USOS Y COSTUMBRES DEL RNA DE INTERFERENCIA.

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1 USOS Y COSTUMBRES DEL RNA DE INTERFERENCIA. Luis Vaca, Julián Valdés, Fabián Flores y Alicia Sampieri. Departamento de Biología Celular. Instituto de Fisiología Celular, UNAM. Apdo. postal , México, D.F. Tel , Fax lvaca@ifc.unam.mx. La introducción de RNA de doble cadena (dsrna) en una gran variedad de células y organismos inicia un proceso altamente eficiente y selectivo de degradación del RNA mensajero (mrna) con secuencia homologa al dsrna introducido. Este fenómeno es actualmente conocido como RNA de interferencia o RNAi y ha causado una verdadera revolución en el campo de la Biología celular moderna. En el año de 2002, la revista Science consideró al RNAi como el descubrimiento más importante del año. Los mecanismos iniciados por el dsrna y que culminan con la degradación selectiva del mrna se conocen solo a grandes rasgos, pero involucran dos grandes pasos: la fragmentación selectiva del dsrna en fragmentos de nucleótidos por una ribonucleasa tipo III denominada Dicer, y el ensamblaje del llamado complejo RISC (del inglés RNA-Induced Silencing Complex), el cual se encarga de degradar el mrna homólogo a la secuencia de dsrna usada, utilizando esta última como templado. Si bien las células animales no producen RNA de doble hebra, lo que si producen son los llamados micrornas, los cuales son RNAs de doble hebra imperfecta que sufren una maduración que culmina con el microrna activo (Moss, 2002). De hecho, el genoma humano contiene alrededor del 40% de secuencias invertidas repetidas capaces de formar hebras imperfectas de RNA de doble cadena. A la fecha se han aislado e identificado más de 350 secuencias de micrornas en plantas y animales superiores, incluyendo al humano (Ambros, 2001; Ambros, 2003; Moss, 2002). La identificación de nuevos micrornas en vertebrados es un campo muy activo en estos momentos. Los micrornas juegan papeles esenciales en una gran variedad de procesos, entre los que se incluyen la regulación del ciclo celular y la división celular durante la embriogénesis, regulación de apoptosis, y el control del tamaño de órganos y tejidos durante el desarrollo de vertebrados (Ambros, 2001; Carrington and Ambros, 2003). Los micrornas tienen patrones de expresión que pueden ser tejido específico, mostrando variaciones a lo largo del desarrollo. Por ejemplo, existen micrornas que solo se expresan en células troncales, mientras que otros únicamente se expresan en el sistema nervioso central de mamíferos (figura 1). Se han identificado micrornas que se expresan exclusivamente en ciertas etapas del desarrollo del ratón, mientras que otros inician su expresión justo unos días después de que nace el ratón (figura 2). Los genes blancos para la mayoría de estos micrornas no han sido identificados a la fecha. En plantas se ha identificado un solo microrna capaz de regular el tamaño y la forma de las hojas de Arabidopsis. La eliminación de este microrna resulta en plantas con hojas de tamaños y formas aberrantes. Hasta el momento se desconoce el tipo de promotores que regulan la expresión de micrornas, aunque se especula que deben ser promotores para polimerasa tipo 2, ya que de otra forma no podrían tener expresión tejido-especifica. Uno de los micrornas mas estudiados es el denominado let-7, el cual se encarga de la represión de genes en el nematodo C. elegans. Este microrna inhibe la expresión de genes importantes en la etapa de larva del nematodo y permite la expresión de varios genes involucrados en la maduración del nematodo a etapa adulta (Ambros, 2003). Así pues, let-7 controla el paso de la etapa larvaria IV del nematodo al adulto, mediante la regulación de varios genes. Let-7 también ha sido identificado en varios vertebrados,

2 incluyendo al humano, en donde se cree que funciona como un switch temporal del desarrollo embrionario, aunque se desconoce el blanco o blancoes de let-7 en animales superiores (Carrington and Ambros, 2003). En general, los micrornas están altamente conservados a lo largo de la evolución, como lo muestra la figura 3 en donde comparamos let-7 de C. elegans, Drosophila y humano. Recientemente se ha demostrado que varias proteínas involucradas en la vía de RNAi también son esenciales para la maduración de micrornas (Hutvagner and Zamore, 2002). Tal es el caso de Dicer y varios argonautas, quienes forman parte del complejo RISC (Doench et al., 2003; Hutvagner and Zamore, 2002). Los micrornas modulan la expresión de genes al aparearse con el mrna en regiones no traducidas del gen (UTRs) al extremo 3 (Ambros, 2001; Ambros, 2003). Una vez formada esta unión micrornamrna este último queda arrestado por el complejo RISC y no tiene acceso al ribosoma, por lo que no se produce la proteína (Moss, 2002). Cuando el apareamiento micrornamrna es perfecto, el mrna es degradado de forma similar a lo que ocurre en el fenómeno de RNAi. La relevancia de micrornas y dsrna durante el desarrollo de vertebrados quedó en evidencia cuando se eliminó la enzima Dicer en el pez cebra y el ratón (mediante knock-outs ). El knock-out de Dicer en ambos organismos resulta en la muerte de los animales en etapas tempranas del desarrollo (Bernstein et al., 2003). Lo anterior ha permitido determinar que Dicer es esencial para el desarrollo de vertebrados, muy posiblemente por su papel de regulador en la maduración de micrornas (Lee et al., 2003). Otro miembro muy importante del RISC es argonauta (en animales superiores llamado eif2c). Este factor fue identificado hace varios años como un factor esencial para la traducción de proteínas. Existen varios de estos factores que forman parte del RISC, por lo que se cree que el RISC tiene una asociación muy estrecha (quizá incluso física) con los ribosomas, aunque esto no ha sido probado experimentalmente. Así pues, el RNAi parece ser una vía un tanto artificial (iniciada por el experimentador), la cual permite explorar con gran detalle la vía de micrornas, los cuales sí son producidos por células animales y vegetales (Carrington and Ambros, 2003; Doench et al., 2003; Hutvagner and Zamore, 2002). Sin embargo, el RNAi (aunque artificial) nos proporciona una herramienta de enorme poder para la exploración de la función de múltiples genes de interés. Recientemente el poder de RNAi ha quedado claramente ejemplificado cuando un grupo de investigadores silenciaron los genes contenidos en un cromosoma completo del nematodo C. elegans, lo que ha permitido hablar del termino RNAi genómico (Carpenter AE and Sabatini DM, 2004). También muy recientemente varios grupos (incluyendo al nuestro) han demostrado el poder del RNAi para silenciar genes esenciales para la virulencia de varios virus patógenos del hombre y otros animales. Lo anterior ha permitido especular sobre la posibilidad del uso de RNA de doble hebra como una nueva generación de agentes antivirales. En el presente trabajo revisaremos el campo del RNAi, haciendo hincapié en los hallazgos mas recientes sobre el mecanismo de acción del RISC, sus componentes y las posibles funciones fisiológicas que el RNAi puede fungir en animales superiores. Así mismo, hablaremos sobre aspectos prácticos del uso de RNAi para la identificación de la función de genes de interés, o bien como una herramienta alterna a la genética reversa clásica.

3 Figura 1. micrornas expresados exclusivamente en sistema nervioso central del ratón. La figura muestra las formas de asa (hairpin) imperfectas típicas de micrornas. En esta figura se muestran micrornas de expresión exclusiva en el sistema nervioso central. La zona marcada en rojo indica la región de corte de Dicer para producir el microrna maduro. Nótese como todas estas regiones resultan en micrornas de 21 nucleótidos de longitud.

4 Pre natal Post natal Figura 2. Patrones de expresión de algunos micrornas durante el desarrollo del ratón. Northern blots mostrando los patrones de expresión durante los días de gestación (E) en ratones para los micrornas indicados a la izquierda. Los días indicados con P muestran la expresión después del nacimiento. Nótese como mir-128 (indicado por flecha en rojo) inicia su expresión pocos días antes del nacimiento del animal, mientras que mir-19b deja de expresarse justo después del nacimiento (segunda flecha roja). Esta regulación en la expresión tan estricta es típica de micrornas.

5 Figura 3. Estructura del microrna let-7 en diferentes organismos. La imagen muestra la estructura de let-7 inmaduro (antes de ser cortado por Dicer). En gris se sombrea la secuencia madura de let-7 (la parte que deja libre Dicer al cortar), nótese como aunque el resto de la secuencia del microrna inmaduro varia en cada especie, la secuencia de let-7 madura de 21 nucleótidos (cortada por Dicer) esta perfectamente conservada en las 3 especies: el nematodo C. elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el humano. REFERENCIAS Ambros, V. (2001). micrornas: tiny regulators with great potential. Cell 107, Ambros, V. (2003). MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing. Cell 113, Bernstein, E., Kim, S. Y., Carmell, M. A., Murchison, E. P., Alcorn, H., Li, M. Z., Carrington, J. C., and Ambros, V. (2003). Role of micrornas in plant and animal development. Science 301, Carpenter AE, Sabatini DM. (2004) Systematic genome-wide screens of gene function. Nat Rev Genet Jan;5(1): Doench, J. G., Petersen, C. P., and Sharp, P. A. (2003). sirnas can function as mirnas. Genes Dev 17, Hutvagner, G., and Zamore, P. D. (2002). A microrna in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 297, Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim, J., Yim, J., Lee, J., Provost, P., Radmark, O., Kim, S., and Kim, V. N. (2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microrna processing. Nature 425, Moss, E. G. (2002). MicroRNAs: hidden in the genome. Curr Biol 12, R