Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas.

Transcripción

1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Especialización CEBI_E1 Técnicas de análisis en biotecnología Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas. Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio CEBI_E1_5:

2 La electroforesis capilar (CE) es una familia de técnicas que emplean capilares estrechos (entre µm de diam. int.) tanto para separar moléculas grandes como pequeñas. Introducción comercial: fin Las separaciones se facilitan por el uso de voltajes altos, lo que generan dos flujos,el electroosmótico (EOF) y el electroforético, de las especies del buffer y de las especies iónicas, respectivamente.

3 Las propiedades de separación así como el resultado obtenido (electroferograma) recuerda a una mezcla entre HPLC y CG con PAGE. Ventajas principales -requiere poca muestra (nl) -eficiencias elevadas (simil GC o +) -cuantificación -automatización -> repetitibilidad -admite muchos analitos -usa poco reactivo

4 El siguiente es un diagrama del funcionamiento básico de un equipo de CE.

5 Cómo y por qué migran los solutos si (o por qué se mueve la fase móvil ) -No hay bomba, como en HPLC -No hay gas presurizado, como en CG -No hay capilaridad (como cromatografía en papel) VER:

6 El flujo electroosmótico (EOF) es el proceso impulsor fundamental en CE. Se produce por la superfice cargada en la pared del capilar. Se debe a la formación de una doble capa eléctrica, en la interfase entre el líquido y la superficie interna del capilar. Habitualmente, el interior de los capilares es de sílica, que presenta grupos silanoles (Si OH) libres en la superficie interna. El pi de la silica fundida es > 1,5. Por encima de ese ph (normalmente > 3 para estar seguros), los silanoles permanecen cargados y confieren a la superficie interna del capilar una carga neta negativa.

7 Como se origina el EOF? Ánodo + Cátodo - Detector

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9 El EOF se produce por el sentido de flujo de los cationes adyacentes al capilar

10 Los cationes del buffer migran hacia la pared del capilar cargada negativamente, lo que termina formando una doble capa eléctrica. Al aplicar el campo eléctrico, los cationes tenderán a migrar hacia el cátodo (de carga opuesta) y los aniones hacia el ánodo. Como los cationes se encuentran solvatados con las cargas negativas de los silanoles de la pared del capilar, ellos terminan arrastrando incluso los aniones y el resto de la solución con ellos.

11 A ph elevados (en capilar de 50 um i.d.): 4 nl/s A ph bajos: 0,5 nl/s.

12 El grado de ionización depende el ph La intensidad del flujo electroosmótico depende de las cargas de la pared y de la intensidad del campo eléctrico. La intensidad de la carga neta negativa de las paredes depende también del ph (cuanto más alcalino, mas ionizados los silanoles). Se grafica la velocidad de EOF en función del ph.

13 La velocidad de migración real de un analito en CE depende también del flujo electroosmótico, que fluye hacia el cátodo (carga negativa). EOF se mide inyectando un analito patrón (y neutro) y evaluando el tiempo que demora en llegar al detector. Por lo tanto, la migración real depende del resultado neto entre la atracción de cargas hacia el electrodo de carga opuesta y el flujo electroosmótico.

14 Los analitos con carga neta positiva son atraídos hacia el cátodo ( ), en el mismo sentido que el flujo electroosmótico. Los analitos con carga neta negativa son atraídos hacia el ánodo (+), en contra del flujo electroosmótico. En condiciones de capilaridad, la fuerza del flujo electroosmótico es mucho mayor que la atracción hacia el ánodo, por lo que los analitos con carga negativa también migran hacia el cátodo ( ), pero con una velocidad mucho menor. Incluso aniones con triple carga negativa terminan migrando hacia el cátodo ( ), por la fuerza del flujo electroosmótico.

15 EOF Velocidades aparentes Analitos con carga neta + se mueven más rápido que EOF EOF Analitos sin carga neta se moverán igual que el EOF. Útil para determinar la velocidad del EOF EOF Analitos con carga se mueven más lentamente que EOF

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17 El tiempo de migración (tm) es uno de los parámetros prácticos claves, y es el tiempo que tarda el soluto en moverse por el capilar desde su inicio hasta el detector. La movilidad electroforética (up) se calcula a partir de la velocidad de migración o electroforética (vp) y la fuerza del campo eléctrico (V/cm). Ld: distancia capilar- detector Lt: distancia total capilar La movilidad electroforética es proporcional a la carga neta de la molécula, e inversamente proporcional a las fuerzas de fricción presentes en el buffer.

18 Movimientos y ecuaciones asociadas: - Analito ν = µ E ν = velocity µ = electrophoretic mobility E = Electric field - Movilidad electrofóretica µ = q/[6πηr] q = charge η = solution viscosity r = Stoke's radius (analito) - Flujo electroosmotico ν EOF = [ε/4πη]ζe ε = dielectric Constant ζ = Zeta potential - Flujo de migración ν = [(μ EO + μ e )V]/L V = potential L = length of capillary

19 Además, el perfil de avance del flujo en los sistemas basados en el flujo electroosmótico, es plano, a diferencia del flujo laminar, perfil característico de los sistemas impulsados por presión (HPLC). Por lo tanto, el flujo no contribuye al ensanchamiento de bandas, como si ocurre en HPLC. La CE puede tener cientos de miles de platos teóricos.

20 El número de platos teóricos (Eficiencia de separación) está dado por: N: Número de platos teóricos μ: Movilidad aparente Dm: Coeficiente de difusión del analito Por lo tanto, la eficiencia solo estaría limitada por la difusión, y acrecentada por la fuerza del campo eléctrico. Y no depende del largo del capilar!

21 Problemas principales Joule heating (calentamiento por la corriente). Se debe a la resistencia que muestra el buffer a fluir con la corriente. Hoy en día no se pueden aplicar corrientes mayores a 30 kv. Difusión del calor dentro del capilar. Genera gradiente, que afecta a la viscosidad. Solución: capilares más estrechos y efectiva remoción del calor (por diseño de equipo).

22 Inyección de la muestra Los viales de origen, destino y el capilar contienen un buffer salino acuoso (electrolito). 2 métodos más difundidos - por presión. - eléctrocinética. Aplicación de un voltaje a la muestra para que ingrese.

23 Detección Pueden usarse varios métodos de detección. Lo más común es absorbancia UV o UV-Visible. Habitualmente una parte del mismo capilar (cercana al extremo de salida) se usa como celda de detección. La detección en el mismo tubo evita una pérdida en resolución. Los capilares habitualmente están cubiertos por un polímero, que debe ser transparente en la ventana de detección, o debe removerse.

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25 El recorrido del haz de luz en la detección de CE (50 um) es mucho menor que en una celda UV tradicional (1 cm). Como la sensibilidad es directamente proporcional a la longitud del recorrido del haz, es necesario encontrar formas de aumentar el recorrido en la CE, a pesar de una segura pérdida de resolución. El mismo capilar puede ser expandido formando una burbuja (Fig. a), o puede agregarse un fragmento perpendicular al capilar (Fig. b) para aumentar el recorrido en el lugar de detección.

26 La detección del analito puede ser directa o indirecta (se coloca un analito patrón que absorba mucho, y se registra la bajada en la Abs como señal; claramente, esta metodología tiene sus limitaciones) (detalle en animación, en diapositiva siguiente)

27 Los conceptos principales de CE se pueden observar en la siguiente animación: - Componentes del sistema - Inyección de muestra - EOF - Detección

28 Modos de CE Capillary zone electrophoresis (CZE) Capillary Isoelectric focusing (CIEF) Capillary gel electrophoresis (CGE) Capillary Isotachophoresis (CITP) Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) Algunas de las técnicas (CZE, CIEF y CITP) están descriptas en la siguiente animación, con sus diferencias y similitudes

29 Selección de técnica según muestra Introduction to CE, Beckman Handbook

30 Capillary Zone Electrophoresis - CZE Es la más común entre las CE. Las moléculas son separadas por su relación carga/masa, dentro de un capilar, sometidas también a un campo eléctrico. Es clave: homogeneidad de los buffers (mantener ph exacto), fuerza eléctrica constante a lo largo del capilar. Se pueden separar tanto moléculas grandes como pequeñas.

31 CZE Los componentes se separan en zonas discretas: Inicio durante Introduction to CE, Beckman Handbook

32 La movilidad electroforética de un analito a un ph determinado se puede aproximar por la teória Debye-Huckel- Henry (ya vista antes): Siendo z la carga neta de la molécula y r el radio de Stokes del analito, y η viscosidad del medio

33 CZE En muchos casos, y especialmente los que involucran a macromoléculas, la carga neta de una molécula: DEPENDE DEL ph. Capilar típico: De sílica fundida, de um. Son transparentes al UV, alta durabilidad y potencial zeta adecuado. Importante: debe ser acondicionado antes del primer uso (0,1M NaOH 10'; H 2 O, 5'; buffer de corrida, 10'). Objetivo: asegurarse que la superficie del mismo se encuentre uniformemente cargada.

34 Efecto del ph: cambio en la migración - ph elevado EOF es importante orden migración: cationes, neutros, aniones. Estos últimos igual migran hacia el cátodo, dada la magnitud de EOF (EOF > migración electroforética). OJO: los compuestos neutros no se separan entre si dado que su carga neta es 0. - ph bajo EOF es pequeño puedo medir cationes y aniones en diferentes corridas, pero NO juntos. Se cambia la posición del cátodo (si mido cationes, configuración std) o ánodo (mido aniones) respecto al detector, revirtiendo la polaridad de los electrodos.

35 Efecto del ph: cambio en la migración Por lo tanto, el cambio de ph influye en las proteínas y péptidos y en su migración! Afectando la sensibilidad en su separación. Regla: elegir un ph al menos 2 unidades > que el pka para asegurarnos una completa ionización. Cuidados - en ph muy alcalinos, ya que EOF es muy grande y podría no separar mis compuestos de interés por su velocidad. - en ph muy ácidos, pared del capilar sin carga. No hay interacción, pero la proteínas pueden precipitar.

36 CZE Ideales para proteínas! (reducen calentamiento) Introduction to CE, Beckman Handbook

37 CZE selección de buffers - concentración típica: mm. - filtrado a 0,45 um para evitar obstruir capilar. Problema de capilares y coating: - pegado de sustancias + a las paredes. - coating puede evitarlo. Hay varios tipos. También se utiliza para evitar el pegado hidrofóbico de proteínas.

38 CZE Ojo: alteran la movilidad electroforética de las protreínas Introduction to CE, Beckman Handbook

39 CZE - aplicaciones Proteínas y péptidos. Diferencias de hasta 1 aminoácido son detectables. Ejemplo: separación de BSA reducida, desnaturalizada y digerida. Realizada a ph bajo con 1,5 M Urea. Introduction to CE, Beckman Handbook

40 CZE - aplicaciones Introduction to CE, Beckman Handbook

41 Capillary Isoelectrofocusing - CIEF Se usan anfolitos carriers, y se forma un gradiente de ph similar al visto para IEF una vez aplicado el voltaje. Contraste con CZE, en donde el buffer debía mantenerse lo más estable posible, mientras aquí es discontínuo. Introduction to CE, Beckman Handbook

42 CIEF Las moléculas migrarán mientras estén cargadas. El EOF debe ser suprimido (momentaneamente) para que el IEF sea efectivo (sino, no se forma un gradiente y corre todo). Se realiza un coating de metilcelulosa o poliacrilamida. Esto suprime tanto el EOF como la adsorción de proteínas. Uso principal: separación de alta resolución de proteínas y polipéptidos. Se resuelven hasta 0,02 unidades de ph.

43 CIEF Importante: ph del buffer anódico debe ser menor que el pi del anfolito más acídico, mientras que el ph del buffer básico debe ser mayor que el del anfolito más básico, para evitar sus migraciones en los mismos. 3 pasos para su aplicación: - cargado - enfocado - mobilización

44 CIEF Cargado. Mezcla muestra + anfolitos (1-2 %). Inyección más común por presión o vacío. Enfoque. Buffer cátodo: NaOH; buffer ánodo: H 3 PO 4. Campo: V/cm. Ojo: precipitación: uso de aditivos. Movilización. Etapa necesaria, ya que si quedan fijos en el capilar, cuándo los detecto? Se puede realizar para el cátodo o ánodo, depende de que buffer se reemplace, para que se reinicie el EOF. Detección a 280 nm dado que los anfolitos absorben a 214 nm.

45 CIEF - Aplicaciones Determinación de pi de proteínas, separación de mezclas Ig, variantes Hb, modificaciones posttraduccionales Introduction to CE, Beckman Handbook Mezcla de proteínas (1-5); 1: pi >; 5: Introduction pi < to CE, Beckman Handbook

46 Capillary Gel Electrophoresis - CGE - EOF está suprimido (el mismo gel lo suprime), al igual que en CIEF (previo a movilización). - Aplicación de CE a electroforesis en geles para separación de ADN. Tendremos separación por tamaño como en PAGE. - Se usan capilares rellenos de poliacrilamida (más usual, pero veremos otros). Agarosa no se puede utilizar dado que no soporta el calentamiento excesivo por los altos voltajes. Introduction to CE, Beckman Handbook

47 CGE Dos clases de relleno de geles: geles físicos (hidroxipropilmetil celulosa) o químicos (poliacrilamida). Capilares de 50 a 100 μm, y entre 10 y 100 cm. A mayor largo, mejor resolución, pero más calentamiento. Puedo cambiar el rango de PM a resolver cambiando la concentración en el gel (= PAGE). Ojo con el calentamiento! Puede ocasionar poros en el gel. Los geles físicos son más sensibles que los químicos.

48 CGE Muy utilizado para proteínas y ADN. Proteínas: se suelen desnaturalizar (calor, SDS, ß- mercaptoetanol). Ventaja: igualdad de carga/masa y forma (todas rod-like). Buffer típico: 90 mm Tris-fosfato ph 8,6 con 0,1 % SDS. Se debe realizar calibración con marcador de PM (= PAGE). Inyección: electrocinética (por presión se obstruye el gel).

49 CGE Ej. separación homopolímero sintético de 50 timidinas. Se logra resolución de separación de 1 unidad. Introduction to CE, Beckman Handbook

50 CGE Ej. separación doble hebra de ADN. Resolución de 3 pb! También es útil para separación de fragmentos ADN por PCR y digestiones con enzimas de restricción (caso en la figura de al lado). Introduction to CE, Beckman Handbook

51 Capillary Isotachophoresis - CITP Al igual que CIEF, se debe eliminar el EOF (así nació, pero hoy en día tb se usa) y se posee un sistema heterogéneo en el buffer. Se usa un electrolito iniciador (alta movilidad) y uno finalizador (baja movilidad), y la separación de la muestra ocurre en el medio. Introduction to CE, Beckman Handbook

52 CITP El electrolito líder se coloca tanto en capilar como en el reservorio catódico (cerca del detector). Debe poseer mayor movilidad que el analito más móvil que yo quiera separar. Por ej: Cl - (si separo especies cargadas negativamente). En el otro reservorio, se pone al electrolito finalizador (posee una movilidad menor a cualquiera de los analitos). Como es un sistema heterogéneo: la fuerza eléctrica en cada zona será diferente, y será inv. proporcional a la conductividad (depende de movilidad y concentración)

53 CITP Como se logran zonas muy delimitadas, la separación por movilidad es muy elevada. Todas las bandas se mueven a la misma velocidad (único en CE), una vez que se enfocaron. Esto es pq: - Si muy móvil: alta conductividad, por lo que E baja, y por lo tanto la velocidad se reduce; - Si poco móvil, baja conductividad (alta resist), generando mayor E y por lo tanto aumentan su velocidad. Al final, la velocidad de todos será igual.

54 CITP Como consecuencia de esto, existe entonces un efecto de enfoque, al igual que en CIEF, debido al juego entre conductividad y caída del voltaje, que son indirectamente proporcionales. Movilidad = conductividad x caída de voltaje No se pueden determinar cationes y aniones en la misma corrida (Cationic CITP y Anionic CITP).

55 CITP El orden de migración es el mismo con y sin EOF El orden de migración es inverso con y sin EOF!

56 CITP selección de buffer

57 CITP Así se ve un electroferograma por CITP. Se utilizan spacers para que se asemeje a los obtenidos por CZE (detección UV). Son compuestos de movilidad intermedia que no absorben. Así se obtiene separación entre bandas! (sino no la habría). Grafico conductividad Introduction to CE, Beckman Handbook

58 CITP Contras respecto a CZE: Es más compleja la elección de buffers. Uso de spacers para evitar superposición de bandas. Capilares de silica 0,25% de metilcelulosa suprime el EOF. Electrolito lider: ácido fosfórico. Electrolito finalizador: valina (100 mm, ajustado a ph con amina primaria).

59 CITP selección de buffer

60 CITP comparaciones Anionic CITP: capilar con cobertura (SIN EOF) Capilar sin cobertura (CON EOF)

61 CITP comparaciones Con spacers, mejor separación Anionic CITP: capilar con cobertura (SIN EOF)

62 Micellar electrokinetic Capillary cromatography - MECC Ideal para determinación de moléculas pequeñas. Se usan micelas que forman soluciones surfactantes, similares a cromatografía líquida en fase reversa, pero con los beneficios de la CE. Introduction to CE, Beckman Handbook

63 MECC Para profundizar: apunte adjunto Introduction to capillary electrophoresis Beckman handbook. Fundamento: (caso ph neutro a básico) EOF (fuerte) Los analitos se particiona entre bulk y micela ; si en micela, tiene menor vel.; sino, es la v del EOF Introduction to CE, Beckman Handbook

64 MECC - aplicaciones Introduction to CE, Beckman Handbook

65 MECC - aplicaciones Introduction to CE, Beckman Handbook

66 Aplicaciones: Detalle: DNA Sequencing, Secuenciación automática de ADN Applied Biosystems Ver: _mod swf Equipo automatizado: Ladder-500

67 Aplicaciones: Análisis de proteínas séricas Objetivo: investigar las modificaciones del perfil proteico y evaluar posibles anomalías presentes en la curva electroforética. Se puede llevar a cabo el análisis cualitativo o cuantitativo de muestras de distinto origen: suero, sangre, orina y/o líquido cefalorraquídeo. FIGURA 1. CAPILARES DE SILICE FUNDIDO FIGURA 4. FRACCIONES DE UN PROTEINOGRAMA DE SUERO NORMAL 8 capilares en paralelo MARIA DE LAS NIEVES SANZ, 2013

68 Aplicaciones: Análisis de proteínas séricas FIGURA 4. FRACCIONES DE UN PROTEINOGRAMA DE SUERO NORMAL Buffer: alcalino COMPONENTE MONOCLONAL FIGURA 6. PROTEINOGRAMA ANOMALO. PRESENCIA DE COMPONENTE MONOCLONAL EN LA ZONA DE LAS GAMMAGLOBULINAS. (cuantificación relativa) Caso de análisis: Mieloma Múltiple (tipo de cáncer de la médula ósea que afecta a las células plasmáticas) MARIA DE LAS NIEVES SANZ, 2013 FIGURA 7. Inmunofijacion en gel de agarosa con Ac monoclonales específicos anti cadena pesada IgG, IgA e IgM y anti cadena liviana Kappa y Lambda. (cualitativo)

69 -Problemas Problema 1. Los siguientes electroferogramas corresponden a muestras de proteínas de suero lácteo nativa (a) y almacenadas con lactosa a 37ºC durante 5 y 10 horas (b y c, respectivamente) obtenidos por electroforesis de zona (CZE) en capilares de sílice sin recubrir en buffer borato 50 mm a ph 9,25. La detección se realizó en el UV a 214 nm. Se grafica el tiempo de inyección (X) vs. Intensidad de señal detectada (Y). a) Indique a que corresponden los picos en el gráfico a. b) Analice que sucede en los electroferogramas b y c. Indique si las proteínas ganaron o perdieron peso. Se debe tener en cuenta cambios en el pi? c) El EOF, es mayor o menor a ph 9 que a ph 3?

70 -Problemas a b c

71 -Problemas Problema 2. Calcular el n de platos teóricos si se conoce que una proteína (mioglobina) pesa 13,9 kda y posee una movilidad de 0, cm 2 /V s (20 mm bicine/tea buffer, ph 8,5) con un D = cm 2 /s a V.

72 -Problemas Problema 3. El siguiente es un electroferograma obtenido de ADN amplificado por PCR obtenido por digestión, realizado por CGE. Indique: a) como es el peso comparable de los picos A-D; b) a que puede corresponder el pico A. m/nprot/journal/v1/n1 /fig_tab/nprot _F1.html