UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD TESIS
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- Ángela Olivera Muñoz
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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD RESPUESTA INMUNE DE NEUTRÓFILOS HUMANOS A Helicobacter pylori A TRAVÉS DE RECEPTORES TIPO TOLL TESIS QUE PRESENTA: B. E. MARÍA DE LOURDES ALVAREZ ARELLANO PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL CO-TUTORA: DRA. MARÍA DEL CARMEN MALDONADO BERNAL. CO-TUTOR: DR. EDMUNDO BONILLA GONZÁLEZ. ASESORA: M. en C. MARGARITA CAMORLINGA PONCE. MÉXICO, D. F. MARZ0 2005
2
3 La Maestría en Biología Experimental de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, formó parte del padrón de Posgrado de Excelencia del CONACYT con número de registro Y actualmente se encuentra dentro del padrón de programas del PIFOP-CONACYT clave C/PFPN Mi reconocimiento al CONACYT por el apoyo económico otorgado durante la realización del presente trabajo a través de la beca-crédito con número de registro
4 COMITÉ TUTORAL Co-Tutora Dra. María del Carmen Maldonado Bernal Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Infecciosas y Parasitarias, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. Co-Tutor Dr. Edmundo Bonilla González Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa. Asesora M. en C. Margarita Camorlinga Ponce Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Infecciosas y Parasitarias, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS.
5 Con todo mi amor y mi respeto este trabajo se lo dedicó a mi Mamá
6 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Ma. del Carmen Maldonado Bernal por darme la oportunidad de seguirla en el camino de la libertad y el conocimiento, por todo su tiempo, paciencia y esfuerzo invertido en mi formación profesional y por toda la confianza que siempre me ha tenido. A la Dra. Margarita Camorlinga Ponce y al Dr. Edmundo Bonilla González por su apoyo y sus valiosas observaciones. A mis Padres por ser mi sostén en los momentos difíciles y por creer siempre en mí. A Nadia y Adriana por su cariño. Gracias a Pablo por su apoyo, paciencia y amor que me da en todo momento. Al Dr. Javier Torres López por permitirme ser parte de su grupo de trabajo y a todos mis compañeros de laboratorio principalmente a Ale y a Polo por ser mis cómplices. A Brenda, Ismael y Abel por ser mis confidentes y por su amistad incondicional.
7 GRACIAS A DIOS
8 RESPUESTA INMUNE DE NEUTRÓFILOS HUMANOS A Helicobacter pylori A TRAVÉS DE RECEPTORES TIPO TOLL TESIS QUE PRESENTA: B. E. MA. DE LOURDES ALVAREZ ARELLANO PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL CO-TUTORA: DRA. MARÍA DEL CARMEN MALDONADO BERNAL. CO-TUTOR: DR. EDMUNDO BONILLA GONZÁLEZ. ASESORA: M. en C. MARGARITA CAMORLINGA PONCE. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA
9 RESUMEN La respuesta inmune innata constituye la primera línea de defensa en contra de las infecciones por microorganismos. La estrategia de activación de la respuesta inmune innata se basa en la detección de productos o de constituyentes que son invariantes en los microorganismos de una determinada clase y que son esenciales para su sobrevivencia. Estas moléculas son llamadas patrones moleculares asociados a patógenos y los receptores que los reconocen son llamados receptores de reconocimiento patrón (PRRs). Los TLRs son un tipo de PRRs y su activación induce la expresión de genes que codifican para moléculas que participan en la respuesta inmune, tales como citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y coestimulación. H. pylori es una bacteria que coloniza la mucosa gástrica humana y representa una de las infecciones bacterianas más comunes en el mundo. La infección por esta bacteria se ha asociado con diversas enfermedades gastroduodenales incluyendo cáncer gástrico. En la gastritis aguda y crónica causada por la infección con H. pylori, los neutrófilos son los iniciadores del proceso inflamatorio como respuesta a la infección y se ha demostrado que existe una correlación entre el grado de daño de la mucosa y la infiltración de neutrófilos. Estudios recientes han demostrado la participación de los TLRs en la respuesta inmune inicial en la colonización con H. pylori. Se demostró que el LPS de H. pylori producido por cepas Cag positivas activan a TLR4 en células epiteliales gástricas. Otros estudios revelaron que TLR2 media los efectos proinflamatorias inducidos por H. pylori en células epiteliales y demuestran que el LPS de H. pylori es agonista del TLR2. Los resultados obtenidos en el presente estudio indican que constituyentes o productos secretados por H. pylori, activan neutrófilos humanos induciendo una
10 respuesta inflamatoria caracterizada principalmente por la producción de IL-8 desde la primera hora y hasta las 24 horas de estimulo. Por otro lado, la producción del stnf-ri en neutrófilos co-cultivados con H. pylori comparada con la producción en neutrófilos sin estimular no se modificó en los diferentes tiempos de co-cultivo (0.5, 1, 3, 6 y 24 horas). Y la producción de IL-10 en respuesta a H. pylori se incrementa a las 6 y 24 horas de estimulo, sin embargo este incremento no fue estadísticamente significativo. Asimismo, se demuestra la regulación negativa de MAC-1 a las 24 horas de estimulo tanto con H. pylori como con LPS de E. coli. Por otro lado, nuestros resultados demuestran que existe una expresión constitutiva de del RNAm de TLR2 y de TLR4 en neutrófilos humanos y que H. pylori regula negativamente la expresión de estos dos receptores. Cuando se bloquearon los receptores TLR2 y TLR4 con anticuerpos monoclonales, la producción de IL-8 disminuye en neutrófilos co-cultivados con H. pylori. Sin embargo esta disminución fue parcial y la diferencia no fue estadísticamente significativa, lo cual indica la existencia de otros mecanismos, aunados a la señalización mediada por TLR2 y TLR4, involucrados en la producción de IL-8 inducida por H. pylori en neutrófilos humanos. Los resultados obtenidos en este estudio indican la participación de TLR2 y en menor medida de TLR4, en la activación de neutrófilos humanos, observada en la producción de IL-8 inducida por H. pylori y la probable existencia de otros receptores involucrados en este proceso.
11 ÍNDICE Página 1. ANTECEDENTES Respuesta Inmune Innata Patrones Moleculares Asociados a Patógenos Receptores de Reconocimiento Patrón Receptores Tipo Toll (TLRs) Neutrófilos Helicobacter pylori JUSTIFICACIÓN HIPÓTESIS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL Y MÉTODO Diseño del estudio Selección de donadores a) Criterios de Inclusión 14 b) Criterios de exclusión Obtención y cultivo de neutrófilos Cultivo de H. pylori
12 Página 6.5 Determinación de la expresión de MAC Determinación de la producción de citocinas Determinación de la expresión de los TLRs Cuantificación de los RNAm de TLR2 y TLR Bloqueo de TLR2 y TLR4 con anticuerpos monoclonales Análisis estadístico RESULTADOS Producción de IL-8 inducida en neutrófilos humanos por H. pylori Producción del stnf-ri inducida en neutrófilos por H. pylori Producción de IL-10 inducida en neutrófilos por H. pylori Expresión de MAC-1 en neutrófilos estimulados con H. pylori Expresión de TLR2 y TLR4 en neutrófilos estimulados con H. pylori Participación de TLR2 y TLR4 en la activación inducida por H. pylori en neutrófilos humanos DISCUSIÓN CONCLUSIONES REFERENCIAS..35
13 Los integrantes del jurado, designados por la División de Ciencias Biológicas y de la Salud de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, aprobaron la presente tesis el día 17 de marzo del Dra. María del Carmen Maldonado Bernal PRESIDENTE Dr. José Miguel Betancourt Rule SECRETARIO M. en C. Margarita Camorlinga Ponce VOCAL
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