Detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi utilizando discos de 3 mm en muestras de sangre seca sobre papel de filtro

Transcripción

1 Detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi utilizando discos de 3 mm en muestras de sangre seca sobre papel de filtro Idialis Hernández-Spengler, Lilliam Pozo-Peña, Grisell Ramos-Martínez, Yaranaima Morán-Peraza y Martha Amat-Arenas Laboratorio de retrovirus, División de Inmunoquímica, Centro de Inmunoensayo, Calle 134 y Avenida 25. Reparto Cubanacán, Playa. La Habana. Cuba. Apartado Postal 6653 iqvih2@cie.sld.cu Recibido: 18 de febrero de Aceptado: 9 de julio de Palabras clave: papel de filtro, diagnóstico, UMELISA, anticuerpos, Trypanosoma cruzi. Key words: filter paper, diagnosis, UMELISA, antibodies, Trypanosoma cruzi. RESUMEN. La utilización de sangre seca sobre papel de filtro ha despertado gran interés en los últimos años en los inmunoensayos debido a las ventajas que ofrece este modo de presentación de las muestras, lo que permite su utilización en países con recursos limitados para realizar estudios epidemiológicos. En este trabajo, se determinaron las condiciones óptimas de elución de muestras de sangre seca sobre papel de filtro para discos de 3 mm, como referencia se tomaron muestras de suero y las condiciones de elución establecidas para discos de 5 mm, en la detección de anticuerpos específicos a Trypanosoma cruzi mediante el ensayo inmunoenzimático indirecto UMELISA CHAGAS (Tecnosuma Internacional S.A.) basado en el Sistema Ultra Micro Analítico (SUMA ). Se evaluaron 12 muestras de suero positivos a la enfermedad de Chagas procedentes de Colombia confirmados por inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA Chagatek y 75 muestras de sangre seca sobre papel de filtro procedentes de Bolivia reactivas por el UMELISA CHAGAS. Además, se evaluaron muestras de suero y sangre seca sobre papel de filtro negativas a la enfermedad de Chagas procedente de donantes sanos del banco de sangre provincial de La Habana. Los resultados del estudio de sensibilidad y especificidad para discos de 3 mm y 5 mm fueron similares. La reducción del diámetro del disco permite, a partir de una misma mancha, realizar una mayor cantidad pruebas de diagnósticos para la detección de otras enfermedades, como el síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida, hepatitis B y C entre otras. ABSTRACT. The use of dry blood spots (DBS) on filter paper has become of increasing interest in the field of immunoassay over the last years due to the advantages this mode of presentation brings, enabling its use in countries where resources are scarce or limited to accomplish epidemiological studies. In this work, the optimal conditions for the elution of dry blood spots (3 mm disks) collected on filter paper were determined. Serum samples and the elution conditions establish for 5 mm disks were taken as reference in the detection of specific antibodies to Trypanosoma cruzi by using the indirect UMELISA CHAGAS (International Tecnosuma S.A.) immunoassay based on Ultra Micro Analytic System (SUMA ). Twelve sero-positive serum samples for Chagas disease from Colombia were confirmed by indirect immunofluorescence (IFI) and ELISA - Chagatek, and 75 DBS on filter paper from Bolivia reactive by UMELISA CHAGAS were evaluated. Additionally, serum samples and DBS negative to Chagas disease from healthy donors from Havana Province Blood Bank were tested. The sensitivity and specificity study results for 3 mm and 5 mm disks were similar. Reduction of the disk diameter allows increasing the number of diagnostic tests, from a very same spot, for the detection of other disease such as the acquired immunodeficiency syndrome, hepatitis B and C, among others. 210

2 INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es una zoonosis producida por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Es endémica en las regiones tropicales de América del Sur y América Central, donde se considera uno de los principales problemas de salud pública. La mayoría de las personas que presentan la enfermedad de Chagas desarrollan anticuerpos específicos contra T. cruzi. En una etapa inicial de la infección parasitaria los anticuerpos que se desarrollan son de clase IgM, siendo reemplazados gradualmente por anticuerpos de tipo IgG a medida que progresa la enfermedad. 1 La vía más específica para el diagnóstico es la detección o visualización del parásito en sangre a través del examen directo. La mayoría de los pacientes son asintomáticos, por lo que el diagnóstico parasitológico se hace difícil, por tanto, se recomienda la complementación con métodos serológicos con el objetivo de detectar anticuerpos específicos contra T. cruzi. 2 La presencia de anticuerpos contra T. cruzi en suero o plasma de una persona, indica que la ha sido infestada por el parásito y potencialmente puede transmitir la enfermedad. Cuando se realizan estudios epidemiológicos y de vigilancia de enfermedades de alto riesgo de infección es necesario procesar una gran cantidad de muestras, por lo que es conveniente emplear metodologías que permitan facilitar tanto su recolección como su procesamiento. Sin embargo, la recogida de las muestras implica la necesidad de un personal adiestrado en la extracción de sangre venosa, de materiales tales como jeringuillas, tubos de laboratorio, equipos para centrifugar la sangre y medios para la conservación de las muestras hasta que sean analizadas. 3 El objetivo del presente estudio consistió en detectar anticuerpos específicos contra T. cruzi en muestras de sangre seca sobre papel de filtro mediante discos de 3 mm, en el diagnosticador UMELISA CHAGAS. MATERIALES Y MÉTODOS Colecta de las muestras Se colectaron 41 muestras de sangre de donantes en el Banco de Sangre Provincial de La Habana, Cuba, en tubos de ensayo a razón de 5 ml de sangre por tubo. Se utilizaron 12 muestras de suero positivos a la enfermedad de Chagas procedentes de Colombia confirmadas por inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA Chagatek y 75 muestras de sangre seca sobre papel de filtro procedentes de Bolivia reactivas por UMELISA CHAGAS, de las cuales nueve fueron clasificadas como positivas bajas, ya que presentaban entre 40 y 60 unidades de fluorescencia (UF) y 57 se clasificaron como positivas altas por presentar valores de fluorescencia > 70 UF. Procesamiento de las muestras En tarjetas de papel de filtro se colocaron cuatro gotas de sangre negativa a la enfermedad de Chagas, a razón de 50 µl por cada gota y se dejaron secar durante 24 h entre 20 C y 25 C y con 48 % de humedad relativa. Con los sueros positivos a la enfermedad de Chagas de procedencia colombiana se prepararon 200 µl de sangre positiva artificial con un 50 % de hematocrito y se dispensaron en tarjetas de papel de filtro de la misma forma que las muestras negativas. Tecnología de Sistema Ultra Micro Analítico (SUMA ) Para el análisis e interpretación de los resultados se empleó la tecnología SUMA compuesta por un lector de placas PR-521 acoplado a una computadora, mediante la cual se realizaron las mediciones de fluorescencia entre 420 y 540 nm de longitud de onda. La conformaron, además, un lavador automático MW-2001, un paquete de programas que realizan la validación, interpretación e impresión de los resultados y los estuches de diagnóstico entre los que se encuentra el UMELISA CHAGAS. 211

3 Ensayo UMELISA. El UMELISA CHAGAS es un ensayo inmunoenzimático indirecto, que emplea como fase sólida tiras de ultramicroelisa recubiertas con tres péptidos sintéticos representativos de diferentes regiones inmunodominantes de la membrana de T. cruzi, los cuales se han obtenido mediante síntesis química en fase sólida. Utiliza para el análisis muestras de suero, plasma o sangre seca sobre papel de filtro (discos de 5 mm). Procedimiento técnico Para las muestras de sangre seca sobre papel de filtro, se cortaron discos de 5 mm y 3 mm de la zona central de la mancha con el perforador P-51 y se depositaron en una placa de ELISA de fondo plano, se les añadió 70 µl y 25 µl respectivamente del diluente del ensayo Tris hidroximetilmetilamina-carnero lo cual corresponde a una dilución 1:21 de la muestra y se incubaron una hora a temperatura entre 20 C y 23 C, para favorecer la elución del suero. A las muestras pareadas de suero se les realizó una dilución 1:21 con el mismo diluente. Se utilizó 10 µl de cada muestra y se transfirieron a la placa de reacción para la realización del ensayo UMELISA CHAGAS. Las muestras se incubaron 30 minutos a 37 C en cámara húmeda. Los anticuerpos IgG presentes en las muestras se fijaron a los antígenos del recubrimiento. Después de 4 ciclos de lavado (de 30 segundos cada uno) con solución reguladora Tris hidroximetilmetilamina 0,0157 M, ph 7,8; se añadieron 10 µl del conjugado anti-igg humana/ fosfatasa alcalina en cada pocillo. Las placas se incubaron y lavaron como se explicó en la etapa anterior; posteriormente se adicionó 10 µl de sustrato fluorigénico (4 metilumbeliferil fosfato) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La intensidad de la fluorescencia emitida revelará la presencia de anticuerpos IgG específicos a T. cruzi en la muestra estudiada. La medición, validación e interpretación de los resultados se realizó de forma automática por el lector PR 521 y su paquete de programas UMELISA CHAGAS. La especificidad y la sensibilidad se calcularon de la manera siguiente 3 : VP VN S = 100 E = 100 VP + FN VN + FP Donde: S Sensibilidad. E Especificidad. VP Verdaderos positivos. VN Verdaderos negativos. FN Falsos negativos. FP Falsos positivos. Análisis estadístico Se realizó un análisis de concordancia (índice Kappa) con el objetivo de evaluar las muestras de sangre seca en papel de filtro 3 mm frente a las muestras de sangre seca en papel de filtro 5 mm. Además, se realizó un histograma de frecuencia y un análisis de regresión lineal entre los dos procedimientos estudiados. RESULTADOS En el estudio realizado los resultados de las muestras evaluadas por UMELISA CHAGAS se expresaron en valores de relación con respecto al control positivo del ensayo, utilizando 0,3 como nivel de corte del ensayo. 212

4 La media de estos valores de las muestras negativas de sangre seca sobre papel de filtro de donantes y de las muestras positivas de sangre seca sobre papel de filtro fuero muy similares al usar discos de 5 mm y 3 mm en la detección de anticuerpos específicos contra T. cruzi. (Tabla 1) Tabla 1 Promedio de los valores de relación de las muestras negativas y positivas de sangre seca sobre papel de filtro. Muestras negativas discos 5 mm 3 mm 0,063 0,062 positivas 0,81 0,79 Todas las muestras positivas estudiadas en el ensayo fueron reactivas, para un 100 % de sensibilidad y todas las muestras negativas mostraron un 100 % de especificidad. El índice Kappa para las dos variantes analizadas (discos de 5 mm y 3 mm) fue igual a 1, lo que indicó muy buena concordancia entre los procedimientos estudiados (Tabla 2). Tabla 2 Resultados del estudio de correlación entre discos de 3 mm y discos de 5 mm. Disco Positivos Negativos Total discos 3 mm discos de 5 mm Total En el análisis de la regresión lineal entre discos de 3 mm y 5 mm, todos los valores de relación se agruparon junto a la recta por lo que la pendiente y el coeficiente de correlación tienen valores muy cercanos a 1(Figura 1). Fig 1. Análisis de regresión lineal de muestras de sangre seca en papel de filtro correspondiente a discos de 5 mm y 3 mm. (R= coeficiente de correlación) 213

5 En la evaluación de las muestras de baja positividad, los resultados fueron similares al utilizar los discos de 3 mm y 5 mm. En el caso de las muestras de alta positividad, se presentaron diferencias en los resultados entre las dos condiciones (Figura 2). Fig 2. Histograma de frecuencias de muestras de sangre seca en papel de filtro correspondiente a discos de 5 mm y 3 mm. (SSPF sangre seca sobre papel de filtro) DISCUSIÓN Los resultados de las muestras negativas de donantes de sangre y de las muestras positivas fueron muy similares al emplear discos de 3 mm y 5 mm, lo que indica que los componentes de la sangre total no impiden el reconocimiento entre los antígenos de la fase sólida y los anticuerpos de tipo IgG de T. cruzi presentes en la muestra. Al evaluar la especificidad y la sensibilidad del estuche UMELISA CHAGAS con muestras negativas y positivas respectivamente, se comprobó que se comportaron de igual manera, lo que demuestra la utilidad de este ensayo en la detección de anticuerpos contra T. cruzi utilizando discos de 3 mm. Un estudio con diferentes métodos usados en el diagnóstico de la infección con T. cruzi con la utilización de muestras de eluatos de sangre sobre papel de filtro y de suero, sus resultados no coincidieron. 4 Los resultados en cuanto a sensibilidad coincidieron con los de otros investigadores al evaluar muestras de sangre seca sobre papel de filtro mediante los ensayos UMELISA 3 y Elisa indirecto. 5 Sin embrago, los resultados de especificidad no coincidieron con los informados por otros autores 5 que reportaron un 97,6 % en la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi mediante un ELISA indirecto empleando muestras de sangre en papel de filtro. Los resultados de la prueba de concordancia, correspondientes a los ponches de 3 mm y 5 mm, indicaron muy buena concordancia entre los procedimientos estudiados, dado por el valor del índice de concordancia Kappa. 6,7 Otros autores 8 han reportado muy buena concordancia en estudios similares realizados en la detección de HBsAg en muestras de sangre seca sobre papel de filtro. 8 La pendiente y el coeficiente de correlación determinados en el análisis de regresión lineal, evidenciaron una relación directa y muy fuerte 9 entre los discos de 5 mm y 3 mm. Esta correlación lineal permitió obtener reproducibilidad en los resultados utilizando ambos procedimientos para evaluar muestras de sangre seca sobre papel de filtro. 10 Iguales resultados encontraron Morales et al., al utilizar este análisis de correlación en sus estudios. El histograma de frecuencia correspondiente a los discos de 3 mm y 5 mm de muestras de sangre seca en papel de filtro mostraron la reproducibilidad del comportamiento de las muestras negativas y de las de baja positividad al ser evaluadas en cada procedimiento con el UMELISA 214

6 CHAGAS. Sin embargo, las muestras de alta positividad presentaron una diferencia en la reproducibilidad en los resultados entre las dos condiciones, la cual no fue significativa, ya que no influye en el diagnóstico cualitativo del ensayo. Se pudo concluir que las muestras de sangre seca sobre papel de filtro utilizando discos de 3 mm, en el diagnosticador UMELISA CHAGAS, no requieren de cambios en los componentes del estuche ni en las condiciones de validación ya establecidas. CONCLUSIONES Existe una buena correlación de los resultados entre los discos de 5 mm y 3 mm de las muestras de sangre seca sobre papel de filtro, por lo que se pueden utilizar los de 3 mm para la detección de anticuerpos específicos contra T. cruzi empleando el UMELISA CHAGAS. La utilización de estos discos en la detección de anticuerpos específicos contra T. cruzi, no requiere de cambios en los componentes del estuche ni en las condiciones de validación ya establecidas en el diagnosticador UMELISA CHAGAS para discos de 5 mm. Se obtuvo 100% de sensibilidad y especificidad para las muestras estudiadas. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Zicker F, Smith PG, Luquetti AO, Oliveira OS. Mass screaning for Trypanosoma cruzi infections using the immunofluorescence, ELISA and haemaglutination test on serum samples and on blood eluates from filter-paper. Bulletin of the World Health Organization 1990; 68(4): Palacio X, Belli A, Espino AM. Detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en Somoto, Nicaragua mediante ELISA indirecto e IFI en muestras de sangre en papel de filtro. Rev Panm Salud. 2000; 8(6). 3. Rosner B. Fundamentals of bioestatics. 3era edition Boston: PWS Kent publishing Company; Altman DG. Practical statistics for medical research. London: Chapman & hail; Delahanty FA, Valdivia AI, Ventura PJ, Trujillo BJ, Ortega LD, Palenzuela DA. Detección de HBsAg en muestras de sangre seca sobre papel de filtro empleando el UMELISA HBsAg Plus. Rev Biomed. 2003; 14: Bouza HCN, Sistachs VV. Estadística, teoría básica y ejercicios. La Habana: Editorial Félix Varela; 2004: p Linares FG. Análisis de datos. La Habana: Facultad de Matemática y Cibernética. Universidad de La Habana; 1990:p Delahanty FA, Valdivia AI, ventura PJ, Trujillo BJ, Ortega LD, Palenzuela DA. Detección de HBsAg en muestras de sangre seca sobre papel de filtro empleando el UMELISA HBsAg Plus. Rev Biomed. 2003;14: Linares FG. Análisis de datos. La Habana: Facultad de Matemática y Cibernética. Universidad de La Habana; 1990:p