiciones control (recordar que la frecuencia se mide

16 durante 30 segundos (por triplicado) y luego se relativiza a un minuto y al peso del animal). A continuación, tomarán los otros dos frascos y modificarán la variable asociada, por ejemplo temperatura. Tendrán entonces un frasco donde disminuirán la temperatura agregando hielo y otro frasco donde subirán la temperatura agregando agua caliente. Una vez alcanzada la temperatura adecuada en cada frasco, agregar un pez en el frasco a temperatura baja, esperar 5 minutos y luego medir la tasa ventilatoria. Culminado esto, pasar ese pez al frasco control y dejarlo 5 minutos en recuperación, y agregar al frasco de temperatura baja el segundo pez, esperando siempre 5 minutos para que se aclimate y luego medir. Al mismo tiempo podrán colocar el primer pez en el frasco de temperatura elevada y hacer la medición correspondiente. Proceder de igual manera hasta medir los tres peces en las tres condiciones de temperatura (control, baja y alta). Finalizado esto, el grupo dejará sus tres peces en los frascos control (por favor no equivocarse de frasco) y pasará a otra estación experimental donde lo estará esperando otro set de tres peces para que registren la ventilación ante cambios del ph, por ejemplo. Proceder de igual manera que en el paso anterior. De esta forma, cada grupo deberá completar las tres estaciones experimentales que estarán distribuidas en el laboratorio de Trabajos Prácticos (cada estación corresponde a una variable en estudio). Es importante que antes de medir la frecuencia ventilatoria, en función del cambio que estén realizando en la variable, puedan predecir qué es lo que esperarían que ocurra con la ventilación. En una computadora tendremos las planillas para cargar los datos que vayan obteniendo. INFORME - Objetivos del Trabajo Práctico - Resultados. Presentar una tabla del grupo y la tabla general del turno. Además, graficar frecuencia ventilatoria para cada variable analizada, mediante gráficos de barras o de líneas. - Discusión. Interpretar los resultados u observaciones aplicando los conceptos teóricos y efectuando relaciones entre los parámetros estudiados. Sacar conclusiones, teniendo en cuenta también lo estudiado en el práctico de Simulación de Sistemas Biológicos. Sistema Respiratorio.

17 TRABAJO PRACTICO Nº 9 METABOLISMO ENERGETICO Objetivo general: entrenar a los alumnos en el uso de metodologías relacionadas con la estimación de la tasa metabólica en función de variables relevantes como la temperatura ambiente y la disponibilidad de agua, en poiquilotermos. Objetivo particular: Determinar los niveles circulantes de glucosa en hemolinfa de cangrejos, como medida indirecta de los cambios en el metabolismo de estos animales, expuestos previamente a diferentes temperaturas ambientales (estrés térmico) o expuestos al medio aéreo (estrés por emersión). Materiales y Métodos Especie a utilizar: Machos adultos de Neohelice granulata Variable a medir: Glucosa. A partir de muestras de hemolinfa extraídas de cangrejos expuestos a diferentes condiciones de estrés, se medirá el contenido de glucosa utilizando un kit comercial (Kit enzimático para detección de glucosa, Laboratorios Wiener S.A.). Con aguja 27G y jeringa de tuberculina (1 ml) se extraerán 100 ul de hemolinfa de la cuarta o quinta pata de cada cangrejo. La muestra de hemolinfa será colectada en un tubo eppendorf de 500 ul y mantenida en frío para evitar su coagulación. Una vez obtenidas todas las muestras, se determinará el contenido de glucosa, siguiendo este procedimiento: 1) Rotular por duplicado los tubos Khan ubicados en la correspondiente gradilla. 2) Colocar 2 ml del reactivo de trabajo en todos los tubos Khan (utilizar micropipeta P1000) 3) Agregar 10 ul de cada muestra, por duplicado, en el tubo correspondiente (utilizar micropipeta P20) 4) Vortexear y colocar 10 minutos en baño termostático a 37ºC. 5) Medir las muestras en espectrofotómetro a 505 nm (Nota: la curva estándar de glucosa será preparada por los docentes)

18 Diseño experimental: a) Estrés Térmico: los animales serán expuestos a dos temperaturas experimentales, 10ºC y 25ºC (temperatura ambiente). Se colocarán en peceras de vidrio con agua salina (12 g/l), bajo las condiciones experimentales, durante la semana previa al trabajo práctico. El tratamiento 10ºC será colocado en una incubadora que permite regular la temperatura ambiente y el fotoperíodo (14Luz:10Osc). El tratamiento 25ºC será mantenido fuera de la incubadora, en condiciones naturales de temperatura y en el mismo fotoperíodo. Cada grupo de alumnos deberá extraer hemolinfa de tres cangrejos de cada tratamiento. b) Estrés por Emersión: los animales serán colocados en peceras a temperatura ambiente y fotoperíodo de 14Luz:10Osc, completamente cubiertos de agua salina (12 g/l). Un grupo de animales se mantendrá siempre sumergido (Tratamiento Sumersión) y se realizarán sucesivas extracciones de hemolinfa a diferentes tiempos (T 0, T 5, T 10, T 20, T 30 ). Otro grupo de animales será expuesto durante 30 minutos al aire (Tratamiento Emersión), extrayendo hemolinfa sucesivamente a los mismos tiempos indicados previamente. El T 0 para ambos grupos experimentales (Sumersión y Emersión) es el control de sumersión (nivel de glucosa sin estrés por emersión). Cada grupo de alumnos deberá extraer hemolinfa de tres cangrejos de cada tratamiento. Glucemia (mg/100ml) ET 10ºC ET 25ºC ES EE Cangrejo 1 Cangrejo 2 Cangrejo 3 Tabla de toma de datos para cada grupo de alumnos: Nivel de glucemia (mg/100ml) en cangrejos expuestos a cada tipo de estrés (térmico y emersión). ET 10ºC: tratamiento estrés térmico a 10ºC; ET 25ºC: tratamiento temperatura ambiente (control); ES: tratamiento sumersión contínua (control); EE: tratamiento estrés por emersión. INFORME Objetivo Breve descripción de la metodología utilizada Resultados obtenidos. Mostrar tablas y/o gráficos Analizar el efecto de la temperatura ambiente y de la emersión sobre los niveles circulantes de glucosa en poiquilotermos. Relacionar los resultados con el control endocrino de la glucemia en invertebrados.

19 TRABAJO PRACTICO Nº 10 Introducción: SISTEMAS A CONTRACORRIENTE El flujo a contracorriente es un mecanismo utilizado para transferir alguna propiedad de un fluido en movimiento a otro que se mueve en dirección contraria, separados por una membrana semipermeable o un material termoconductor. Este mecanismo es muy eficiente para el intercambio de solutos o calor entre dos fluidos y fue seleccionado a lo largo de la evolución en numerosos sistemas biológicos. Ejemplos de flujo a contracorriente encontramos en el sistema excretor de los mamíferos, en el sistema respiratorio de los peces o en las extremidades de las aves. Durante este trabajo práctico evaluaremos la eficiencia de un flujo a contracorriente para el intercambio de calor con un sistema experimental artificial simple y lo compararemos con el flujo en paralelo. Diseño experimental Utilizaremos el siguiente aparato para simular flujos paralelos y contracorriente: 350m Intercambiador de calor hecho con dos caños de cobre soldados con estaño y recubierto con material aislante. Flujo Paralelo a) Colocar en cada uno de los recipientes 2 litros de agua a: 50C (agua caliente en termo) y a 0C (agua de la canilla con hielo). Conectar las mangueras al intercambiador de modo que el agua circule de forma paralela. b) Con una jeringa hacer vacío desde el extremo opuesto al recipiente que contiene el agua, para que empiece a circular hacia el recipiente colector (envase de telgopor de ½ litro). Dejar correr unos 200 mililitros (ml) de agua para estabilizar el sistema, regulando el caudal con los reguladores (canillas negras de plástico) hasta alcanzar aproximadamente los 50 ml/min. c) Una vez alcanzado el caudal deseado en ambas mangueras, iniciar la primera medición colectando el agua a la salida de cada tubo, de manera simultánea, en envases de telgopor vacíos de ½ litro de capacidad durante 2 minutos (use un cronómetro), registrando la temperatura con un termómetro que se debe mantener dentro del envase desde el inicio de la

20 recolección de agua. Transcurridos los 2 minutos, retirar la manguera, colocarla en otro recipiente de telgopor de 1 litro de capacidad y medir en una probeta el volumen de agua colectado de cada salida. d) Repetir esta medición 4 veces más, anotando los resultados en la Tabla I. Es sumamente importante verificar que la temperatura de cada recipiente superior se mantenga constante en los valores iniciales (50ºC y 0ºC), así como el caudal (50 ml/min). Cambio de caudal: e) Una vez obtenidas las 5 mediciones con el caudal 50 ml/min, realizar otras 5 mediciones pero incrementando el caudal al doble (100 ml/min). Para ello, variar la apertura de los reguladores de flujo (canillas negras). Flujo Contracorriente: f) Realizar la misma operación, pero ahora con el flujo a contracorriente. Conectar las mangueras según corresponda, dejar correr 200 ml de agua para estabilizar el sistema, bajar el caudal a 50 ml/min y realizar 5 mediciones (anotar los datos en la Tabla I). g) Finalizadas estas mediciones, cambiar el caudal a 100 ml/min y realizar otras 5 mediciones con este nuevo caudal. Diagrama de Flujo Paralelo Diagrama de Flujo a Contracorriente Recomendaciones: 1. Cuando sea necesario cortar la medición, hágalo descargando el contenido de las mangueras de circuito desde la parte superior. 2. Calibrar la salida del agua con los reguladores (canillas negras) en cada nueva medición. 3. Controlar la temperatura de los termómetros en los recipientes colectores, que deben estar en 0 C al inicio de cada medición. 4. Al cambiar de un flujo al otro, controle la posición de las mangueras de salida.

21 Una vez realizadas todas las mediciones, calcular la cantidad de calor (Q) que se intercambió en cada tipo de flujo (paralelo y contracorriente) y para cada caudal (50 y 100 ml/min). Recuerde que: Q = m * Ce * T donde Q es el calor medido en calorías, m es la masa de la solución (masa de soluto + masa de solvente) expresada en gramos (1 ml = 1 gramo), Ce(H 2 O) es el calor específico del agua que equivale a 1 caloría/g * ºC y T es la diferencia entre la temperatura final y la temperatura inicial. Complete las siguientes tablas con sus datos experimentales: Medición: Tabla I PARALELO Frio PARALELO Caliente CONTRA CTE Frío CONTRA CTE Caliente T inicial T final T inicial T final T inicial T final T inicial T final T T T T Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo Volumen Volumen Volumen Volumen Caudal Caudal Caudal Caudal Q Q Q Q (Recordatorio: para cada tipo de flujo (paralelo y contracorriente) deberán tener un total de 5 mediciones con un caudal de 50 ml/min y 5 mediciones con un caudal de 100 ml/min) INFORME: Se deberá entregar vía mail un informe grupal que contenga los objetivos, los resultados del trabajo práctico indicando todos los datos obtenidos en las mediciones y los cálculos de intercambio de calor. Hacer referencia a la eficiencia de cada uno de los diseños (en paralelo y en contracorriente).