Expresión de la proteína Ezrina en líneas celulares tumorales cervicales.

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1 3 er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de septiembre 2016 Memorias Expresión de la proteína Ezrina en líneas celulares tumorales cervicales. Maribella Domínguez de la Paz (Becaria) Unidad Académica Preparatoria No.41 Azoyu, Gro, Universidad Autónoma de Guerrero. Marco Antonio Leyva Vázquez (Asesor) Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Introducción El cáncer. Cada una de las células de nuestro cuerpo tienen ciertas funciones, las células normales se dividen de manera ordenada, éstas mueren cuando se van desgastando o se dañan, y nuevas toman su lugar. El cáncer se origina cuando las células comienzan a crecer descontroladamente, las células cancerosas siguen creciendo y formando nuevas células que desplazan a las células normales, esto causa problemas en el área del cuerpo en la que comenzó el cáncer.(gandur, 2010) Las células cancerosas también se pueden propagar a otras partes del cuerpo, por medio del torrente sanguíneo, a este proceso se le denomina metástasis. Los tratamientos más comunes para el cáncer incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia. El tratamiento será el que sea más adecuado para el paciente.(leo, 2016) El cáncer es un término usado para referirse a un grupo de más de 100 enfermedades. Entre ellos se encuentra el cáncer cervical. Cáncer cervical. Una de las principales causas que se han referido a la generación del cáncer cervical es la infección por el virus del papiloma humano (VPH). Existen muchos tipos diferentes de VPH 655

2 y algunos llevan a cáncer cervical. Otros tipos pueden causar verrugas genitales. Existen dos tipos de células en la superficie del cuello uterino: escamosas y columnares, regularmente el cáncer cervical se desarrolla en la superficie del cuello uterino en las células escamosas.(diane Shannon, 2007). El desarrollo del cáncer cervical generalmente es muy lento y comienza como una afección precancerosa llamada displasia. Esta afección se puede detectar por medio de una citología vaginal.(leo, 2014) Ezrina. Dentro de las células se encuentra la proteína Ezrina, una proteína de unión al citoesqueleto; ésta se encarga de la adhesión, migración y organización de las células a las estructuras de la superficie.las moléculas de adhesión se encuentran en la superficie de toda la célula y desempeñan un papel muy importante en las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, contribuyendo de esta manera al intercambio de información entre el ambiente extracelular y el citoesqueleto; favorecen la organización del citoesqueleto y participan es la transducción de señales, regulando diversos procesos celulares, como el crecimiento, la proliferación, organización espacial y migración.(leyva-garcia, 2012) Ezrina y cáncer. Ezrina desempeña un papel muy importante en el desarrollo del cáncer. El nivel de expresión de Ezrina se asocia con la progresión y diseminación del tumor.(kong, 2013) Para determinar el nivel de expresión de dicha proteína es necesario hacer varios métodos. Los que usamos para ver dicho resultado fueron inmunofluoresencia y western blot. Migración celular. La migración celular ocurre en procesos biológicos fundamentales como el desarrollo embrionario, la extensión de las proyecciones del sistema nervioso, la defensa del organismo ante los agentes infecciosos, la reparación de heridas y la generación de los vasos sanguíneos durante el desarrollo y en el organismo adulto. Implica cambios en la forma celular, regido por los eventos de la transducción de señales que provocan cambios en el citoesqueleto, conduciendo al movimiento, individual o en grupo.(prado, 2006) La migración celular es un proceso fundamental tanto en el desarrollo embrionario como a lo largo de la vida de un organismo. El organismo adulto, tienen gran importancia en los procesos como la reparación de los tejidos. Las células que migran de forma individual son 656

3 células que tienen lugar a cambios de bipolaridad y adhesión celular y se convierten en células con capacidad de migrar.(espartero, 2015) Planteamiento El Aumento de la expresión de ezrina influye en el desarrollo del cáncer? Objetivos Objetivo General Evaluar el nivel de expresión de la proteína Ezrina en líneas celulares tumorales cervicales para determinar su relación con el cáncer cervical. Objetivos específicos Visualizar y analizar a la proteína Ezrina por medio de métodos específicos haciendo uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente. Metodología Inmunofluorescencia Se basa en el uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para mostrar la presencia de una determinada molécula.(franco Cordoza, 2005) Las líneas celulares analizadas fueron HaCat, C33A, SiHa y HeLa, fueron cultivadas en placas multipocillo en medio de cultivo celular en laminillas. Preparación de los anticuerpos. Se preparó el anticuerpo primario y secundario. Para elaborar el anticuerpo primario se agregó a un tubito un micro litro de Ezrina y dos micro litros de E- Cadherina se finalizó agregando 97 micro litros PBS+BSA teniendo un total de 100 micro litros. Anticuerpo secundario: se agregó en un tubito dos micro litros de Anti-Mouse y un micro litro de Anti-Rabbit para finalizar se agregó 97 micro litros de PBS+BSA asiendo un total de 100 micro litros. Retirar el cubre objetos y colocarlo en una porta objetos limpio. Se tomaron muestras del cultivo celular y se pusieron sobre el porta objetos. Se colocó el portaobjetos en una cámara húmeda para que no se resecaran las muestras. 657

4 Permeabilizar las muestras con PBS-Tritón 0.2%. Lavar con PBS durante 5 minutos. Se les coloco a las muestras 20 micro litros de PBS-Tritón y se dejaron por 5 minutos. Se colocaron en la cámara húmeda y se taparon con papel aluminio para que no le entrara luz. Se lavó con PBS tres veces por cinco minutos. Bloqueo de uniones inespecíficas con PBS+BSA durante 30 minutos. Se agregaron 20 micro litros de PBS+BSA, se dejó reposar por 30 minutos y se retira el exceso. Agregar 20 micro litros de anticuerpo primario a cada una de las muestras y las dejamos reposar una hora. Se agregaron 20 micro litros de anticuerpo primario y se dejó por una hora en una cámara húmeda. Se lavó con PBS tres veces de cinco minutos cada uno. Agregar 20 micro litros de anticuerpo secundario y dejarlas por dos horas en la oscuridad. Se agregaron 20 micro litros anticuerpo secundario y lo dejamos dos horas en un cuarto oscuro. Lavar con PBS tres veces de cinco minutos. Agregar una gota de DAPI (es un marcador fluorescente que nos permite ver el núcleo de la célula) en un portaobjetos nuevo y colocar el cubreobjetos de manera invertida. Tomar un portaobjetos nuevo y pusimos una gota de DAPI. Colocar el cubre objeto de manera invertida. Dejar en reposo toda la noche en oscuridad. Observación microscópica. Western Blot Es una técnica analítica utiliza para el estudio de proteínas, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica, se utiliza un anticuerpo que reconoce a la proteína de interés. La técnica puede estimar el tamaño de una proteína y es utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteínas en las muestras.(corporation, 2011) 658

5 Cuantificación de proteínas. Cuantificar las proteínas para saber la cantidad que tenemos. Preparación de muestras y geles. Se prepararon las muestras y se tiñeron para ver cómo se recorren hacia abajo. Preparar un gel de acrilamida al 8%. Electroforesis Poner las muestras en los pocillos del gel. En el primer pocillo añadimos colorante. En los siguientes agregamos las proteínas. (utilizamos una pipeta para cargar las muestras en los pocillos). Se colocó el gen dentro de una caja para electroforesis al que se le coloco buffer de muestra que les da a las proteínas una carga negativa que le permite bajar. Se puso la caja a una carga de 80 volts. Transferencia Humedecer las almohadillas de esponja y el papel filtro. En un casete poner una esponja, un papel filtro, el gel y sobre el gel la membrana humedecida en metanol y tapar con el papel filtro y por último colocar la esponja. Colocar el casete en la caja para realizar la transferencia. Se aplica un voltaje de 60 volts para que las proteínas migren a la membrana. Tinción Teñir la membrana para ver las proteínas transferidas. Durante 15 minutos. Bloqueo Para el bloqueo se utilizó PBS + Leche al 5%, para que bloqueara a las proteínas y solo permita que veamos las proteínas que nosotros necesitamos ver. Se dejó durante una hora. Incubación del anticuerpo primario Se agregó el anticuerpo primario. Anti-Ezrina, 20 micro litros. Dejar reposar toda la noche a 4 centígrados. Recuperar el anticuerpo y lavar 10 veces de 10 minutos cada uno. Incubación del anticuerpo secundario Se agregó el anticuerpo secundario. Anti- Mouse, 20 micro litros. 659

6 Dejar durante dos horas. Recuperar el anticuerpo y lavar 10 veces de 10 minutos cada uno. Rebelado Localizar las bandas en la membrana Se puso la membrana en una bolsita de plástico y se le agrego luminol. Se colocó en el C-Digit. Resultados Western Blot. 2.5 Expresión de Ezrina total Nivel de expresión HaCat C33A HeLa Líneas celulares SiHa 660

7 Inmunofluorescenci Conclusiones La expresión de Ezrina está presente en las cuatro líneas celulares sin embargo tiene mayor expresión en la línea celular SiHa y HeLa a comparación de la línea celular negativa a VPH que es C33A Y HaCat que es una línea celular no tumoral. Referencias bibliográficas Bibliografía Corporation, A., ANALISIS DE PROTEINAS. [En línea]available at: Diane Shannon, M. M. B. M., ASSOCIATION OF REPRODUCTIVE HEALTH PROFESSIONALS. [En línea] Available at: 661

8 Franco Cordoza, Y., FITOSANIDAD. [En línea]available at: Gandur, D. N., Instituto Nacional del Cancerr. [En línea] Available at: pdf Kong, J., BIO MED CENTRAL. [En línea] Available at: Leo, G. R., AMERICAN CANCER SOCIETY. [En línea] Available at: Leyva-Garcia, N., REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS FARMACEUTICAS. [En línea] Available at: Prado, J. V.-., MECANISMOS MOLECULARES DE LA MIGRACION DE CELULAS.. [En línea] Available at: file:///e:/biologia%20celular%20y%20molecular%20- %20Gerarld%20Karp/Mensaje_Bioq06v30p77_104_Jose_Vazquez.pdf 662