Encapsulación de meloxicam en nanopartículas poliméricas biodegradables de Poli-ε-caprolactona.

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1 Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016) 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias Encapsulación de meloxicam en nanopartículas poliméricas biodegradables de Poli-ε-caprolactona. Karla Maldonado Solís Unidad Académica de Ciencias Naturales Programa Verano UAGro Área III: Medicina y ciencias de la salud karla_mldsls@hotmail.com Dr. Sergio Alcalá Alcalá Profesor-Investigador de la Facultad de Farmacia de la UAEM sergio.alcala@uaem.mx Resumen Las nanopartículas poliméricas (NPs) se han venido empleando para el transporte y liberación controlada de fármacos, cuyo tamaño fluctúa en el orden de los nanómetros los cuales permiten mejorar la biodistribución de moléculas frágiles o complejas y favorecer su interacción con tejidos específicos, protegiendo a su vez el tejido sano. En este trabajo se encapsuló MLX en NPs se realizó la validación de un método, evaluando los parámetros de especificidad, linealidad, límite de cuantificación, límite de detección, exactitud y precisión, con la finalidad de asegurar que los resultados puedan ser confiables, también se determinó la longitud de onda máxima del MLX de nm. Las NPs y un potencial zeta utilizando un equipo Zetasize, encontrando partículas esféricas de un diámetro promedio de nm y un potencial Z de 25.0 mv, La eficacia de encapsulación de MLX fue medida por espectrofotómetro UV-Vis, donde se obtuvo un encapsulamiento del 92.96% cuando de tenían 50mg de MLX disponible. Palabras Clave: Nanopartículas poliméricas, policaprolactona, Meloxicam, encapsulación. Introducción Las nanopartículas poliméricas (NPs) son vehículos que se han venido empleando para el transporte y liberación controlada de fármacos, poseen un diámetro entre los rangos de 1 a 1000 nm. Las NPs, especialmente compuestas por polímeros biodegradables, representan una mejora

2 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 sobre los métodos tradicionales de administración de fármacos en términos de eficiencia y efectividad. Entre los diferentes polímeros que se pueden implementar para su fabricación esta la policaprolactona (PCL), la cual ha sido utilizada para encapsular principios activos de diferentes grupos farmacológicos y mantener la concentración del fármaco en el organismo alrededor del nivel efectivo por un tiempo prolongado en una solo dosis. Además de su adecuada biocompatibilidad y baja imunogenicidad, la PCL presenta algunas características particulares que justifican su uso como biomaterial en el campo de la liberación controlada de fármacos. El método utilizado es el de emulsión evaporación de solvente consiste en formar una emulsión a partir de dos fases inmiscibles. Una fase acuosa o continúa provista de un agente emulgente apropiado y una fase dispersa orgánica que contiene el principio activo y el polímero destinado a la formación de la matriz. Una fuente de energía permite formar pequeñas gotas de la fase dispersa, generalmente se emplea una sonda de ultrasonido. Una vez formada la emulsión, el solvente orgánico es evaporado, por lo que debe ser suficientemente volátil. El polímero precipita atrapando al fármaco, lo que permite la formación de nanopartículas. Pr otro lado, el Meloxicam es un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) del grupo del ácido enólico (figura 1). Tiene un amplio espectro de actividad antiinflamatoria con menos irritación gástrica 7 y del tejido local que los otros AINEs existentes. MLX es un polvo de color amarillo claro, inodoro o prácticamente inodoro. Fue seleccionado para el desarrollo farmacéutico porque exhibe una alta potencia en pruebas con animales para potencial de acción anti-artrítica, y tiene un espectro más amplio de actividad antiinflamatoria, junto con menos gástrica y el tejido local. Figura 1: Estructura del Meloxicam La solubilidad acuosa de MLX es escasa. La solubilidad en solución acuosa de los AINEs ácidos en el cual se incluye el MLX, es dependiente de ph: al reducir el ph causa un aumento en el radio de fármaco no-ionizado a ionizado causando una disminución en la solubilidad. MLX es poco soluble en acetona, soluble en dimetilformamida, muy poco soluble en etanol 96% y en metanol. Materiales y Métodos Validación de método

3 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Se preparó una solución 100µg/mL agregando 10 mg del fármaco en un matraz aforado de un volumen de 100 ml, al cual se le agrego 20 ml de hidróxido de sodio 0.1 M y su volumen final se ajustó con metanol. Se leyeron las muestras (blanco y muestra) en el espectrofotómetro UV- Visible (CARY 60 UV-Vis) en un rango de 200 a 500 nm Por último, se preparó una dilución de 30µg/mL para obtener una absorbancia entre 0.1 a 1.5 para encontrar la longitud de onda máxima de absorción. Finalmente, se elaboró una curva de calibración 5 niveles de concentración: 10, 15, 20, 25 y 30 µg/ml a partir de un patrón 100µg/mL. Preparación de nanopartículas poliméricas La preparación de nanopartículas se llevó a cabo por el método de evaporación del disolvente, donde se realizaron dos soluciones una orgánica y otra acuosa: el proceso se realizó por triplicado. Solución orgánica: 100 mg de Policaprolactona (PCL) y 25, 50 y 75 mg de Meloxicam (MLX) en 20 ml de Diclorometano (DCM), diluidos con agitación magnética. Solución acuosa: Polivinil alcohol (PVAL) en agua destilada a 1% p /v (0.4 g de polímero), el cual se homogenizó por agitación magnética. Se mezclaron ambas soluciones y se sometieron a agitación con un quipo Ultra-Turrax TM a 15,000 rpm durante 10 min. En un vaso de precipitado se agregaron 50 ml de agua destilada, mientras se mezclaba por agitación magnética se vertió continuamente la mezcla de soluciones gota a gota. Finalmente, se evaporo el disolvente (diclorometano) por agitación constante. Determinación de tamaño de las nanopartículas Se determinaron los tamaños de las nanopartículas empleando un equipo Zetasizer, a partir de una muestra de cada lote de NPs que se obtuvo, diluyendo con agua destilada. Eficacia de encapsulación de Meloxicam en la NPs. La cuantificación del Meloxicam no encapsulado en las nanopartículas, este procedimiento se realizó por medio de una bolsa de diálisis, la cual se hidrato con el blanco (hidróxido de sodio y metanol). Después se asegura la orilla con un hilo, posteriormente se le agrega 1 ml de nuestras nanopartículas que contienen meloxicam y se vuelve asegurar con hilo. Por último, se colocó en un vaso de precipitado con 10 ml de nuestro blanco, se le deposito un pequeño agitador magnético. Se dejó agitando durante 2 horas. La eficiencia se calculó usando la siguiente ecuación: Eficiencia % = m totalfarmaco mfarmacolibre m totalfarmaco x100 Potencial Zeta

4 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 Se determinó el potencial zeta por medio del Zetasizer, a partir de la nanopartículas que se encuentran dentro de la bolsa de diálisis donde se realizó la cuantificación de fármaco y de la muestra control. Resultados Validación de método El barrido llevado acabo a la dilución de meloxicam de 30µg/mL ha proporcionado valores de absorbancia en 0.1 a 1.5 para un intervalo de longitudes de onda ( nm). El valor máximo de absorbancia se obtuvo a 364 nm como se puede observar en la figura 2. Figura 2: Barrido de longitud de onda en el intervalo de 200 a 500 nm para una dilución de meloxicam en agua destilada (30µg/mL). Para la validación de método se elaboraron 5 rectas de calibración empleando el espectrofotómetro UV-Visible (CARY 60 UV-Vis). Tabla 1: Absorbancias obtenidas para cada punto de la curva de calibración. MLX (µg/ml) Recta #1 Recta #2 Recta #

5 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Se han realizado los parámetros de linealidad, exactitud y precisión en el intervalo de concentraciones entre 10 y 30µg/mL. Dando como resultados los datos de la tabla 2. Tabla 2: Resultados obtenidos con las diluciones de µg/ml. Parámetros Resultados Coeficiente de correlación r Intercepción Desviación estándar Constante de variación (%) Límite de detención (µg/ml) Límite de cuantificación (µg/ml) Con el método de evaporación de disolvente se obtuvieron nanopartículas con un rango de nm a una velocidad de 15,000 rpm. En la tabla 3 se observan el tamaño de las nanopartículas cargadas con fármaco y de muestras control (sin MLX), para cada una de las 3 diferentes cantidades de MLX, que se probaron, en las cuales se realizaron por triplicado. Tabla 3: Determinación de tamaño de nanopartículas. Muestras Control 25 mg de MLX 50mg de MLX 75mg de MLX Determinación del potencial Zeta en las 4 muestras realizadas, donde se observa que no hay cambios en el potencial Z, aun cuando se tenga fármaco encapsulado.

6 Encapsulación de MLX (%) 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 Tabla 4: Potencial Zeta de las nanopartículas Muestras Cantidad de Meloxicam Resultado Control mg mg mg 25.0 Eficacia de Encapsulación de Meloxicam Cantidad de farmaco total (mg) 67.12% 92.96% 67.51% Grafica 1: Eficiencia de encapsulación de MLX, con respecto a las 3 cantidades de MLX que se manejaron. Discusión y conclusiones La validación de método cumple con los parámetros establecidos, ya que el valor del coeficiente de determinación es mayor a 0.99, el coeficiente de variación de los factores de respuesta es 2%, al igual que los límites de detención y cuantificación que se encuentra en los criterios de aceptación, lo cual satisfacen los requisitos para la aplicación analítica deseada. Se obtuvieron nanopartículas poliméricas (NPs) formadas con el polímero PCL con y sin MLX. Estas nanopartículas presentaron tamaños regulares, con valores entre nm. Presentaron un potencial zeta positivo de 25.0 mv, tanto en las muestras control como en la muestras con MLX, lo cual nos indica que se encuentran estables. La eficacia de la encapsulación del MLX en las nanopartículas poliméricas fueron de un 92.96%, ya que en estas fueron donde se obtuvo la mejor cantidad de fármaco encapsulado. Agradecimientos Le agradezco al proyecto PRODEP con número de oficio de liberación No. DSA/103.5/15/6986, dirigido por el Dr. Sergio Alcalá Alcalá profesor-investigador del laboratorio N 1 tecnología

7 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Autónoma del Estados de Morelos, por todas sus atenciones, el uso de sus instalaciones y disposición para poder trabajar en este proyecto, también agradezco a su grupo de trabajo (tesistas y estudiantes de maestría) por compartir su conocimiento y sus asesorías con el uso de los equipos. Referencias 1. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogo México. (2002). Guía de validación de métodos analíticos. (1ª. Edición). México. 11,21-38 p. 2. Correa, Y. Ortiz, S. Sereno, O. Sabino, M. (2013). Obtención de micro/nanopartículas de policaprolactona cargadas con antibiótico comercial y potencial aplicación en liberación controlada de fármacos. Rev. LatinAm. Metal. Mat Francine-Rodrigues,I. (2015). Validation of high performance liquid chromatography method for determination of meloxicam loaded PEGylated nanocapsules. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences (BJPS), Induri, M. (2012). Dissolution studies and quantification of meloxicam in Tablet dosage form by spectrophotometry. PJPS Luger, P. Daneck, K. (1995). Structure and physicochemical properties of meloxicam, a new NSAID. European Journal of Pharmaceutical Sciences (EJPS). 175p. 6. Rocha-Formiga, F., Ansorena, E., Hermoso de Mendoza, A. (n.d.). Nanosistemas a base de poliésteres Reyes-Pool, H., Mendoza-Díaz, S. (2012). Desarrollo de nanopartículas poliméricas para la encapsulación, protección y liberación dirigida de quercetina, un potente antioxidante. CIENCIA@UAQ Thuy-Dao,T. (2012). Desarrollo galénico de nuevas formulaciones inyectables de meloxicam y amoxicilina sódica para uso veterinario. Tesis doctoral, Facultad de Farmacia, Univerdad Complutense de Madrid. 18p.