La Biología Molecular en el Diagnóstico de las Hemoglobinopatías.

Transcripción

1 La Biología Molecular en el Diagnóstico de las Hemoglobinopatías. Indicaciones y validación de resultados Adoración Blanco Álvarez 16 de noviembre de

2 α y β talasemia HbE HbS 2

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7 TIPO DE MUTACIÓN POSIBLE CONSECUENCIA (EJEMPLO) Mutación puntual Variante sinónima Variante missense (Hb S, Hb C,.) Aparición codón stop (Hb McKess Rocks) Desaparición codón stop (Hb Constant Spring) Duplicación o deleción de uno o más genes Entrecruzamiento desigual durante la meiosis produciendo genes de fusión Pérdida de expresión del gen (α-talasemia) Pérdida de la expresión de los genes β y δ pero incremento de la función del gen Gγ (Persistencia de Hb F) Fusión α 2 α 1 (-α 3.7 talasemia) Fusión δβ (Hb Lepore) Mutaciones indel (frameshift) Alteración en la pauta de lectura ( β-talasemia) Translocaciones cromosómicas Triplicación de un gen α 7

8 Diagnóstico en el Laboratorio HEMOGRAMA Electroforesis de Hemoglobinas Cuantificación de las fracciones HbA2 y HbF Pruebas de solubilidad Estudio de estabilidad molecular Estudio de afinidad por el oxígeno TÉCNICAS MOLECULARES 8

9 Cuándo realizar estudio molecular en las Hemoglobinopatías Discrepancia genotipo-fenotipo Hemoglobinopatías compuestas Diagnóstico en α-talasemia Consejo genético Estudio prenatal 9

10 Qué estudiar en las Hemoglobinopatías Hemoglobinopatías estructurales Síndromes drepanocíticos, Hb inestables, Hb de alta afinidad, Hb M Talasemias α-talasemia, β-talasemia Variantes de la hemoglobina talasémicas HB E, HB Lepore, HB Constant-Spring Persistencia hereditaria de la Hb fetal 10

11 Cómo estudiar las Hemoglobinopatías PCR Mutaciones conocidas y recurrentes MLPA Grandes deleciones o adiciones conocidas o no Secuenciación Mutación desconocida 11

12 Hemoglobina S: Qué, Cómo y Cuándo 12

13 Piel F et al

14 Cribado neonatal Consejo genético Discrepancia fenotipo-genotipo Estudio prenatal 14

15 CASO1 Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia. El padre (35 a) no presenta anemia y VCM 81. Hb F y Hb A2 normal. Ambos hermanos (6 a y 3 a) presentaban anemia (Hb 12,8 y 12,6) y microcitosis (VCM 69 y VCM 68). El estudio del metabolismo era normal. 15

16 Mutaciones delecionales de α-talasemia Harteveld an Higgs Orphanet Journal of rare diseases 2010, 5:13 16

17 TRANS CIS 17

18 Hidropesia fetal por Hb Bart 18

19 SOUTHERN BLOT POLYMERASE CHAIN REACTION 19

20 GAP-PCR Deleción 3,7 Kb de α-tal 20

21 PCR e hibridación inversa Obtención del ADN Amplificación PCR utilizando cebadores marcados con biotina Hibridación en tiras contienen sondas aleloespecíficas Revelación utilizando estreptavidina-fosfatasalcalina y sustrato de color 21

22 Deleción 3,7Kb Triplicación alfa 22

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24 CASO1 Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia. Todos presentan microcitosis sin alteraciones en el metabolismo del hierro. PADRE: Triplicación α HIJOS: No presentan alteraciones Sospecha de mutaciones puntuales 24

25 Mutaciones no delecionales de α-talasemia 69 mutaciones puntuales Formas no delecionales de alfa talasemia (α T α/αα) Afectan: secuencias de control de la expresión: CAJA CCAAT Y TATA Codón de iniciación y terminación Señales de splicing Señal de poliadenilacion Mutaciones sin sentido Modificacion del marco de lectura Secuencia de aminoácidos 25

26 Secuenciación Sanger 26

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28 CASO1 Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia. Todos presentan microcitosis sin alteraciones en el metabolismo del hierro. PADRE: Triplicación α HIJOS: No presentan alteraciones HEMOGLOBINA AGRINIO EN HETEROCIGOSIS HbVar: Hemoglobina hiperinestable Microcitosis 28

29 CASO 2 Niña (propositus) de 7 años con Hb 10,7, VCM 64, HbF 7,3%, HbA2 2,7%. Hermano 9 años con Hb 11.5, VCM 63, HbF 1.8%, HbA2 3.2%. Madre portadora de α-talasemia, 3,7Kb con leve anemia y microcitosis Padre no estudiado SOSPECHA: Niña δβ-talasemia heredada del padre Hermano α-talasemia heredada de la madre 29

30 CASO 2 Niña (propositus) de 7 años con Hb 10,7, VCM 64, HbF 7,3%, HbA2 2,7%. Hermano 9 años con Hb 11.5, VCM 63, HbF 1.8%, HbA2 3.2%. Madre portadora de α-talasemia, 3,7Kb con leve anemia y microcitosis Padre no estudiado SOSPECHA: Niña δβ-talasemia heredada del padre Hermano α-talasemia heredada de la madre 30

31 CASO 2 Estudio α-talasemia: Madre deleción 3,7Kb heterocigosis Padre normal Niña normal Hermano deleción 3,7Kb heterocigosis Estudio βδ-talasemia: Madre deleción Spanish heterocigosis Padre normal Niña deleción Spanish heterocigosis Hermano deleción Spanish heterocigosis 31

32 Cuándo realizar estudio molecular en las Hemoglobinopatías Discrepancia genotipo-fenotipo Hemoglobinopatías compuestas Diagnóstico en α-talasemia Consejo genético Estudio prenatal 32

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