Factores genéticos relacionados con la tembladera o scrapie en ganado ovino

Transcripción

1 Informe final de proyecto Factores genéticos relacionados con la tembladera o scrapie en ganado ovino Centro: NEIKER Participantes: Ana Hurtado (ahurtado@neiker.net) David Garcia Crespo Ana L. García Pérez Ramón A. Juste Jesse Barandita Leyre Benedicto Año

2 Factores genéticos relacionados con la tembladera o scrapie en ganado ovino 1.- Actividades más destacadas y resultados obtenidos - Estudio comparativo de técnicas de detección de SNPs para el genotipado ovino en los codones 136, 154 y 171 del gen que codifica la proteína PrP Se han desarrollado dos técnicas para la detección de los polimorfismos (SNPs) en los codones 136, 154 y 171. Por una parte se ha puesto a punto una técnica de PCR-RFLP que mediante dos reacciones de PCR y tres restricciones enzimáticas permite determinar los polimorfismos del gen PrP asociados a la susceptibilidad/resistencia genética al desarrollo de scrapie. El análisis de las variaciones en el tamaño de los fragmentos de restricción enzimática obtenidos a partir de la digestión de los fragmentos del gen PrP amplificados por PCR identifica todas las variantes posibles en los tres codones. Sin embargo, y a pesar de la mejora conseguida con respecto a las técnicas de hibridación utilizadas con anterioridad, el tipado por PCR-RFLP es una técnica larga y tediosa que no permite el procesado rápido de grandes volúmenes de muestras. Es por esto, que se ha desarrollado una nueva técnica, la PCR a tiempo real, que permite el procesado de un gran número de muestras con un reducido tiempo de manipulación y por tanto con mayor rapidez. La técnica se basa en la utilización de sondas marcadas con fluorescencia (sondas TaqMan MGB) específicas para cada una de las posibles variables alélicas en los codones 136, 154 y 171 en una reacción de PCR que ahorra los pasos finales de detección manual. Esto ha supuesto un gran avance con relación a las técnicas de las que se disponía hasta el momento (hibridación en soporte sólido o PCR- RFLP). Para la realización de esta técnica se utiliza un equipo ABI PRISM 7000 Realtime quantitative PCR de Applied Biosystems adquirido con subvención del departamento de Educación del Gobierno Vasco (EC2001-3). La técnica desarrollada es susceptible de automatización y permite dar una respuesta rápida en caso de urgencia diagnóstica para el tipado de un rebaño con algún caso clínico declarado. - Muestreos de campo y selección de muestras representativas de las razas ovinas a analizar y de animales alto valor comercial Se han seleccionado 53 rebaños comerciales de la CAPV repartidos en los 3 Territorios Históricos (TH), y en los que las distintas variedades de razas estuvieran representadas proporcionalmente a los censos (datos 1999): Latxa Cara Rubia-LCR (15), Latxa Cara Negra-LCN (30), Carranzana-CARR (5) y Sasi-Ardi (3). Los rebaños de LCR y Sasi- Ardi, debido a que son variedades que están básicamente localizada en Gipuzkoa, se eligieron exclusivamente en dicha provincia. Por la misma razón los rebaños de CARR seleccionados proceden de Bizkaia, mientras que los rebaños de LCN se seleccionaron en las 3 provincias. Dentro de cada TH la selección de los rebaños se hizo proporcionalmente a los censos de cada comarca, y dentro de cada comarca los rebaños se seleccionaron mediante la técnica de números aleatorios. Se decidió recoger sangre a aproximadamente 10 ovejas mayores de 1 año de cada uno de los 53 rebaños seleccionados (8 de Araba, 14 de Bizkaia y 31 de Gipuzkoa) con lo que se obtuvieron un total de 525 sangres pertenecientes a las 4 razas: 302 LCN, 143 LCR, 50 Carranzana y 30 Sasi-Ardi. Se han seleccionado también animales de interés comercial en el 2

3 proceso de selección de ARDIEKIN: machos pertenecientes a ganaderías y al Centro de Selección de ARDIEKIN, y madres de corderos que se incorporan al Centro de Selección. En total se han genotipado más de 3000 animales, aproximadamente la mitad de ellos por la técnica de PCR a Tiempo Real puesta a punto durante el desarrollo de este proyecto. Se ha conseguido un alto grado de automatización del proceso, lo que permite dar una respuesta rápida en caso de urgencia diagnóstica. El gran número de animales tipados nos ha permitido conocer las distribuciones alélicas y genotípicas en cada una de las razas de la CAPV y ver que se trata de razas con genotipos relativamente susceptibles al scrapie. Los resultados obtenidos han sido objeto de una publicación en el Veterinary Record donde se describen con detalle las técnicas y resultados obtenidos. - Análisis del nivel de expresión del gen que codifica PrP en diferentes órganos y tejidos ovinos mediante la detección del RNA mensajero, y de la distribución de la proteína prion normal, en animales de genotipos más o menos susceptibles a la enfermedad. El nivel de expresión del gen PrP se midió mediante la cuantificación relativa del mrna por PCR a Tiempo Real. Para ello se seleccionaron seis tejidos, tres del Sistema Nervioso Central (SNC): óbex, cerebelo y cerebro, y tres del Sistema Linfoide (SL): bazo, íleon terminal y nódulo linfático. La cuantificación de la expresión de mrna mediante PCR a Tiempo Real (Higuchi et al., 1993; Heid et al., 1996; Bustin, 2000) consiste en una RT-PCR dividida en dos etapas. En un primer paso se realiza la transcripción de todos los mrna existentes a cdna y en segundo lugar, una amplificación del gen problema a partir de este cdna mediante cebadores específicos. La extracción de RNA total se realiza a partir de tejido congelado a -80ºC extraído a partir de animales seleccionados según su genotipo y manteniendo en todo momento la cadena de frío. En nuestro caso, dada la alta heterogeneidad de los tejidos ha sido necesaria la aplicación de dos protocolos diferentes para lograr un máximo rendimiento, diferenciando del resto los tejidos con alto contenido en grasas (óbex, cerebelo, cerebro y médula espinal). En cualquier experimento de cuantificación relativa es imprescindible establecer una serie de genes constitutivos o housekeeping (HK) cuya expresión permanece estable independientemente del animal o del tejido del que se trate (Thellin et al., 1999; Schmittgen et al., 2000). Hasta la fecha, se venía empleando un único gen constitutivo, pero algunos autores destacan la necesidad de emplear 3 genes HK para una correcta estandarización (Vandesompele et al., 2002). El nivel de expresión de estos genes servirá para relativizar la expresión del gen PrP y de este modo eliminar todas las posibles variaciones que puedan darse en el ensayo, como son la integridad del RNA y la cantidad de muestra empleada, entre otras. Dado que la puesta a punto exige el análisis de varios genes HK, se ha empleado SYBR Green como fluoróforo, lo que nos ha proporcionado una mayor libertad en el diseño sin un coste elevado. En una primera etapa se diseñaron los cebadores tanto para el gen problema PrP como para los genes HK. En el diseño se ha hecho especial énfasis en garantizar la ausencia de enlaces entre oligos para evitar dímeros ya que nos daría una medición errónea debido a una suma de la fluorescencia del amplicón con el dímero. Otros aspectos 3

4 considerados han sido la temperatura de ligación (entre 58-60ºC), así como evitar la existencia de G/Cs en el extremo 3. En el diseño de cebadores para cuantificación, es una ventaja que uno de los cebadores se encuentre en la región exón-exón del gen para no amplificar posibles restos de DNA genómico así como pseudogenes. En nuestro caso esto no ha sido posible dada la escasez de secuencias ovinas en las bases de datos, con lo cual el RNA total es tratado con DNAasa tras su extracción. Esta misma escasez nos ha obligado en el caso de los genes HK cuya secuencia de DNA no está descrita para oveja, a comparar las secuencias de otros animales con el fin de diseñar oligos en la región más conservada. De esta manera, se han seleccionado 8 genes HK: 4 para los se conoce su secuencia en ovino, y otros 4 para los que el diseño de los cebadores se ha realizado empleando las regiones más conservadas entre varias especies de mamíferos (ratón, rata, humano, vaca). Tras diseñar y evaluar las 8 parejas de oligos, dos de ellas se han tenido que descartar debido a que su escasa expresión. Respecto al gen prion, hemos descartado la posibilidad de diseñar oligos en la región exón-exón debido a que solo un exón de los tres que posee es el que codifica para la proteína PrP. Una vez diseñados los cebadores tanto para el gen problema PrP como para los seis genes HK se puso a punto la RT-PCR seleccionando las condiciones óptimas para cada reacción. Una vez finalizado el análisis de estos seis genes HK en 6 tejidos de 22 animales sanos, usando la aplicación Visual Basic para Microsoft Excel GeNorm v3.4. se han realizado los cálculos estadísticos necesarios para seleccionar los genes HK más adecuados para nuestro estudio. Una vez finalizado el análisis de estos genes se han seleccionado los genes HK más estables en cada tejido para calcular el factor de normalización con el que se ha relativizado la expresión del gen PrP. Los resultados de expresión obtenidos se han analizado estadísticamente para determinar la posible asociación entre los niveles de PrP mrna y la resistencia genética al scrapie. Para ello se han considerado el efecto edad, genotipo, grupo de riesgo y las interacciones entre estos factores. Se ha visto una marcada asociación entre el nivel de PrP mrna y el tipo de tejido (p<0.0001). El óbex mostró los mayores niveles de expresión (38.054) seguido por el íleon (35.725), nódulo linfático (33.506), bazo (29.989), cerebelo (28.885) y cerebro (21.584). No se encontró asociación entre los niveles de mrna y la edad, el grupo de riesgo (R) o el genotipo. Tampoco se encontró una asociación significativa con el efecto grupo de riesgo-genotipo, aunque sí se encontraron ciertas diferencias entre grupos concretos. En general, en los tejidos del SNC se vio una tendencia hacia una mayor expresión de PrP asociada a animales de genotipo más sensible. Así, los animales resistentes R1 mostraron los niveles de expresión más bajos y se observó un incremento gradual en la expresión obteniéndose los mayores valores en animales R4. Aunque los animales R4 presentaron mayores valores que los R5 las diferencias no fueron estadísticamente significativas. En los tejidos del SL se encontró la situación opuesta con mayores niveles de expresión del gen PrP en los animales con genotipos más resistentes. Los altos niveles de PrP mrna en SNC en animales con genotipos susceptibles en combinación con la alta eficiencia de conversión de la proteína prion normal (PrPc) en la forma patológica (PrPSc) asociada a estos genotipos, explicarían el gran número de casos clínicos de scrapie descritos en estos genotipos. Por el contrario, en SL (vía de entrada de PrPSc) la mayor eficiencia de conversión de PrPc en PrPSc en animales susceptibles contrarrestaría sus bajos niveles de PrP mrna. En cualquier caso, pueden existir otros factores tales como la regulación post-transcripcional, otros genes o la propia cepa de scrapie, que también influyan en la patogenia de la enfermedad. Estos resultados son objeto de un artículo científico actualmente en evaluación. 4

5 Utilizando el mismo protocolo se ha estudiando también el nivel de expresión del gen PrP y otros 6 genes asociados a la respuesta inmune, estrés oxidativo y apoptosis en los 22 animales sanos mencionados anteriormente y otros 4 animales con scrapie. Las muestras están ya procesadas y pendientes del análisis de los resultados. Estos resultados son objeto de un artículo científico actualmente en preparación. Publicaciones Científicas Internacionales - GARCÍA-CRESPO D., OPORTO B., GÓMEZ N., NAGORE D., BENEDICTO L., JUSTE R.A., HURTADO A. (2004) PrP polymorphisms in Basque Country sheep breeds determined by PCR-restriction fragment length polymorphism and real-time PCR. The Veterinary Record 23: GARCÍA-CRESPO D., JUSTE R.A., HURTADO A Selection of ovine housekeeping genes for normalisation by real-time RT-PCR. Analysis of Prp gene expression and genetic susceptibility to scrapie. BMV Veterinary Research 1:3. - GARCÍA-CRESPO D., JUSTE R.A., HURTADO A Differential gene expression in central nervous system tissues of sheep with natural scrapie. Brain Research : Comunicaciones a Congresos, Reuniones, Simposios - D. GARCÍA-CRESPO, B. OPORTO, N. GOMEZ, D. NAGORE, L. BENEDICTO, R. A. JUSTE, A. HURTADO. A Real-time PCR protocol for PrP gene polymorphisms analysis. Distribution of polymorphisms in the Basque Country sheep breed. European network for surveillance and control of TSE in Small Ruminants (with emphasis on epidemiology, pathology and diagnostic tests), SR- TSE network meeting, 31 Octubre 1 Noviembre 2003, Ayia Napa, Cyprus. - GARCIA-CRESPO D., JUSTE R.A., HURTADO A. Stability of six housekeeping genes in nine ovine tissues and its application to the relative quantification of Prion protein gene expression. 1st International qpcr Symposium & Application Workshop. Transcriptomics, Clinical Diagnostics & Gene Quantification. Freising- Weihenstephan 3rd - 6th Marzo 2004, Alemania. - GARCIA-CRESPO D., JUSTE R.A., HURTADO A. Cuantificación de la expresión del gen PrP en relación a la susceptibilidad genética frente a scrapie. XXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM) Lleida, Septiembre GARCIA-CRESPO D., JUSTE R.A., HURTADO A. Expresión génica diferencial en el sistema nervioso central de ovejas con scrapie. Congreso de la Sociedad Española de Genética, Roquetas de Mar, Almeria, 5-7 Octubre