PUNCIÓN FOLICULAR GUIADA POR MEDIO DE ULTRASONOGRAFIA:

Transcripción

1 Las técnicas de recolección y transferencia embrionaria en los caballos se desarrollaron en los últimos años de Últimamente, la tecnología de reproducción asistida, que ya se aplica con éxito en el ganado, también ha progresado considerablemente en la especie equina. Los grandes avances en el área, como son la fertilización in vitro, la clonación y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides tienen en común la necesidad de utilizar ovocitos de alta calidad o capacidad de desarrollo, factor que es clave para lograr una alta eficiencia de estas tecnologías. Entre un 50 y 70% de los ovocitos obtenidos son aptos para la fertilización in vitro, alrededor del 90% de estos son fertilizados y entre el 20 y 40% alcanzan el estadio de blastocisto. Por lo tanto, mantener una fuente constante de ovocitos de alta capacidad de desarrollo, alto valor genético y máxima calidad sanitaria es uno de los puntos claves para garantizar un sistema comercial de producción in vitro de embriones. El 95% de los embriones transferidos a nivel mundial son producto de superovulación; sin embargo, el número de embriones producidos por tratamiento superovulatorio es altamente variable dependiendo de la raza de la donante, de los tratamientos superovulatorios previos, de la hormona superovulatoria a utilizar y del día del ciclo en que se inicie el tratamiento, entre otros. La obtención de ovocitos de una hembra viva mediante la aspiración folicular transvaginal representa la alternativa más viable para lograr satisfacer las necesidades de ovocitos de un sistema de producción de embriones. Esto es probablemente debido a que combina lo mejor de diversas tecnologías como la superovulación, la ultrasonografía y la producción in vitro de embriones. Además, la aspiración folicular transvaginal es una técnica confiable, poco invasiva y con gran repetibilidad.

2 SUPEROVULACIÓN: La técnica de superovulación en la yegua, consiste en causar la ovulación de un mayor número de folículos de lo normal. Económicamente, sería muy interesante aumentar la tasa de ovulación de las yeguas donantes, en un intento de aumentar la tasa de recogida de embriones por lavado uterino. Sin embargo, esta técnica tiene varias limitaciones en las yeguas, siendo pocas las que responden, siendo el tratamiento muy caro y sobre todo, porque se disminuye la viabilidad de los embriones obtenidos. En el bovino, ovino y otros, el tratamiento con la ecg (PMSG) o gonadotropina sérica de yegua gestante, o el tratamiento con hormona folículo-estimulante (FSH) siempre induce la ovulación múltiple de las hembras. Sin embargo, la especie equina es muy resistente al tratamiento con ecg. A continuación se describen los principales tratamientos de superovulación que se han ensayado en yeguas. Hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Esta hormona se ha descrito como capaz de inducir la ovulación en las yeguas anestro, fuera de la temporada de reproducción. Sin embargo, cuando las yeguas están cíclicas, esta hormona no tiene ninguna eficacia en el la inducción de la ovulación múltiple El extracto de pituitaria equina (EPE) La EPE proviene de hipófisis de matadero. Se trata de un extracto crudo que contiene de 6% a 10% de LH y de 2% a 4% de FSH. La respuesta de las yeguas cíclicas depende de su población folicular al comienzo del tratamiento. Idealmente, la administración de la EPE o FSH equina (se detalla a continuación) se inicia al principio de una onda folicular, antes de que aparezcan folículos dominantes. Así, si el tratamiento se inicia el día 5 del ciclo, la respuesta será mejor que si comienza a los 12 días después de la ovulación. Esta respuesta se puede mejorar mediante monitorización ecográfica de los ovarios, con el fin de identificar las yeguas que tengan en un momento dado todos sus folículos con un diámetro inferior a 25 mm. También se pueden administrar soluciones oleosas de progesterona y estradiol que disminuyan el desarrollo folicular antes del inicio del tratamiento con EPE. Es posible mejorar la respuesta al tratamiento cuando se administra 2 veces al día en lugar de una. La mejor opción sería la administración de 25 mg dos veces al día de la EPE. La eficacia en las yeguas en anestro profundo es bastante baja (en torno a un 20%) mientras que en las yeguas en el período de transición, se obtiene casi un 90% de efectividad con un tratamiento de 12 días. Al parecer, los folículos de yeguas en anestro profundo no disponen de suficientes receptores de FSH para responder al EPE. Por otro lado, la cantidad de FSH y LH equina inyectada no siempre se sabe y la EPE no está disponible comercialmente. 2

3 Sin embargo se ha llegado a comercializar una FSH equina (e FSH) purificada a partir de estos extractos. Esta efsh produce un aumento de las tasas de ovulación y la recogida de de embriones de yeguas donantes. FSH equina (efsh) Los estudios iniciales sobre el uso de FSH utilizaron la FSH porcina (FSHP) obteniéndose tasas de ovulación de un promedio de 1,7 ± 0,6 ovocitos frente a 1,0 en el grupo de control. Recientemente, ha aparecido en el mercado una FSH equina comercial. En los últimos años, se ha incrementado el uso de esta hormona en los programas de TE. Sin embargo, una vez más, su efecto no es siempre coherente y predecible. En algunos casos, las yeguas tratadas pueden ovular un solo folículo, mientras que en otros la respuesta folicular y la tasa de ovulación puede ser mayor que las deseadas. En la actualidad, el protocolo recomendado en yeguas es la administración de 12,5 mg efsh, intramuscular, 2 veces al día, a partir del 5 a 7 días después de la ovulación, sin ninguna verificación de la tamaño de los folículos, y la administración de prostaglandinas el segundo día de la terapia con efsh para producir la luteolisis Por último, un agente la inducción de la ovulación se administra cuando el desarrollo de folículos es de un diámetro menos de 35 mm, y se suspende el tratamiento con e FSH ese mismo día. Hace poco se hizo una modificación de este protocolo, incorporando un periodo de descanso al final del tratamiento con efsh. Se trataría de un intervalo de tiempo entre el final de la terapia con efsh y la inducción de la ovulación, durante la cual no se administra ninguna gonadotropina. Este período se ha incorporado con la intención de reducir la cantidad de efsh utilizada y para prevenir la sobrestimulación de los ovarios. PUNCIÓN FOLICULAR GUIADA POR MEDIO DE ULTRASONOGRAFIA: Mejor conocida por sus siglas, OPU (Ovum Pick-up), la aspiración folicular transvaginal es una técnica mediante la cual los ovocitos inmaduros son recolectados de los folículos en los ovarios de una yegua viva por aspiración guiada mediante ultrasonografía a través de la pared vaginal. Es un método que se puede repetir cada días y no interfiere con la actividad normal del donante incluso si es un sujeto en el entrenamiento deportivo. Se puede realizar en cualquier época del año, incluso fuera de la temporada de cría. El Ovum Pick Up, está dirigido a: - Yeguas con problemas reproductivos (enfermedades de los ovarios, trompas y útero) también vinculadas a la vejez. - Yeguas con antecedentes de abortos involuntarios recurrentes. 3

4 - Yeguas en deportes que no quieren impregnar. - Yeguas desde las que desea mas potros o mas embriones. - Sementales con subfertilidad. Para llevar a cabo esta técnica de aspiración folicular in vivo se requiere contar con un equipo de ultrasonografía, un transductor sectorial, una bomba de aspiración y un sistema de guía de la aguja. La sonda ultrasonográfica para OPU ha sido construida con la finalidad de que permita la manipulación de la aguja desde el exterior del animal y que el transductor esté en contacto con los ovarios; de ese modo, el extremo de la aguja pueda ser visualizado cuando penetra dentro de los folículos que serán aspirados. La aguja está conectada a la bomba de vacío por medio de una tubería plástica o de silicona, lo que permite que el contenido folicular sea vaciado directamente al filtro, que es similar al utilizado para la recolección de embriones. Técnica: Durante el aspirado folicular transvaginal, es reflejado mediante ultrasonido. Se requiere una maquina ultrasonido, una sonda y un fiador. Se pueden usar una sonda lineal o curvilínea para la recolección de oocitos. Cuando utilizamos la lineal tenemos que colocar la cara de la sonda dorsalmente. El ovario estará colocado con el folículo preovulatorio en el extremo posterior de la cara de la sombra. Con la sonda curvilínea el ovario se mantendrá anterior a la sonda. Para hembras con vaginas cortas la curvilínea suele ser más fácil de usar ya que la distancia entre la cara de la sonda y el fiador es más corta. Antes de la aspiración de oocitos, se puede administras flunixin meglumine si queremos dar analgesia. Para el proceso de recolección, la hembra debe estar colocada en un potro de contención, la cola sujeta y cubierta, el recto evacuado y el perineo lavado. Se seda con una combinación de butorfanol y xilacina o detomidina, dependiendo del individuo. Para reducir las contracciones del recto, administrar Buscapina. Las hembras son inmovilizadas durante el proceso de recolección de oocitos para minimizar movimientos. La existencia de aire en el recto hace más dificultoso el procedimiento y potencia los riesgos en la hembra, por ello, el veterinario tiene que prevenir la entrada de aire en el recto. Un tubo blando en forma de Y unido a una jeringa de 500 ml puede ayudar a succionar rápidamente el aire del lumen rectal. Antes de introducir la sonda, hay que administrar un lubricante no tóxico para mejorar el contacto con la pared vaginal. Sin meter aire en la vagina, la sonda se desplaza por la vagina lateral al cérvix e ipsilateral al folículo preovulatorio. Las manipulaciones transrectales se utilizan para posicionar el folículo con el ápex yuxtapuesto al fiador. La cara ventral del ovario puede ser palpada para evitar ser puncionado el ligamento ancho, el oviducto y la fosa ovulatoria. Se pueden usar agujas de una 4

5 sola luz, sin embargo, agujas de doble luz 12G son las que usan normalmente para la recolección de oocitos en yeguas. La aguja se avanza a través del fiador para puncionar las paredes foliculares. La succión puede aplicarse usando jeringas largas o un set de bombas a presión de 150 mmhg. Las agujas de doble luz tienen un tubo de entrada de flujo y otro de salida, por lo que el folículo puede ser lavado con ml de medio de flushing a la vez que se aspira el contenido folicular. Aproximadamente, 10 IU/ml de heparina se pueden añadir al flushing medio para prevenir la coagulación. Durante la aspiración del contenido folicular, el medio puede ser alternativa o simultáneamente recolectado o inyectado, mientras el folículo es masajeado por el recto. Unos 30 ml de líquido amarillo folicular es inicialmente recolectado del folículo preovulatorio. Durante el lavado folicular, el medio, a veces, llega a ser sanguinolento al alterar la vascularización del folículo. Antes de la recolección del oocito, el equipo es conservado a 38ºC, ya que el frío del equipo puede afectar potencialmente el desarrollo del oocito. El medio y el líquido folicular es depositado en una placa, y se realiza un examen riguroso para localizar el oocito. El aspirado no es filtrado si el complejo cúmulus-oocito está pegajoso y con tendencia a adherirse al filtro. El oocito equino tiene aproximadamente un diámetro de 160 nanómetros, sin embargo, el complejo cúmulus-oocito puede llegar a medir 1 ml de diámetro, por lo que será fácil identificarlo y se podrá ver normalmente sin necesidad de estereoscopio. Las células del cúmulus aparecen como una masa translúcida en la solución sanguinolenta del flushing. Aunque las células de la granulosa aparecen similares a las del complejo del cúmulus, tienen diferencias características de textura y color. El oocito es gris con variaciones, con el complejo del cúmulus habrá un anillo de células (corona radiada) alrededor del oocito. Después de la identificación del complejo cúmulus-ocito, se realiza el lavado en un medio para quitar posible sangre y restos. En general, la recolección de oocitos de folículos maduros es satisfactoria con experiencia en la técnica. Cuando la recolección de oocitos se realiza 39 horas después de la administración de un análogo de GnRH, se obtienen más oocitos de los folículos maduros significativo que si la recolección se hiciera de folículos inmaduros (79% vs 18% respectivamente). El número de oocitos recolectados por folículo no va a variar si son de 22 a 33 horas después de la administración de hcg (75% y 82% respectivamente) en la aspiración transvaginal, ó en variaciones de horas después de hcg (66% y 73% respectivamente) usando la aspiración flank. Con personal con experiencia limitada en la técnica OPU, la recolección de oocitos va a ser significativamente inferior, sin embargo, 5

6 si ésta técnica es realizada por personal con experiencia tendrá un 70% de éxito. Estas diferencias corresponden con la habilidad de los clínicos a la hora de la manipulación de los folículos durante el procedimiento. BIBLIOGRAFÍA: - Libro: Equine reproduction, segunda edición, autores: Angus O.McKinnon, Edward L.Squires, Wendy E.Vaala y Dickson D.Varner. Editorial: Wiley-Blackwell. USA Libro: Current Therapy in Equine Reproction, Autores: Juan C.Samper, Jonathan F.Pycock y Angus O.McKinnon. Editorial: Saunders Elsevier. USA Artículo: Transferencia de embriones y biotecnología asociadas en la especie equina. Autor: Ian Gordon. - Artículo: Aspiración folicular transvaginal. Autor: Hector Nava- Trujillo y Hugo Hernández Fonseca. Autores: Anabel Navarro Rodríguez/Mercedes García Marchal EQUISAN Veterinaria Equina Integral 6